PRCTICAS DE MICROBIOLOGA

2 Curso Licenciatura de Farmacia

Universidad Miguel Hernndez Campus de San Juan

Profesor: Dr. Francisco Rodrguez Valera (Catedrtico de Universidad, rea de Microbiologa)

normas generales de uso del laboratorio

Para el desarrollo de las prcticas es conveniente tener en cuenta algunas normas elementales que deben ser observadas con toda escrupulosidad:
1. Antes de realizar una prctica, debe leerse detenidamente el guin para adquirir una idea clara de su objetivo, fundamento y tcnica. (Los resultados deben ser siempre anotados cuidadosamente apenas se conozcan). Accidentes personales, tales como derrame de reactivos, cortes y quemaduras, deben comunicarse inmediatamente al Instructor. El orden y la limpieza son esenciales en todas las experiencias de laboratorio. En consecuencia, al terminar cada prctica se proceder a limpiar cuidadosamente el material que se ha utilizado. Cada grupo de prcticas se responsabilizar de su zona de trabajo y de su material. Los productos inflamables (gases, alcohol, ter, etc.) deben mantenerse alejados de las llamas de los mecheros. Si se manejan mecheros de gas se debe tener mucho cuidado de cerrar las llaves de paso al apagar la llama. Cuando no se utilizan los mecheros, stos deben guardarse y se debe estar seguro que se les ha apagado al final de cada laboratorio. Antes de utilizar un compuesto hay que fijarse en la etiqueta para asegurarse de que es el que se necesita y de los posibles riesgos de su manipulacin. Todo el material, especialmente los aparatos delicados, como lupas y microscopios, deben manejarse con cuidado evitando los golpes o el forzar sus mecanismos. Todos los materiales de desecho que hayan entrado en contacto con microorganismos (como pipetas usadas, placas petri o tubos), deben colocarse en bolsas de autoclave preparadas para tal efecto y proceder posteriormente a su esterilizacin. Las pipetas Pasteur de cristal y los cubres y portas usados se colocarn

2. 3.

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5. 6. 7. 8.

en un recipiente especial para vidrio. 9. Usar siempre bata en el laboratorio. 10. Nunca deben sustraerse cultivos de microorganismos del laboratorio. 11. Lavarse las manos con jabn o con un desinfectante si es necesario, antes de dejar el laboratorio.

..algunas precauciones:
1. 2. Se debe trabajar en las proximidades de un mechero, PERO SIN QUEMARSE EL PELO!. Los medios inoculados deben colocarse en las cmaras de cultivo con su identificacin respectiva, ej.: nmero de mesa, nombre, naturaleza del espcimen o sustrato del cual se asla Las pipetas se cogern de forma que sea el dedo ndice el que tape su extremo superior para regular la cada de lquido. Las cubetas para el espectrofotmetro, y los cubreobjetos y portaobjetos deben cogerse por los bordes para evitar que se engrasen. Los tubos de ensayo que contengan medios de cultivos o cultivos de microorganismos, nunca deben abrirse en posicin vertical, sino lo ms horizontalmente posible (inclinados) y para quitar el tapn se mantendrn inclinados con una mano y se abrirn con la otra, que sostendr a su vez el asa. Una vez abierto, se flamea por algunos segundos el orificio, repitiendo dicha operacin una vez realizada la siembra (el tapn nunca debe dejarse sobre la mesa). Antes de utilizar las asas con hilos de platino que sirven para las siembras, stas deben flamearse al rojo en posicin vertical bajo la accin de la llama; tambin debe flamearse el mango. Antes de efectuar la siembra debe esperarse algunos segundos a que se enfren, pudiendo enfriarse tambin en el borde de la placa de Petri que contiene el medio de cultivo. Inmediatamente despus de haberlas utilizado, deben flamearse nuevamente.

3. 4. 5.

6.

ndice: PRCTICA 1
Trabajo en condiciones estriles y manipulacin de microorganismos Medios de cultivo i. Distintos tipos de medios de cultivo. ii. Preparacin y esterilizacin de medios de cultivo.

Prctica Da 1 PRCTICA 2
Esterilidad y contaminacin o Mtodos de esterilizacin Agentes fsicos Agentes qumicos Aislamiento y recuento de bacterias i Tcnicas de aislamiento para la obtencin de cultivos puros. ii Mtodos de recuento y medida del crecimiento

o o o o o Prctica Da 2 PRCTICA 3 y 4

contaje directo en cmara de recuentos Medidas de masa molecular y turbidez Densidad ptica en espectrofotmetro Otras medidas (peso seco, protenas, etc.) Cuantificacin de clulas viables

Efecto de factores ambientales sobre el crecimiento. Tcnicas de incubacin. Microorganismos productores de antibiticos

Instrucciones para el aislamiento de microorganismos productores de antibiticos

Agentes antimicrobianos. Antibiograma o Caractersticas generales de los antibiticos o Actividad de un antibitico o Antibiograma o Concentracin mnima inhibitoria Diferentes Anlisis microbiolgicos i. Microbiologa ambiental y sanitaria: Ej. Anlisis de agua ii. Microbiologa industrial: Ej. Anlisis de alimentos Microbiologa industrial Mtodos de identificacin bacteriana i. Mtodos de identificacin tradicionales Sistema de identificacin API Observacin de bacterias al microscopio

ii. Microscopia- Microscopios iii. Tinciones o Tinciones simples o Tinciones diferenciales Tincin de Gram Prctica Da 3 Prctica Da 4 PRCTICA 5: (Sala ordenadores) Algunos enlaces de inters en Microbiologa Molecular. BLAST

PRCTICA 1 TRABAJO EN CONDICIONES MICROORGANISMOS ESTRILES Y MANIPULACIN DE

El trabajo con microorganismos no se realiza con clulas aisladas, sino con poblaciones extensas y homogneas del microorganismo a estudiar, por lo que el microbilogo utiliza tcnicas que permiten obtener un cultivo puro, y luego cultivar a gran escala dicho microorganismo. Importancia de:

- La esterilizacin del material de trabajo (asas de siembra, medios de cultivo, frascos de toma de muestras, etc.) - El mantenimiento de un ambiente estril (mechero bunsen, campanas de flujo laminar) para la manipulacin de microorganismos.

ESTERILIZACIN DE ASAS DE SIEMBRA (Figura 1, 2)

Aspectos bsicos para: - toma de muestras - inoculacin o siembra de microorganismos

Siembra por extensin (Figura 3)

MEDIOS DE CULTIVO
DISTINTOS TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los microorganismos. Composicin de un medio de cultivo: - componentes indispensables: agua, nutrientes orgnicos (hidratos de carbono, aminocidos, vitaminas, etc.), nutrientes inorgnicos ( P, e, N, Mg, S, etc.) - componentes alternativos: isosmotizantes (NaCl), agente solidificante (agar-agar), tampones, indicadores de pH, etc. Tipos de medios de cultivo: En funcin de su consistencia: - medios lquidos - medios slidos (en tubo, en placa) - medios semislidos En funcin de su composicin: - medios complejos (caldo ordinario, extracto de levadura) - medios sintticos

Existen medios de cultivo cuya composicin permite el crecimiento de una gran diversidad de microorganismos (agar nutritivo, caldo ordinario). Otros en cambio, se utilizan para la seleccin de determinados grupos de organismos, o se desarrollan para el estudio de determinadas pruebas fisiolgicas o test bioqumicos. medios selectivos enriquecimientos medios para test bioqumicos (utilizacin de citratos, acidificacin a partir de azcares, etc.). Ejemplos de medios selectivos:

PREPARACIN Y ESTERILIZACIN DE MEDIOS DE CULTIVO Preparacin de un medio de cultivo: - Pesar y disolver los componentes en el medio en el volumen indicado de agua destilada - Ajustar el pH del medio, si procede - Para la preparacin de medios slidos se adiciona agar-agar como agente solidificante. Para asegurar la completa disolucin del agar, el medio se calienta hasta ebullicin al mismo tiempo que se somete a agitacin previamente a su esterilizacin en el autoclave. Esterilizacin de medios de cultivo: Una vez preparado el medio, ste se debe esterilizar lo antes posible para evitar el crecimiento de microorganismos: - Medios slidos en placa - tapar el matraz con tapn de algodn graso y cubrir con papel de aluminio para llevar a esterilizar en el autoclave (121 C, 15-20 min). Una vez estril repartir el medio en placas de Petri estriles y dejar en reposo para su solidificacin. (Figura 4)

