4.

DUGE NEKODIRAJUE RNK

Egzoni koji sadre informaciju za proteine ine svega 1 do 2% genoma sisara, dok se sa funkcijom preostalih 98% genoma intenzivno upoznajemo u postgenomskoj eri. Nedavno je otkiveno da se ogroman procenat genoma transkribuje (vie od 63% genoma mia i vie od 93% genoma oveka) (slika 1). Prema nekim procenama transkriptom oveka sadri od 80 000 do 180 000 razliitih molekula RNK, od kojih veina nema konzervisani otvoreni okvir itanja i duine je od 50 do vie od 100 000 nukleotida. Ova grupa molekula RNK se naziva dugim nekodirajuim RNK (eng. long noncoding RNA, ncRNA). Prema drugim procenama broj dugih ncRNK je oko 17 000 u genomu oveka i oko 10 000 u genomu mia. Znaajna nepodudarnost navednih procena ukazuje da smo daleko od realnog broja ovih molkula u naem genomu.

Slika 1. Grafiki prikaz procenta genoma koji se transkribuje kod sisara. Plavi kvadrat predstavlja genom. Zeleni krug predstavlja procenat genoma koji se transkribuje, dok tamno zeleni krug predstavlja region genoma koji se transkribuje sa oba lanca. Ovaj provenat transkriptoma odgovara dugim ncRNK, od kojih neke uestvuju u regulaciji transkripcije, dok se funkcija veine ne zna. CDSs predstavlja sekvence koje kodiraju proteine, dok UTRs predstavljaju netranslatirajue regione, Crne take prestavlju procenat genoma koji kodira male regulatorne RNK i snoRNK.

Otkrie dugih ncRNK je nametnulo pitanje da li su one transkripcioni "um" ili je re o funkcionalnim molekulima. injenice da se procenat transkribovanih ncRNK u genomu poveava sa poveanjem sloenosti organizama, kao i da veina dugih ncRNK ima preciznu vremensku i prostornu regulaciju, ukazuje da je u velikom broju sluajeva re o funkcionalnim molekulima. Duge nekodirajue RNK predstavljaju nivo unutranjih signala koji kontroliu razliite nivoe ekspresije gena tokom razvia i u normalnim i patolokim fiziolokim uslovima. Smatra se da bi regulatorne mree RNK mogle odreivati nae sloene karaktristike i predstvaljti neistraeni svet genetikih varijacija unutar i izmeu vrsta. Dosadanja saznanja o funkciji ncRNK ukazuju da bi one mogle da imaju vanu ulogu u regulaciji ekspresije na transkripcionom nivou. Zajedno sa proteinima sa kojima stupaju u interkaciju ncRNK formiraju mreu koja bi mogla da regulie transkripcioni program, i to uporedo sa dobro izuenom mreom regulatorni elemenati DNK-regulatorni proteini (aktivatori i 1

represori). Mnoge, ako ne i sve, duge ncRNK funkcioniu kao "maje" ili zaetnici u asembliranju kombinatornih proteinskih kompleksa, a nastali kompleksi ncRNK-proteini predstavljaju fleksibilnu platformu koja deluje kao senzor i integrator razliitih signala primaju fizioloke signale i signale tokom razivia i, nakon prijema signala, integriu aktivnost velikog broja regulatornih proteinskih kompleksa koji naee dovode do epigenetikih promena. Neke ncRNK direktno vezuju proteinske komplekse, dok ih veina vezuje preko RNK-vezivnih proteina, koji slue kao mostovi izmeu RNK i proteinskih kompleksa. Naime, smatra se da se veina funkcija dugih ncRNK oslanja na njihovoj interkaciji sa RNK-vezivnim proteinima. S obzirom da RNK-vezivni proteini predstavljaju najveu familiju "transkripcionih" regulatora u genomu, strategija integracije transkripcionog programa kroz interakciju dugih ncRNK sa regulatornim proteinskim kompleksima koja je posredovana RNK-vezivnim proteinima je verovatno opte pravilo za regulaciju transkripcije i obrade RNK.

Slika 2. Koncept regulacije transkripcionog programa mreama ncRNK-proteini. Poreenje dobro izuene mree DNK-transkripcioni faktori (A) i mree ncRNK-proteini. Regulatorne mree ncRNK-proteini obezbeuju veoma fleksibilnu platformu sposobnu da deluje kao senzor razliitih signala nakon ega integrie aktivnost velikog broja regulatornih kompleksa. Nc RNK koje deluju in cis i in trans mogu sinergistiki regrutovati proteinske komplekse ukljuene u regulaciju transkripcije. Neke direktno vezuju te komplekse, dok ih veina vezuje preko RNK-vezivnih proteina koji slue kao mostovi izmeu RNK i proteinskih kompleksa, koji naee dovode do epigenetikih promena.

Regrutovanje proteinskih kompleksa na duge ncRNK se verovatno ostvaruje se na dva naina. 1) Duge ncRNK formiraju strukture RNK-RNK ili RNK-DNK koje predstavljaju mesta vezivanja proteina, ime usmeravaju proteine do ciljnih mesta. 2) Duge ncRNK bi mogle funkcionisati i kao riboswich-evi, tako da bi nakon vezivanja liganda mogle menjati svoju strukturu. 2

