Professional Documents
Culture Documents
cair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. HPLC berupaya untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu.
Fasa stationer Fasa Gerak
Padat
Cair
dan pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm. Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.
menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol. Air mengandung buffer atau garam untuk membantu dalam pemisahan komponen analit. Fase balik HPLC adalah bentuk yang biasa digunakan dalam HPLC.
Solvent reservoir
Sample injection
Injeksi sampel Injeksi sample seluruhnya otomatis. Terjadi pada tingkat dasar dan jauh lebih rumit, karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas.
Waktu retensi
Adalah waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor .Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.
Waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada: Tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut) Kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel) Komposisi yang tepat dari pelarut Temperatur pada kolom.
Detektor Umumnya, penggunaan serapan ultra-violet (UV) sebagai detector pada HPLC.
UV detector Output from the column
UV light
Interpretasi output dari detektor Output akan direkam sebagai rangkaian puncakpuncak, dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV. Penggunaan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh ( sepanjang dilakukan kontrol terhadap kolom)
kuantitas dari senyawa yang dihasilkan. Meihat waktu retensi dari senyawa tersebut Hubungan jumlah dari senyawa X dengan puncak dari senyawa yang dihasilkan.
Senyawa murni
sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer.
Merupakan suatu metode analisis kimia yang bertujuan untuk memisahkan suatu jenis ionik dengan menggunakan muatan dan gaya friksionalnya. Teknik penerapannya melibatkan suatu pipa kapiler dengan lebar 20-200 m dengan efisiensi pemisahan tinggi baik untuk molekul besar maupun kecil.
bisa diamati prosesnya dari luar. Dua buah elektroda Power supply (bisa diatur untuk bertegangan tinggi) Detector (sinar UV) Larutan buffer beserta dua buah tempat penyimpanannya
Terminologi Elektroforesis
Pergeseran waktu (migration time) tm merupakan waktu yang dibutuhkan larutan untuk bergerak dari kolom kapiler menuju jendela detektor. Hal-hal yang mempengaruhi mekanisme proses ialah mobilitas elektroforesis (electrophoretic mobility) ep(cm2/Vs), kecepatan elektroforesis (electrophoretic velocity) vep(cm/s), dan besarnya medan listrik (electric field strength) E (V/cm). Hubungannya dapat dilihat pada persamaan dibawah:
Ld / tm ep E V / Lt
vep
(1)
Kecepatan
merupakan hasil kalkulasi dari membagi perpindahan waktu dengan jarak pipa kapiler dari detektor. Mobilitas tergantung pada hasil pembagian antara kecepatan dengan besar medan listrik. Ketinggian cairan sampel pada pipa kapiler tergantung pada jenis buffer yang dipakai, kondisi pH dan temperatur. Panjang pipa kapiler yaitu panjang menuju detektor (Ld), dan panjang total (Lt), panjang ketika proses separasi terjadi pada segmen kapiler, Ld , dan panjang keselurahan adalah Lt, selisih atau kelebihan Lt terhadap Ld harus diketahui untuk menghubungkan pipa kapiler pada buffer reservoir. Pada sistem P/ACE excees panjangnya bernilai 7 cm, dengan ukuran panjang ini apabila susunan pipa tersebut dibalikkan maka akan terjadi suatu separasi yang cepat.
Elektroosmosis
Merupakan proses dasar yang mengendalikan CE, peristiwa ini merupakan hasil dari terdapatnya muatan pada dinding pipa kapiler. Aliran elektroosmosis didefenisikan dalam persamaan dibawah:
veo E 4
(2)
Dimana adalah konstanta dielektrik, adalah viskositas larutan buffer , dan adalah potensial zeta diukur pada saat bidang pembatas menutup pada hubungan permukaan antara liquid dan padatan. Muatan negatif dinding menarik muatan positif ion dari larutan buffer, menghasilkan dua lapisan elektrik. Ketika tegangan yang dilibatkan melewati pipa kapiler, kation yang ada didalam jumlah yang panjang (banyak)pada lapisan ganda (double layer), berpindah secara langsung kadalam katoda dengan mengikutsertakan air. Hasilnya adalah jaringan aliran larutan buffer pada elektroda negatif. Meningkatnya konsentrasi akan mengakibatkan aliran elektroosmosisnya menjadi menurun.
