Metody y pouvan k detekci polymorfism

Rozdlen polymorfism

B d Bodov ATGCGGTAACGTAGGCTTCAGG ATGCGGTAACATAGGCTTCAGG

I Inzer n-dele d l n ATGCGGTAACGTAGGCTTCAGG ATGCGGTAAC-TAGGCTTCAGG ATGCGGTAAC TAGGCTTCAGG ATGCGGTAACG-TAGGCTTCAGG ATGCGGTAACGGTAGGCTTCAGG

Mono vyut DNA ipy

Nen mon vyut DNA ipy

Detekce polymorfism pomoc PCR

Detekce bodovch SNP pomoc mis-match primeru na 3konci T A T G DNA polymerasa m asto 3 5 exonukleasovou aktivitu, kter neumouje pouit tto metody, dostvme nejednoznan vsledky. Detekce inzern/delench polymorfism (inzerce/delece vt ne 2 bze)

AATGC

A Analza PCR produkt se provd na agarosovm (> 5-10bp) nebo polyakrylamidovm gelu monost automatizace analzy na Genetickm analyztoru

Detekce polymorfism restrikn analzou

PCR

RA

Velmi asto se sname pouvat co nejlevnj restrikn endonukleasu, nap. Taq1 (5'-T^C G A-3'). Pokud sekvence v oblasti SNP nesouhlas s danou restriktasou, je mono pout primer, kter nm poadovanou sekvenci pro restrikci vytvo.

GGAATCG GGAAACGAGTTA
Taq1

GGAATCG GGAAACGTGTTA
Taq1 - TCGA

Detekce polymorfism pomoc Real-Time PCR

Pouit specifickch fluorescennch sond

Hydrolizan sondy TaqMan

Hybridizan sondy Molecular beacon, FRET

Detekce polymorfism pomoc Real-Time PCR

Pravidla pro nvrh sond: polymorfismus l fi b by ml b bt umst n piblin ibli uprosted d sondy d Tm sondy by mla bt o deset stup vy, ne Tm primer sonda d b by neml la vytv t et t dn d stabiln t bil struktury t kt v rmci i sebe b pro zven stability duplexu sonda-DNA je mon pout modifikace baz MGB sondy LNA sondy

Detekce polymorfism pomoc Real-Time PCR

Detekce jednobodovch polymorfism pomoc metody SNaPshot

mono detekovat a 12 SNPs najednou metoda trv 1 den

Pprava templtu

Amplifikace gDNA

Odstrann dNTPs a primer Analyzovan polymorfismus Purifikovan templt

Detekce jednobodovch polymorfism pomoc metody SNaPshot

Pprava reakce: k : templt Primer SNaPshot Multiplex Reakn sms

Denaturace templtu

Nasednut primeru

Proveden teplotnch cykl

Extenze primer pomoc ddNTP Odstrann volnch ddNTP a denaturace

Odstrann volnch ddNTP

Detekce jednobodovch polymorfism pomoc metody SNaPshot

Elektroforza vzork na kapilrovm sekventoru

Analza dat

Detekce jednobodovch polymorfism pomoc metody SNPlex

mono detekovat a 48 SNPs najednou metoda trv 2 dny

Detekce jednobodovch polymorfism pomoc metody SNPlex

Detekce jednobodovch polymorfism pomoc metody SNPlex

Detekce jednobodovch polymorfism pomoc metody p y GoldenGate

Genotypizace vybranch SNPs Prmrn call rate > 99% 96-1536 SNPs/vzorek 16 nebo 96 vzork najednou Formt matrice nebo ipu

Detekce jednobodovch polymorfism pomoc metody p y GoldenGate

Detekce jednobodovch polymorfism pomoc metody p y Infinium

Celogenomov typizace SNPs Monost provdn CNV analz (copy number variation) Prmrn call rate > 99% 1 072 820 SNPs/vzorek j 4 a 48 vzork najednou
InfiniumHDBeadChips HumanOmni1Quad Human1MDuo

Samplesper BeadChip 4 2

MarkersperSample >1million* >1million >700,000 >658,000 ~300,000 standardcontentandupto 60,800customizedSNPsper sample

HumanOmniExpress

12 4 12 2/4

Human660WQuad

HumanCytoSNP12

SemiCustomHuman1MDuo+, andHumanHap550Quad+

CNV analza
Na ipu jsou naneseny SNPs v pravidelnch rozestupech (nap. co 3000 bp) genom 3 miliardy bp/ 3000 = 1mil. SNPs pokryje genom Vypotv se logR pomr = Rvzorek k/Rreference f Za normlnch okolnost je R = 1

Detekce jednobodovch polymorfism pomoc metody p y Infinium

Detekce jednobodovch polymorfism pomoc ip Affymetrix

Schma syntzy ipu

Detekce jednobodovch polymorfism pomoc ip p p Affymetrix y

Schma detekce