Deteksi Mutasi Gen p53 Kromosom 17 Exon 7 dan Exon 8, Isolasi dan Identifikasi Mikroflora Probiotik Usus Besar

pada Pasien Kanker Kolorektal

Abstrak Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif yang dilakukan di Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran dan Laboratorium Bioteknologi Fakultas Pertanian. Objek penelitian ini adalah jaringan kanker kolorektal dari pasien yang telah mengalami bedah kuratif di rumah sakit Umum Pusat M. Djamil dan beberapa rumah sakit di Kota Padang. DNA hasil isolasi dari jaringan kanker kolorektal, diamplifikasi PCR dengan primer gen p53 exon 7 dan exon 8, selanjutnya disekuensing. Sekuen yang diperoleh dibandingkan dengan database yang terdapat pada NCBI internet site (http://www.ncbi.nlm nih.gov). Untuk isolasi dan identifikasi bakteri dilakukan penanaman pada medium spesisfik dan uji biokimia. Hasil penelitian yang diperoleh dari 5 sampel pasien terdapat mutasi gen p53 exon 7 pada kodon 226,230,231,232. 248,249 dengan jenis mutasi antara lain misense mutasi, silent mutasi dan mutasi delesi. Untuk exon 8 ditemukan mutasi delesi pada kodon 263 dan 294. Dan hasil isolasi dan identifikasi bakteri diperoleh bakteri genus enterobakteriaciae, salmonella .sp dan bakteri asam laktat, Lactobacillus sp. Key Word: Kanker Kolorektal, Gen p53, Mikroflora Usus, PCR-Sekuen.s. ing

PENDAHULUAN Kanker kolorektal merupakan keganasan keempat di seluruh dunia dengan perkiraan kasus 1.023.000 dan kematian 529.000 tiap tahunnva. Di Amerika Serikat kanker kolorektal menduduki urutan keganasan ketiga (Santosa. 2009). Di Kanada kanker kolorektal merupakan penyebab kematian kedua, pada tahun 2006 tercatat 20.000 kasus kanker kolorektal dan 8500 orang meninggal (Zarychanski. 2007). Dari semua jenis kanker yang ada, kanker kolorektal merupakan penyebab kematian kedua. Jumlah penderita kanker kolorektal pada laki-laki sedikit lebih banyak daripada wanita dengan perbandingan sebesar 19,4 dan 15,3 per 100.000 penduduk (Aru. 2010). Angka kejadian kanker kolorektal secara nasional belum

ada. Pada 14 provinsi di Indonesia ditemukan 1378 kasus kanker kolorektal dari total penduduk 134.743.42(1 atau 1,8 per 100.000 penduduk (Aswiyanti. 2004). Berdasarkan data patologi anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Andalas pada tahun 1999 dan 2003 kanker kolorektal menduduki peringkat ke-2 dari 10 kanker terbanyak di Sumatera Barat dengan persentase kasus 11,13% dan 16,74%. Berdasarkan data Rumah Sakit Umum Pusat (RSUP) M. Djamil Padang 2007 diketahui bahwa ada 238 pasien kanker kolorektal. Salah satu penyebab terjadinya kanker kolorekatal adalah mutasi dan allelic loss dari gen p53 (El-Mandani. 1997). Mutasi gen p53 menyebabkan hilangnya fungsi p53 sebagai pengatur perkembangan dan pematian sel yang tidak normal (Geutskens. 2000). Penelitian mengenai kanker kolorektal telah banyak dilakukan diantaranya, Overexpression of p53 niRNA in Colorectal Cancer and its Relationship to p53 Gene Mutation. Berdasarkan hasil penelitan yang diperoleh dari 109 pasien penderita kanker kolorektal di Hospital Saint-Antoine Prancis. Ekspresi mutasi pada tingkatan mRNA gen p53 terdapat tiga mutasi titik menimbulkan stop pada kodon 148, 186 dan 193. Dan 44 kasus 33 diantaranya mengalamin missense mutasi, yang umumnya terjadi pada kodon 175, 245, 248, 273, dan 272. Sembilan mutasi pada kodon 273 (enam diantaranya perubahan dari CGTTGT atau dari asam amino R Q, tiga perubahan dari CGTCAT atau dari asam amino RF1). Enam missense mutasi pada kodon 248 (empat diantarnya perubahan dari CGGCAG atau dari asam amino R-4), dan dua perubahan dari CGGTGG atau dari asam amino RW). Dua missense mutasi pada kodon 175 (perubahan dari CGCCAC atau asam amino R41. dan CGCGGC atau asam amino RG). Mutasi pada kodon 245 (perubahan dari GGCGGA atau dari asam amino GC) and GGCTGC atau dari asam amino GC). Dua mutasi lagi terjadi pada kodon 272 (perubahan dari GTGATG atau dari asam amino VM dan dari GTG--JTG atau dari asam amino VL). ada juga delesi sitosin pada kodon 257 dan 301, delesi adenin pada kodon 280. Selain itu juga ada insersi 5 basa pada kodon 263 (ElMandani.1997).

