GASTROENTEROHEPATOLOGI

I. EMPEDU
Empedu diproduksi oleh hati dan disimpan di dalam kandung empedu. Selama pencernaan, kandung empedu berkontraksi dan menyalurkan empedu ke usus kecil. Banyaknya empedu yang disalurkan tergantung dari : Jenis makanan, makin banyak makanan (lemak) maka makin banyak empedu Susunan empedu dalam hati Perangsangan empedu tergantung dua factor : Faktor makanan Factor hormonal Sebelum masuk ke usus kecil empedu bercampur dahulu dengan getah pancreas. Empedu bereaksi alkalis. Diantara bahan-bahan terpenting yang terdapat didalam empedu adalah garam-garam empedu (natrium glikokolat dan taurokolat), pigmen-pigmen empedu, lesitin, kolesterol dan garam-garam organic. Empedu merupakan campuran sekresi dan ekskresi. Bahan yang disekresi misalnya garam-garam empedu dan yang diekskresi adalah pigmen-pigmen empedu dan kolesterol. Garam-garam empedu membantu proses pencernaan dan penyerapan vitamin-vitamin yang larut dalam lemak. Aktivitas tadi disebabkan karena : 1. Garam empedu merendahkan tegangan permukaan dan membantu emulsifikasi lemak sehingga memudahkan pencernaan 2. Garam empedu berikatan dengan asam lemak membentuk suatu kompleks yang lebih mudah larut dan diserap Disamping mensekresikan zat yang disintesis oleh hepar sendiri, sel-sel hepar juga mengekskresikan sejumlah zat yang dibentuk ditempat lain di dalam tubuh. Diantaranya yang terpenting adalah bilirubin, yang merupakan salah satu produk akhir utama pemecahan haemoglobin. Dimana bila sel darah merah telah melewati masa hidupnya, rata-rata 120 hari, maka membran sel darah merah pecah dan melepaskan hemoglobin yang difagositosis oleh sel-sel retikuloendoteloial system di seluruh tubuh. Disini hemoglobin akan dipecah menjadi hem dan globin, lalu cincin hem cepat dikonversi menjadi bilirubin yang dilepaskan kedalam plasma atau disebut bilirubin I. Kemudian ada juga yang dikonjugasi oleh sel hepar menjadi bilirubin II yang dieksresikan oleh transpor aktif kedalam empedu. PERCOBAAN-PERCOBAAN EMPEDU 1. Sifat-sifat Fisis dan Reaksinya a. Catatlah warna, bau dan konsistensinya b. Tentukan pH-nya c. Tentukan Berat jenis dengan urinometer

41|Penuntun Praktikum Biokimia Biomedik 2 FK UNHAS 2012

2.

Percobaan Emulsi dengan Empedu a. Ke dalam tabung reaksi masukkan 1 ml minyak dan 10 ml air b. Kedalam tabung reaksi yang lain dimasukkan 1 ml minyak, 9 ml air dan 1 ml empedu. Kedua tabung reaksi ini dikocok kuat-kuat & tempatkanlah untuk beberapa lama dirak tabung reaksi. Perhatikanlah emulsi yang terjadi.

3.

Percobaan untuk Menyatakan Pigmen Empedu a. Gmellins test Kedalam tabung reaksi yang kering dimasukkan asam nitrat pekat (HNO 3) pekat kemudian dituangkan empedu sebanyak 2 ml secara hati-hati sehingga membentuk lapisan bawah. Pada batas antara kedua larutan itu akan terdapat suatu cincin berwarna biru, violet sampai merah. Ulangi percobaan ini dengan menggunakan empedu yang telah diencerkan.

b. Rosenbach Modification Gmallins Test Ambillah sepotong kertas saring dan basahilah dengan aquadest. Setelah itu, tetesi beberapa tetes empedu diatas kertas saring yang telah dibasahi. Kemudian ditetesi lagi dengan 1 2 tetes asam nitrat (HNO3) pekat. Perhatikanlah warna yang terjadi. c. Smiths Test Kedalam tabung reaksi dimasukkan empedu yang sudah diencerkan. Kemudian tetesi larutan iodium 0,5% dalam alcohol, sehingga membentuk lapisan atas. Perhatikan warna cincin yang terbentuk pada batas kedua lapisan tersebut. Reaksi Van den Berg

4.

Ke dalam tabung reaksi dimasukkan 1 ml empedu dan 10 ml air, lalu dicampur. Kemudian tambahkan 1 ml reagen diazo dari ehrlich yang segar. Perhatikan warna yang timbul. Reaksi ini adalah dasar penentuan bilirubin dengan serum. 5. Percobaan Menyatakan Garam Empedu (Pattenkoffers Test)

Ke dalam tabung reaksi dimasukkan 3 ml empedu yang telah diencerkan dan 5 tetes larutan sukrosa 5%. Tuangkan 2 ml asam sulfat pekat perlahan-lahan sehingga membentuk lapisan bawah. Perhatikan warna cincin yang terbentuk pada batas kedua larutan. Dasar reaksi adalah pembentukan furfural dari sukrosa. Reaksi mana lagi yang mempunyai dasar yang sama? Apa bedanya ? Jawab :