- Medios slidos en tubo (agar inclinado) - tras la ebullicin del medio con agar, ste se reparte en los tubos de cristal, de forma que queden llenos hasta aproximadamente la mitad. Los tubos se cubren con tapn (de aluminio), etc.). Para llevar a autoclavar. Una vez esterilizado, los tubos se disponen en posicin inclinada para su solidificacin. - Medios lquidos una vez disueltos los componentes del medio en el matraz, repartir en su caso en tubos a razn de 2-4 ml por tubo, cubrir con tapn y llevar a esterilizar en el autoclave. Alternativamente, se puede esterilizar el medio en el matraz, y posteriormente repartirlo con la ayuda de pipetas estriles en tubos de plstico estriles. - Medios semislidos se preparan con concentraciones inferiores de agente solidificante (agaragar). El medio se reparte en tubos. En caso de desear proporcionar condiciones anaerbicas, existen diversas metodologas para ello. Los medios semislidos se utilizan para el crecimiento bacteriano a lo largo del tubo. Los niveles de difusin de oxgeno en las distintas capas condicionar el crecimiento de distintos tipos de microorganismos (aerobios, anaerobios).

Prctica DA 1
PREPARACIN DEL MATERIAL A ESTERILIZAR Colocar un filtro de algodn en el extremo posterior de las pipetas con ayuda de la aguja enmangada (con precaucin de que el algodn no quede excesivamente compactado). Las pipetas debern ser autoclavazas empaquetadas. Se debe tomar la precaucin de orientar las pipetas, de forma que todas ellas se puedan extraer posteriormente sin ser expuestas a contaminacin. 6 Pipetas Pasteur ------ + algodn --------- empaquetar y marcar ---------- AUTOCLAVAR PREPARACIN / MANIPULACIN DE MATERIAL ESTRIL (en condiciones estriles / Bunsen) (suero fisiolgico = NaCl al 0,9%) Con ayuda de pipetas de plstico estriles: - 4 tubos estriles ---------------------- + 4,5ml de suero fisiolgico estril o Se usarn en la prctica del da 2 en el Banco de diluciones - 1 tubo estril --------------------------- + 6ml de suero fisiolgico estril o Se usa en la prctica de aislamiento de microorganismos del suelo (ver a continuacin) - 1 tubo estril --------------------------- + 8ml de YE (extracto de levadura) estril o Se usa para realizar la curva de crecimiento (ver a continuacin) CURVA DE CRECIMIENTO (en condiciones estriles / Bunsen) - Inocular 1 colonia del organismo en el tubo con 8ml de YE. Usar para ello el asa de platino esterilizada a la llama del mechero tal como se muestra en la Figura 2. - Agitar en vrtex. - Marcar el tubo con el nmero de mesa. - Incubar el tubo con el cultivo a 37 C en la cmara de incubacin correspondiente. AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEL SUELO (en condiciones estriles / Bunsen) Por cada mesa: - Resuspender 0,1-1gr de suelto en el tubo con 6ml de suero preparado anteriormente. - Agitar bien en vrtex. Dejar sedimentar las partculas. - Tomar una muestra con pipeta de 2ml estril y extender con el asa de vidrio (previamente flameada con alcohol) en 1 placa de Agar Nutritivo. Figura 2 y 3. - Incubar: Mesa par: 30 C Mesa impar: 37 C (Marcar la placa con el nmero de mesa y la temperatura de incubacin)

PREPARACIN DE PLACAS DE MEDIO SLIDO (en condiciones estriles / Bunsen) Dispensar aproximadamente 20-25ml del medio autoclavado (tras dejar enfriar a 55-60 C) en placas Petri estriles. 1 botella por cada par de mesas o bancada. Figura 4. AGAR MAC CONKEY Marcar como MAC
Peptona de casena.......................................... 17,0 g. Peptona de carne............................................... 3,0 g. Cloruro de sodio............................................... 5,0 g. Lactosa........................................................... 10,0 g. Sales biliares..................................................... 1,5 g. Rojo neutro.................................................... 0,03 g. Cristal violeta............................................... 0,001 g. Agar.............................................................. 13,5 g. Agua destilada c.s.p. .......................................... 1 lt. pH = 7,1 0,1

AGAR MUELLER-HINTON Marcar como MH

Infusin de carne..........................................5,0 g. Caseina hidrolizada.....................................17,5 g. Almidn........................................................1,5 g. Agar............................................................12,5 g. pH = 7,4 0,2

MF C: Preparar la suspensin hervir - dejar enfriar a 55-60 C aadir el cido roslico homogeneizar dispensar en placas Marcar como MF-C AGAR NUTRITIVO Marcar como AN
Extracto de carne..................................... 3,0 g. Peptona de carne...................................... 5,0 g. Agar....................................................... 15,0 g. Agua destilada c.s.p. .................................. 1 lt.

PRCTICA 2 ESTERILIDAD Y CONTAMINACIN

(Conceptos generales). Esterilizacin y contaminacin. Desinfectantes y antispticos. El concepto de esterilizacin implica la eliminacin de todas las formas vivas. Segn dicha definicin, estril significa libre de organismos. Otras metodologas, como desinfeccin, pasteurizacin, etc., conllevan una eliminacin parcial de los microorganismos existentes. Mtodos de esterilizacin: Agentes fsicos a) Calor Calor seco: flameado, aire caliente (horno Pasteur) Calor hmedo: vapor saturado (AUTOCLAVE). En el autoclave la esterilizacin se produce mediante vapor de agua a presin. En el autoclave se alcanza una temperatura de 121 C a una presin de 1 atmsfera sobre la presin ambiental. Esquema de autoclave

b) Filtracin: permite la eliminacin de los microorganismos de un medio lquido, sin la destruccin de estos. Para ello se hace pasar la muestra lquida a travs de un filtro de membrana con tamao de poro inferior al tamao de los microorganismos (0,2-0,45 micras). Los microorganismos quedarn retenidos en el filtro y el fluido obtenido tras la filtracin estar estril.
Micrografas al microscopio electrnico de dos membranas de filtro de diferente tamao de poro:

Mat-type Millipore BS bacteriological filter, 2 m pore dimensions. Bar: 20 m

Mat-type MicronSep bacteriological filter, 0.45 m pore dimensions. Bar: 2 m

Micrografas al microscopio electrnico de microorganismos retenidos en los filtros:

Campylobacter jejuni bacteria on a Nuclepore filter with 0.4 m pores. Bar: 2 m

Saccharomyces cerevisiae yeast cells on a Millipore BS filter with 2 m pores. Bar: 5 m

Millipore EA filter, 1.0 m pores. Joined globular structures are part of the filter. Bar: 5 m

c) Radiaciones: - Rayos gamma -. Radiaciones ionizantes - Rayos Ultravioleta de escasa penetracin y de utilidad para eliminacin de microorganismos de superficies. Esquema de lmparas de UV Campana de seguridad con UV

Agentes qumicos: para esterilizar material (generalmente algunos tipos de plstico) que son termolbiles. Como el xido de etileno y glutaldehdo.

Otros mtodos de eliminacin, si bien parcial, de microorganismos: - calor: ebullicin, pasteurizacin, tindalizacin - agentes qumicos: desinfectantes, antispticos

AISLAMIENTO Y RECUENTO DE BACTERIAS

TCNICAS DE AISLAMIENTO PARA LA OBTENCIN DE CULTIVOS PUROS A partir de un cultivo mixto, se pretende obtener un cultivo puro de bacterias, a travs de la obtencin de colonias aisladas. Cada colonia representa una poblacin de microorganismos procedentes de una sola clula, a partir de la cual se posee la seguridad de obtener dicho cultivo puro de un solo tipo de microorganismo. Para ello se utilizan diferentes tcnicas de aislamiento, basadas en diluir la muestra inicial para obtener colonias aisladas. Una vez que se ha obtenido un cultivo puro, se puede mantener haciendo resiembras en tubos de agar inclinado o bien congelando las clulas en glicerol (10-30%) a -70 C, en Nitrgeno lquido a -173 C, o mediante liofilizacin.