Smatra se da mrea nc-RNK-proteini ima vei potencijal u regulaciji transkripcije u pogledu razliitosti i fleksibilnosti u odnosu na mreu DNK-proteini. Razlozi za to su mnogobrojni. 1) Zahvaljujui svojoj sekvenci i strukturnoj fleksibilnosti, duge ncRNK mogu alternativno vezivati vei broj razliitih proteinskih kompleksa u razliitim kombinacijama. 2) Mogu se alternativno splajsovati. 3) Mogu delovati in cis i in trans (u ovom sluaju in cis oznaava delovanje na mestu njihove sinteze, dok in trans oznaave njihovo delovanje na mestim udaljnim od mesta njihove sinteze). Nc RNK koje deluju in cis i in trans mogu sinergistiki regrutovati proteinske komplekse ukljuene u regulaciju transkripcije. 4) Mnoge nekodirajue RNK imaju antisense transkripte, a prisustvo jednolananih ncRNK i dvolananih ncRNK je dinamino regulisano u eliji. Njihov odnos moe bitno modulisati aktivnost ncRNK jer formiranje dvolanane RNK moe narutiti funkcije jednolanane RNK, ili joj ak dodeliti neke nove funkcije. 5) Najzad, veina RNK-vezivnih proteina sadri nekoliko RNK-vezivnih domena, to im verovatno omoguava da prepoznaju i vezuju se za razliite ciljne RNK. Ovo ukazuje da bi mnogi RNK-vezivni proteini mogli zauzimati konformaciju koju im diktira ciljni molekul RNK. Prve duge ncRNK, otkivene poetkom devedesetih godina prologa veka, bili su molekuli RNK ukljueni u doznoj kompenzaciji (na primer, Xist RNK) i utiskivanju gena, koji svoju funkciju obavljaju regrutovanjem kompleksa koji dovde do epigenetikih promena. Duge ncRNK naroito povoljne za alelsku regulaciju imprintovanih gena, kao i za bilo koju in cis regulaciju specifinu za lokus.Veina dugih ncRNK ukljuenih u regulaciji neimprinotvanih gena uestvuje u regulaciji transkripcije, takoe, regrutovanjem kompleksa za epigenetike promene, ali koristi i razliite druge mehanizme kako bi obavile regulatornu ulogu u kontroli transkripcije (slika 2).

4.1. Osobine dugih nekodirajuih RNK 4.1.1. Klasifikacija ncRNK

Duge ncRNK se, esto, definiu kao molekuli RNK dui od 200 nukleotida, koji su ukljueni u doznoj kompenzaciji i utiskivanju gena. Najvei broj dugih ncRNK koje uestvuju u regulaciji transkripcije neimprintovanih gena obino su krae od 10 kb. One mogu biti klasifikovane na osnovu razliitih kriterijumima. Na osnovu koliine, dele se na one prisutne u velikim koliinama (na primer, NEAT1 i NEAT2) i one prisutne u malim koliinama (na primer, CCDN1). Na osnovu funkcije, dele se na one koje deluju in trans i one koje deluju in cis. Na osnovu pozicije u odnosu na gene, razlikuju se ncRNK asocirane sa promotorima i uzvodnim promotorskim regionima, intergenske i antisense.

4.1.2. Sense i antisense duge ncRNK

Duge ncRNK se eksprimiraju sa jednog ili drugog lanca DNK, a nekada istovremno sa oba. Sparivanje sense i antisense dugih ncRNK je opisano u nekim sluajevima. Na primer, masivno sparivanje sense i antisense transkripata se deava u ponovljenim elementima Alu i netranslatirajuim regionima gena za proteine. Znaaj formiranja dvolanane duge ncRNK nije poznat. Meutim, moe se pretpostaviti da dvolanaana duga ncRNK gubi sposobnost 3

sparivanja sa komplemntarnom sekvencom u molekulu DNK ili nekom drugom molekulu RNK, tako da formiranje dvolanane RNK moe blokirati ili regulisati barem neke funkcije jednolanane RNK. Ovo svakako ne iskljuuje mogunost da se dvolanana duga ncRNK formira sa ciljem da se promeni njen afinitet za proteine.

4.1.3. Lokalizacija dugih ncRNK u eliji

Suprotno molekulima iRNK, koji nakon obrade, lokalizuju u citoplazmi, veina dugih ncRNK lokalizuje u nukleusu, ukljuujui i duge ncRNK bez poli-A RepA, koje predstavljaju veliki deo ukupno transkribovanih sekvenci, i duge ncRNK transkribovane sa intronskih regiona. Mali broj dugih ncRNK lokalizuje kako u nukleusu, tako i u citoplazmi, a postoje i one koje selektivno lokalizuju u citoplazmi.

4.1.4. Regulacija i obrada dugih ncRNK

Duge ncRNK se odlikuju ekspresijom u mnogim elijama, obino na izuzetno niskom nivou, to namee pitanje njihove transkripcije, regulacije i funkcije. Tkivno specifian obrazac ekspresije mnogih dugih ncRNK tokom razvia, kao i razliita unutraelijska lokalizacija, ukazuje da je njihova ekspresija precizno regulisana. Veina dugih ncRNK se transkribuje sa Pol II, mada neke prepisuje i Pol III. Uglavnom je nepoznato kako se regulie ekspresija dugih ncRNK na nivou transkripcije ili obrade. Za oko 1 600 dugih ncRNK konzervisanih meu sisarima, pokazano je da su osnovna pravila transkripcije analogna konvencionanoj transkripciji sa Pol II: trimetilacija H3K4 u promotorskom regionu i trimetilacija H3K36 u transkricionoj jedinici, kao i prisustvo mesta za 5'-kapu. Takoe, nekoliko dobro okarakterisanih transkripcionih faktora koji uestvuju u transkripciji gena sa Pol II, asocira i sa velikim brojem transkripcionih jedinica za duge ncRNK. Za duge ncRNK koje ne pokazuju konvencionalnu metilaciju H3K4 i H3K36 i mesto za 5'-kapu, nije jasno da li nastaju obradom veoma dugogo transkripta ncRNK, ili imaju neku alternativnu transkripcionu strategiju. Duge ncRNK se obino obrauju, koristei mehanizam obrade slian obradi miRNK. Na primer, inaktivacija Drosha, ali ne i Dicera, poveava nivo ekspresije CCND1 iRNK za oko etri puta, to ukazuje da bi u njenoj obradi mogao uestvovati Drosha.