2 | Penuntun Praktikum Biokimia Biomedik 2 FK UNHAS 2012

II. PERCOBAAN BILIRUBIN (Metode Jendrassik dan Grot)

DASAR : Total bilirubin ditentukan oleh reaksi dengan Diazotized sulfanilic acid, dengan adanya larutan caffeine sehingga membentuk hasil akhir pigmentazo. Dengan reaksi yang sama tetapi tanpa caffeine dapat digunakan untuk menentukan bilirubin direct. Bilirubin bereaksi dengan Diazotized sulfanilic acid dan membentuk suatu zat warna yang berwarna merah dalam larutan netral dan biru dalam larutan alkali. Bilirubin glukoronides bisa larut dalam air bereaksi langsung (Direct), sedangkan bilirubin yang bebas hanya akan bereaksi bila ada akselerator (Indirect) REAGENS : 1. 2. 3. 4. 5. ALAT : Larutan sulfanic acid (29 mmol/l C8H7NO3S; 170 mmol/l HCl) Larutan sodium nitrit (29 mmol/l NaNO2) Akselerator (130 mmol/l caffeine; 156 mmol/l sodium benzoat; 460 mmol/l sodium asetat) Larutan Fehling II (930 mmol/l potassium sodium tartrat; 1,9 mmol/l larutan sodium hidroksida) NaCl 0,9 % Spektrofotometer, pipet tetes, pipet mikro dan tabung reaksi

CARA KERJA : Bilirubin direct Sample Blanko bilirubin 200 l 200 l 1 tetes 2 ml 2 ml 200 l 200 l Bilirubin total Sample 200 l 1 tetes 1 ml 200 l Blanko bilirubin 200 l 1 ml 200 l

Larutan sulfanic acid (1) Larutan sodium nitrat (2) Akselerator (3) NaCl 0,9% (5) Sample serum/plasma

Campurkanlah dengan segera. Untuk bilirubin direct inkubasi pada waktu yang tepat yaitu 5 menit dengan temperatur kamar, kemudian pindahkan kedalam kuvet dan ukur absorban sampel terhadap sampel blanko pada panjang gelombang 546 nm. Untuk Bilirubin total, inkubasi selama 10 menit pada temperatur ruang kemudian tambahkan masing-masing 1 ml larutan Fehling (4). Campurkan dan inkubasi selama 5 menit kemudian ukur absorban sampel terhadap blanko pada panjang gelombang 578 nm.

3 | Penuntun Praktikum Biokimia Biomedik 2 FK UNHAS 2012

PERHITUNGAN : Konsentrasi bilirubin direct = absorban x 14,4 mg/dl Konsentrasi bilirubin total = absorban x 10,8 mg/dl Konsentrasi bilirubin indirect = bilirubin total bilirubin direct NILAI NORMAL : Bilirubin direct sampai 0,3 mg/dl Bilirubin indirect sampai 1 mg/dl

4 | Penuntun Praktikum Biokimia Biomedik 2 FK UNHAS 2012

III. ALT (ALANIN TRANSAMINASE)

DASAR :
ALT

L-alanin + -Ketoglutarat
LDH

L-Glutamat + Piruvat L-laktat + NAD+

Piruvat + NADH+ + H+

Kecepatan penurunan kadar NADH diukur secara fotometrik dan berbanding lurus dengan aktivitas ALT dalam bahan sampel. REAGENSIA :
TRIS-HCl buffer pH 7,8 100 mM

ALAT-ALAT :

L-alanin 500 mM -Ketoglutarat 15 mM NADH 0,18 mM NaHCO3 10 mM LDH 1428 ukat/l Waterbath, pipet, tabung reaksi, spektrofotometer

CARA KERJA : Kedalam tabung reaksi, pipet 1 ml reagen ALT Inkubasi selama 1 5 menit pada suhu 37 oC (waterbath) Tambahkan 100 l sampel serum/plasma Dikocok kemudian diisap pada spektrofotometer (dengan panjang gelombang 340 nm) Hasil dibaca pada spektrofotometer dalam U/L

PERHITUNGAN : Konsentrasi ALT = abs x 1745 U/L NILAI NORMAL : (perempuan) = 9 36 U/L ( 39 U/L) (laki-laki) = 9 43 U/L ( 47 U/L)

12| Penuntun Praktikum Biokimia Biomedik 2 FK UNHAS 2012

IV. AST (ASPARTAST TRANSAMINASE)

DASAR :
AST

L-aspartat + 2-oksoglutarat
MDH

L-Glutamat + Oksaloasetat L-malat + NAD+

Oksaloasetat + NADH+ + H+

Kecepatan penurunan kadar NADH diukur secara spektrofotometri dan berbanding lurus dengan aktifitas AST dalam bahan sample REAGENS: ALAT-ALAT : CARA KERJA : Kedalam tabung reaksi, pipet 1 ml reagen AST Inkubasi selama 1 5 menit pada suhu 37 oC (waterbath) Tambahkan 100 l sampel serum/plasma Dikocok kemudian diisap pada spektrofotometer Hasil dibaca pada spektrofotometer dalam U/L TRIS-HCl buffer pH 7,8 80 Mm LDH 28 ukat/l L-Aspartat 240 mM NADH 0,18 mM 2-oksoglutarat 12 mM Waterbath, pipet, tabung reaksi, spektrofotometer - MDH 10 ukat/l - Na-azide 0,3% -

NILAI NORMAL : (perempuan) = 10 31 U/L ( 37 U/L) (laki-laki) = 10 34 U/L ( 31 U/L)

