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Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán Campo 1

Carrera: Química Asignatura: Bioquímica estructural Grupo: 2601 Reporte de la práctica No. 8 “Cinética enzimática de la ureasa” Equipo No. 2 Chávez Ramos Kenia León León Donaldo Gamaliel Fecha de realización de la práctica: 25 de abril de 2012 Fecha de entrega del reporte: 2 de mayo de 2012 Asesoras: Q. Karla Hernández Pérez QFB Jessica Filisola Villaseñor

Para encontrar la máxima velocidad de una reacción enzimática. Graficas de las energias de las diferentes fases de una reacción química. transcurra a mayor velocidad que sin la presencia de la enzima. mientras que elevadas concentraciones de sustrato tienden a incrementar la actividad. el cual puede decirnos cómo de afín es la unión entre el sustrato y la enzima. Las velocidades de las enzimas dependen de las condiciones de la solución y de la concentración de sustrato. la concentración de sustrato se incrementa hasta que se obtiene una tasa constante de formación de producto. La constante de Michaelis-Menten (Km). las cuales se convierten en moléculas diferentes denominadas productos. Vmax es sólo una de las constantes cinéticas de la enzima. Aquellas condiciones que desnaturalizan una proteína. En estas reacciones. sea cinéticamente favorable. las enzimas actúan sobre unas moléculas denominadas sustratos. dificultan o impiden la actividad enzimática. siempre que sean termodinámicamente posibles: Una enzima hace que una reacción química que es energéticamente posible (ver Energía libre de Gibbs). es decir. pero que transcurre a una velocidad muy baja. A las reacciones mediadas por enzimas se las denomina reacciones enzimáticas. . pH extremo o altas concentraciones de sal. A la máxima velocidad (Vmax) de la enzima. Figura 1. y la cantidad de complejos ES es igual a la cantidad total de enzima. Cada enzima tiene un valor de Km característico para un determinado sustrato.Introducción Las enzimas son moléculas de naturaleza proteica que catalizan reacciones químicas. como temperaturas elevadas. que viene a ser la concentración de sustrato necesaria para que una enzima alcance la mitad de su velocidad máxima. Casi todos los procesos en las células necesitan enzimas para que ocurran a unas tasas significativas. Sin embargo. todos los sitios activos de dicha enzima tienen sustrato unido.

Figura 3.  Extraer ureasa de frijol de soya aplicando homogeneización mecánica con un mortero y empleando centrifugación esto con el fin de analizar factores que modifican la cinética de esta enzima sobre la urea. inhibiendo su actividad. Los inhibidores son moléculas que regulan la actividad enzimática. Las reversibles se unen de forma reversible a la enzima.   . Inhibición enzimática. Curva de saturación de una reacción enzimática donde se muestra la relación entre [S] y la velocidad de reacción. pudiendo clasificarse a su vez. A grandes rasgos. acompetitivas y mixtas. según la forma en que intervienen en la reacción. en competitivas. pueden clasificarse en reversibles e irreversibles. Las irreversibles se unen covalentemente a la enzima sin posibilidad de revertir la modificación. Analizar los siguientes factores: concentración de sustrato. Obtener experimentalmente valores de Vmáx y de Km por medio del modelo de Michaellis-Menten y por el modelo de Lineweaver-Burk y estos compararlos con los reportados en la literatura. pH y tiempo en la modificación de la velocidad de reacción enzimática para determinara la condiciones óptimas de trabajo de la enzima. temperatura. siendo útiles en farmacología.Figura 2. Objetivos.