- Agotamiento. Para obtener colonias aisladas por la tcnica del agotamiento la muestra se extiende sobre la superficie segn se indica en la figura, de forma que al final de dicha siembra por agotamiento, la cantidad de inculo se espera sea lo suficientemente bajo como para que se depositen clulas aisladas y distanciadas en la superficie del agar a partir de las cuales surjan, tras incubar, colonias aisladas. Estras escocesas. Se procede de forma similar al caso anterior, en lo que se respecta al mtodo general para la siembra en placa y permite tambin obtener colonias aisladas. MANIPULACIN DE MICROORGANISMOS. Aislamiento en estra (Figura 5) ESTRAS ESCOCESAS

(1)

(2)

ESTRAS POR AGOTAMIENO

(3) (4)

Tcnica se aislamiento y recuento. Banco de diluciones. Tcnica que consiste en obtener una

suspensin de la mezcla de microorganismos y hacer diluciones seriadas que se vierten en una placa Petri hasta conseguir colonias aisladas.

Instrucciones: Se debe trabajar, como siempre, en condiciones estriles, flameando la boca de los tubos antes y despus de introducir la pipeta, en las proximidades del mechero. Mediante una pipeta estril, tomar una muestra del cultivo mixto, y depositar 1ml en el primer tubo con 9ml de suero fisiolgico ( en nuestro caso: 0,5ml en 4,5ml respectivamente) (dilucin 10-1). Agitar hasta conseguir una suspensin homognea. Tomar otra pipeta estril, y transferir de esta primera dilucin 0,1ml al siguiente tubo con 10ml de suero fisiolgico (10-2), y as sucesivamente. A partir del tubo con dilucin 10-2 y 10-4, con una pipeta estril , inocular 0,1ml en placa AN extendiendo la muestra sobre la superficie con el asa de vidrio, la cual se debe esterilizar mediante su introduccin en alcohol y posterior flameado, por lo que se pasa el asa impregnada en alcohol por el mechero y se deja consumir el alcohol completamente. Tras incubar se podrn obtener colonias aisladas. El recuento de estas colonias permitir conocer el nmero de clulas existentes en el cultivo original. Figura 6: Diluciones seriadas

Ci = N x D x 10
Ci = Concentracin inicial (unidades: nmero de clulas / ml) N = n de colonias D = dilucin

MTODOS DE RECUENTO Y MEDIDA DEL CRECIMIENTO BACTERIANO - Contaje directo en cmara de recuentos Se basa en el recuento directo del nmero de clulas en un volumen determinado, prefijado en la cmara de recuento, mediante su observacin al microscopio. El mtodo no permite distinguir entre clulas viables y no viables. Ejemplo de cmara de recuento

- Medicin de la densidad ptica en el espectrofotmetro Se trata del mtodo ms habitual para el seguimiento del crecimiento de un cultivo bacteriano. La medicin de alcuotas o muestras del cultivo a lo largo del tiempo, permite desarrollar curvas de crecimiento de la poblacin bacteriana. Ello permitir, a su vez, la comparacin de tasas de crecimiento en diferentes condiciones, el establecimiento de las condiciones ptimas, etc.

El incremento en el nmero de clulas es lento al principio y despus llega a ser de forma exponencial. La grfica anterior es caracterstica de un cultivo en un recipiente cerrado en el que los nutrientes son limitados. En la curva se distinguen: 1. Fase de latencia. Fase de adaptacin de las clulas a las nuevas condiciones del medio de incubacin al que han sido transferidas. Las clulas no crecen inmediatamente sino despus de este tiempo de latencia. Las clulas son metablicamente activas, se adaptan al medio y eventualmente lo modifican. Para un mismo inculo, esta fase de latencia varia dependiendo del medio al que se transfieren y de las condiciones de incubacin. 2. Fase de crecimiento exponencial. Fase en la que las clulas se estn dividiendo regularmente a ritmo constante. En condiciones apropiadas durante esta fase, el grado de desarrollo es mximo. Es en este periodo donde puede calcularse el tiempo de generacin de un microorganismo. 3. Fase estacionaria. El n de clulas no se incrementa ms porque los nutrientes del medio se van agotando y posibles sustancias txicas pueden ir acumulndose. No hay incremento neto del n de clulas, el n de clulas que se originan es igual al n de las que mueren.

- Recuento de viables Se determina el nmero de clulas capaces de generar colonias sobre la superficie de un medio slido. En la prctica habitual se considera que el nmero de colonias en una placa debe oscilar entre 30 y 3000, con objeto de que la muestra sea estadsticamente representativa, y evitando que aparezca crecimiento confluente. o Mediante la realizacin de diluciones, en caso de muestras concentradas. o Mediante tcnicas de filtracin, de volmenes determinados, y posterior incubacin del filtro en que han quedado retenidos los microorganismos sobre la superficie de medios slidos. Ello permite el uso de medios selectivos para el aislamiento y cuantificacin de determinados grupos de microorganismos.

Recuento de viables

Prctica DA 2
Ver resultados del aislamiento de microorganismos del suelo - comparar si existen diferencias de crecimiento entre 30 y 37 C anotar los resultados - observar posibles halos de inhibicin del crecimiento de otros microorganismos alrededor de colonias

CURVA DE CRECIMIENTO (en condiciones estriles / Bunsen) - Tomar 1ml del cultivo en Y.E. creciendo a 37 C con Pipeta Pasteur estril. - Medir D.O. en el espectrofotmetro. - Iniciar la representacin de la curva de crecimiento. AISLAMIENTO EN CULTIVO PURO A PARTIR DE UNA SUSPENSIN BACTERIANA O CULTIVO MIXTO: Siembras: Ver esquema Figura 5 e instrucciones !!!!!! - Agotamiento, con asa de platino y en placa de AN
Tomar una muestra del cultivo mixto, con ayuda del asa de siembras previamente flameada. Debe flamearse la boca del tubo antes y despus de tomar la muestra. La muestra se extiende con suavidad con el asa sobre la superficie del medio de agar nutritivo en placa Petri. Para ello la placa se destapa ligeramente en las proximidades del Mechero bunsen. Una vez finalizado se vuelve a tapara la placa y est se dispone en posicin invertida para llevar a incubar. Este es el proceso general para la siembra de placas.

Estras escocesas, con asa de platino y en placa de AN

Para obtener colonias aisladas por este procedimiento, segn se ndice en el esquema,

se realizan una serie de estras sobre la superficie del medio, tras lo cual se cierra la placa y se flamea el asa. Con el asa estril se realizan nuevas estras arrastrando clulas de las estras anteriores, y por tanto diluyendo la muestra. El proceso se repite varias veces, flameando el asa entre cada nuevo paso de estras. Al final se puede realizar un pequeo agotamiento. La placa se lleva a incubar, invertida, como en el caso anterior. Ello permitir obtener colonias aisladas.