4.2. Duge ncRNK regrutuju proteinske komplekse koji najee uestvuju u epigenetikoj regulaciji
Dosadanja saznanja ukazuju da duge ncRNK imaju vanu ulogu epigenetikoj regulaciji, koju ostvaruju regrutovanjem kompleksa i faktora za promenu strukture hromatina na specifinim lokacijama u genomu i nukleusu. Pretraivanje blizu 3 300 konzervisanih i intergenskih dugih ncRNK pokazalo je da ak 38% stupa u interkaciju sa kompleksima i faktorima za promenu strukture hromatina. Uglavnom je re o faktorima i kompleksima koji dovode do utiavanja gena, ali se pretpostavlja da jednak broj dugih ncRNK regrutuje komplekse i faktore stvaraju aktivan hromatin.

Smatra se da e duge ncRNK u pogledu mehanizama kojima ostvaruju epigenetiku regulaciju prevazii razliitost epigenetikih mehanizama koji se ostvaruju proteinima i malim regulatornim RNK. Upoznavanje epigenetikih mehanizama, naslednih promena u funkciji gena koje se ne objanjavaju promenama u sekvenci DNK, postalo je jasno da su ivi organizmi vie od prostog zbira njihovih gena. Bioloka sloenost organizama je manje zavisna od broja gena a vie od toga kako se oni koriste (eksprimiraju), to umnogome zavisi od regulatornih molekula, i to kod viih eukariota izgleda, pre svega, od regulatornih molekula RNK, koji su aktivno uklju eni u epigenetike mehanizme.

4.3. Mehanizmi regulacije transkripcije dugim ncRNK

Duge ncRNK reprimiraju i/ili aktiviraju transkripciju gena delujui kao senzori za razliite regulatorne signale. Mehanizmi kojima ostvaruju svih efekat na transkripciju podrazumevaju: 1) regrutovanje kompleksa za epigenetiku regulaciju (kompleksa za modifikaciju histona, modifikaciju DNK i remodelovanje nukleozoma), koji ujedno predstavlja i najei mehanizam; 2) modifikovanjem vezivanja RNK Pol II optih transkripcionih faktora za DNK; 3) transkripcionom interferencijom; 4) modulacijom specifinih transkripcionih faktora.

4.3.1. Duge ncRNK kao ligandi ili kofaktori koj posreduju u modifikaciji histona
Evf2 ncRNK kao koaktivator Duga ncRNK Evf2 ima funkciju koaktivatora/korepresora tokom razia prednjeg mozga kod mia. Evf2 ncRNK je poliadenilovana i transkribuje se sa evoluciono veoma ouvanog intergenskog regiona koji sadri pojaivae (Ei i Eii) za gene Dlx-5 i Dlx-6. Dlx proteini pripadaju familiji proteina sa homeodomenom i imaju vanu ulogu u razviu nervnog sistema. Ei i Eii su intergenski pojaivai za gene Dlx-5 i Dlx-6, i regulisani su proteinom Dlx-2. Ekspresija Evf2 ncRNK visoko-korelie sa ekspresijom Dlx-5 i Dlx-6. Evf2 ncRNK formira kompleks sa Dlx-2, indukujui aktivnost pojaivaa Ei i Eii, to dalje indukuj e ekspresiju Dlx-5 i Dlx-6. U opisanom primeru ncRNK ima funkciju koaktivatora: transkripcija Evf2 ncRNK promovie aktivnost pojaivaa regrutovanjem proteina Dlx-2, dok se u sluaju odsustva ekspresije Evf2, za pojaiva ne vezuje Dlx-2. CCND1 ncRNK kao ligand koji in cis posreduje u modifikaciju histona Neke duge ncRNK, kao to je CCND1 ncRNK, mogu funkcionisati kao ligandi koji posreduju u modifikaciji histona. CCND1 ncRNK regrutuje protein TLS (eng. translocated in liposarcoma), koji pripada familiji RNK-vezivnih proteina. C-kraj proteina TLS sadri RNK-vezivne domene, dok N-kraj sadri regione bogate glutaminom i odgovoran je za interakciju sa kompleksom CBP/p300, u kome oba proteina imaju aktivnost histon acetil transferaza (HAT). Interesantno je da je C-kraj proteina TLS esto deletiran u malignim elijama, dok N-kraj fuzionie sa drugim transkripcionim faktorima.

CCND1 ncRNK spada u transkripte koji se prepisuju sa regiona koji je uzvodno u odnosu na promotor (eng. promoter upstream transcripts), u ovom sluaju u odnosu na promotor gena za ciklin D1 (gena CCDN1). U uslovima odgovora na genotoksini stres (oteenja DNK) dolazi do pojaene ekspresije CCND1 ncRNK, dok je ekspresija CCND1 iRNK reprimirana. Indukcija CCND1 ncRNK dovodi do regrutovanja proteina TLS, koji svojim N-krajem inhibira histon acetilaznu aktivnost kompleksa CBP/p300, to uspostavlja hipoacetilovanih hromatin (menja otvorenu strukturu hromatina u zatvorenu) i reprimira transkripciju gena CCND1. Pored toga CCND1 ncRNK izgleda olakava i vezivanje represivnih kompleksa za modifikaciju hromatina PRC1 i PRC2, koji su bitni za represiju promotora gena CCND1. CCND1 ncRNK je prisutna sa svega dve do osam kopija po eliji, asocirana je sa hromtinom i funkcionie in cis (deluje samo na mestu sinteze) kao jednolanana RNK koja regrutuje TLS i modulie aktivnost CBP/p300, dovodei do represije transkripcije.