12| Penuntun Praktikum Biokimia Biomedik 2 FK UNHAS 2012

UROGENITALIA
I. SIFAT-SIFAT URIN VOLUME URIN Volume urin dalam 24 jam tergantung pada faktor fisiologik (misalnya intake cairan, suhu dan kerja fisik) dan faktor patologik (misalnya penyakit ginjal, diabetes mellitus dan sebagainya). Beberapa obat misalnya golongan diuretik, kopi, alkohol dapat pula mempengaruhi volume urin. Pada manusia, normalnya volume urin antara 600 2500 ml/24 jam. Kelainan-kelainan dalam volume urin : Poliuri Oligouri Anuri : bila volume urin > 2500 ml/24 jam : bila volume urin < 600 ml/24 jam : bila tidak terbentuk urin

Prinsip : untuk menentukan volume urin diperlukan urine yang dikumpulkan dalam 24 jam Percobaan : Urin hari pertama dibuang pada waktu yang telah ditentukan (misalnya jam 6 pagi). Semua urin mulai waktu itu sampai dengan waktu yang sama pada hari berikutnya dikumpulkan. Seluruh urin tersebut harus disimpan dalam keadaan dingin dengan toluen sebagai pengawet. BERAT JENIS URIN Berat jenis urin normal antara 1,003 1,030 tergantung pada jumlah zat-zat yang larut didalamnya dan volume urin. Jumlah total zat padat dalam urin 24 jam kira-kira 50 gram. Berat jenis urin berubah terutama pada penyakit ginjal. Prinsip : untuk menentukan berat jenis urin diperlukan alat hydrometer/urinometer. Urine yang digunakan adalah urine 24 jam. Percobaan : Tampung urin (sewaktu, pagi hari dan urin 24 jam) kedalam wadah yang telah disediakan Isilah sebuah tabung urinometer dengan urin tersebut diatas dan letakkan hidrometer didalamnya hingga urinometer pada posisi terapung. Hidrometer tidak boleh menyentuh dinding tabung. Catatlah

suhu urin tersebut dengan menggunakan termometer. Tiap-tiap urinometer telah ditera pada suhu tertentu. Bila suhu urin tidak sama dengan suhu tera, lakukanlah koreksi dengan cara tambahkan 0,001 pada angka yang dinyatakan hidrometer bagi tiap penambahan suhu 3 oC diatas suhu tera atau kurangi 0,001 pada angka yang dinyatakan hidrometer bagi tiap penambahan suhu 3 oC dibawah suhu tera. Kemudian bacalah skala pada meniskus bawah urin dan hitunglah dengan menggunakan rumus berikut : BJ urin sesungguhnya = BJ ukur +
(suhu urin suhu tera) x 0,001 3

Kalikan dua angka terakhir berat jenis urin sesungguhnya tersebut diatas dengan koefisien Long (2,6). Hasilnya diperoleh secara kasar jumlah zat padat total dalam 1 liter urin (gram)

PH URIN Urin dapat bersifat asam, netral atau basa dengan pH antara 4,7 8,0. Tetapi urin yang dikumpulkan selama 24 jam biasanya bersifat asam. Urin yang diambil pada waktu-waktu tertentu mempunyai pH yang berbeda-beda. Beberapa waktu setelah makan, urin akan bersifat netral bahkan alkalis. Ini disebut alkalin tide. Bila dibiarkan untuk waktu lama, urin dapat mengalami ammoniacal fermentation atau acid fermentation. Hal ini disebabkan oleh bakteri dan pH urin menjadi basa. Prinsip : pH urin ditentukan dengan indikator universal, urine yang digunakan adalah urine 24 jam Percobaan : Celupkan secarik strip indikator universal ke dalam urin sewaktu dan 24 jam kemudian bacalah pH urin tersebut.

BAU, WARNA DAN KEKERUHAN Urin yang baru dikeluarkan mempunyai bau khas. Bila urin mengalami dekomposisi, timbul bau amonia yang tidak enak. Pada penderita diabetes mellitus dengan ketosis maka urin akan berbau aseton. Warna urin berbeda-beda sesuai dengan kepekatannya, tetapi dalam keadaan normal urin berwarna kuning muda. Warna terutama disebabkan oleh pigmen urokrom yang berwarna kuning & sejumlah kecil oleh urobilin & hematoporfirin.

27| Penuntun Praktikum Biokimia Biomedik 2 FK UNHAS 2012

Dalam keadaan demam karena pemekatan, warna urin berubah menjadi kuning tua atau agak coklat. Pada penyakit hati, pigmen empedu dapat menyebabkan urin menjadi hijau, coklat atau kuning tua. Darah/hemoglobin menyebabkan warna urin merah, sedangkan methemoglobin atau asam hemogentisat menyebabkan warna urin coklat tua. Urin normal biasanya jernih pada waktu dikeluarkan, tetapi bila dibiarkan dalam waktu lama akan timbul kekeruhan disebabkan oleh nukleoprotein, mukoid atau sel-sel epitel. Selain itu pada urin yang alkalis, kekeruhan dapat disebabkan oleh endapan fosfat sedangkan pada urin asam biasanya disebabkan oleh endapan urat. PERCOBAAN : jam. Catatlah bau, warna dan kekeruhan urin sewaktu, pagi hari dan urin 24

II.