Incubar a 37 C (Marcar las placas con n de mesa) Diluciones: Ver Figura 5 e instrucciones !!!!!!!. - realizar diluciones con pipeta de 2ml: 0,5ml en 4,5ml de suero fisiolgico, segn instrucciones. - en placa de Agar nutritivo, y con asa de vidrio previamente flameada, extender 0,1ml de las muestras: - Dilucin 10-2 - Dilucin 10-4 Incubar a 37 C (Marcar las placas con n de mesa y la dilucin)

ESTERILIZACIN Se pretender comprobar, la eficacia de distintas metodologas para la eliminacin de microorganismos. Para ello se utiliza un cultivo mixto y tras los diversos tratamientos se procede a sembrar la muestra en placa de agar nutritivo. A PARTIR DE UNA SUSPENSIN BACTERIANA O CULTIVO MIXTO: - Filtracin: - Filtrar 1-2ml de suspensin bacteriana con ayuda de una jeringuilla estril y se hace pasar a travs de un filtro de membrana de 0,45 micras de poro. - Inocular 0,1ml en placa AN con ayuda de una pipeta de 2ml, y extender con asa de vidrio previamente flameada. - Efecto de Radiacin UV: - Inocular 0,1ml en placa AN con ayuda de una pipeta de 2ml, y extender con asa de vidrio previamente flameada. - levantar la tapa y cubrir la mitad de la placa con papel de aluminio. - exponer a la lmpara de UV colocando la placa abierta bajo la accin de la luz ultravioleta durante 5 minutos. Transcurrido este tiempo cerrar la placa. - PASTEURIZACIN:
Es el proceso de destruccin de las bacterias patgenas que pueden existir en un lquido mediante el calor, generalmente usado en el tratamiento de lquidos alimenticios, alterando lo menos posible la estructura fsica y los componentes qumicos de ste. En 1862, el qumico francs Louis Pasteur cre el proceso que lleva su nombre, comprobando que calentar ciertos alimentos y bebidas por encima de los 60 C evitaba su alteracin, al disminuir de manera sensible el nmero de microorganismos presentes en su composicin. Se usa para fundamentalmente para destruir microorganismos dainos en productos comestibles. Posteriormente, los productos se sellan hermticamente con fines de seguridad. El avance cientfico de Pasteur mejor la calidad de vida al permitir que productos como la leche pudieran transportarse sin descomponerse.

Tomar 1 2ml de la suspensin bacteriana. Tratar a 63 C durante 30 minutos. Inocular 0,1ml en la placa de AN, extender con asa de vidrio previamente flameada.

Louis Pasteur

Incubar a 37 C. (Marcar las placas con n de mesa y proceso)

PRCTICA 3 / 4
EFECTO DE FACTORES AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTO. TCNICAS DE INCUBACIN Los distintos factores ambientales (temperatura, pH, oxgeno, concentracin de solutos u osmolaridad, etc.) afectan al crecimiento microbiano. Se debe, por tanto, tener en cuenta las condiciones en que se debe cultivar un determinado tipo de microorganismos. TEMPERATURA: En funcin de su espectro de crecimiento respecto a la temperatura, distintos tipos de microorganismos crecern con distintas tasas de crecimiento a una determinada temperatura. Ello puede ser utilizado como base para el aislamiento de organismos psicrfilos, mesfilos o termfilos. Se incubarn muestras de diversos orgenes (suelo, agua, alimentos y cultivos mixtos y puros) a distintas temperaturas en medio slido (agar nutritivo, medios selectivos) y se comparar el crecimiento y tipos de microorganismos obtenidos tras su incubacin. OXGENO: Existen mtodos para proporcionar una mayor o menor oxigenacin en funcin del tipo de microorganismos que se desee cultivar. Los medios lquidos permiten una mayor difusin del oxgeno hacia las capas inferiores que los medios slidos. Se utilizan medios semislidos para el crecimiento bacteriano a lo largo del tubo. Los niveles de difusin de oxgeno en las distintas capas condicionar el crecimiento de distintos tipos de microorganismos (aerobios, anaerobios estribitos, anaerobios facultativos, microaerfilos).

Incubacin de bacterias aerobias - Medio lquido: o Tubo - horizontal o inclinado con agitacin o Matraz con poca cantidad de medio, con agitacin o burbujeo - Medio slido o Placa en superficie o Tubo agar inclinado (crecimiento en superficie)

Incubacin de bacterias anaerobias - Medio lquido o Tubo vertical con agente reductor (tioglicolato sdico) - Medio slido o Placa en el interior de jarra de anaerobios o en estufa de anaerobios o - Medio semislido o Tubo en tubo vertical. El medio se somete a ebullicin, con objeto de eliminar el oxgeno, previamente a la inoculacin de la muestra. Se puede adicionar entonces un agente reductor. Tras haber sembrado la muestra por picadura, se sella la parte superior del medio (con glicerina estril). Jarra de anaerobios Cmara de anaerobiosis

MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE ANTIBITICOS

Los antibiticos son productos del metabolismo secundario de diversos grupos de microorganismos (hongos como Penicillium, o bacterias fundamentalmente del grupo de los actinomicetos, como Streptomyces, u otras bacterias del suelo), y que matan o inhiben el crecimiento de otros microorganismos. La modificacin de estos compuestos naturales permite la obtencin de nuevas variaciones de antibiticos. Sir Alexander Fleming descubri las propiedades inhibitorias bacterianas de un producto metablico de Penicilium notatum. Llamo a la sustancia penicilina. En 1929, su descubrimiento abri la era de los antibiticos. Por sus contribuciones, Fleming fue condecorado y comparti del Premio Nobel de Fisiologa o Medicina en 1945.

INTRUCCIONES para el aislamiento de microorganismos productores de antibiticos: 1. Se resuspende aproximadamente 0,1 1 gr. de una muestra de suelo en 10ml de suero fisiolgico estril. Se siembra 0,1ml en placas de agar nutritivo, se extiende la muestra, y se incuban a diferentes temperaturas: temperatura ambiente, 30 C y 37 C (24h 48h). 2. Se observa la presencia alrededor de colonias de halos de inhibicin del crecimiento de otros microorganismos (de la propia muestra de suelo, o bien tras cubrir con una doble capa de una organismo indicador).

3. La colonia de microorganismo productor seleccionada se siembra en una nueva placa: por estra en un lados de la placa segn figura. Se incuba durante 24h. con objeto de permitir la produccin de antibitico.

4. Una vez crecido el microorganismo productor y difundido el antibitico, las cepas indicadoras como posibles susceptibles se siembran por estra perpendicularmente al productor. Como cepas indicadoras posiblemente susceptibles se utilizan cepas de diversos grupos bacterianos Gram positivos y Gram negativos (ej.: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis). Se incuba 24h a 37 C.

5. Se observan las zonas de inhibicin del crecimiento de las cepas indicadoras.

FIGURA 7

AGENTES ANTIMICROBIANOS. ANTIBIOGRAMA

Antibiticos y otros antimicrobianos Actividad bacteriosttica o bacterioltica Antibiograma Concentracin mnima inhibitoria

Los antibiticos son compuestos orgnicos de bajo peso molecular sintetizados por microorganismos, que a bajas concentraciones inhiben el desarrollo o matan a otros microorganismos. CARACTERSTICAS GENERALES 1. Inhiben el crecimiento (bacteriostticos) o matan (bactericidas). 2. Son efectivos a bajas concentraciones. 3. Poseen toxicidad selectiva: actan sobre el patgeno sin afectar al organismo hospedador. 4. Pueden actuar frente a procariotas o eucariotas. 5. Pueden ser de accin muy especfica o de amplio espectro. 6. Solubles en agua. 7. Poseen estabilidad qumica. 8. Son productos del metabolismo secundario. Es importante tener en cuenta la posibilidad de aparicin de resistencia a determinados antibiticos en algunos microorganismos durante el tratamiento de una infeccin. MICROORGANISMOS PRODUCTORES Se encuentran tanto dentro del grupo de procariotas como en el de eucariotas. Procariotas: Bacillus, Streptomyces, Nocardia Eucariotas: Penicillium, Aspergillus, Cephalosporium CLASIFICACIN Hay muy diversas clasificaciones: Segn su origen naturales: sintetizados por microorganismos. sintticos: obtenidos completamente por sntesis qumica. semisintticos: parte de compuesto sintetizada por microorganismos y otra parte sintetizada qumicamente. Segn su estructura qumica -lactmicos: penicilinas, cefalosporinas. macrlidos: eritromicina. aminoglucsidos: estreptomicina. polipeptdicos: bacitracina. polinicos: anfotericina B tetraciclinas derivados del benceno: cloranfenicol.