Slika 3. Duge nekodirajue RNK deluju kao kofaktori ili ligandi u regulaciji transkripcije. A) Evf2 ncRNK se tranksribuje sa intergenskog pojaivaa za gene DLX -5 i DLX-6. Evf2 ncRNK promovie aktivnost pojaivaa regrutovanjem proteina DLX -2. U sluaju naruene ekspresije Evf2, nema vezivanja DLX-2. B) CCDN1 ncRNK je prisutna u malom broju koija i indukuje s e oteenjima DNK i in cis regrutuje TLS, koji inhibira ekspresiju CCDN1 iRNK tako to inhibira histon acetil transferaznu aktivnost kompleksa CBP/p300. TLS regrutuje i hromtin-represivni kompleks PRC2. C) HOTAIR ncRNK se sintetie sa klastera HOXC na hromozomu 12, i in trans reprimira ekspresiju gena klastera HOXD regrutovanjem PRC2.

HOTAIR ncRNK kao korepresor koji in trans posreduje u modifikaciji histona HOX geni tokom razvia kontroliu anteriornoposteriornu osu i segmentalnu duplikaciju. U genomu oveka su organizovani u etri klastera, oznaena kao A, B, C i D , i smetena na 6

razliitim hromozomima. U okviru ova etri klastera HOX gena indentifikovane su, ak, 231 nove ncRNK, ija je ekspresija precizno regulisana tokom razvia. Jedna od njih je HOTAIR ncRNK. HOTAIR ncRNK je duga oko 2,2 kb i transkribuje se sa HOXC klastera, preferencijalno u posteriornim i distalnim mestima. HOTAIR ncRNK regrutuje represivni kompleks za modifikavciju histona (PRC2 koji uvodi H3K27 trimetilaciju) dovodei do represije transkripcije gena u HOXD klasteru. Dakle, HOTAIR ncRNK deluje in trans dovodei do represije transkripcije.

4.3.2. Duge ncRNK i metilacija DNK

Mnogi geni imaju antisense transkripte, koji omoguavaju RNK posredovanu epigenetiku regulaciju specifinu za dati gen. Ovakva epigenetika regulacija se esto ostvaruje metilacijom ili demetilacijom DNK. Pokazano je da mnogi tumor supresor geni imaju antisense transkripte koji dovode do utiavanje ekspresije svog sense, odnosno samog tumor supresor gena u malignim elijama. P15 je tumor supresor gen, veoma esto utian kod leukemija usled hipermetilacije. Antisense transkript gena P15 je ncRNK duine oko 200 nukleotida, oznaena kao P15AS. Suprotni obrasci ekspresije P15 i P15AS ukazuju da bi P15AS mogla da posreduje u epigenetikom utiavanju P15 gena u malognim elijama. Duge anrisense ncRNK mogu indukovati i demetilaciju DNK. Khps1 je duga antisense ncRNK koja se transkribuje sa regulatornog regiona za sense transkript Sphk1. Prekomerna ekspresija Khps1 ncRNK dovodi do demetilacije CpG koja korelie sa ekspresijom Sphk1.

4.3.3. Duge ncRNK moduliu vezivanje Pol II i optih transkripcionih faktora za promotor
Duge ncRNK mogu reprimirati transkripciju direktnim vezivanjem za Pol II, to interferira sa njenim kontaktima sa promotorom, ili mogu stimulisati transkripciju tako to otvaranjem hromatina poveavaju dostupnost Pol II i optim transkripcionim faktorima da se veu za promotor. SINE RNK in trans reprimiraju transkripciju direktnim vezivanjem za Pol II Ogroman broj dugih ncRNK se prepisuje sa SINE retrotranspozona, ukljuujui element Alu kod oveka, i elemente B1 i B2 kod mia. Alu i B2 ncRNK reprimiraju transkripciju gena kuepazitelja tokom toplotnog stresa. Efekat ostvaruju direktnim vezivanjem za Pol II, i to sa visokim afinitetom, tako da deluju in trans, slino proteinskim transkripcionim represorima. Alu ncRNK ima modularnu strukturu, slino modularnoj strukturi proteinskih transkripcionih represora. Smatra se da represivni domeni Alu ncRNK vezuju DNK vezivni kanal Pol II, spreavajui tako da Pol II formira odgovarajue kontakte sa DNK u promotoru. Na taj nain, Alu ncRNK spreava formiranje zatvorenog kompleksa transkripcije, uprkos injenici da Pol II ostaje u asocijaciji sa promotorom.

Fbp1+ nc RNK in cis aktiviraju transkripciju gena fbp1+ Ekspresija gena fbp1+ kod S. pombe indukuje se uslovima nedostatka glukoze. U takvim uslovima, a pre indukcije tranksripcije gena fbp1+, dolazi i do indukcije najmanje tri transkripta od nekoliko kb. Mesta poetka transkripcije ovih ncRNK nalaze se u regionu od -1,3 kb do -530 bp u odnosu na mesto poetka transkripcije gena fbp1+. U uslovima nedostatka glukoze, mesta vezivanja za Pol II u uzvodnom regionu gena fbp1+ se pomeraju i smeru 5'3', dovodei prvo do sinteze barem tri ncRNK, a zatim i fbp1+ iRNK. Uporedo dolazi i do promene strukture hromatina u tom regionu. Uvoenjem signala za terminaciju transkripcije izmeu mesta odakle se prepisuju ncRNK i elementa TATA gena fbp1+ i gajenjem elija u prisustvu glukoze, dolazi do: poremeaja transkripcije ncRNK (sinteza kratkih, okrenjenih ncRNK), poremeaja regrutovanja Pol II, ometanja remodelovanja hromatina nizovdno od uvedenih terminatora transkripcije, i najzad odsustvo transkripcije gena fbp1+ (uprkos prisustvu glukoze). Navedeno ukazuje da transkripcija ncRNK u uzvodnom regionu gena fbp1+, posredovana sa Pol II, verovatno dovodi do otvaranja hromatina, to poveava dostupnost Pol II i optim transkripcionim faktorima tako da se sintetie fbp1+ iRNK. Dakle, fbp1+ ncRNK kao in cis faktori reguliu ekspresiju specifinog gena (fbp1+), tako to utiu na aktivnost Pol II i optih transkripcionih faktora.

