Programirana elijska smrt znaaj, mehanizmi i metode t d detekcije d t k ij

Razvoj koncepta

Razvoj koncepta
R. Lockshin and C. Williams, (1965) Programmed cell death. II. Endocrine presentation of the breakdown of the intersegmental muscles of silkworms. J Insect Physiol. J. Physiol 11 11, 803 803-809. 809

Biol. Rev. 26:59-86 (1951)

Razvoj koncepta
Fizioloki signali
Razvoj Postnatalni period

(fiziki uticaji, hemijski i bioloki agensi, agensi zraenje) enje )

Patoloki signali/uticaji

Uklanjanje nepotrebnih elija lij oblikovanje blik j organa Uklanjanje nekomnekompetentnih elija tkivna petentnih homeostaza (1010 dnevno!)

Ote enje elije

Smrt elije

Smrt elije

Razvoj koncepta

Rudolf Ludwig Karl Virchow (1821(1821 -1902) Omnis cellula e cellula

1858. 1858 . (Predavanje XV) Nekroza Nekrobioza

Walter Flemming (1885.)

Hromatoliza

Razvoj koncepta
Al k Aleksandar d . Kosti K ti (1 (1921. 921.) )

Razvoj koncepta
Br. J. Cancer (1972) 26, 239

APOPTOSIS: A BASIC BIOLOGICAL PHENOMENON WITH WIDERANGING IMPLICATIONS IN TISSUE KINETICS

J. F. R. KERR, A.H. WYLLIE AND A. R. CURRIE
From the Department of Pathology, University of Aberdeen
received for publication April 1972

Nekroza

Apoptoza

Razvoj koncepta

Razvoj koncepta

Mrtva elija

iva elija

Visoka temperatura

Fiksacija

Glukokortikoidi

Razvoj koncepta Nekroza

patoloki agensi grupe elija rana p pojava j edema liza elija, karioliza nasumina fragmentacija DNK, nejasno ograniene mase hromatina Masivna zapaljenska reakcija Mobilizacija nespecifinog imunskog odgovora stvaranje oiljka

Razvoj koncepta Apoptoza Apoptoza

fizioloki ili patoloki uslovi pojedina j di ne elije lij rani gubitak elijskih veza kondenzacija hromatina - jasno ograniene mase, internukleozomska fragmentacija DNK dugo ouvan integritet organela izraena fagocitoza odsustvo zapaljenja i oiljka

Razvoj koncepta A Apoptoza

Apoptozu karakterie niz dramatinih promena u elijskoj arhitektonici koji doprinose ne samo programiranoj smrrti elije, ve doprinose i pripremi elije za uklanjanje fagocitozom i i bega anj neeljene reakcije izbegavanju eakcije im imunskog nskog sistema . Mnogi dogaaji koji se deavaju tokom efektorske faze apoptoze posredovani d i su aktivno kti u l lanova enzimske i k familije f ilij cistein i t i proteaza kaspaza. Ove proteaze O t mogu da d deluju d l j na nekoliko k lik stotina t ti proteina t i i usmeravaju ih na kontrolisan nain u proces kontrolisane proteolize, ime se na najmanju meru svode oteenja susednih elija lij i izbegava i b osloba l b anje j imunostimulatornih i ti l t ih molekula. l k l

Za razliku od apoptoze, nekrozu (nekontrolisanu smrt elije) karakterie brz gubitak integriteta elijske membrane i oslobaanje elijskog sadraja u vanelijski j p prostor. Brojne injenice ukazuju da imunski sistem sutinski razliito reaguje na apoptotine i nekrotine elije. Nekrotine elije skoro po pravilu pokreu zapaljensku reakciju neutrofila, neutrofila makrofaga i ostalih elija ukljuenih u uroeni imunski odgovor i oslobaaju se neki molekuli (danger-associated molecular patterns - DAMPs ili alarmini) koji se vezuju za receptore na makrofagima, makrofagima dendritinim i NK elijama. elijama STOGA, JEDNA OD VANIH OSOBINA APOPTOZE JE SPREAVANJE DEMASKIRANJA SOPSTVENIH ANTIGENA.

