LAPORAN TETAP PRAKTIKUM BIOKIMIA

I. II. III. Nomor Percobaan : I Nama Percobaan : Reaksi Uji Terhadap Asam Amino

Tujuan Percobaan : Untuk mengidentifikasi atau menguji gugus fungsi yang terdapat dalam suatu asam amino melalui reaksi dengan reagen Millon, Hopkins-Cole, dan Ninhidrin

IV.

Dasar Teori Protein adalah makromolekul yang paling berlimpah di dalam sel hidup

dan merupakan 50% atau lebih berat kering sel. Protein ditemukan didalam semua sel dan semua bagian sel. Protein juga amat bervariasi; ratusan jenis yang berbeda dapat ditemukan dalam satu sel. (Lehninger Kunci struktur ribuan protein yang berbeda-beda adalah gugus pada molekul unit pembangun protein yang relative sederhana. Semua protein, baik yang berasal dari bakteri yang paling tua atau yang berasal dari bentuk kehidupan tertinggi, dibangun dari rangkaian dasar yang sama dari 20 asam amino yang berikatan kovalen dalam urutan yang khas. Karena masing-masing asam amino mempunyai rantai samping yang khusus, yang memberikan sifat kimia masingmasing individu, kelompok 20 molekul unit pembangun ini dapat dianggap sebagai abjad struktur protein. (Lehninger, 1982) Asam amino adalah senyawa dan amina organik yang (biasanya -NH2).

memiliki gugus fungsional karboksil (-COOH)

Dalam biokimia seringkali pengertiannya dipersempit: keduanya terikat pada satu atom karbon yang sama (disebut atom C "alfa" atau ). Gugus karboksil memberikan sifat asam dan gugus amina memberikan sifat basa. Dalam bentuk larutan, asam amino bersifat amfoterik: cenderung menjadi asam pada larutan basa dan menjadi basa pada larutan asam. Perilaku ini terjadi karena asam amino mampu menjadi zwitter-ion. Asam amino termasuk golongan senyawa yang 1

paling banyak

dipelajari

karena

salah

satu

fungsinya

sangat

penting

dalam organisme, yaitu sebagai penyusun protein. Struktur asam amino secara umum adalah satu atom C yang mengikat empat gugus: gugus amina (NH2), gugus karboksil (COOH), atom hidrogen (H), dan satu gugus sisa (R, dari residue) atau disebut juga gugus atau rantai samping yang membedakan satu asam amino dengan asam amino lainnya. Gambar Struktur asam -amino, dengan gugus amina di sebelah kiri dan gugus karboksil di sebelah kanan

Atom C pusat tersebut dinamai atom C ("C-alfa") sesuai dengan penamaan senyawa bergugus karboksil, yaitu atom C yang berikatan langsung dengan gugus karboksil. Oleh karena gugus amina juga terikat pada atom C ini, senyawa tersebut merupakan asam -amino. Asam amino biasanya diklasifikasikan berdasarkan sifat kimia rantai samping tersebut menjadi empat kelompok. Rantai samping dapat membuat asam amino bersifat asam lemah, basa lemah, hidrofilik jika polar, dan hidrofobik jika nonpolar. Asam amino dalam bentuk tidak terion (kiri) dan dalam bentuk zwitterion.

Karena asam amino memiliki gugus aktif amina dan karboksil sekaligus, zat ini dapat dianggap sebagai sekaligus asam dan basa (walaupun pH alaminya biasanya dipengaruhi oleh gugus-R yang dimiliki). Pada pH tertentu yang disebut titik isolistrik, gugus amina pada asam amino menjadi bermuatan positif (terprotonasi, NH3+), sedangkan gugus karboksilnya menjadi bermuatan negatif

(terdeprotonasi, COO-). Titik isolistrik ini spesifik bergantung pada jenis asam aminonya. Dalam keadaan demikian, asam amino tersebut dikatakan