4.3.4. Duge ncRNK i transkripciona interferencija

Vie od 80% gena ima alterantivna mesta poetka transkripcije. Duge ncRNK prepisane sa alternativnih mesta poetka transkripcije mogu uticati na transkripciju susednih, nizvodnih gena tako to njihova transkripcija interferira sa vezivanjem optih transkripcionih faktora, na primer TBP-a, neophodnih za transkripciju susednog gena.

4.3.4. Duge ncRNK i reguliu aktivnost transkripcionih faktora

Familija nuklearnih faktora aktiviranih T elija (NFAT) reprimira se ncRNK oznaenom kao NRON (eng. noncoding represor of NFAT). NRON ncRNK ima tri splajs varijante, duine od 0,8 do 3,7 kb, odlikuju se tkivno specifinom ekspresijom i naroito su zastupljene u limfoidnom tkivu. Opisano je jedanaest proteina koji se vezuju za NRON ncRNK, ukljuujui importin i faktor ukljuene u transport izmeu nukleusa i citoplazme, zbog ega NRON ncRNK mogu uticati na transport NFAT izmeu citoplazme i nukleusa, moduliui elijsku lokalizaciju ovih proteina. Nije poznato da li je funkcija NRON ncRNK da reprimiraju nuklearni import NFAT ili stimuliu nuklearni eksport NFAT (iako je na slici prikazano da NRON ncRNK spreava nuklearnu lokalizaciju transkripcionog faktora NFAT).

4.4. Bioloke funkcije dugih ncRNK 4.4.1. Uloga ncRNK asociranih sa promotrom ili transkribovanih sa regiona uzvodno od promotora
Veliki broj ncRNK prepisuje se sa regiona koji se nalaze u blizini promotora i onesuoznaene kao ncRNK asocirane sa promotorom (eng. promoter associated ncRNAs). Broj opisanih ncRNK asociranih sa promotrima je sve vei u genomu oveka, ali i kod drugih vrsta. 8

One se nalaze pod preciznom kontrolom razliitim signalima. Manje stabilne ncRNK su one koje se prepisuju sa regiona koji je uzvodno u odnosu na promotor (eng. promoter upstream ncRNAs). Uloga ovih vrsta dugih ncRNK, regulacija transkripcije nizvodnih gena regrutovanjem kompleksa za promenu strukture proteina (na primer CCND1 ncRNK i Khps1 ncRNK) ili menjanjem strukture proteina usled sopstvene transkripcije (na rpimer, fbp1+ ncRNK).

Slika 4. Nekodirajue RNK ostvaruju aktivnost transripcionih regulatora korienjem veeg broja mehanizama. A) Antisense ncRNK sa tumor supresor gena (TSG) indukuje metilaciju DNK i represivnu metilaciju histona u promotorima TSG. B) NcRNK sintetisane sa alternat ivnih mesta poetka transkripcije (TSS) imaju aulogu aktivatora ili represor promotra susednog gena, tako to moduliu regrutovanje optih transkripcionih faktora ili Pol II. C) NEAT1 ncRNK se specifino eksprimira u parapegama i kolokalizije sa markerima parapega. Utiavanje NEAT1 RNK pomou siRNK dodovi do nestanka parapega, dok prekomerna ekspresija NEAT1 ncRNK poveava broj parapega. D) NRON ncRNK spreava nuklearnu lokalizaciju transkripcionog faktora NFAT.

4.4.2. Uloga ncRNK kao signalnih senzora

U skladu sa njihovom ulogom u regrutovanju specifinih komplksa, duge ncRNK slue kao senzori za razliite fizioloke signale i signale u razviu. Naveden je primer CCND1 ncRNK koja "osea" genotoksian stres elije i reprimira ekspresiju gena CCDN1, kao i HOTAIR ncRNK koja je senzor za signale tokom razvia koji reguliu anteriorno -postriornu osu i funkcionie tako to in trans reprimira transkripciju gena HOXD klastera. Ulogu senzora za signale tokom razvia imaju i ncRNK koje uestvuju u doznoj kompenzaciji i inaktivaciji X hromozoma kod sisara. RepA ncRNK sa Xist ncRNK ima ulogu senzora za signale tokom razvia na poetku inaktivacije X hromozoma. Tada RepA ncRNK regrutuje kompleks PRC2 na Xist ncRNK, to dovodi do inicijacije i irenja inakrivacije X hromozoma.

4.4.3. Potencijalna strukturna uloga u odravanju integritata nuklearnih organela

Analogno funkciji rRNK u formiranju i odravanju strukture ribozoma, duge ncRNK bi mogle imati funkciju u formiranju i odravanju integriteta nuklearnih organela (tela) kao to su nuklearne pege (eng. speckles) i nuklearne parapege (eng. paraspeckles). NEAT1 i NEAT2 su duge poliadenilovane ncRNK koje se transkribuju sa hromzoma 11 i lokalizovne su nukleusu. Visoko su konzervisane meu sisarima, ali meusobno nisu homologne. NEAT2 ncRNK koloklizuje sa markerima nuklarnih pega, dok NEAT1 ncRNK kolokalizuje sa proteinskim markerima nuklearnih parapega, koji uestvuju u transkripciji, splajsovanju pre-iRNK i nuklearnoj retenciji (PSP1, PSP2, PSF/PSFQ i p54/nrb). Reprimiranje NEAT1 ncRNK dovodi do dezorganizacije i nestanka nuklearnih parapega, dok prekomerna ekspresija NEAT1 ncRNK dovodi do poveanja broja nuklearnih parapega. Fleksibilnost molkekula RNK da stupa u interakciju sa serijom proteinskih kompleksa, kao i da se prua du velikih fizikih razdaljina, ukazuje na potencijalnu ulogu molekula RNK u regulaciji arhitekture nukleusa.