Segn su mecanismo de accin actan sobre la pared celular bacteriana inhibiendo su sntesis: penicilinas. actan sobre la membrana celular alterando su permeabilidad. inhiben la sntesis proteica. inhiben la sntesis de cidos nucleicos: mitomicina.

Los antibiticos en general pueden ser de amplio espectro o de espectro reducido, estos ltimos van a matar grmenes ms especficamente. Dependiendo del origen o localizacin de la infeccin, se va a utilizar uno u otro. Por ejemplo en una infeccin de garganta no se debera utilizar uno de amplio espectro ya que matara tambin a la microbiota tan importante para nosotros. Actividad de un antibitico: Ejemplo de tres tipos de accin de agentes antimicrobianos. En el tiempo indicado por la flecha, se aadi una concentracin inhibidora del crecimiento, a un cultivo en fase exponencial de crecimiento. Observar la relacin entre clulas viables y nmero total de clulas

BACTERIOSTTICO

BACTERIOLTICO

BACTERICIDA

Antibiograma: Consiste en el estudio de la sensibilidad o resistencia de determinado microorganismo (o grupo de ellos) a varios antibiticos. Se puede utilizar para tratar un patgeno, aadir a alimentos, en definitiva para saber como se comporta un germen frente a determinado antibitico. El antibiograma se puede hacer tanto en medio lquido como en medio slido. En nuestro caso vamos a utilizar un agar ordinario pero modificado de manera que grmenes y antibiticos puedan difundir correctamente: agar de Muller-Hinton.
Actividad antibitica por difusin en agar Actividad antibitica por crecimiento en csped. FIGURA 8

Se siembra la cepa de inters en la superficie de una placa de medio Mueller Hinton, realizando la extensin con ayuda de un hisopo estril (o asa de siembra) de forma que se obtenga un crecimiento confluente o en csped distribuido homogneamente.

Con ayuda de unas pinzas metlicas (esterilizadas mediante flameado con alcohol), se depositan los discos de los distintos antibiticos sobre la superficie

Se incuban las placas a 37 C durante 24 horas.

Se observan los halos de inhibicin de cada uno de los antibiticos ensayados sobre la cepa correspondiente. El dimetro del halo de inhibicin del crecimiento se utiliza como indicativo de la sensibilidad o resistencia a cada antibitico.

- Concentracin mnima inhibitoria En el manejo de estos agentes teraputicos se utilizan dos trminos muy importantes: * Concentracin mnima inhibitoria (CMI): Se trata de la dosis mnima con la que un frmaco inhibe el crecimiento de un determinado patgeno, y es indicativa de la eficacia del antibitico * Concentracin mnima letal (CML): Concentracin ms baja a la que un frmaco mata al patgeno

DIFERENTES ANLISIS MICROBIOLGICOS

MICROBIOLOGA AMBIENTAL Y SANITARIA: ejm. ANLISIS DE AGUA Muestras lquidas: Aguas En el agua pueden encontrarse una gran variedad de microorganismos, los cuales afectan en mayor o menor medida a la potabilidad del agua y a sus caractersticas organolpticas. Adems de la flora normal (Bacillus, Pseudomonas, etc.), en el agua pueden existir microorganismos contaminantes. Una de las fuentes principales de contaminacin son las aguas residuales que contienen heces que pueden ser vehculo de transmisin de patgenos. La presencia de indicadores de contaminacin fecal (Escherichia coli, Enterococcus faecalis) revela la existencia de contaminacin fecal, y por tanto la posibilidad de que se encuentren presentes patgenos de transmisin oral-fecal.
El agua se considera potable si los valores obtenidos en los ensayos estn dentro de los lmites establecidos por la ley. Las normas legales vigentes exigen: Aerobios totales: No existe lmite legal pero los valores mximos recomendados son: Aerobios a 37 C: 10 /ml. Aerobios a 22 C: 100 por ml. Coliformes: Coliformes totales: < 1 / 100ml. Coliformes fecales: < 1 / 100ml. Estreptococos fecales: < 1 / 100ml. Clostridios sulfito reductores: < 1 / 20 ml.

Aparte del problema de transmisin de enfermedades, la contaminacin del agua tambin acarrea otras consecuencias. Por ejemplo, la degradacin biolgica por los microorganismos de grandes cantidades de residuos

orgnicos vertidos al agua hace disminuir rpidamente el oxgeno existente, creando un ambiente desprovisto de toda forma de vida que no sea anaerbica: mueren los peces, disminuye la vida vegetal y se produce el hedor caracterstico debido a las actividades de los microorganismos anaerobios.

En esta prctica tratamos de simular un aislamiento de microorganismos a partir de una muestra (agua o alimentos contaminados...), para identificarlos posteriormente mediante un conjunto de pruebas. Concretamente, vamos a realizar la determinacin de bacterias pertenecientes al grupo de bacilos Gram (-) anaerobios facultativos, en el que se incluyen las enterobacterias. Muchas de ellas forman parte de la flora normal del tracto digestivo del hombre pudiendo producir enfermedades en determinadas circunstancias. Otros como Salmonella o Vibrio pueden causar enfermedades por la ingestin de alimentos o agua contaminados. De ah la necesidad de desarrollar pruebas que permitan aislar e identificar rpidamente estos microorganismos. GRUPO DE BACTERIAS GRAM (-) ANAEROBIAS FACULTATIVAS Son bacilos o cocobacilos, pueden crecer en presencia o en ausencia de O2 son pues anaerobios facultativos. En anaerobiosis obtienen la energa por fermentacin. En este grupo se incluyen las familias Enterobacteriaceae y Vibrionaceae. FAMILIA Enterobacteriaceae: Forma: bacilos, cocobacilos / Movilidad: inmviles o mviles por flagelos peritricos / Catalasa (+) / Oxidasa (-). La mayora de enterobactericeas pueden fermentar glucosa y otros azcares. La capacidad o no para fermentar algunos sustratos se utiliza para la identificacin de las distintas especies. Por ejemplo, Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter fermentan la lactosa, mientras que Salmonella, Shigella, Proteus no fermentan la lactosa. FAMILIA Vibrionaceae: Forma: bacilos ligeramente curvados. Movilidad: mviles por flagelos polares. Catalasa (+) / Oxidasa (+) . Las vibrionceas crecen bien en medio alcalino. La mayora son inofensivas y se encuentran en ambientes acuticos. Algunos son patgenos, como Vibrio cholerae que es el agente causal del clera. Para este tipo de anlisis se puede proceder: mediante realizacin de una siembra directa, o tras dilucin, en caso de muestras con alta carga microbiana. mediante filtracin de una volumen determinado de la muestra (10ml, 50ml, 100ml) (en caso de muestras con escasa concentracin microbiana) a travs de un filtro de membrana de 0,2 0,45 micras y posterior incubacin del filtro depositado sobre un medio de cultivo slido (agar nutritivo para bacterias totales, medio selectivos para distintos grupos bacterianos como MacConkey para enterobacterias, etc.).

En esta prctica se investigar: - la presencia de bacterias aerobias totales (en agar nutritivo, incubacin a 37 C, o a 30 C) - la presencia de enterobacterias (agar MacConkey, 37 C) - la presencia de coliformes fecales (medio MF-C, incubacin a 45.5 C)

Muestra slidas: alimentos Para analizar este tipo de muestras se proceder a homogeneizar la muestra y resuspensin de microorganismos en suero fisiolgico estril (ej: 1 gr de muestra en 10-50 ml de suero), tras lo cual se realizara una siembra directa de la suspensin obtenida en medio selectivo. Microbiologa de productos lcteos y productos fermentados. Deteccin de microorganismos (como bacterias del cido lctico) utilizados en la industria para la obtencin de derivados lcteos (queso, yogur, kefir, mantequilla) y diversos productos fermentados (aceitunas espaolas, pepinillos).

MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
Los microorganismos pueden ser considerados en trminos generales con dos criterios que son antagnicos: - Uno corresponde a las actividades tiles que tienen algunos para obtener bienes o servicios - y otro completamente distinto corresponde a los efectos perjudiciales que ocasionan que estn generalmente asociados a la produccin de enfermedades, tanto en el hombre como en los animales, y que tambin se pueden extender al deterioro producido sobre alimentos y materiales diversos. La Microbiologa Industrial se ocupa fundamentalmente de las actividades tiles de los microorganismos. Un poco de historia: Las aplicaciones de los microorganismos datan de tiempo inmemorial. El hombre hizo uso de ellos sin saber que stos existan desde que invent o descubri al azar la manera de hacer cerveza, vinagre, vino o pan. La cerveza era conocida antes del 6000 a.C. por sumerios y babilonios, y en el antiguo Egipto exista ya verdadera produccin en 1700 a.C.; el vinagre se produca desde antes de esa fecha y el vino es tambin muy antiguo, ya que existe evidencia de su produccin antes del 2000 a.C. en Egipto y China, y finalmente el pan se conoce desde 4000 a.C. aproximadamente. A partir de 1900 comienza la etapa de produccin de una serie de productos nuevos que se suman a los conocidos desde la ms remota antigedad, y que son la levadura de cerveza, glicerol, cido lctico, acetona butanol y etanol. Hasta el 1945 poco se esperaba del futuro de la Microbiologa Industrial, ya que solamente unos pocos productos eran fabricados con microorganismos. Con el descubrimiento de la penicilina en 1945 y la necesidad de su produccin, se produce un impacto formidable sobre los procedimientos microbiolgicos, ya que se plantea el desafo de la produccin en gran escala en condiciones de mucho mayor control y con necesidad de operaciones ms complejas para la separacin y purificacin de los productos. Como consecuencia de los avances logrados en esos desarrollos se produce en pocos aos la aparicin de un gran nmero de nuevos productos, como otros antibiticos, aminocidos, esteroides, enzimas, biomasa aplicada a la alimentacin animal y humana (protenas unicelulares), nucletidos, etc. A partir de 1979 la Microbiologa Industrial recibe un nuevo y notable impulso que se suma al anterior cuando se concretan a nivel de procedimientos prcticos las posibilidades que ofrece la ingeniera gentica, disciplina surgida como consecuencia del avance de la Biologa Molecular. Este nuevo impulso posibilita la produccin industrial, basada en la utilizacin de microorganismos recombinantes, de sustancias nuevas nunca producidas antes por esa va como la insulina. La Microbiologa Industrial abarca todos aquellos procesos que se realizan con microorganismos. En Microbiologa Industrial se utilizan los trminos fermentacin y fermentaciones industriales, para caracterizar a los procesos o tecnologas basados en el uso de microorganismos. El trmino "fermentacin", que deriva del latn fermentar (hervir), inicialmente reservado a la actividad microbiana anaerobia, se fue aplicando asimismo a procesos aerobios y finalmente tambin a aqullos que utilizan clulas animales y vegetales. El estudio de los microorganismos de inters industrial, se centra en la seleccin, mantenimiento y mejoramiento de los microorganismos, ya que es muy importante el aumento de la productividad de las cepas empleadas.

MTODOS DE IDENTIFICACIN BACTERIANA

La correcta deteccin e identificacin de los microorganismos presentes en muestras clnicas o de otros orgenes es imprescindible para determinar el origen de las infecciones, seguir el curso de las enfermedades y decidir los tratamientos a aplicar. Todos los puntos del proceso son importantes, desde la forma de tomar y mantener las muestras hasta su manipulacin en el laboratorio. Se puede decir que en el proceso de identificacin de microorganismos se ponen en juego todos los conocimientos acumulados en Microbiologa. La identificacin de bacterias puede basarse en muchos caracteres: morfolgicos, fisiolgicos, bioqumicos, de tipo serolgico y de patogenicidad. Morfologa celular: Forma (bacilos, cocos) y agrupamiento (diplococos, racimos, rosarios). Tincin (Gram, cido-alcohol resistentes...) Estructuras especiales: flagelos, endosporas Morfologa de las colonias: Forma, color, consistencia, borde, seccin... Fisiologa: Aerobios, anaerobios, anaerobios facultativos Temperatura ptima de crecimiento Movilidad Bioqumica: Presencia o ausencia de una enzima o de toda una ruta metablica. Fermentacin de carbohidratos Utilizacin de citratos como nica fuente de carbono Tcnicas Moleculares: Sondas para hibridacin o para amplificacin en PCR. Anlisis filogentico mediante secuenciacin de 16S rRNA.

MTODOS DE IDENTIFICACIN TRADICIONALES Identificacin de enterobacterias: Como ejemplo, diversos gneros y especies de enterobacterias se identificarn mediante: - Aislamiento en medio selectivo (MacConkey) - Tincin de Gram - Sistema de identificacin API Prueba de la oxidasa: Una varilla de identificacin de la actividad oxidasa se pone en contacto con una masa bacteriana de la cepa a ensayar.

SISTEMA DE IDENTIFICACIN API. La batera de pruebas API20E es un sistema de identificacin rpida para bacterias de la familia Enterobacteriaceae y otras bacterias Gram(-). Bsicamente consta de 23 tests bioqumicos estandarizados y miniaturizados y una base de datos. Este sistema presenta las ventajas de ser rpido, eficaz y de permitir realizar numerosas pruebas a la vez. Cada tira de API 20E contiene 20 microtubos o pocillos con distintos sustratos deshidratados. Cada tubo es una prueba bioqumica distinta (ver tabla "sumario de los resultados con API 20E "). Los microtubos se inoculan con una suspensin de microorganismos, en agua o solucin salina, que rehidrata los medios. Las tiras se incuban a 37 C y por efecto del metabolismo bacteriano se van a producir cambios de colores espontneos o bien al aadir reactivos. La lectura de las reacciones se hace mediante comparacin con una tabla de lectura donde se indica si los Instrucciones API. FIGURA 9 1.- Se humidifica el sistema mediante adicin de agua destilada en los pocillos de la base de plstico transparente.

2.- Se toma con el asa de siembras una colonia de la cepa a analizar y se resuspende en 5ml de suero fisiolgico estril. Se homogeneiza la suspensin.

3.- Con ayuda de una pipeta Pasteur estril (y chupetn) se rellenan los pocillos del sistema de identificacin segn las indicaciones. Hasta el borde del tubo en todos los casos excepto: -en los marcados con el rectngulo abierto [_] en los que se rellena tambin la cpula (CIT, VP, GEL). - en el caso de los tubos marcados con subrayado _ (ADH, LDC, ODC, H2S, URE), se realizar anaerobiosis mediante adicin de parafina estril rellenando la cpula del tubo (una vez lleno el tubo con la muestra). Se incuba a 37 C durante 18-24 h

Se observan los resultados de las pruebas bioqumicas en cada pocillo o microtubo: - Tras observar el resultado de la reaccin de fermentacin de la glucosa en el tubo GLU ( y anotar en hoja de resultados), en este mismo tubo se observa la reaccin de reduccin de nitratos (mediante la adiccin de los reactivos NIT-1 y NIT-2 sucesivamente). - Se adicionan los reactivos indicados en los tubos correspondientes (TDA, IND, VOP-1 + VP-2) - Los resultados se comprueban en tabla de identificacin o programa de identificacin. (Ver fotocopias adjuntas al final)

OBSERVACIN DE BACTERIAS AL MICROSCOPIO

MICROSCOPA- MICROSCOPIOS El microscopio es uno de los instrumentos ms necesario para un microbilogo, ya que permite la observacin de organismos que no pueden ser apreciados en detalle a simple vista, es decir de los microorganismos. Existe una gran variedad de microscopios que, segn la fuente de iluminacin utilizada, se agrupan en: Microscopios pticos: La fuente de iluminacin es la luz.
De campo claro. Permiten la observacin de preparaciones, en su color natural o contrastadas mediante tinciones, resaltadas sobre un fondo ms brillante. De campo oscuro. Permiten la observacin de formas celulares que destacan brillantes sobre un fondo oscuro. Este efecto se consigue utilizando diafragmas especiales.