berbentuk zwitter-ion. Zwitter-ion dapat diekstrak dari larutan asam amino sebagai struktur kristal putih yang bertitik lebur tinggi karena sifat dipolarnya. Kebanyakan asam amino bebas berada dalam bentuk zwitter-ion pada pH netral maupun pH fisiologis yang dekat netral. Menurut Lehninger (1982), Asam amino dapat digolongkan berdasarkan gugus R. Terdapat empat golongan asam amino: (1) golongan dengan gugus R nonpolar atau hidrofobik, (2) golongan dengan gugus R polar, tetapi tidak bermuatan, (3) golongan dengan gugus R bermuatan negatif, dan (4) golongan dengan gugus R bermuatan positif. 1. Golongan dengan gugus R nonpolar atau hidrofobik Gugus R dalam golongan asam amino ini merupakan hidrokarbon, dan bersifat hidrofobik. Meliputi lima asam amino dengan gugus R alifatik (alanin, valin, leusin, isoleusin, dan prolin), dua dengan lingkaran aromatic (fenilalanin dan triptofan), dan satu yang mengandung sulfur (metionin). 2. Golongan dengan gugus R polar tidak bermuatan Gugus R dari asam amino polar lebih larut di dalam air, atau lebih hidrofilik, dibandingkan dengan asam amino nonpolar, karena golongan ini mengandung gugus fungsionil yang membentuk ikatan hydrogen dengan air. Meliputi: glisin, serin, treonin, sistein, tirosin, asparagin, dan glutamine. 3. Golongan dengan gugus R bermuatan negative Mengandung gugus R dengan muatan total negative pada pH 7 adalah asam aspartat dan asam glutamate, masing-masing mempunyai tambahan gugus karboksil. Asam amino ini merupakan senyawa induk asparagin dan glutamine berturut-turut. 4. Golongan dengan gugus R bermuatan positif Asam amino yang mengandung gugus R dengan muatan total positif pada pH 7 adalah lisin, yang mengandung tambahan gugus amino (kedua) pada posisi di rantai alifatiknya; arginin, yang mengandung gugus guanidine bermuatan positif; dan histidin yang mengandung gugus inidazol yang mengion sedikit.

Uji asam amino dapat dilakukan melalui reaksi dengan reagen Millon, Hopkins-Cole, dan Ninhidrin. 1. Uji Millon Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat. Apabila pereaksi ini ditambahkan ke dalam larutan protein yang mengandung asam amino dengan rantai samping gugus fenolik, akan menghasilkan endapan putih yang dapat berubah menjadi merah oleh pemanasan. Tetapi khusus untuk proteosa dan pepton secara langsung akan menghasilkan larutan berwarna merah. Endapan yang terbentuk berupa garam kompleks dari tirosin yang ternitrasi. Jika larutan protein yang dianalisis ada dalam sussana basa, maka terlebih dahulu harus dinetralisasi dengan asam, karena dalam basa ion merkuri dalam pereaksi akan mengendap sebagai Hg(OH)2. Pada penetralan ini digunakan asam selain HCl, karena ion Cl- dapat bereaksi dengan asam nitrat menghasilkan radikal klor (Cl.). Radikal klor dapat merusak kompleks berwarna. Pada dasarnya reaksi ini positif untuk fenol-fenol, karena terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksi fenil yang berwarna. Protein yang mengandung tirosin akan memberikan hasil yang positif. 2. Uji Hopkins-Cole Reagen Hopkins-Cole mengandung asam glioksilat (HOOC-CHO). Jika reagen ini ditambahkan ke dalam larutan senyawa yang mengandung cincin indol dan ditambah larutan asam sulfat pekat, maka akan terbentuk cincin ungu pada interfase kedua cairan tersebut. Karena triptofan merupakan satusatunya asam amino yang mengandung cincin indol, maka uji ini dipakai untuk identifikasi asam amino triptofan dan protein yang mengandung asam amino triptofan. Cincin ungu yang tampak pada bidang batas antara kedua cairan adalah hasil kondensasi ttiptofan dengan gugus aldehida dari asam glioksilat dalam suasana asam pekat. 3. Uji Ninhidrin Ninhidrin beraksi dengan asam amino bebas da protein menghasilkan warna ungu. Reaksi ini termasuk yang paling umum dilakukan untuk analisis kualitatif protein dan produk hasil hidrolisisnya. Reaksi ninhidrin dapat pula

dilakukan terhadap urin untuk mengetahui adanya asam amino atau untuk mengetahui adanya pelepasan protein oleh cairan tubuh. Apabila ninhidrin (triketohidrin) dipanaskan bersama asam amino, maka akan terbentuk kompleks berwarna ungu. Kompleks berwarna ungu dihasilkan dari reaksi ninhdrin dengan hasil reduksinya, yaitu hidrindantin dan amonia. Asam amino dapat ditentukan secara kuantitatif dengan jalan mengamati intensitas warna yang terbentuk sebanding dengan konsentrasi asam amino tersebut. Pada reaksi ini, dilepaskan CO2 dan NH4 sehingga asam amino asam amino dapat ditentukan secara kuantitatif dengan mengukur jumlah CO2 dan NH3 yang dilepaskan. Prolin dan hidroksi prolin menghasilkan kompleks yang berbeda warnanya dengan asam amino lainya. Kompleks berwarna yang terbentuk mengandung dua molekul ninhidrin yang bereaksi dengan amonia yang dilepaskan pada oksidasi asam amino.