Figura 4. también se preparo otra serie de tubos siguiendo otra metodología también indicada en el manual pero estos serán los tubos problema. se llevo a cabo por cada equipo. fue que se repartió el resto de las actividades.3g de frijol de soya y se agregaron 10 mL de etanol hasta obtener un homogeneizado. Se trituraron 0. Coloración canela esperada. Homogeneizado de frijol de soya. La modificación realizada a la práctica. Centrifugado del homogeneizado. si si lo tomast anexala sino omite esto. Se centrifugo el homogeneizado a 2500 rpm durante 15 min. Cálculos y gráficos. La extracción de la enzima. correspondiente a la práctica No. es decir. Kenis no recuerdo si tomast foto a esto. teniendo en cuenta que al hidrolizarse la urea se producen dos iones de amonio que reaccionan con el HCl 0. Observaciones y resultados.1N hasta un vire de color canela. Estas dos series de tubos se incubaron a 50°c durante 5 minutos pasado este tiempo se les adiciono 0. Figura 5.5 mL del extracto de ureasa mientras volviéndose a incubar por 30 min a 50°C. Metodología. esto porque por cada dos iones de amonio reacciona un micromol de HCl. página 65. Se preparo una serie de 5 tubos de acuerdo a las indicaciones en el manual de prácticas que serian los blancos. terminado el tiempo a los tubos problema se les adiciono 4 gotas de bicloruro de mercurio y a ambas series se les agrego 2 gotas de rojo de metilo y se procedió a valorar con HCl 0. La misma indicación anterior kenis. 8. siendo el pH el factor con el que trabajamos empleando la metodología indicada en el manual de Bioquímica.1N que contiene 100 micromoles/mL. de tal manera que los micromoles de urea hidrolizados se obtienen multiplicando el valor de titulación corregido (VTC) de cada tubo por 50.Diagrama ecológico. se tienen 50 micromoles por cada molécula de amonio formada por la hidrólisis de la urea . Figura 6. Se procedió a calcular los micromoles de urea hidrolizados para cada uno de los factores de cada uno de los tubos.

5 6 7.1N y alcanzar el volumen de vire se observaba una coloración color canela como se menciono anteriormente.3 2. Tubo 1 2 3 4 5 pH 4.1 1. Creo q s x esto el 50. V / µmoles mL-1 35 30 25 20 15 10 5 0 0 2 4 6 pHopt 8 10 12 pH Gráfica 1. Velocidad de reacción en función del pH.4 2. .que están reaccionando con los 100 micromoles de HCl. ( ) ( ) Tabla 1.6 2. Se realizo un grafico de Velocidad de reacción donde esta se expresa en micromoles/mL en función del pH.6 VTP 0 0. asmelo saber!.7 2.2 0. Efecto del pH sobre la velocidad de la reacción.6 2. si cres q s otro cosa kenis.5 0.5 10 VTB 0 0.2 µmoles de urea hidrolizadas 0 25 30 10 10 Cabe mencionar que la coloración inicial de la muestra a valorar con la gotas de rojo de metilo era de color amarillo y al adicionar HCl 0.2 8. En el caso de los tubos 1 y ya que los valores son de 0 en el caso del blanco presentaba una coloración rojiza intensa esto significa que el pH en el medio es más bajo en comparación de la muestra problema que está presentaba la coloración canela.8 VTC 0 0.6 0.

el pH es una función logarítmica de la concentración de protones ([H+]) por lo tanto se realizara un grafico parecido al anterior con la diferencia que ahora se expresara la velocidad de reacción en escala logarítmica. esto quiere decir. es decir. Tubo 1 2 3 4 5 t/min 10 20 30 40 50 VTB 0.3 0.4 0.2 0 0 2 4 6 pHopt 8 10 12 pH Gráfica 2. el pH óptimo es de 7. log V 1.3 0.4 1.2.6 0.4 0. Tabla 2. Efecto del tiempo sobre la velocidad de la reacción.8 0.6 1.La línea punteada muestra que el pH óptimo de trabajo es de 7.5 0.3 0.8 1. por lo tanto. Como método alternativo.4 VTC -0.3 0.4 0.2 Para obtener los micromoles de urea hidrolizadas para el resto de los factores en estudio.4 VTP 0. que al valor de pH mencionado es el valor donde la enzima presenta su mayor actividad catalítica. los equipos nos proporcionaron sus resultados para poder lograr los objetivos. presentados en las posteriores tablas (tabla 2.1 0 -0. Ya que el primer valor es cero.2 0 µmoles de urea hidrolizadas -5 0 -5 10 0 .3 0.2. a este no se le aplicara logaritmo ya que es un error matemático. se graficara log v en función del pH. De acuerdo al gráfico la velocidad máxima se da al valor de pH de 7. mismo valor determinado anteriormente.2 1 0. Logaritmo de la velocidad de reacción en función del pH. 3 y 4) posteriormente se realizo un grafico para cada factor de velocidad de reacción (µmoles de urea hidrolizadas) en función de cada factor.1 0.