Razvoj koncepta
Nekroza zades
patoloki agensi grupe elija rana p pojava j edema liza elija, karioliza nasumina fragmentacija DNK, nejasno ograniene mase hromatina zapaljenska lj k reakcija k ij stvaranje oiljka

Apoptoza program/proces
fizioloki ili patoloki uslovi pojedina pojed ane e e elije je rani gubitak elijskih veza kondenzacija hromatina - jasno ograniene mase, internukleozomska fragmentacija DNK d dugo ouvan i integritet t it t organela l izraena fagocitoza odsustvo zapaljenja i oiljka

Morfoloke karakteristike
Latentna faza Kondenzacija K d ij Fragmentacija Fagocitoza Digestija

Morfoloke karakteristike
Gubitak meuuelijskih veza

Pupljenje fragmentacija

Morfoloke karakteristike

Kolaps hromatina

Morfoloke karakteristike

Pojava fosfatidilserina na spoljnoj strani membrane

Annexin V

Morfoloke karakteristike

Profesionalni fagociti

Okolne elije

Digestija

Morfoloke karakteristike
Stadijum II

Normalna elija

Stadijum I

Stadijum j III

Morfoloke karakteristike
Nekraptoptoza Paraptoza Onkoza Programirana nekroza Latiptoza

Autofagocitoza Apoptoza

Programirana elijska smrt

Klasifikacija

(Nomenclature Committee on Cell Death)* Death)*

Modalitet elijske smrti Apoptoza (Tip 1) Autofagija (Tip 2) Nekroza (Tip 3) Mitotska katastrofa

Morfoloke karakteristike
Zaokrugljivanje Z k lji j elija lij Redukcija volumena (piknoza) Fragmentacija M l promenen izgleda Male i l d organela l

Odsustvo kondenzacije hromatina Masivna vakuolizacija citoplazme ( t f (autofagne vakuole k l sa d dvostrukom t k membranom) Edem elije i organela Ruptura R t plazma l membrane b Umerena kondenzacija hromatina Mikronukleacija Multinukleacija
* Cell Death Differ , 2005; 12 (Suppl 2): 14631463-7

Mehanizmi
Signali citokini, adhezioni molekuli, metaboliki signali
Okolnosti Fenotip Doza Trajanje

Oteenje DNK, citotoksiki oksidativni stres, hipoksija, fiziki agensi

Adaptacija Reparacija Replikacija Mutacioni defekti

Apoptoza

Nekroza (neapoptotska smrt elije)

Mehanizmi
Indukcija

Apoptoza p p j je proces! p
Prenos signala Efektori

Modulacija M d l ij signala

Smrt

Mehanizmi
Receptor Adaptor I i ij t Inicijator Modulator Caspaze Efektor Proteini Bcl porodice Proteini koji j inhibiraju j apoptozu

Mehanizmi
Pokretanje apoptoze preko receptora na elijskoj membrani e b a receptori ecep o smrtonosnih s o os signala unutar t elijski lij ki faktori f kt i ote t enje j mitohondrijalne membrane, slobodni radikali, dik li ote t enje j DNK ...

Mehanizmi
Okidaki signal
Adaptor Receptor signala smrti Ligand

Stres endoplazmatskog retikuluma

C 2+ Ca Prokaspaza 8
Citohrom c

Kaspaza 8 Kaspaza 9 Kaspaza 3

Prokaspaza 12

Kaspaza 12
APAF 1 APAF-1

Prokaspaza 3 DP3 APP Ab

Prokaspaza 9

Apoptoza

Mehanizmi
Kaspaze ekipa za ruenje
U elijama lij normalno l prisutne i t k kao neaktivni kti i proenzimi i i Pripadaju familji proteaza Imaju obavezno Cys ostatak u aktivnom mestu i zahtevaju Asp ostatak na mestu hidrolize peptidne veze u molekulu supstrata. U procesu otpoinjanja apoptoze, apoptoze dolazi do aktivacije kaspaza Iskljuivanje sistema odgovornih za odravanje osnovnih ivotnih funkcija elije - Proteini koji uestvuju u procesima transkripcije i translacije - Fragmentacija genomske DNK -Fragmentacija Goldi aparata i ER -Fragmentacija mitohondrija

Mehanizmi
Apo2L FasL TNFa Apo3L ?