V.

Alat dan Bahan Alat: Bahan: 1. Reagen Millon 2. Reagen Hopkins-Cole 3. Reagen Ninhidrin 0,1% 4. H2SO4 pekat 5. Larutan Alanin 6. Larutan Valin 7. Larutan Glisin 8. Larutan Albumin 9. Larutan Triptofan 10. Larutan Tirosin 11. Larutan Asam glutamat 12. Larutan Glutamin 13. Larutan Arginin 14. Larutan Prolin

1. pipet tetes 2. gelas ukur 3. beker gelas 4. bunsen 5. tabung reaksi 6. rak tabung reaksi 7. penjepit tabung

VI.

Prosedur

1. Uji Millon Tambahkan 5 tetes reagen Millon ke dalam 3 ml larutan protein, panaskan campuran baik-baik. Jika reagen yang digunakan terlalu banyak, maka warna akan hilang pada pemanasan 2. Uji Hopkins-Cole Ke dalam 2 ml larutan protein, tambahkan 2 ml reagen Hopkins-Cole. Tambahkan sedikit demi sedikit kira-kira sebanyak 5 ml H2SO4 pekat melalui sisi tabung. Amati warna yang terbentuk pada pertemuan kedua cairan. Jika perlu putar perlahan-lahan tabung tersebut sampai terbentuk cincin berwarna. 3. Uji Ninhidrin Tambahkan 0,5 ml larutan Ninhidrin 0,1% ke dalam 3 ml larutan protein. Panaskan hingga mendidih.

VII.
No Uji

Hasil Pengamatan
Perlakuan Hasil Pengamatan

Uji Millon

Reagen Millon + Alanin Reagen Millon + Valin Reagen Millon + Glisin Reagen Millon + Albumin Reagen Millon + triptofan Reagen Millon + Tirosin Reagen Millon + Asam Glutamat Reagen Millon +

larutan berwarna bening tetap bening larutan berwarna bening tetap bening larutan berwarna bening tetap bening larutan berwarna bening endapan merah bata larutan berwarna coklat keruh terdapat endapan coklat larutan berwarna bening endapan merah bata larutan berwarna bening tetap bening larutan berwarna bening

larutan

larutan

larutan

terdapat

terdapat

larutan

larutan 6

Glutamin Reagen Millon + Arginin Reagen Millon + Prolin 2 Uji HopkinsCole Reagen Hopkins-Cole + Alanin Reagen Hopkins-Cole + Valin Reagen Hopkins-Cole + Glisin Reagen Hopkins-Cole + Albumin

tetap bening larutan berwarna bening tetap bening larutan berwarna bening tetap bening larutan berwarna bening + H2SO4 pekat larutan berwarna bening kecoklatan larutan berwarna bening + H2SO4 pekat larutan berwarna bening kecoklatan larutan berwarna bening + H2SO4 pekat larutan berwarna bening kecoklatan larutan berwarna bening + H2SO4 pekat terbentuk cincin ungu pada pertemuan kedua cairan larutan larutan

Reagen Hopkins-Cole + Triptofan

larutan berwarna bening + H2SO4 pekat terbentuk cincin ungu pada pertemuan kedua cairan

Reagen Hopkins-Cole + Tirosin Reagen Hopkins-Cole + Asam Glutamat Reagen Hopkins-Cole + Glutamin Reagen Hopkins-Cole + Arginin Reagen Hopkins-Cole + Prolin 3 Uji Reagen Ninhidrin +

larutan berwarna bening + H2SO4 pekat larutan berwarna bening kecoklatan larutan berwarna bening + H2SO4 pekat larutan berwarna bening kecoklatan larutan berwarna bening + H2SO4 pekat larutan berwarna bening kecoklatan larutan berwarna bening + H2SO4 pekat larutan berwarna bening kecoklatan larutan berwarna bening + H2SO4 pekat larutan berwarna bening kecoklatan larutan berwarna bening berwarna ungu larutan berwarna bening berwarna ungu 7 larutan larutan