4.5. Duge ncRNK i dozna kompenzacija

Genetiko utiskivnje (eng. imprinting) je fenomen da sa neki geni eksprimiraju sa jednog od dva alela u zavisnosti od roditeljskog porekla. Imprintovani geni su obino grupisani u domenima i koordinisano su regulisani sa jednim (ili dva) kontrolna regiona za utiskivanje (eng. imprintng control region, ICR), i to in cis. Slino imprintovanim genima, inaktivacija X hromozoma, mehanizam dozne kompenzacije kod sisara, takoe je kontrolisan jednim kontrolnim regionom (X inaktivacionim centrom) in cis, a celi X hromozom, sa skoro vie od 1 000 gena za proteine, predstavlja domen koji se transkripciono utiava. Inaktivacija X hromozoma mora biti koordinisano kontrolisana kako bi obuhvatila gene samo jednog X hromozoma. Zajedniko za utiskivanje gena i inaktivaciju X hromozoma su kontrolni regioni koji ostvaruju dugotrajni epigenetiki efekat na hromatin i alelska priroda regulatornih procesa (inaktivacija samo jednog od dva alela, odnosno jednog od dva X hromozoma). Centralnu ulogu 10

u ovim regulatornim procesima imaju regulatorni molekuli RNK, koji slue kao platforma za regrutovanje proteina koji dovode do epigenetikih promena. Jo 1991. godine otkrivena je Xist RNK koja ima centralnu ulogu u inaktivaciji X hromozoma. Otkrie njene uloge je ukazalo da molekuli RNK imaju potencijal da reguliu epigenetike promene in cis. Danas je poznato da su duge ncRNK naroito povoljne za alelsku regulaciju imprintovanih gena, kao i za bilo koju in cis regulaciju specifinu za lokus.

4.5.1. Inaktivacija X hromozoma dozna kompenzacija

enke sisara imaju dva X hromozoma, dok mujaci imaju jedan X i jedan Y hromozom. Iako je ovakva kombinacija polinih hromozoma osnova za detrminaciju pola, ona predstavlja i problem: bilo koji gen sa X hromozoma bi mogao biti eksprimiran na dvostruko veem nivou kod enki u odnosu na mujake i neravnotea bi mogla imati ozbiljne posledice na metabolike i druge elijske procese. Problem doze se izbegava doznom kompenzacijom, koja se kod sisara postie inaktivacijom jednog X hromozoma kod enki. Dozna kompenzacija za posledicu ima transkripciono utiavanje svih gena na neaktivnom X hromozomu, tako da se geni sa X hromozoma eksprimiraju na jednakim nivoima kod mujaka i enki sisara. Inaktivacija se deava u ranom embrionalnom razviu na stadijumu od 32 do 64 elije, a izbor koji e se X hromozom inaktivirati je nasumian u nekim embrionalnim elijama se inaktivira X hromozom poreklom od oca, a u drugim X hromozom poreklom od majke. Jednom kada se u datoj eliji selektuje inaktivan X hromozom, ista kopija hromozoma ostaje neaktivana u svim njenim potomcima. Kao posledica nasumine inaktivacije jednog X hromozoma enke sisara su mozaici neke njihove elije esprimiraju gene sa majinog, a neke sa oevog X hromozoma. Ovo obino ima male posledice na fenotip, ali u sluaju X-vezanih bolesti kod ljudi moe uticati na teinu simptoma u zavisnosti kolika je proporcija elija u kojima se mutirani gen eksprimira. Oigledinij primer za mozainost enski sisara za X hromozom je trobojna (eng. calico ili tortoiseshall) maka. Kod make, jedan gen na X hromozomu odreuje boju krzna. On ima dva alela, od kojih jedan odreuje narandasto-braon boju krzna, a drugi crnu. Kod maki koje su heterozigoti za ovaj gen, razliiti obrasci narandasto-braon i crnih regiona krzna sastoje se iz elija u kojima su razliiti X hromozomi inaktivirani. Ova objanjava zato su sve trobojne make enke. Bela boja krzna je determinisana autozomnim genima.

4.5.2. "Izazovi" inaktivacije X hromozoma za eliju

Inaktivacija X hromzoma prua eliji brojne izazove, jer dva X hromozoma koja se nalaze u istom nukleusu tokom ranog razvia moraju biti potpuno suprotno tretirana. Prvi izazov je brojanje (eng. counting) hromozoma, koje podrazumeva odreivanje da li elija poseduje jedan X hromozom (XY) ili poseduje dva X hromozoma, u kojem sluaju jedan mora biti inaktiviran. Drugi izazov je sluajan izbor jednog X hromozoma koji se inaktivira (Xi) i jednog koji ostaje aktivan (Xa). Meusobno iskljuiva priroda Xi i Xa ukazuje da je pri sluajnoj inaktivaciji jednog X hromozoma neophodna in trans komunikacija izmeu dva X hromozoma, kako bi se izbegle letalne kombinacije za eliju, XiXi ili XaXa. Brojanje hromozoma i in trans komunikacija dva X hromozoma zahteva aktivnost dugih ncRNK.