ZAT-ZAT FISIOLOGIK URIN

KLORIDA Klorida merupakan zat padat yang jumlahnya terbanyak kedua setelah urea dalam urin. ekskresi melalui urin utamanya dalam bentuk NaCl sekitar 10 15 gr/24 jam tergantung intake. Dengan menentukan jumlah klorida maka kita dapat menentukan jumlah NaCl yang diekresikan melalui urin. ekskresinya menurun pada perspirasi berlebihan, retensi natrium, radang ginjal menahun, diare dan sebagainya. Sedangkan pada insufisiensi korteks adrenal, ekskresinya akan bertambah. PERCOBAAN : Siapkan sebuah tabung reaksi bersih dan kering. Masukkan 5 ml urin kedalam tabung reaksi tersebut. Tambahkan beberapa tetes HNO3 encer (4 tetes) dan beberapa tetes AgNO3 2% (4 tetes). Perhatikan apa yang terjadi, endapan putih yang terbentuk adalah perak klorida yang larut dalam amonia. Catat dan gambar.

BELERANG

27| Penuntun Praktikum Biokimia Biomedik 2 FK UNHAS 2012

Dalam keadaan normal, 1 gram belerang dikeluarkan dalam 24 jam. Belerang adalah zat sisa metabolisme asam amino yang mengandung S, tiosulfat, tiosianat, sulfida dan sebagainya. Belerang yang diekskresi terdapat dalam 2 bentuk yakni : belerang yang tak teroksidasi (belerang netral) belerang yang teroksidasi (oxidized sulfur) sulfat anorganik sulfat eterial

Belerang teroksidasi ada 2 bentuk yaitu : Sulfat anorganik adalah bagian terbesar dari belerang teroksidasi. Sedangkan sulfat eterial yang terpenting dalam urin adalah indikan. Indikan merupakan zat yang berasal dari pembusukan triptofan dalam usus atau ditempat lain dalam tubuh. Jumlah indikan yang diekskresi dalam urin kira-kira 10 20 mg/24 jam. Ekskresi indikan meninggi pada beberapa keadaan seperti stagnasi usus, pembusukan dalam usus meningkat dan pada pemecahan protein jaringan atau protein cairan tubuh (abses, gangren, emfisema dan sebagainya). PERCOBAAN : 1. Sulfat Anorganik Siapkan sebuah tabung reaksi bersih & kering. Masukkan 10 ml urin kemudian tambahkan 1 ml HCl encer dan 1 ml BaCl2 setelah itu kocok. Terbentuknya endapan putih menunjukkan BaSO4 yang terbentuk Belerang yang tak-teroksidasi Dasar : Dengan adanya katalisator Zn, belerang yang terdapat dalam urin bereaksi dengan HCl encer menghasilkan gas H2S, yang baunya sangat khas dimana gas ini dapat diidentifikasi dengan menghitamnya kertas saring yang telah direndam dengan Pb asetat membntuk PbS (endapan hitam) 3. Siapkan sebuah tabung reaksi bersih & kering. Masukkan 10 ml urin lalu masukkan sebutir Zn & sedikit HCl encer Tutup tabung tersebut dengan kertas saring yang dibasahi dengan Pb-asetat. Kertas saring akan tampak berwarna hitam Indikan (tes obermeyer)

2.

27| Penuntun Praktikum Biokimia Biomedik 2 FK UNHAS 2012

Tujuan : memeriksa adanya indikan (potassium indoksil sulfat) dalam urine Dasar : pereaksi obermeyer (FeCl3 dalam HCl pekat) akan mengoksidasi gugus indoksil membentuk warna biru indigo yang larut dalam kloroform

Masukkan 5 ml urin kedalam tabung reaksi bersih dan kering. Tambahkan sejumlah pereaksi obermeyer (5 ml), biarkan beberapa menit Lalu tambahkan 3 ml kloroform. Campur dengan membolak-balikkannya kira-kira 10 kali. Jangan mengocoknya! Kloroform akan mengekstraksi biru indigo yang terbentuk. Warna biru akan lebih nyata bila cairan diatas ekstrak kloroform dibuang dan ditambah dengan air

FOSFAT Pada umumnya jumlah ekskresi fosfat melalui urin kira-kira 1,1 gram/24 jam. Sebagian besar dalam bentuk fosfat anorganik dan hanya 1 4 % dalam bentuk fosfat organik. Jumlah fosfat meningkat pada beberapa penyakit, misalnya hiperparatiroidisme, pada beberapa penyakit tulang seperti osteomalasia, ricketsia dan sebagainya. Sedangkan ekskresi fosfat menurun pada hipoparatiroidisme, penyakit ginjal, kehamilan dan lain-lain. PERCOBAAN : Siapkan sebuah tabung reaksi bersih dan kering lalu masukkan 5 ml urin. Tambahkan 1 ml larutan urea 10% dan 10 ml pereaksi molibdat spesial Campur dan tambahkan 1 ml larutan ferosulfat spesial. Warna biru yang terbentuk menunjukkan adanya fosfat.

AMONIA Amonia merupakan hasil akhir metabolisme protein yang mengandung N. Ini merupakan kedua yang terpenting setelah urea. Dalam urin, amonia terdapat dalam bentuk garam amonium dan jumlahnya kirakira 0,7 gram/24 jam atau 2,5 4,5 % dari nitrogen total/24 jam. PERCOBAAN : Siapkan sebuah tabung reaksi bersih dan kering. Masukkan larutan natrium hidroksida (NaOH) pada beberapa ml urin (2 ml) sehingga reaksinya alkalis (caranya dengan melihat perubahan warna dari kertas lakmus, jika kertas lakmus berubah menjadi biru hentikan penambahan NaOH)

27| Penuntun Praktikum Biokimia Biomedik 2 FK UNHAS 2012

III. UREA

Panaskan, perhatikan bau yang timbul dan uji uap yang terbentuk dengan kertas lakmus yang dibasahi. SISA-SISA METABOLISME

Urea merupakan komponen terbanyak zat padat dalam urin. urea merupakan sisa metabolisme asam amino. Biosintesis urea dari asam amino terjadi dalam 4 tahap, yaitu : (1) Transaminasi, (2) Deaminasi oksidatif, (3) Pengangkutan amonia, dan (4)Reaksi pada siklus urea.