Velocidad de reacción en función del tiempo corregida. Velocidad de reacción en función del tiempo.V / µmoles mL-1 12 10 8 6 4 2 0 -2 -4 -6 t/min 0 10 20 30 40 50 60 Gráfica 3. Ya que el grafico no presenta el comportamiento correcto.-0. por el momento se indicara que el retirar los datos es incorrecto pero se hará con fines de análisis de resultados. se retiraran los datos (30. . V / µmoles mL-1 12 10 8 6 4 2 0 -2 -4 -6 t/min 0 10 20 30 40 50 Gráfica 4.5) y (50.0) y posteriormente se tratara el análisis de esta grafica.

25M de urea contiene 250 micromoles/mL así como el volumen total en cada tubo.1 µmoles de urea hidrolizadas 10 15 30 10 5 V / µmoles mL-1 35 30 25 20 15 10 5 0 0 20 40 Topt 60 80 100 T/°C Gráfica 5. Tubo 1 2 3 4 5 T/°C 0 26 50 70 90 VTC 0. El cálculo de los micromoles hidrolizados se realizo de la manera anteriormente mencionada. Por ejemplo para el primer tubo que contenía 0.6 0. Velocidad de reacción en función de la temperatura. Efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de la reacción. primeramente se calcularon los micromoles de urea iniciales por mL para cada tubo tomando en cuenta que cada mL de solución 0.3 0.8 µmoles de urea hidrolizadas 40 .25M y un volumen total de 10mL el cálculo de los micromoles iniciales es de la siguiente manera: ( )( ) Tabla 4.5mL de urea 0.2 0. Efecto de la temperatura sobre la velocidad de la reacción.5 VTC 0. es decir. De acuerdo a la gráfica se pudo obtener la temperatura óptima de trabajo.2 0. Para el efecto de la concentración de sustrato. la temperatura a la cual la enzima tiene su mayor actividad catalítica siento este valor de 50°C. Tubo 1 Concentración inicial de urea en µmoles/mL en el medio 12.Tabla 3.

donde la expresión es la ecuación de una línea recta: ( ) [ ] Tabla 5.5 1.008 0.02 .025 0.02 0.5 µmoles/mL. con fines de obtener mayor utilidad de estos datos.08 0. Aunque el grafico anterior no presenta el comportamiento correcto.02 0. siendo es de 7. se determino el valor de KM característico de esta enzima. se procedió a realizar un grafico de dobles reciprocos (ecuación de Lineweaver-Burk). Valores de 1/[S] y 1/V.2 3 4 5 25 50 125 187.2 1 1 1 60 50 50 50 V / µmoles mL-1 70 60 50 40 30 20 10 0 0 KM=7.5 1/2 Vmáx=25 Vmáx = 50 50 100 150 200 [S]i / µmoles mL-1 Gráfica 6.00533333 0. 1/[S] 1/V 0 0 0. Velocidad de reacción en función de la concentración de sustrato inicial. Ya que estos valores no son del todo correctos por el mal comportamiento del grafico.02 0.04 0.01666667 0.