11

Trei izazov je, da nakon odluke koji e se X hromozom inaktivirati, faktori za utiavanje budu regrutovani samo na budui neaktivan X hromozom, irei svoj efekat du hromozoma iskljuivo in cis. Inaktivacija poinje u regionu hromozoma veliine 10 do 500 kb, koji sadri najmanje sedam gena za duge ncRNK i naziva se X-inaktivacioni centar (Xic). Iz ovog centra inaktivacija se iri na celi hromozom, tako da inaktiviran X hrom ozom postaje obogaen markerima heterohromatina. Glavni "glasnik" regiona Xic je Xist RNK, koja informaciju o inaktivaciji iri du hromozoma i direktno je odgovorna za utiavanje ekspresije gena na inaktiviranom X hromozomu. Insercija regiona Xic na nekom autozomnom hromozomu dovodi do kompletnog utiavanja gena du tog autozomnog hromozoma. Dakle, duge ncRNK imaju kljunu ulogu u "saznanju" elije da ima dva X hrom ozoma, zatim u obezbeivanju da samo jedan, nasumino izabran, X hromozom bude inaktiviran, i najzad u samom procesu inaktivacije X hromozoma.

4.5.3. Duge ncRNK u X-inaktivacionom centru

Najmanje sedam dugih ncRNK je identifikovano u regionu Xic (slika 5), od kojih etri imaju vitalnu funkciju u inaktivaciji X hromozoma. Xist RNK je duga 17 kb i transkribuje se samo sa X hromozoma koji je selektovan za inaktivaciju. Akumuliranje Xist RNK in cis indukuje utiavanje celog X hromozoma vezivanjem i irenjem represivnog kompleksa PRC2 du X hromozoma. Sekvenca na 5'-kraju Xist RNK kodira relativno kratku RepA RNK duine 1,6 kb, koja direktno vezuje represivni kompleks PRC2 i regrutuje ga na region Xic. Na izgled paradoksalno, ovaj represivni kompleks aktivira ekspresiju Xist RNK, ime se inicira inaktivacija X hromozoma. Aktivnost RepA RNK i ekspresija Xist RNK se negativno kontrolie njihovim zajednikim antisense transkriptom, Tsix RNK, koja je dugaka oko 40 kb. Za inaktivaciju X hromozoma kljuan je ravnotean odnos Xist i Tsix RNK. U nediferenciranim embrionalnim elijama Tsix RNK se eksprimira sa oba X hromozoma, dok se Xist RNK eksprimira na ekstremno niskom bazalnom nivou. Na poetku diferncijacije elije, Tsix RNK ostaje aktivna samo na hromozomu koji je selektovan da bude aktivan X hromozom, to spreava ekspresiju Xist RNK. Suprotno, reprimiranje ekspresije Tsix RNK na X hromozomu selektovanom da bude inaktiviran, dovodi do masovne transkripcije Xist RNK (slika 6). Da li e se tokom diferncijacije elija transkribovati Tsix RNK kontrolisano je uzvodnim lokusom Xite, koji sadri razvojno regulisan pojaiva koji odrava ekspresiju Tsix RNK. Lokus Xite se takoe transkribuje dajui Xite RNK. etri ncRNK koje su kljune za doznu kompenzaciju X hromozoma imaju odnos Yin Yang, gde RepA i Xist RNK promoviu inaktivaciju X hromozoma, dok Tsix i Xite RNK blokiraju aktivnost RepA i Xist RNK. Interesantno je da se sa regiona Xic transkribuju i male nekodirajue RNK duine 21 do 42 nukleotida, nastale pre svega obradom Xist-Tsix dvolanane RNK. Njihova uloga je jo uvek nepoznata.

12

Slika 5. X-inaktivacioni centar, njegovi geni za ncRNK i njihova funkcija tokom inaktivacije X hromozoma : A) Vie od sedam ncRNK je opisano u X-inaktivacionom centru, a poznate su uloge Xist, RepA, Tsix i Xite. Oznaeni su regioni odgovorni za sparivanje X hromozoma, brojanje hromozoma i izbor za inaktivaciju, kao i za inicijaciju i irenje utiavanja. B) Koraci u inaktivaciji X hromozoma i poznati faktori koji ih reguliu.

Slika 6. Yin-Yang odnos izmeu Xist i Tsix RNK. U nedifernciranim elijama (pre-XCI elije), Tsix se eksprimira sa oba X hromozoma, dok se Xist eksprimira u niskom bazalnom nivou (oko 5 kopija). Kada pone diferencijacija elije, ekspresija Tsix ostaje samo na hromozomu koji je selektovan da ostane aktivan. Postojanje Tsix RNK je to koje sprava pojaanje ekspresije Xist na Xa. Suprotno, smanjena ekspresija Tsix na X hromozomu selektovanom da bude inaktiviran, omoguava jaku transaktivaciju Xist i irenje Xist RNK du X hromozoma, kako bi inicirala utiavanje celog hromozoma.

4.5.4. Mehanizam nasumine inaktivacije jednog X hromozoma (slika X)

1) U nedifernciranim embrionalnim elijama X hromozomi su epigenetiki ekvivalentni i oba eksprimiraju Tsix RNK na visokom nivou i Xist RNK na izuzetno niskom bazalnom nivou (oko 5 kopija). Lokusi Xite i Tsix sadre brojna vezivna mesta za protein Ctcf, koji je 13

