Phng php thc nghim dng nh tn cc loi vi khun

Vietsciences-Nguyn Ln Dng

- inh Thy Hng 26/04/2006

Chng trnh Vi sinh vt

2.3.

Nhu cu v O2 v CO2

Cn c vo nhu cu i vi xy, vi khun c thnh cc nhm hiu kh, k kh, k kh khng bt buc v vi hiu kh.

2.3.1. Nhu cu i vi xy Vi khun hot ho cy vo mi trng dch th thch hp. t cc iu kin: - khng kh cha 5% CO2 v 10% O2 - khng kh bnh thng. Theo di s pht trin ca vi khun.

2.3.2. Tnh k kh ca vi khun sinh bo t Chun b mi trng thch k kh: Casein thy phn NaCl Na-mercaptoacetat Na-formaldehyd sulfoxylate Thch Nc ct 20 g 5g 2g 1g 15 g 1000 ml.

Cy vi khun theo kiu chch su 1 vng que cy (ng knh 1,5 mm) vo mi trng ni trn. Nui 30 0C, kim tra kt qu sau 3 ngy v 7 ngy. Nu vi khun mc pha trn l thuc loi hiu kh; nu mc dc ng cy l k kh khng bt buc; nu ch mc bn di l k kh bt buc.

2.4.

Kh nng ng ha cc ngun carbon Mi trng khong c bn (g/l):

(NH4)2SO4 MgSO4.7H2O NaH2PO4.H2O CaCl2.2H2O K2HPO4 Nc ct

2g 0,2 g 0,5 g 0,1 g 0,5 g 1000 ml

Ngun carbon (ng, polysaccarid, ru, axit bo, axit amin, axit hu c, hydroxy axit (alcohol axit, dicarboxylic axit) c kh trng qua mng lc. B sung ngun carbon vo mi trng khong c bn (ng v ru nng 0,51%, cc loi khc nng 0,1-0,2%), chia mi trng vo cc ng nghim tit trng. Cy vi khun vo mi trng, s dng 3 ng nghim i vi mi loi ngun carbon. Theo di s pht trin nh gi kh nng ng ha ngun carbon.

Cch khc l chun b mi trng khong c s c thch v a Petri. Vi khun c cy dn u trn a bng que gt. Ngun carbon dng tinh th c a ln a (khong bng ht go) cho khuych tn dn ra xung quanh. Nu vi khun ng ha c ngun carbon no s mc thnh vng xung quanh ch c t ngun carbon .

Cc ngun carbon thng c dng trong th nghim: ng 5C Arabinoza, Riboza, Xyloza, Fucoza, Rhamnoza ng 6C Glucoza hay Dextroza, Mannoza, Sorboza, Fructoza hay Levuloza, Galactoza ng kp Saccharoza hay Sucroza-ng knh, Maltoza, Sorboza, Lactoza, Trehaloza, Cellobioza, Melibioza ng tam ng a Ru bc 3 Ru bc 4 Ru bc 5 Ru bc 6 Raffinoza, Melizitoza Tinh bt (Starch), Dextrin, Inulin, Glycogen Glycerol Erythritol Adonitol, Arabitol, Xylitol Mannitol, Sorbitol, Dulcitol Inozitol

Ru bc 6 mch vng Glucoside

Salicin, Coniferrin, Aesculin, Arbutyl, Amygdalin, alpha-Methylglucosid

2.5.

Kh nng ng ha cc ngun nit Mi trng c s: KH2PO4 CaCl2 NaHPO4. MgSO4.7H2O FeSO4.7H2O Glucoza Nc ct 1,36 g 5 ml 2,13 g 0,2 g 0,5 ml 10 g 1000 ml

Glucoza c th c thay th bng ngun carbon thch hp khc nh Citrat, Acetat, Mannit vi nng 0,2-0,5%. Cc ngun nit khc nhau (mui ammon, mui nitrat) c a vo mi trng vi nng 0,05-0,1%. i chng l mi trng hon ton khng b sung ngun nit. Chnh pH ti 7,0-7,2. Chia mi trng vo cc ng nghim (4-5 ml/ ng), kh trng 112 0C trong 20-30 pht. Cy vi khun hot ho 18-24 gi (3 ng cho mi loi ngun nit). t nhit thch hp trong 3 ngy v 7 ngy. So snh s pht trin vi i chng (o c ca dch t bo) xc nh kh nng ng ha ngun nit.