De contraste de fases. Gracias a la utilizacin de diafragmas y objetivos especiales, que consiguen aumentar las diferencias en el ndice de refraccin de las clulas y el medio que las rodea, permiten la observacin de clulas vivas, ya que no es necesario realizar ninguna tincin de las mismas. De interferencia. Permiten observar clulas vivas sin teir, obtenindose una imagen en relieve de las mismas. De fluorescencia. La fuente de iluminacin proporciona luz ultravioleta que excita ciertas molculas presentes en las clulas (bien de forma natural o aadidas a la preparacin) que emiten fluorescencia en el espectro visible.

Microscopios electrnicos: La fuente de iluminacin es un chorro de electrones y las lentes son electroimanes. De transmisin. Permiten la observacin de muestras teidas con sustancias que son resistentes al paso de electrones y cortadas dando lugar a lminas finas, denominadas cortes finos. Los electrones no son visibles directamente por lo que stos se envan a una pantalla que emite fluorescencia ms o menos intensa segn el nmero de electrones que inciden en ella. Las estructuras celulares que se tian ms intensamente impedirn el paso de electrones y por lo tanto no permitirn la emisin de fluorescencia, por lo que estas estructuras aparecern oscuras en un fondo ms brillante. Se consiguen entre 10.000 y 100.000 aumentos. - De barrido. Permiten la observacin de clulas enteras, sin necesidad de cortes finos, de modo que aparecen los relieves originales y las superficies externas. Alcanzan entre 1.000 y 10.000 aumentos. Durante las prcticas se emplear el microscopio ptico de campo claro, cuyos componentes fundamentales (mecnicos, de iluminacin y pticos) se muestran en la figura anterior. -

Para aumentar el lmite de resolucin, normalmente se utiliza aceite de inmersin. Es importante recordar que no todos los objetivos son impermeables al aceite, slo si lo son puede utilizarse este producto. En los microscopios que se utilizarn en las prcticas, slo puede utilizarse el aceite de inmersin con el objetivo de 100 aumentos!!.

PREPARACIONES DE OBSERVACIN EN FRESCO - A partir de cultivos en medio lquido: cargar el asa bacteriolgica con una gota de cultivo en medio lquido, depositarla en el portaobjetos y cubrir con un cubreobjetos (procurando que no queden burbujas de aire). - A partir de cultivos en medio slido: colocar una gota de agua sobre el portaobjetos con ayuda del asa. Cargar el asa (estril) con una pequea cantidad de bacterias de una colonia y resuspenderlas en la gota de agua. Observar bacterias vivas al microscopio con el objetivo de inmersin (con una gota de aceite de inmersin), observar motilidad, etc. TINCIONES Son tcnicas que permiten observar microorganismos en funcin de la capacidad de los mismos para retener (o no) determinadas sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la clula y del colorante. PREPARACIN DE EXTENSIONES DE CULTIVOS BACTERIANOS PARA TINCIONES A partir de cultivos en medio lquido o bien en medio slido, se procede como en el caso de la preparacin en fresco: - Extender la suspensin con el asa hasta conseguir una capa fina. - Secar la preparacin acercndola a la llama del mechero, evitando que se caliente demasiado, para no afectar a la estructura y forma normal de los microorganismos (se comprueba con el dorso de la mano que no est demasiado caliente). - Una vez seca la preparacin se procede a la fijacin de la muestra, haciendo pasar la preparacin 3-4 veces por la llama del mechero (la llama debe tocar la parte inferior del portaobjetos). - Una vez seca y fijada la preparacin, se procede a su tincin y posterior observacin. TINCIONES SIMPLES Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las clulas tienen una composicin qumica diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un colorante. Ejem: Azul de metileno, safranina etc.
Una vez fijada la preparacin (tras esperar que se enfre), cubrir con el colorante durante 1 minuto, lavar a continuacin abundantemente con agua destilada, y secar con papel de filtro. Observar al microscopio.

TINCIONES DIFERENCIALES Se basan en el hecho de que distintos tipos de clulas tienen distinta composicin qumica, y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tincin, lo que permite clasificar los microorganismos en diferentes grupos, segn su capacidad de tincin. En este apartado estn dos

tinciones de importancia taxonmica y mdica: la tincin de Gram y la de cido-alcohol resistencia (de Ziehl-Neelsen). Estas tinciones utilizan ms de un colorante. Tincin de Gram:
El fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una capa de peptidoglicano ms fina y una capa lipopolisacardica externa. Tras la tincin con el primer colorante (Cristal violeta) se efecta un lavado con etanol que arrastrar al colorante slo en las Gram (-), mientras que en las Gram (+) el colorante queda retenido y las clulas permanecern azules. Las clulas Gram (-) se teirn despus con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse.

foto de tincin mixta

foto de Bacillus (G+)

foto de Enterobacteria (G-)

Instrucciones para la tincin de GRAM - Cubrir la preparacin con violeta de genciana y mantener durante 1 minuto. - Escurrir el colorante y cubrir con lugol. Dejar actuar durante 1 minuto. Lavar con agua - Decolorar con alcohol-acetona durante 15 segundos. - Cubrir con el colorante de contraste (safranina). Dejar actuar durante 1 minuto. Lavar con agua y secar la preparacin. - Observar al microscopio (objetivo de inmersin, recordar usar aceite de inmersin).

Tincin de endosporas: Las bacterias de los gneros Bacillus y Clostridium se caracterizan porque forman endosporas. Las endosporas son formas de resistencia que garantizan la supervivencia de la especie ante situaciones adversas (agotamiento de nutrientes, cambios de temperatura, acumulacin de metabolitos txicos...). Estas estructuras, que contienen una copia completa del genoma, se desarrollan en el interior de la clula bacteriana, pudiendo alcanzar un dimetro considerablemente mayor que el de la clula. La clula acaba por lisarse y morir dejando libre a la espora. Las endosporas germinarn cuando las condiciones ambientales vuelvan a ser favorables. Algunas enfermedades muy conocidas son producidas por especies de los gneros Clostridium: y Bacillus: C. tetani (ttanos), C. perfringens (gangrena gaseosa), C. botulinum (botulismo), B. anthracis (antrax). - Cubrir el portaobjetos con una solucin de verde de malaquita (en abundancia), y calentar hasta la emisin de vapores. Mantener durante 3 minutos. Lavar con agua. - Cubrir con safranina como colorante de contraste. Dejar actuar 1 minuto. Lavar con agua y secar. - Observar al microscopio (objetivo de inmersin). Las esporas aparecen teidas de verde y las clulas vegetativas de rosa.

Tincin de cido-alcohol resistencia (Ziehl-Neelsen): Se basa en que ciertos microorganismos no son desteidos por una mezcla de cido y alcohol si han sido previamente teidos con fucsina fenicada. Se dice que son microorganismos cido-alcohol resistentes. Una vez realizada la decoloracin con esta mezcla se utiliza un colorante de contraste (el Azul de metileno) para poder observar las clulas sensibles a la decoloracin por cido-alcohol. Son microorganismos cido-alcohol resistentes las micobacterias, por la especfica composicin de su pared celular, y algunos actinomicetos, como Nocardia. Algunos microorganismos patgenos son cido-alcohol resistentes: Mycobacterimum tuberculosis (tuberculosis), M. leprae (lepra). - Cubrir la preparacin con fucsina fenicada y calentar hasta la emisin de vapores. Dejar actuar durante 5 minutos cuidando que no se deseque la preparacin. Lavar abundantemente con agua. Decolorar con la solucin de cido-alcohol durante 10-20 segundos. Lavar con agua. Teir con azul de metileno como colorante de contraste durante 2 minutos. Lavar y secar la preparacin. Observar al microscopio.

Las clulas cido-alcohol resistentes permanecen teidas de fucsia, ya que retienen el primer colorante, mientras que las no resistentes se decoloran con el cido-alcohol y se teirn de azul con el colorante de contraste.