transkripcioni aktivator oba lokusa. Protein Ctcf stupa u interakciju sa Oct4. Protein Oct4 je faktor pluripotentnosti i samnjenje nivoa ovog proteina direktno pokree diferencijaciju elije, brojanje i inaktivaciju X hromozoma. 2) Smanjenje nivoa Oct4 tokom diferncijacije elija pokree sparivanje dva X hromozoma, omoguavajui in trans komunikaciju dva X hromozoma tokom koje se vri brojanje X hromozoma i meusobno iskljuiv izbor za X hromozom koji ostaje aktivan i X hromozom koji se inaktivira. Sparivanje dva X hromozoma deava se samo u regionu Xic, i to u okviru 15 kb dugog regiona, koji obuhvata lokus Xite i 5'-kraj lokusa Tsix i to meusobnim intreakcijama proteina Ctcf, i Oct4. Pored direktne interakcije Oct4 sa regionom neophodnim za sparivanje dva X hromozoma, potrebna je i transkripciona aktivnost ovog regiona koja dovodi do sinteze Xite RNK i Tsix RNK. Smatra se da je prolazno sparivanje dva X hromozoma posredovano je kompleskima RNK-proteini. 3) In trans interakcija dva X hromozoma moe da generie fiziku razliku izmeu hromozoma, odnosno narui njihovu fiziku simetriju. Naime, proteini Ctcf i Oct4, i drugi transkripcioni aktivatori, koji su do tog trenutka bili nasumino rasporeeni na oba X hromozoma, pomeraju se sada samo na jedan X hromozom. S obzirom da taj hromozom zadrava transkripcione aktivatore, on ostaje aktivan X hromozom sa koga se Tsix RNK sada monoalelno eksprimira.

Slika 7. Mehanizam inaktivacije X hromzoma. Objanjenje u tekstu.

4) Gubitak transkripcionih aktivatora na buduem inaktivnom X hromozomu, i time gubitak ekspresije Tsix RNK, omoguava RepA RNK koja direktno regrutuje represivni kompleks PRC2 da taj kompleks smesti na 5'-kraj lokusa Xist (eng. polycomb repressive complex 2). Naime, U nediferenciranim embrionalnim elijama, RepA se transkribuje na oba X hromozoma i uporedo sa svojom transkripcijom vezuje kompleks PRC2, ali on usled transkripcije lokusa Tsix, ne moe da dovede do trimetilacije H3K27 na 5'-kraju lokusa Xist (Tsix je antisense transkript Xist RNK). Tokom diferncijacije elija, represija transkripcije lokusa Tsix na buduem inaktivnom X hromozomu dozvoljava RepA RNK da regrutovani PRC2 prebaci na 5'-kraj lokusa Xist. 5) Kompleks PRC2 dovodi do trimetilacije H3K27 na 5'-kraju lokusa Xist, dok se RepA RNK se degraduje. Naime, jedna od prvih promena koja prati represiju Tsix RNK na buduem 14

inaktivnom X hromozomu je trimetilacija H3K27 5'-kraja lokusa Xist pomou kompleksa PRC2, koji je tu regrutovan pomou RepA RNK. Ova aktivnost stvara hetrohromtin koji je neophodan za aktivaciju promotra lokusa Xist, njegove masivne transkripcije i akumulacije Xist RNK. 6) Xist RNK se iri du budueg inaktivnog X hromozoma, regrutuje PRC2, dovodei do brzog utiavanja celog hromozoma. Dakle, sama Xist RNK ne dovodi do utiavanja X hromozoma, ve ona regrutuje PRC2 kompleks i druge faktore koji modifikuju i kondenzuju hromatin. Jednom kada je dolo do inaktivacije hromozoma, Xist RNK vie nije potrebna. Modifikacije hromatina su te koje dovode do inaktivacije hromozoma i obezbeuju da se inaktivacija istog X hromozoma nasleuje u svim potomcima date elije nasleivanjem nastalih modifikacija hromtina. Opisani model inaktivacije X hromozoma predvia tri uloge ncRNK u inicijaciji utiavanja X hromozoma. 1) U nedifernciranim embrionalnim elijama i buduima aktivnim X hromozomima u difernciranim elijama visok nivo transkripcije lokusa Tsix spreava inaktivaciju X hromozoma interferirajui sa kompleksom RepA RNK-PRC2. 2) Reprimiranje transkipcije lokusa Tsix na buduem inaktivnom X hromozomu omoguava da RepA produktivno vezuje PRC2 usmeravajui aktivnost ovog kompleksa na promot or Xist, to dovodi do stvaranja hetrohromatina sa trimetilovanim H3K27, to 100 puta pojaava transkripciju lokusa Xist. 3) Xist RNK vezuje PRC2 koji iri teimetilaciju H3K27 du X hrom ozoma dovodei do utiavanja celog hromozoma. Ovakav model inaktivacije X hromozoma predvia da sprivanje dva X hromozoma generie asimetrinu ekspresiju Tsix RNK ("off" na buduem Xi i "on" Xa), koja je osnova za asimetrinu inaktivaciju X hromozoma. Kljuni aspekt ovog mehanizma je verovatno struktura hromatina u lokusima Xist i Tsix, koja je identina! Namee se pitanje zato su njihove ekspresije suprotne? Lokus Tsix je transkripciono aktivan u otvorenom hromtainu, dok je lokus Xist aktivan u zatvorenom hromtainu. Transkripciona aktivnost lokusa Xist u neaktivnom hromatinu je samo prividan paradoks ako se ima u vidu da lokus Xist mora da izbegne sopstvenu inaktivaciju koja nastaje njegovim irenjem represivnog hromtaina.

4.5.5. Dozna kompenzacija kod drugih organizama

Dozna kompenzacija je neophodna kod svih drugih ivotinja, ali se razlikuju mehanizmi kojima se ona postie. Na primer, dozna kompenzacija kod Drosophile postie se poveanjem ekspresije X-vezanih gena kod mujaka. Ovaj mehanizam, takoe, ukljuuje aktivnost dugih ncRNK, roX1 i roX2, koje u ovom sluaju, na X hromozomu mujaka, regrutuju komplekse za promenu strukture hromatina koje pomau u aktivaciji transkripcije.

15