025 0. el valor obtenido experimentalmente corresponde a un valor de pH de 7. existe un valor de pH en donde la enzima presenta su actividad máxima.04 0.06 0. es decir. esta velocidad alcanza un límite de acuerdo a la naturaleza de la enzima y del sustrato. esto porque a mayor concentración del sustrato la enzima se cubre de en su totalidad por este haciendo que la actividad de la enzima se lleve a cabo en su totalidad. El comportamiento no es el esperado. a la presencia de uno o más aminoácidos cargados en el sitio activo de la enzima o del propio sustrato. así que por debajo o por encima de este valor de pH la enzima se inactiva. esa corrección es errónea ya que no se están tomando casi la mitad de datos y se está forzando a tomar la tendencia esperada. la dependencia del pH de una enzima normalmente refleja el medio ambiente en el cual la enzima esta activa. las enzimas son sensibles al pH.015 0. el cual debió haber sido parecido al de la gráfico 4 supuestamente corregida. Gráfica de dobles recíprocos.1/V 0. y por lo tanto no se puede obtener de manera consistente valores para Vmáx y KM.02 0. experimentalmente no se obtiene el resultado esperado ya que el grafico no presenta el comportamiento característico. esto es corroborado con la literatura y por lo tanto. su máxima actividad catalítica es a este valor de pH.08 0.1 1/[S] Gráfica 7. La tendencia correcta (Gráfica 4) es válida para cuando la concentración de sustrato es mayor que la concentración del enzima. se le conoce como pH optimo. La desaparición de sustrato por la acción de la enzima es una función lineal del tiempo. pero como se menciono anteriormente. Con respecto al efecto del tiempo en la velocidad de reacción.2. normalmente.01 0. De acuerdo a esto.02 0. Primeramente. . Como se podría esperar. esta dependencia del pH se debe.2.03 0.005 0 0 0. Discusión de resultados. el efecto del pH sobre la actividad de la ureasa es notorio en la velocidad de reacción para valores de pH mayores y menores de 7.

aumenta con la concentración de sustrato pero de tal forma que cada incremento adicional de sustrato. Esta relación corresponde al modelo empleado por Michaellis-Menten que se puede ejemplificar de la siguiente manera: . Con respecto al efecto de la temperatura. que por alguna razón esta haya excedido los 50°C y la enzima al sobrepasar esta temperatura se inactiva. dato que se corrobora con la literatura. porque no se obtuvo una línea recta parecida a la mostrada en la figura 7. y que de acuerdo a los datos experimentales. Por lo tanto se alcanza una temperatura en donde la enzima presenta su actividad máxima y que por debajo de esta la reacción se lleva a menor velocidad y por arriba de esta la enzima se inactiva. sin importar el incremento en la concentración de sustrato. esto error puede radicar en la temperatura en la que se trabajo. Al alcanzar este punto. Otra posible respuesta a esto conlleva a un error experimental. da como resultado un aumento menor de la velocidad de reacción. se alcanzara un punto en donde ya no se observara ningún cambio en la velocidad de reacción. Experimentalmente el valor obtenido de temperatura óptima de trabajo es a 50°C. es decir. a este punto se le conoce como velocidad máxima (Vmáx). siendo esta temperatura a la cual la ureasa presenta su mayor actividad y como se menciono anteriormente. la velocidad de reacción catalizada por una enzima aumenta con la temperatura. los cuales algunos presentan signo negativo significaría que la enzima no existe en el sistema. la velocidad de una reacción catalizada enzimáticamente. ya que el incremento en la energía cinética de las moléculas de la enzima y del sustrato. Justificación para esto podrían existir más pero lo antes mencionado es lo que consideramos razonable para este problema.Ahora. la velocidad de reacción permanecerá constante. Por último. De manera más precisa. el sobrepasar de esta temperatura pudo haber provocado que la enzima se inactivara y así hubieran existido errores experimentales. conduce a un mayor número de colisiones facilitando la unión correcta al sustrato. que no se hayan tenido los cuidados pertinentes y que antes de la valoración hubiera existido una confusión entre muestra problema y muestra blanco y esto se vea reflejado en los signos negativos que se obtuvieron. Sin embargo se llega un punto en el que el aumento en la temperatura es desfavorable porque la enzima se comienza a desnaturalizar.