Kebanyakan urea dibentuk di dalam hati dan pada penyakit hati berat, nitrogen urea darah (BUN) turun dan NH3 darah meninggi. Enzim yang terlibat dalam sintesis urea adalah ornitin karbamoiltransferase. Defisiensi enzim ini akan menyebabkan keracunan NH 3 (kongenital), sekalipun orang-orang yang heterozigot untuk defisiensi ini. Ekskresi urea dalam urin jumlahnya sangat dipengaruhi oleh 3 hal yakni intake makanan berprotein tinggi, metabolisme protein dalam tubuh dan kemampuan ginjal dalam filtrasi dan reabsorpsi urea. Pada penderita gagal ginjal dimana terjadi gangguan pada filtrasi urea akan menyebabkan terjadinya peninggian urea dalam darah yang disebut uremia. ASAM URAT Asam urat dibentuk dari pemecahan purin dan dengan sintesis langsung dari 5-fosforibosil pirofosfat (5PRPP) dan glutamin. Kadar asam urat darah normal pada manusia adalah sekitar 4 mg/dl (0,24 mmol/l). Pada manusia asam urat diekskresi melalui urin, tetapi pada mamalia yang lain asam urat dioksidasi menjadi allantoin sebelum diekskresi. Ekskresi asam urat melalui urin jumlahnya dipengaruhi olehh intake makanan sehingga kurang tepat dalam mengekspresikan laju filtrasi glomerulus. Dalam urin, asam urat dapat membentuk kristal yang mengendap dan menyebabkan batu ginjal. Peningkatan asam urat dalam darah (hiperurisemia) dan urin terjadi pada peningkatan intake makanan kaya purin yang meningkat pada penderita anemia hemolitik dan kanker dan penderita penyakit sendi. Hiperurisemia juga terjadi pada penderita gagal ginjal.

27| Penuntun Praktikum Biokimia Biomedik 2 FK UNHAS 2012

KREATININ Kreatinin disintesis didalam hati dari asam amino methionin, glisin dan arginin. Dalam otot rangka, kreatinin difosforilasi menjadi fosforil kreatinin yang merupakan simpanan energi penting untuk sintesis ATP. Kreatinin di dalam urine dibentuk dari fosforilkreatinin. Kreatinin tidak dikonversi secara langsung menjadi kreatinin. Kecepatan ekskresi kreatinin relatif konstan setiap hari, jumlahnya tidak dipengaruhi oleh intake makanan dan tidak direabsorpsi oleh ginjal. Hal ini memungkinkan ekskresi kreatinin menunjukkan kemampuan laju filtrasi glomerolus yang dinyatakan sebagai kreatinin klirens. TUJUAN 1. 2. Mengetahui metode pemeriksaan sisa-sisa metabolisme, yaitu urea, asam urat dan kreatinin Menginterpretasi hasil pemeriksaan sisa metabolisme dalam urin

PERCOBAAN SISA-SISA METABOLISME 1. PENENTUAN KADAR UREA (METODE BERTHELOT)

DASAR : Urea dihidrolisis oleh adanya air dan urease menjadi amonia dan karbondioksida. Dalam reaksi berthelot ion amonium bereaksi dengan hipoklorit dan salisilat untuk membentuk zat warna yang dihasilkan (turunan indophenol) dapat diperkuat dengan menambahkan sejumlah kecil natrium nitroprussid. Intensitas warna sebanding dengan kadar urea diukur secara fotometrik. REAKSI :
urease

Urea + H2O 2NH4+ + CO322NH4+ + salisilat + hipoklorit Metode 1 : Reagensia :

turunan indofenol

a. Reagens warna (fosfat buffer pH = 6,8 20 mM;sodium salisilat 61 mM;sodium nitroprussid 3,4 mM;EDTA-Na2 1,34 mM; urease 23 U/ml; stabilizer) b. Standar urea 40 mg/dl dan Larutan hypoklorit c. Sample serum/urin pengenceran 50 kali 27| Penuntun Praktikum Biokimia Biomedik 2 FK UNHAS 2012

ALAT-ALAT : CARA KERJA : -

Spektrofotometer, kuvet, waterbath, pipet dan tabung reaksi

Siapkan 3 buah tabung reaksi bersih dan kering. Beri label pada setiap tabung dengan : Masukkan kedalam tabung Reagen warna Sampel serum/urine yg sdh diencerkan 50 kali (1 dlm 49) Standar urea Sampel 1 ml 10 l Standa r 1 ml 10 l Blanko 1 ml -

Campurkan segera, kemudian inkubasikan dalam waterbath selama 3 menit pada suhu 37 C/selama 5 menit pada suhu 20-25 oC Larutan hypoklorit 1 ml 1 ml 1 ml

Campurkan segera, kemudian biarkan selama 5 menit pada suhu 37 oC atau selama 10 menit pada suhu 20-25 oC Baca absorbansi sampel pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 578 nm (range panjang gelombang 570 600 nm) Sampel serum/plasma, kadar urea = Sampel urine, kadar urea =
Absorban sampel 40 mg/dl Absorban standar

PERHITUNGAN :