DR4, DR5

Fas

TNFR1

DR3

DR6 TRADD

FADD Kaspaza 8 Kaspaza 3

TRADD

Apoptoza

Mehanizmi
Receptor smrtonosnog signala

FasL

Fas ( (CD95) )

DD

ProPro -kaspaza 8 Kaspaza 8

DD DD DED DD DED D DD

FADD

DED D DED

[Smrt]

Mehanizmi
Fas (CD95)

Receptori mamci a

FasL
DcR3

DD

DD

DED

DED

DD

DD

DD

Preivljavanje Preivljavanje

ProPro -kaspaza 8

DED D

FADD

DED D

Mehanizmi
Nagla promena propustljivosti unutranje membrane mitohondrija permeability transition

Razdvajanje komponenti respiratornog i t lanca l Kolaps Ym prestanak sinteze ATP ATP-a a oslobaanje Ca++ stvaranje slobodnih radikala oslobaanje malih proteinskih molekula

Mehanizmi
Oteenje Stres Bid Kaspaza 8 ProPro -kaspa aspaza za 3

ProPro -kaspa aspaza za 9 ApafApaf -1

dATP

Kaspa aspaza za 3

Citochrom c

AIF Kaspaza aspa p za 9

ProPro -kaspa aspaza za 3

Mehanizmi
Bid Bax, Bax Bak BclBcl -2/Bcl 2/Bcl-XL Nezavisno od kaspaza Zavisno od kaspaza

ROS EndoG AIF

Smac IAP

Citohrom c ApafApaf -1 Kaspaza aspaza-9 Kaspaza aspaza-3 Proteini elijska smrt Kaspaze

Oksidacija li id lipida

Razgradnja DNK

Omi

Mehanizmi
BclB l- 2 Bcl
BH2 BH3 BH4

BH3

BH1

BH2 Bak(72Bak(72 -87) TM

Bik Hrk Bid ((-TM) BclBcl -XS (+BH4)

BclBcl -XL

Bcl-2 BclBclBcl -XL MclMcl -1 BclBcl -w A1

Bax Bak Bad ( (-TM)

Antiapoptotski

Proapoptotski

Mehanizmi
Regulacija Bcl Bcl-2 proteina na nivou g genske ekspresije p j posttranslacione modifikacije fosforilacija proteoliza p
Bax

ILIL -3 Kinaze

Bad

BclBcl c -2

1414 -3-3 Preivljavanje

Apoptoza

Mehanizmi
Kaspaza 9

Apaf-1
dATP

Citohrom C

Pro-kaspaza 9

Apaf-1
Bax BclBcl -2 BclBcl -2

Apaf-1

Mehanizmi
Genotoksiki stres

Aktivni p53
Waf1

(p21)

MDM2

IGFIGF -BP3

GADD45

Ciklin G

PCNA

Cdk Ciklin

p21

P pRB E2F pRB E2F G1 S

Mehanizmi
Genotoksiki stres Aktivni Akti i p53 53

Bax IGFIGF -BP3 Fas

Bcl-2 BclIGF1R IGFII

GADD45 TFHII RPA PCNA p21Waf1

Zavisi od funkcije p53 53 u transkripciji t k i iji

Ne zavisi i i od d funkcije f k ij p53 3 u transkripciji k i iji

Apoptoza

Apoptoza

Mehanizmi
Oteenje DNK Indukcija sinteze Spreavanje razgradnje Geni za apoptozu

p53

p21 (Waf(Waf-1)

CiklinCiklin -CDK
P P P P P P P

Geni za popravku DNK

Aktivni pRB Neaktivni pRB

Mehanizmi
Signali za elijsku smrt

Nekroza

Ne

ATP

Da

Procesi koji zavise od ATP-a

Nekroza

Kaspazna k k d kaskada Ne Da ATP Cas3 Cas8

Aktivni transport u jedro (zavisi od ATP-a)

Apoptoza

Mehanizmi - primena

U dizajniranju antitumorskih lekova

- Poremeaj odnosa proapoptotskih/antiapoptotskih inilaca - Protein/protein interakcije