2.6.

Kh nng sinh sc t hunh quang Mi trng lm ng thch nghing: Pepton Glyxerin K2HPO4 MgSO4.7H2O Thch Nc ct pH = 7,2. Kh trng 121 0C trong 20 pht, t thch nghing. Cy vi khun hot ha 24 gi ln mt thch, a vo t m v theo di sau 1, 3, 5 ngy. Quan st ng nghim di n t ngoi xem c sn sinh sc t hunh quang hay khng? 20 g 10 g 1,5 g 1,5 g 15 g 1000 ml

2.7.

Tnh mn cm i vi cht khng khun

Chun b mi trng thch a thch ng vi tng loi vi khun. Cy gt vi khun ln mt thch a (c th trn vi khun vo mi trng thch lm ngui ti 50 0C ri a). t ln mt thch cc khoanh giy (t ch hoc mua sn) tm cht khng khun cc nng khc nhau. Nui trong t m 30 0C trong 24-48 gi. Quan st cc vng v khun to thnh xung quanh cc khoanh giy cha cht khng khun. Vng v khun cng ln tc l vi khun cng mn cm.

Hnh 2.2.

Vng v khun to thnh quanh cc khoanh giy thm cht khng khun.

2.8.

ng ha Malonat

Mi trng dch th: 1g 2g

Cao men (NH4)2SO4

K2HPO4 KH2PO4 Natri malonat

0,6 g 0,4 g 3g 0,025 cg 1000ml

Bromophenol blue (BPB) Nc ct pH= 7,0-7,4

Chia mi trng vo ng nghim, kh trng 121 0C trong 15 pht. i chng l mi trng khng c Natri-malonat.

Cy vi khun hot ha, t nhit thch hp trong 1-2 ngy. Quan st s i mu ca mi trng: nu chuyn mu t lc sang lam l c ng ha malonat (dng tnh), nu khng l m tnh.

Hnh 2.3.

S i mu ca mi trng khi vi khun ng ho malonat.

2.9.

Xt nghim ng ha Citrat

Mc ch: phn bit cc nhm vi khun ng rut da trn kh nng ng ho citrat. Mi trng Simmons:

NaCl MgSO4.7H2O NH4H2PO4 K2HPO4.3H2O Natri xitrat BPB 1% trong nc Thch ( ra nc) Nc ct

5g 0,2 g 1g 1g 2g 10 ml 12 g 990 ml.

un tan thch, chnh pH n 7,0, thm ch th mu BPB v phn vo ng nghim lm thch nghing. Kh trng 121 0C trong 15 pht. Cy vi khun vo ng thch, t nhit thch hp trong 3-7 ngy. Mi trng bin mu t lam sang o tc l vi khun c kh nng ng ha citrat (dng tnh). Vi cc loi Bacillus cn s dng mi trng sau: NaCl MgSO4.7H2O NH4H2PO4 Natri xitrat Nc ct phenol (Phenol red) 0,04% 0,5 g 2g 1000 ml 20 ml. 1g 0,2 g

2.10.

Nhu cu mui v tnh chu mui Chun b mi trng dch th thch hp i vi tng loi vi khun.

B sung NaCl cc nng 2, 5, 7, 10%, mi trng cn trong sut. Cy vi khun hot ha, trong 3-7 ngy. Theo di mc sinh trng ca vi khun (mi trng khng cy vi khun lm i chng).

2.11.