Absorban sampel 2 g/dl Absorban standar

Fp = 50, jadi kadar urea urine = abs x fp x [standar] = abs x [(50 x 40 mg/dl) / 1000 g/dl] NILAI NORMAL : Sampel serum/plasma, kadar urea = 10 50 mg/dl Sampel urine, kadar urea = 20 35 g/24 jam

Metode 2 : REAGENS : a. suspensi urease 3,5 KU/l nitroprussid) b. standar urea 40 mg/dl NaOH) c. reagen fenol(150 mmol/liter fenol; 0,47 mmol/liter natrium d. larutan hipoklorit (13 mmol/liter NaOCl; 130 mmol/liter

27| Penuntun Praktikum Biokimia Biomedik 2 FK UNHAS 2012

CARA KERJA : Siapkan 3 buah tabung reaksi bersih dan kering. Beri label pada setiap tabung dengan : Masukkan kedalam tabung Suspensi urease Reagen fenol salisilat Sampel serum Standar urea Sampel 100 l 1 ml 10 l Standar 100 l 1 ml 10 l Blanko 100 l 1 ml -

Campurkan segera, kemudian inkubasikan dalam waterbath selama 15 menit pada suhu 37 oC Larutan hypoklorit 1 ml 1 ml 1 ml

Campurkan segera, kemudian biarkan pada suhu ruang selama 15 menit pada suhu 37 oC. Baca absorbansi sampel pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 620 nm

2. PENENTUAN KADAR ASAM URAT (METODE ENZIMATIK URIKASE PAP)

DASAR : Asam urat diubah secara kuantitatif oleh uricase sehingga menghasilkan hidrogen peroksida. Dengan adanya enzim peroksidase, H2O2 akan mengoksidasi 3,5-dikloro-2-hidroksi benzena sulfanic acid (DCHBS) dan 4-aminoantipyrin membentuk zat warna merah derivat quinoneimin. Intensitas warna yang terjadi sebanding dengan konsentrasi asam urat REAKSI :
Uricase

Asam urat + H2O + O2

POD

Allantoin + CO2 + H2O2

zat warna merah (turunan quinoneimin) + 4 H2O

2H2O2 + 4-aminoantipyrin +3,5-dikloro-2-hidroksi sulphonat

REAGENS : a. Reagens warna (Buffer pH=7 120 mM; 3,5-dikloro-2-hidroksi benzena sulfanic acid (DCHBS) 3,5 mM; 4-aminoantipyrin 0,4 mM; EDTA Na2.H2O 0,9 mM; K3Fe(CN)6 0,1 mM; Uricase 120 U/L; Peroksidase 350 U/L; Ascorbat-oksidase 7000 U/L; Stabilizers tidak reaktif) Standar asam urat 8 mg/dl Spektrofotometer, kuvet, pipet, waterbath dan tabung reaksi

b.

ALAT-ALAT : CARA KERJA : -

Siapkan 3 buah tabung reaksi bersih dan kering. Beri label pada masing-masing tabung reaksi dengan :

27| Penuntun Praktikum Biokimia Biomedik 2 FK UNHAS 2012

Masukkan kedalam tabung Reagens warna Standar asam urat Sampel serum/urine yang sudah diencerkan 1:10 (larutkan 1 ml urine dalam 10 ml aquadest) -

Sampel 1 ml 20 l

Standa r 1 ml 20 l -

Blanko 1 ml -

Campurkan segera, biarkan pada suhu ruang selama 5 menit pada suhu 37 oC atau 10 menit pada suhu ruangan Baca absorbans pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 510 nm Atau Masukkan kedalam tabung Sampel Standa r Reagens warna 2 ml 2 ml Standar asam urat 40 l Sampel serum/urine yang sudah diencerkan 1:10 40 l (larutkan 1 ml urine dalam 10 ml aquadest) Blanko 2 ml -

Campurkan segera, biarkan pada suhu ruang selama 15 menit pada suhu 37 C. Baca absorbans pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 510 nm
Absorban sampel 8 mg/dl Absorban standar

PERHITUNGAN : Kadar asam urat serum = Kadar asam urat urin =

Absorban sampel 88 mg/dl fp Absorban standar

Dalam hal ini, fp = faktor pengenceran = 11, Jadi, 88 = fp x 8 NILAI NORMAL : Asam urat serum = laki-laki = 3,4 7 mg/dl Perempuan = 2,4 5,7 mg/dl

Asam urat urin = 250 750 mg/24 jam

3.

PENENTUAN KADAR KREATININ (METODE JAFFE TANPA DEPROTEINISASI

27| Penuntun Praktikum Biokimia Biomedik 2 FK UNHAS 2012

Kreatinin (anhidrida kreatin) banyak terdapat dalam jaringan otot. Kreatin fosfat merupakan cadangan ikatan fosfat berenergi tinggi dalam otot. Kreatinin terutama dibentuk didalam otot dan diekskresi melalui ginjal. Ekskresi kreatinin pada seseorang dalam 24 jam dari hari ke hari tetap dan berhubungan dengan berat badan orang itu. DASAR : Kreatinin dengan asam pikrat dalam suasana alkali bereaksi membentuk suatu senyawa kompleks berwarna kuning orange. Intensitas warna yang dihasilkan sebanding dengan kadar kreatinin diukur secara fotometrik. REAGENS :
1. mol/l Asam pikrat 0,035 2. Natrium hidroksida 0,32 mol/l 3. mg/dl Standar kreatinin 2