Prctica DA 3
Ver resultados del aislamiento en cultivo puro: - Agotamiento - Estras escocesas - Diluciones: realizar recuento Ver resultados de la esterilizacin: - Filtracin - UV - pasteurizacin

CURVA DE CRECIMIENTO- adicin de antibitico (en condiciones estriles / Bunsen) Tomar 1m de cultivo con Pipeta Pasteur estril y medir D.O y anotar. Aadir al cultivo una solucin del antibitico suministrado. (0/60/200/600 l del stock preparado) Continuar la incubacin del cultivo a 37 C AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEL SUELO PRODUCTORES DE ANTIBITICOS
Leer instrucciones previamente !!!

Seleccionar colonias productoras de halo de inhibicin del crecimiento Sembrar estra en placa de AN ( en lateral, segn FIGURA 7 ) Incubar a 37 C 24 horas para permitir produccin del antibitico ANLISIS DE AGUAS Sistema de filtracin

Introducir filtro de 0,45mm en sistema de filtracin (con pinzas metlicas previamente flameadas) Filtrar muestra 50-100ml de la

Depositar filtro (con pinzas metlicas previamente flameadas) en placa de: Agar nutritivo marcar- incubar a 37 C MacConkey marcar incubar a 37 C MF-C marcar incubar a 44,5 C

ANLISIS DE ALIMENTOS Homogeneizar muestra Inocular 0,1ml en placa de AN, y extender con asa de vidrio previamente flameada. Lavar despus el asa de vidrio TINCIONES : Realizar TINCIN DE GRAM (segn instrucciones anteriores)

Prctica DA 4
Ver resultados del anlisis de agua y anlisis de alimentos CURVA DE CRECIMEINTO- EFECTO DE ANTIBITICO - Tomar 1ml de la muestra (con pipeta Pasteur estril) - Medir D.O. Representacin grfica Comparar resultados de soluciones de antibitico diferentes entre las mesas

CONTINUAR OBRSERVACIN DE TINCIONES

MICROORGANISMOS PRODUCTORE DE ANTIBITICOS Una vez crecido el microorganismo productor y difundido el antibitico: Sembrar estras de cepas indicadoras, perpendicularmente a la estra del organismo productor de antibitico (segn indicaciones en Figura 7, paso 4) Incubar a 37 C.

ANTIBIOGRAMA. (Ver instrucciones en Figura 8) - Tomar, son un HISOPO estril, una muestra de la cepa suministrada - Extender con la ayuda del HISOPO con objeto de obtener crecimiento en csped - Depositar los discos de antibitico (con pinza metlica previamente flameada) Incubar a 37 C

IDENTIFICACIN BACTERIANA. SISTEMA API. (Ver instrucciones en Figura 9) - Resuspender 1 colonia de la cepa problema suministra en 6ml de suero fisiolgico estril. - Inocular la muestra (con pipeta Pasteur estril) en microtubos del sistema de identificacin API - Cubrir con parafina estril los tubos indicados en el sistema - Incubar a 37 C

Prctica DA 5
Ver resultados de microorganismos productores de antibiticos Observar la inhibicin del crecimiento en las distintas cepas indicadoras

Interpretation of Zone Diameters of Test Cultures

Abbr Ampicillin Amikacin Aureomycin Bacitracin Cephalothin Chloramycetin Colymycin Erythromycin Gantrisin Gentamicin Kanamycin Lincomycin Methicillin Nalidixic Acid Novobiocin Oxacillin Penicillin Polymyxin B Streptomycin Sulfadiazine Triple sulfa Tetracycline Tobramycin AM AN A B CR C CL (colistin sulfate) E G Gm K L ME NA NB OX P PB S SD SSS TE TM RESISTANT (mm or less) 20 14 14 8 14 12 8 13 12 12 13 13 9 14 17 9 20 8 11 12 10 14 12 Intermediate (mm range) 21-28 15-16 15-18 9-12 15-17 13-17 9-10 14-17 13-16 13-14 14-17 14-17 10-13 14-18 18-21 10-13 21-28 9-11 12-14 13-16 11-15 15-18 13-14 Susceptible (mm or more) 29 17 19 13 18 18 11 18 17 15 18 18 14 19 22 14 29 12 15 17 16 19 15

Ver resultados de curva de crecimiento efecto de antibitico - Tomar 1ml de la muestra (con pipeta Pasteur estril) - Medir D.O Representacin grfica Compara resultados de soluciones de antibitico de diferente concentracin. Ver resultados de antibiograma Medir halos de inhibicin y comparar resultados con tablas de sensibilidad Ver resultados del sistema de identificacin API Ver resultados (tras adicin del reactivo indicado en su caso) Identificacin de la cepa problema

SALA INFORMTICA

Algunos enlaces de inters en Microbiologa Molecular General

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (Centro de Informacin Biotecnolgica de EEUU) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed (Base de datos de publicaciones cientficas) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Taxonomy (Identificacin del grupo taxonmico al que pertenece una especie)

Identificacin de Secuencias
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ (BLAST frente a GenBank o Banco de datos gentico mundial)

Microbiologa en Espaa
http://www.semicro.es/ (Sociedad Espaola de Microbiologa) http://www.inab.org/ (Instituto Nacional de Bioinformtica) http://www.redgb.org (Red Nacional de Genmica Bacteriana) http://www.cect.org/ (Coleccin espaola de cultivos tipo) -medios de cultivo -catlogo de especies

Listado de genomas completos y proyectos en curso

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/static/eub_g.html

Informacin detallada de funciones y anlisis metablico

http://www.genome.jp/kegg/kegg2.html (metabolic pathways, gene maps, catlogo de medicinas con sus estructuras y frmulas, etc) -Haz clic en PATHWAY en la parte superior de la pgina -Selecciona una ruta metablica (por ejemplo, metabolismo de la galactosa) Ahora aparece la ruta de referencia potencial, indicando las enzimas involucradas en la produccin de los compuestos sealados. -Selecciona una especie de entre la lista que aparece en la pestaa (por ej. E coli), y pulsa Go. Observa que aparecen marcados en color los genes presentes. Ahora sabemos qu rutas metablicas de la galactosa puede realizar la bacteria seleccionada. -Selecciona otra bacteria (por ej. Bacillus anthracis, la bacteria causante del ntrax). Como ves, muchos de los genes presentes en E coli no estn presentes en esta especie; hay rutas que no es capaz de realizar. -Selecciona, por curiosidad, Homo sapiens con alguna ruta metablica. -Vuelve a la pgina principal (KEGG2) y haz clic en LIGAND en la pestaa superior. -Ve al apartado de Search Drug (Bsqueda de medicina) y selecciona name. Introduce un nombre en ingls (por ejemplo, aspirin). Aparecer informacin sobre la aspirina, tipo de efecto teraputico, etc. -Ve al apartado de Search Compound (Bsqueda de compuesto) y selecciona name. Introduce un nombre en ingls (por ejemplo, kanamycin). Aparecer informacin sobre los distintos tipos de kanamicina, frmulas, etc.

Realizar un BLAST
1/ BLAST: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 2/ Nucleotide-Nucleotide BLAST : (blastn) ( 3 opcin dentro del apartado Nucleotide)

Observar que se abre una pantalla nueva. 3/ Abrir el documento en el que estn depositadas las secuencias en formato FASTA. (>) y copiar toda la secuencia (en el escritorio: Secuencia X) 4/ Volver a la ventana del BLAST y pegar la secuencia en la ventana Search Observar que pasa a otra pantalla con una numeracin. Haz click en FORMAT 5/ Pasado unos segundos, aparece el resultado de la bsqueda: Tratar de encontrar la siguiente informacin: - Microorganismo al que pertenece la secuencia con probabilidad Indicar a qu pertenece esa secuencia Quin deposit esa secuencia en el Banco de Genes

Realizar una bsqueda bibliogrfica

1 / Pubmed: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi Observar que existen varias opciones de bsqueda: protenas, genomas completos, nucletidos etc. En nuestro caso, si lo que queremos son publicaciones tendremos que buscar en Pubmed. 2/ En la ventana de for: introducir el parmetro de inters Probar resultados, por ejemplo con: Rodriguez-Valera F Marshall BJ o Warren JR Watson JD o Crick FH (1953)

Tabla de lectura del sistema API20E