Ya que el primer grafico 6 no es congruente y no se obtuvieron resultados favorables se procedió a realizar el grafico de dobles recíprocos (modelo Lineweaver-Burk). teóricamente el valor de Km es de 2. no se obtiene el resultado esperado (gráfica 7) y por esta razón. . en donde el sobrenadante contenía esta enzima. Conclusiones.Figura 7. Relación entre velocidad de reacción y concentración de sustrato.5x10-2 M es decir 25 µmoles/mL. esto puede ser justificado por qué no existió la tendencia esperada en este grafico (gráfica 6). habrían sido erróneos con la justificación del mal comportamiento de dicha gráfica pero esta demás determinarlos. El grafico teórico presenta la siguiente tendencia. pero con fines de enriquecer este análisis. De haberse propuesto la obtención de estos valores.5 µmoles/mL. Dicha enzima fue empleada para la hidrólisis de la urea. se consideraro: Y aplicando interpolación se obtuvo dicho valor. en este tipo de grafico se obtiene una función lineal. por lo que el resultado obtenido no es el correcto. y como se menciono anteriormente. para determinar el valor de Km. la cual es un arreglo al modelo empleado por Michaellis-Menten. siendo este de 7. Representación del modelo de Lineweaver-Burk. Experimentalmente no se obtuvo una tendencia de este tipo (gráfica 6). Figura 8. Se obtuvo un valor de 50 µmoles/mL como Vmáx. De nueva cuenta. se procedió a determinar Vmáx y Km. no se pueden obtener valores para Vmáx y Km. experimentalmente. Se extrajo uresa apartar del frijol de soya aplicando homogeneización mecánica con un mortero y empleando el método de centrifugación.

México.2 T=50°C Estas condiciones.En la hidrólisis se analizaron diversos factores que pueden modificar la velocidad de esta reacción.com. LEHNINGER. Asimismo se comprendió la relación que existe entre los factores antes mencionados y la velocidad de reacción de una reacción catalizada enzimáticamente así como la modificación de esta. [en línea]. Primera edición. el tiempo y la concentración de sustrato.M. Recuperado el 28 de Abril de 2012. el pH. A partir de esto se obtuvieron las condiciones óptimas de trabajo de la enzima. (2012). A partir del efecto propiciado por la concentración de sustrato se espero determinar el valor de Vmáx y de Km. LAGUNA. Consultadas: 60-72. Barcelona. “Biología celular y molecular”. A. Referencias. por la sensibilidad a dichos factores. experimentalmente se obtuvo una Vmáx de 50µmoles/mL y un valor de Km de 7. el cual es de 25 µmoles/mL. Editorial Pearson Educación. fueron corroboradas con las reportadas en la literatura. W. Consultadas: 74-77.5µmoles/mL. este último no corresponde con el valor teórico reportado. Primera edición. Editorial Omega. las cuales son:   pH=7.google. el cual pudo propiciar la desnaturalización de la enzima o bien. “Curso breve de Bioquímica”. Consultadas: 176-187. de http://books. un error en cuanto a la metodología a seguir. Pags. Primera edición. Pags. No se obtuvo la linealidad esperada con respecto al tiempo. editorial ciencia y cultura latinoamericana. en donde se planteo como justificación un incremento en dicha temperatura.mx/books?id=r5bedH_aST0C&pg=PA495&lpg=PA495&dq=valor+de+km+ de+la+ureasa&source=bl&ots=RlgOjTwaO8&sig=nYoU3iALgm8r0x5nSNPTt2AvzRY&hl=es&sa=X&ei =6lmfT9GC8W42wWzxvHOAg&ved=0CDkQ6AEwBA#v=onepage&q=valor%20de%20km%20de%20la%20ur easa&f=false . BECKER. Pags. J y PIÑA E. la temperatura. siendo correctas. México. entre ellos. Valor de Km de la ureasa. (1995) “Bioquímica”. (1985). L.