27| Penuntun Praktikum Biokimia Biomedik 2 FK UNHAS 2012

ALAT-ALAT : Spektrofotometer, pipet, tabung reaksi, stopwatch CARA KERJA : Sebelumnya buatlah larutan pikrat alkali sesuai dengan kebutuhan, dengan mencampur reagens 1 dan 2 dengan perbandingan 1 : 1 (tahan selama 6 jam pada temperatur kamar dalam botol berwarna gelap). Siapkan 2 buah tabung reaksi bersih dan kering. Beri tanda pada tabung reaksi : Tambahkan kedalam tabung Larutan pikrat alkali Sampel serum/urine yang diencerkan 1:49 Standar Sampel 2 ml 200 l Standar 2 ml 200 l

Campurkan baik-baik dan biarkan selama 30 detik pada temperatur kamar. Kemudian ukur absorbansinya. Diamkan selama 2 menit. Ukurlah kembali absorbansi sampel dan standar terhadap blanko (aquadest) pada panjang gelombang 492 nm
Asp 2 Asp 1 2 mg/dl Ast 2 Ast 1

PERHITUNGAN : Kadar kreatinin =

Kadar kreatinin urine = Kreatinin klirens =

Asp2 - Asp1 100 mg/dl Ast 2 - Ast1

kreatinin urin 1440 kreatinin serum 24

Keterangan : Asp1 = absorbansi sampel pada waktu 30 detik Asp2 = absorbansi sampel pada waktu 2 menit Ast1 = Absorbansi standar pada waktu 30 detik Ast2 = absorbansi standar pada waktu 2 menit Dimana, fp = faktor pengenceran = 50. Jadi, 100 = fp x 2 NILAI NORMAL : Serum = Laki-laki Perempuan Urin = Laki-laki Perempuan (< 50 tahun) = < 1,3 mg/dl = < 1,1 mg/dl = 20 26 mg/kg BB/24 jam = 14 22 mg/kg BB/24 jam (> 50 tahun) = < 1,4 mg/dl

I.

ZAT-ZAT PATOLOGIK DALAM URIN

43| Penuntun Praktikum Biokimia Biomedik 2 FK UNHAS 2012

GLUKOSA Pada keadaan normal, tidak lebih dari 1 gram glukosa diekskresi dalam 24 jam. bila kadar glukosa dalam urin tinggi disebut glukosuria. Pada keadaan fisiologik, glukosuria dapat terjadi setelah makan banyak karbohidrat (alimentary glukosuria). Sedangkan, pada keadaan patologik glukosuria dapat disebabkan: Ambang ginjal untuk glukosa menurun. Pada keadaan ini, gula darah dalam batas-batas normal. Hal ini terjadi pada beberapa kelainan ginjal dan disebut renal diabetes. Gangguan metabolisme karbohidrat. Ini menyebabkan kadar glukosa darah meningkat sehingga ambang ginjal dilampaui dan glukosa dikeluarkan kedalam urin. misalnya, terdapat pada penyakit diabetes mellitus, hipopituitarisme dan hiperadrenalisme. TUJUAN : memeriksa kadar gula dalam urine secara semikuantitatif DASAR : dalam suasana alkalis ion kupri akan direduksi menjadi kuprooksida oleh gula yang memiliki gugus aldehide atau keton bebas. Kuprooksida yang terbentuk bersifat tidak larut dan berwarna merah. Banyaknya endapan merah yang terbentuk sebanding dengan kadar gula yang terdapat dalam urine. PERCOBAAN : Siapkan sebuah tabung reaksi bersih & kering. Masukkan 2,5 ml pereaksi benedict & campurlah dengan 4 tetes urin Panaskan selama 5 menit pada penangas air mendidih atau didihkan diatas api kecil selama 1 menit. Biarkanlah menjadi dingin perlahan-lahan

INTERPRETASI : Warna Biru/hijau keruh Hijau/kuning hijau Kuning/kuning kehijauan Jingga Merah bata Penilaian 0 + ++ +++ ++++ Kadar <0,5 g% 0,5 1 g% 1 2 g% > 2 g%

ZAT-ZAT KETON 43| Penuntun Praktikum Biokimia Biomedik 2 FK UNHAS 2012

Yang termasuk zat-zat keton ialah asam asetoasetat, -hidroksibutirat dan aseton. Zat-zat ini merupakan zat antara pada pemecahan asam lemak didalam hati dan selanjutnya mengalami pemecahan pada jaringan ekstrahepatik. Pada beberapa keadaan patologik, terjadi penimbunan zat-zat keton dalam darah (ketonemia) dan dikeluarkan melalui urin dalam jumlah besar (ketonuria). Keadaan ini disebut ketosis. PERCOBAAN : Siapkan sebuah tabung reaksi bersih dan kering. Masukkan 5 ml urin kedalamnya Bubuhkan kristal amonium sulfat sampai jenuh (penambahan diteruskan sedikit demi sedikit, jika dikocok kristal amonium sulfat tidak larut lagi maka hentikan penambahan) Tambahkan 23 tetes Na-nitroprussid 5% dan 1 2 ml amonium hidroksida pekat. Campur dan biarkan selama setengah jam. Terbentuknya warna ungu menyatakan adanya zat-zat keton.

PROTEIN Dalam keadaan normal, tidak lebih dari 30 200 mg protein diekskresi dalam 24 jam. yang dimaksud dengan proteinuria ialah terdapatnya protein dalam jumlah yang abnormal dalam urin. urin normal tidak memberi hasil positif dengan tes-tes terhadap protein yang biasa dikerjakan. PERCOBAAN : Siapkan sebuah tabung reaksi bersih dan kering. Masukkan 2 ml urin kedalamnya dan tambahkan 4 tetes larutan asam sulfosalisilat 10%. Kekeruhan atau presipitat menyatakan adanya albumin atau globulin, presipitat akan bertambah pada pemanasan.