Autofagija (Tip 2)

Autofagija (Tip 2)

Slini stresori mogu da dovedu ili do apoptoze ili do autofagije, S f to zavisi od konteksta, praga osetljivosti i drugih inilaca. Pored toga, ova dva procesa u odreenom astepenu inhibiraju jedan drugog, ali u nekim sluajevima u istoj eliji se mogu uoiti i karakteristike apoptoze i autofagije Iako se smatra da autofagija uglavnom elijama omoguava prilagoavanje na stres, t i izraena autofagija t f ij d dovodi di d do smrti ti elije. lij

Nekroza (Tip 3)
ER

Mt ER

Mitotska katastrofa

Mehanizmi

Mehanizmi

Biohemijski procesi
Modalitet elijske smrti ti
Apoptoza

Stimulus
Aktivacija receptora smrti Oteenje DNK ER stres

Proces
MMP Aktivacija kaspaza inhibicija kaspaza Autofagna vakuolizacija inhibicija makroautofagije Masivna aktivacija litikih enzima

Nedostatak nutrienata

Autofagna smrt elija

Osmotska liza ROS Preoptereenje Ca2+

Nekroza

Detekcija - morfologija

Detekcija - morfologija
DAPI

Propidijum jodid Akridin oran

Aneksin V

Detekcija - mitohondrije
Depolarizacija mitohondrija

100

101

102 FL1-H

103

104

100

101

102 FL2-H

103

104

12 10 8 6 4 2 0 0 2 4 6 8 kontrola L3 (50 mkroM)

Detekcija oteenje membrane

kontrola Annexin PI.001

kontrola Annexin PI.001

Pojava fosfatidilserina na spoljnoj strani membrane

M1

100

101

102 103 Annexin V FITC

104

100

101

102 103 Annexin V FITC

104

Taxol 24h Annexin PI.001

M1

A Annexin i V
100 101 102 103 Annexin V FITC 104

100

101

102 103 Annexin V FITC

104

Detekcija aktivni egzekutori

Novoroeni pacov 15 min. ishemija 3 h reperfuzija

Antitelo na aktivisanu kaspazu 3 (17 kDa)

Leukemija Razmaz krvi Posle citostatika

Antitelo na aktivisanu kaspazu 3

Detekcija fragmentacija DNK

DNK
3 5 Proces apoptoze endonukleaze 3 5

dNTP

Terminalna transferaza

TUNEL tehnika h ik

Detekcija - fragmentacija DNK

HL 60 12 HL-60, 12,5 5 M, M 12h

M4

M1

M2

M3

200

400

FL2-A

600

800

1000

B-16, 25 M, 24h

M4

M1

M2

M3

200

400

FL2 A FL2-A

600

800

1000

Dodatne informacije : Nature Reviews Molecular Cell Biology

The engine driving the ship: metabolic steering of cell proliferation and death Marisa R. Buchakjian & Sally Kornbluth doi: 10.1038/nrm2972 September 2010
621 |

Focus on APOPTOSIS

Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond Stephen W. G. Tait & Douglas R. Green doi: 10.1038/nrm2952

October 2008
781 |

Phagosome maturation: going through the acid test Jason M. Kinchen & Kodi S. Ravichandran doi: 10.1038/nrm2515

July 2008
532 |

Cytochrome c: functions beyond respiration Yong-Ling P. Ow, Douglas R. Green, Zhenyue Hao & Tak W. Mak doi: 10.1038/nrm2434

January 2008
47 |

The BCL-2 protein family : opposing activities that mediate cell death Richard J. Youle and Andreas Strasser doi: 10.1038/nrm2308 10 1038/nrm2308

September 2007
741 |

Self-eating and self-killing: crosstalk between autophagy and apoptosis M. Chiara Maiuri, Einat Zalckvar, Adi Kimchi and Guido Kroemer doi:10.1038/nrm2239

May 2007

405 |

The apoptosome : signalling platform of cell death Stefan J. Riedl and Guy S. Salvesen doi:10.1038/nrm2153

February 2006

97 |

Developmental apoptosis in C. elegans: a complex CEDnario Guillaume Lettre & Michael O. Hengartner doi:10.1038/nrm1836