Kh nng ng ha Tartrat Mi trng dch th kim tra: Pepton NaCl Nc ct BPB (0,2%) Kali tartrat Chnh pH = 7,4. Phn mi trng vo ng nghim, kh trng 115 0C trong 20 pht, nn dng ngay. Nu mi trng qu 14 ngy th cn kh trng li bng un cch thy 10 pht. Cy vi khun vo mi trng, hng ngy theo di s i mu. Sau 14 ngy thm mt lng dung dch ch acetat bo ha trung tnh bng th tch mi trng (vol/vol). i chng l mi trng khng cy vi khun. Nu c chuyn sang mu lc vng v c t ch acetat kt ta l c kh nng ng ha tartrat (dng tnh). Nu mu vng hay mu lc v c nhiu ch acetat kt ta l xt nghim m tnh. Phn ng ny dng phn bit Salmonella zava (dng tnh) v Salmonella paratyphi B (m tnh). 10 g 5g 1000 ml 12,5 ml 10 g

2.12.

Kh nng sinh trng vi KCN

KCN c tc dng c ch Escherichia coli nhng khng c ch Citrobacter freundi, v th thng c dng phn bit 2 loi ny. Mi trng c s: Pepton NaCl KH2PO4 K2HPO4 Nc ct pH = 7,6. Kh trng 115 0C trong 20 pht. mi trng vo t lnh cho ngui n 4 0C, thm 15ml dung dch KCN 0,5%, phn vo mi ng nghim 1ml (thao tc v trng); c th bo qun c trong 2 tun. Mi trng i chng khng thm dung dch KCN. Cy vi khun t mi hot ho (24 gi) vo cc mi trng chun b trn, t nhit thch hp trong 4 ngy v quan st s chuyn mu ca mi trng. Nu mi trng chuyn mu l sinh trng dng tnh ( Citrobacter freundii), nu mi trng vn khng mu l sinh trng m tnh (Escherichia coli). 3g 5g 0,22 g 5,64 g 1000 ml.

3. 3.1.

CC C IM SINH HA: Xt nghim oxidaza Mc ch: phn bit cc nhm vi khun da trn hot tnh cytochrom oxidaza Pha dung dch Tetramethyl-p-phenylen diamin dihydrochlorid (TPPDD) 1% trong nc, bo qun trong l mu ti 4 C, s dng trong 2 tun. t mt ming giy lc trong np hp Petri sch, nh dung dch TPPDD 1% ln trn ming giy lc sao cho va m, khng qu t. Dng que cy c u que lm bng si platin hay dng a thy tinh (khng dng u que cy bng si kim loi st, niken...) ly mt t vi khun hot ho (18-24 gi) bi ln ming giy lc.

Sau 10 giy nu vi khun chuyn sang mu hng tc l c oxydaza dng tnh; nu sau 60 giy mi chuyn mu l oxydaza m tnh. Ch : nu dung dch t chuyn sang mu hng ri th khng c s dng. Nu giy lc qu t s cn tr khun lc tip xc vi khng kh nn chuyn mu chm, to nn m tnh gi.

3.2.

Xt nghim catalaza Mc ch: kim tra kh nng phn hu H2O2 ca vi sinh vt nh sn sinh ra enzyme catalaza. Chun b dung dch H2O2 nng 3-10%, nh mt git ln phin knh. Dng u que cy platin ly mt t vi khun mi hot ho (24 gi) trn vo git H2O2 trn phin knh. Nu thy si bt l dng tnh, khng si bt l m tnh. C th nh trc tip dung dch H 2O2 ln khun lc trn thch a cng cho kt qu tng t.

Hnh 3.1. 3.3.

Phn ng si bt khi tip xc vi dung dch H2O2 ca vi khun c catalaza dng tnh. Kh nng ln men/xy ha glucoza

C th dng mt trong hai mi trng sau lm th nghim Mi trng I: Pepton NaCl 2g 5g