DARAH Bila dalam urin terdapat darah, keadaan ini disebut hematuria atau hemoglobinuria. Hematuria terjadi karena darah masuk kedalam urin, misalnya pada radang atau kerusakan ginjal dan saluran kemih. Sedangkan hemoglobinuria terjadi karena hemolisis sehingga hemoblin dibebaskan. Ini dapat terjadi pada penyakit malaria, reaksi transfusi atau kongenital. Darah dapat kita periksa secara mikroskopis atau kimia. Secara kimia yaitu dengan tes yang kita kenal sebagai benzidin test/orthotoluidine test atau dapat pula dengan menggunakan tes guaiak. CARA KERJA : a. Tes guaiak : Siapkan tabung reaksi kosong dan bersih. Pipetkan 2 ml urin kedalamnya dan 3 ml reagen guaiak 1% dalam alkohol. Tambahkan 1 ml H2O2 3%. Warna merah yang terbentuk menunjukkan hasil tes positif Siapkan tabung reaksi kosong dan bersih. Pipetkan 2 ml urin yang telah dimasak (diatas penangas air mendidih) kedalam tabung reaksi, dinginkan. Kemudian tambahkan 1 ml reagen guaiak 1%

43| Penuntun Praktikum Biokimia Biomedik 2 FK UNHAS 2012

dalam alkohol dan 1 ml H2O2 3%. Warna merah yang terbentuk menunjukkan hasil tes positif dan catat perbedaannya b. Tes orthotoluidin/benzidin: Siapkan tabung reaksi kosong dan bersih. Pipetkan 1 ml urin kedalam tabung reaksi. Kemudian tambahkan 1 ml reagen orthotoluidin 1% dalam asam asetat glasial dan 1 ml H2O2 3%. Warna biru kehijauan yang terbentuk menunjukkan hasil tes positif

BILIRUBIN Bilirubin normalnya tidak terdapat dalam urin. pada keadaan-keadaan patologik seperti hepatitis dan batu empedu maka bilirubin akan meninggi kadarnya didalam darah dan kemudian diekskresikan melalui urin. PERCOBAAN : Siapkan tabung reaksi bersih dan kering. Masukkan 5 ml urin dan 3 ml BaCl2 10%. Campur kemudian saring Bentangkan kertas saring tersebut diatas corong biarkan hingga kering. Teteskan 2 3 tetes reagen fouchet diatas kertas saring berisi endapan tersebut. Terbentuknya warna hijau menandakan bilirubin positif

A.

PERCOBAAN PROTEIN

43| Penuntun Praktikum Biokimia Biomedik 2 FK UNHAS 2012

1. TOTAL PROTEIN (Metode Biuret) DASAR : Protein dengan ion tembaga dalam larutan alkalis menghasilkan senyawa kompleks yang berwarna ungu, intensitas warna sebanding dengan kadar protein, diukur secara fotometrik. REAGENS :
1. Reagensia Biuret (K.Na Tartrat 20 mmol/liter; KI 1 mmol/liter; CuSO 4 12 mmol/liter; NaOH 200 mmol/liter)

2.

Larutan standar (6 gr/dl)

CARA KERJA : Siapkan 3 buah tabung reaksi bersih dan kering. Beri tanda/label pada masing-masing tabung reaksi yang dipakai : Masukkan kedalam tabung Serum Larutan standar Reagens warna Sample 50 ul 2,5 ml Standar 50 ul 2,5 ml Blanko 2,5 ml

Campurkan baik-baik dan biarkan selama 30 menit pada temperature kamar. Sesudah 30 menit ukurlah absorbans sample dan standar terhadap blanko pada panjang gelombang 545 nm
Absorban sampel 6 g/dl Absorban standar

PERHITUNGAN : Kadar Total Protein = NILAI NORMAL : 6,6 8,7 gr/dl

2. ALBUMIN (Metode Bromcresol Green) DASAR : Albumin dengan Bromcresol Green pada pH 4,3 membentuk kompleks warna, intensitas warna sebanding dengan kadar albumin, diukur secara fotometrik.

REAGENSIA : 1. Reagens warna buffer pH 4,3

43| Penuntun Praktikum Biokimia Biomedik 2 FK UNHAS 2012

2.

Sodium succinat buffer 454 mmol/l Bromcresol Green 0,95 mmol/l Standar albumin 5 gr/dl Spektrofotometer, pipet, tabung reaksi

ALAT-ALAT : CARA KERJA : -

Siapkan 3 buah tabung reaksi bersih dan kering. Beri tanda/label pada masing-masing tabung Masukkan kedalam tabung Reagens warna Sample plasma/serum Larutan standar dengan : Sample 3 ml 10 l Standar 3 ml 10 l Blanko 3 ml -

Kocok baik-baik isi tabung. Inkubasi pada temperature kamar selama 10 menit. Kemudian ukur absorbans sample dan standar terhadap blanko pada panjang gelombang 620 nm.

43| Penuntun Praktikum Biokimia Biomedik 2 FK UNHAS 2012

PERHITUNGAN :

Kadar albumin =

Absorban sampel 5 g/dl Absorban standar

NILAI NORMAL :

Albumin = 3,5 5,5 gram/dl Globulin = 1,5 3,5 gram/dl Rasio A/G = 1,2:1