Ninhidrin Alanin Reagen Ninhidrin + Valin

Reagen Ninhidrin + Glisin Reagen Ninhidrin + Albumin Reagen Ninhidrin + Triptofan Reagen Ninhidrin + Tirosin Reagen Ninhidrin + Asam Glutamat Reagen Ninhidrin + Glutamin Reagen Ninhidrin + Arginin Reagen Ninhidrin + Prolin

larutan berwarna bening berwarna ungu larutan berwarna bening berwarna ungu larutan berwarna bening berwarna ungu larutan berwarna bening berwarna ungu larutan berwarna bening berwarna ungu larutan berwarna bening berwarna ungu larutan berwarna bening berwarna ungu larutan berwarna bening berwarna kuning

larutan

larutan

larutan

larutan

larutan

larutan

larutan

larutan

VIII.

Persamaan Reaksi
Uji MILLON

HO O OH H N H tyrosin O OH Hg HO N H
+ +

Hg

NO 2

mercuri

berw arna merah bata

Uji Hopkins-Cole
O OH NH tryptofan OH NH2

COOI COO-

NH2 CH3 cicin ungu

Uji Ninhidrin

IX.

Pembahasan Pada reaksi uji asam amino ini dilakukan tiga buah pengujian, yaitu uji

Millon, uji Hopkins-Cole, dan uji Ninhidrin. Uji-uji ini dilakukan untuk mengidentifikasi asam amino yang reaktif terhadap reagen-reagen tersebut. dalam pengujian ini digunakan berbagai larutan asam amino dan protein albumin. Uji yang pertama yaitu uji Millon. Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat. Apabila pereaksi ini ditambahkan ke dalam larutan protein yang mengandung asam amino dengan rantai samping gugus fenolik atau hidroksifenil, maka akan menghasilkan endapan merah bata oleh pemanasan. Dari hasil percobaan, didapatkan bahwa tirosin dan albumin memberikan uji positif terhadap reagen Millon. Hal ini dikarenakan tirosin memiliki gugus hidroksifenil pada strukturnya. Sedangkan pada protein albumin, didapatkan uji positif karena di dalam protein albumin terkandung beberapa asam amino, diantaranya tirosin, sehingga albumin juga mengandung gugus

10

hidroksifenil pada strukturnya. Endapan yang terbentuk berupa garam kompleks dari tirosin yang ternitrasi. Pada dasarnya reaksi ini positif untuk fenol-fenol, karena terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksi fenil yang berwarna. Prinsip dari uji millon adalah pembentukan garam merkuri dari tirosin yang ternitrasi. Uji ini spesifik untuk protein yang mengandung asam amino yang memiliki gugus hidroksifenil. Reaksi ini didasari bahwa bila suatu protein ditambahkan garam merkuri, maka akan terjadi koagulasi. Protein dapat terkoagulasi karena protein mengalami destruksi bentuk tiga dimensi dari rantai polipeptida yang ikatannya akan pecah tanpa mengakibatkan pemecahan ikatan kovalen dari ikatan peptidanya. Tetapi pada larutan triptofan, larutan yang dihasilkan berwarna coklat keruh dengan endapan coklat, hal ini dikarenakan triptofan mengandung gugus indol. Uji yang kedua adalah uji Hopkins-Cole. Reagen Hopkins-Cole mengandung asam glioksilat (HOOC-CHO). Jika reagen ini ditambahkan ke dalam larutan senyawa yang mengandung cincin indol dan ditambah larutan asam sulfat pekat, maka akan terbentuk cincin ungu pada interfase kedua cairan tersebut. Dari hasil pengamatan yang didapat, reaksi positif terjadi pada triptofan dan albumin. Cincin ungu yang tampak pada bidang batas antara kedua cairan adalah hasil kondensasi triptofan dengan gugus aldehida dari asam glioksilat dalam suasana asam pekat. Untuk protein albumin, didapatkan uji positif karena pada albumin terkandung beberapa asam amino, diantaranya triptofan. Sehingga dapat disimpulkan bahwa uji Hopkins-Cole ini spesifik untuk asam amino triptofan, yang mana triptofan mengandung gugus indol, dan semua protein yang mengandung triptofan. Uji yang terakhir adalah uji Ninhidrin. Protein dan asam amino yang mengandung amino bebas dan sedikitnya satu gugus karboksil akan menghasilkan reaksi spesifik dengan reagen Ninhidrin. Apabila ninhidrin (triketohidrin) dipanaskan bersama asam amino, maka akan terbentuk kompleks berwarna ungu. Kompleks berwarna ungu dihasilkan dari reaksi ninhdrin dengan hasil reduksinya, yaitu hidrindantin dan ammonia. Dari hasil percobaan yang didapat, protein albumin dan semua asam amino yang digunakan kecuali prolin