Pada gambar 2 diatas, diperlihatkan pengaruh pH terhadap EOF, ion zwiter seperti peptida telah dipisahkan kedalam dua kondisi pH, pada pH tinggi EOF besar dan peptida bermuatan negatif sehingga perpindahan elektroforesis menuju kearah elektroda positif (anoda),
Pada saat aliran pada pipa kapiler diberikan suatu pendorong yaitu tekanan maka akan terlihat perbedaan kecepatan aliran yaitu pada lintasan tengah pipa lebih cepat dibanding dengan pada dinding, hal ini terjadi karena ada gaya friksional(gesek) liquid terhadap dinding kapiler (sistem hidrodinamik). Gambar bagian atas menunjukkan sistem yang dikendalikan secara elektris, gaya dorong pada EOF terdistribusi secara uniform(merata) sepanjang pipa tersebut, sehingga tidak ada pengaruh tekanan, distribusi kecepatan merata kecuali pada bagian yang dekat sekali pada dinding pipa kapiler.
(3)
Sepanjang berpindah , terjadi difusi molekular kemudian memuncak pada dispersi, persamaan dispersi sebagai berikut: (5)
Angka teoritis pelat alas diberikan dalam persamaan sebagai berikut: (6)
(7)
Diameter Kapiler dan Panas Joule Penggunaan tegangan listrik yang tinggi mengakibatkan terdapatnya panas yang terhimpun dalam sistem. Ada dua masalah yang cukup besar yang timbul sebagai akibat dari panas yang dihasilkan, yaitu gradien temperatur yang melintasi kolom kapiler dan pertukaran temperatur dalam beberapa waktu menjadi tidak efektif terhadap panas yang hilang. Kecepatan panas yang dihasilkan pada kolom kapiler dapat ditinjau melalui pendekatan persamaan sebagai berikut (8)
Dimana L adalah panjang pipa kapiler, A adalah luas area yang dialiri. Apabila i=VR dan R=L/kA sedangkan k adalah koduktivitas maka: (9)
Gradien temperatur yang melintas pada kolom kapiler merupakan akibat dari dissipasi panas, temperatur pada aliran tengah kolom kapiler lebih tinggi dibandingkan dengan temperatur pada dinding kapiler.
Viskositas akan menjadi lebih rendah pada saat temperatur tinggi, dalam kondisi ini pula EOF dan mobilitas elektroforesis (EPM) juga akan meningkat.
Gradien temperatur sebanding dengan kuadrat diameter dari pipa kapiler, dapat dilihat melalui persamaan dibawah:
(10)
Diman W adalah usaha, r merupakan jari-jari kapiler, dan K adalah konduktivitas termal.
Separasi molekul-molekul kecil dan besar dapat dilakukan dengan baik dengan metode CZE. Meskipun pada molekul yang lumayan kecil dimana rasio antara muatan dan massanya tidak begitu bagus.
Aplikasi
CZE sangat berguna untuk men-separasi protein dan peptide, hasil yang didapat akan dianalisa perbedaannya berdasarkan satu subtituent dari asam amino. Hal ini berguna dalam memetakan tempat modifikasi mutasi dan post-translasi yang terdeteksi.
Perpindahan(pergerakan) cairan pada pipa kapiler akan terus berlangsung sepanjang larutan memiliki muatan atau diberi muatan, apabila kondisi sudah menjadi netral maka cairan akan berhenti bergerak.
Aplikasi
IEF berguna untuk menentukan pI dari protein, terutama dalam memisahkan immunoglobulin , variasi hemoglobin dan menentukan posisi translational modifikasi dari protein rekombinan, separasi campuran protein dapat dilihat pada gambar dibawah:
Aplikasi
DNA Pemisahan oligonucleotida dan sekuen produk DNA melibatkan agar polyacrylamide, gambar dibawah menunjukkan hasil separasi
Isotachophoresis
Pada metode ini aliran elektroosmosis sama dengan 0, sistem pada buffer adalah heterogen, pipa kapiler diisi dengan larutan elektrolit yang memiliki mobilitas tinggi dibandingkan sampel-sampelnya yang akan diteliti sebagai leading , kemudian sampel diinjeksi, kemudian larutan elektrolit kembali dimasukkan kembali sebagai terminating.
Aplikasi