11

menghasilkan reaksi spesifik terhadap reagen Ninhidrin. Asam-asam amino tersebut antara lain alanin, valin, glisin, triptofan, tirosin, asam glutamat, glutamin, dan arginin. Asam-asam amino tersebut mengandung satu gugus karboksil dan amino bebas bebas pada strukturnya. Untuk protein albumin, dihasilkan uji positif karena albumin mengandung asam-asam amino yang memiliki gugus karboksil dan amino bebas. Sedangkan pada prolin, didapatkan uji negatif atau tidak spesifik karena prolin tidak memilik amino bebas pada strukturnya.

X.

Kesimpulan 1. Protein dan asam amino akan menunjukkan uji positif pada Uji Millon bila mengandung gugus hidroksifenil. 2. Pada uji Millon, uji asam amino pada suatu sampel bertanda positif ditunjukkan dengan terbentuknya endapan merah bata setelah campuran dipanaskan. 3. Uji Hopkins-Cole ini spesifik untuk asam amino triptofan, yang mana triptofan mengandung gugus indol, dan semua protein yang mengandung triptofan. 4. Uji Hopkins-Cole menunjukkan terbentuknya cincin ungu pada interfase kedua cairan karena tryptofan berkondensasi dengan aldehid dalam suasana asam yang mengandung asam glioksilat. 5. Protein dan asam amino yang mengandung amino bebas dan sedikitnya satu gugus karboksil akan menghasilkan reaksi spesifik dengan reagen Ninhidrin 6. Asam amino dan protein menghasilkan uji positif terhadap reagen Ninhidrin ditunjukkan dengan terbentuknya kompleks berwarna ungu pada campuran.

XI.

Daftar Pustaka

12

Anonim.

2009. Struktur Asam Amino dan Zwitter Ion, (Online) ,

(http://kimiadahsyat.blogspot.com/2009/07/struktur-asam-amino-danzwitter-ion.html, diakses tanggal 1 Maret 2012). Lehninger, 1982. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta : Erlangga Unja. 2011. Protein, (Online), (http://kimia-

master.blogspot.com/2011/11/protein.html, diakses tanggal 23 Februari 2012).

XII.

Gambar Alat

13

XIII.

Jawaban Pertanyaan Uji Millon 1. Apa yang terjadi jika garam merkuri ditambahkan ke dalam protein? Bila suatu protein ditambahkan garam merkuri, maka akan terjadi koagulasi. 2. Mengapa larutan albumin terkoagulasi? Protein dapat terkoagulasi karena protein mengalami destruksi bentuk tiga dimensi dari rantai polipeptida yang ikatannya akan pecah tanpa mengakibatkan pemecahan ikatan kovalen dari ikatan peptidanya. 3. Larutan protein mana yang memberikan uji negatif? Mengapa? Larutan yang memberikan uji negatif antara lain larutan alanin, valin, glisin, triptofan, asam glutamat, glutamin, arginin, dan

14

prolin, karena pada asam-asam amino ini tidak terdapat gugus hidroksifenil, sehingga larutan yang dihasilkan tetap bening (larutan berendapan coklat pada triptofan karena adanya gugus indol) tanpa adanya endapan merah bata. Uji Hopkins-Cole Protein apakah yang tidak memberikan uji positif? Larutan yang memberikan uji negatif pada uji Hopkins-Cole antara lain larutan alanin, valin, glisin, tirosin, asam glutamat, glutamin, arginin, dan prolin, karena asam-asam amino ini tidak mengandung gugus indol, sehingga tidak terbentuk cincin ungu pada campurannya. Uji Ninhidrin 1. Warna apa yang terbentuk? Warna yang terbentuk pada uji positif adalah warna ungu. 2. Gugus apa yang memberikan uji positif? Gugus yang memberikan uji positif adalah amino bebas.

15