Penelitian lain yang telah dilakukan tentang kanker koloretal adalah Mutations and Allelic Loss of p53 in Primary Tumor DNA From Potentially Cured Patients With Colorectal Carcinoma. Hasil penelitiannya adalah 29 pasien yang berpotensi menderita kanker kolorektal stadium satu di Goteborg, Swedia. Rata-rata pasien ini berumur 61 tahun. 15 pasien (52%) lokasi tumornya pada kolon dan 14 pasien (48%) lokasi tumornya pada rektum. Dan 25 jaringan pasien yang diketahui menderita kanker kolorektal, 15 (60%) diantaranva mengalami mutasi pada exon 5-9. Dan 39 pasien penterita metastase 16 pasien (41%) mengalami mutasi. Empat (16%) dari 25 pasien mengalami dua mutasi. Dan 19 mutasi. empat (21%) terdapat pada exon 5. dua (11%) di exon 6, tiga (16%) di exon 7 dan sepuluh (53%) di exon 8 (Forslund. 2001). Penentuan lokasi mutasi gen p53 pada pasien kanker kolorektal menggunakan primer spesifik untuk gen p53 mulai dari exon 5-9. Penentuan lokasi mutasi gen p53 menggunakan metoda PCR dan Sequensing. Sejumlah kecil pencernaan dalam usus besar terutama disebabkan oleh bakteri dan bukan oleh kerja enzim. Usus besar mensekresi mukus alkali yang tidak mengandung enzim Mukus ini bekerja untuk melumas dan melindungi mukosa. Bakteri usus besar mensintesis vitamin K dan beberapa vitamin B. Pembusukan oleh bakteri dari sisa protein menjadi asam amino dan zat yang lebih sederhana seperti peptida, indol, skatol, fenol, dan asam lemak. Bila asam lemak dan HCl dinetralisir oleh bikarbonat, akan dihasilkan karbondioksida. Pembentukan berbagai gas seperti NH3, CO2, H2, H2S dan CH4 membantu pembentukan gas (Flatus) dalam kolon. Beberapa substansi ini dikeluarkan dalam feses sedangkan zat lain diabsorpsi dan diangkut ke dalam Kati untuk diubah menjadi senyawa yang kurang toksik dan dieksresi melalui urine (Price. 2006). Nutrisi yang masuk seperti oligosakarida dan gula alkohol yang dikonsumsi dapat memperbaiki mikroflora potensi prebiotik (intestine). Oligosakarida yang tidak dapat dicerna atau monosakarida yang tidak dapat diserap usus halus dapat digunakan oleh bakteri intestine (terutama yang berada di usus besar), yang mengakibatkan adanya produksi sejumlah Short chain fatty acid (SCFA) sehingga pH lumen usus besar menurun, bakteri yang menguntungkan

seperti Bilidobacterium dan Lactobacillus meningkat, sedangkan bakteri yang berbahaya menurun karena sensitif terhadap asam. Kondisi seperti ini meningkatkan keschatan saluran pencernaan (E Prangdimurti. 2007).

BAHAN DAN METODA Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah buffer PBS, ddH2O. agrarosa 2%. Kit isolasi DNA (Promega). isopropanol, etanol 70%. primer gen p53 exon 7 1.51[GC1-GTG TTG TCT CCT AGG TTG GCT CTG-3' dan 5'-CAA GTG GCT CCT GAC CTG GAG TC3-1 dan exon 8 {5' [GC]-ACC TGA TTT CCT TAC TGC CTC TGG C-3' dan 5'-GTC CTG CTT GCT TAC CTC GCT TAG T-3'1 (Forslund. 2001:2830). Primer universal 16S rRNA 27F dan 1525R. Pepton Water (Oxoid) 25,5 gram dalam 1 L aquades, Mc. Conkey (Oxoid) 52 gram dalam 1 L aquades, MRS (de Mann Rogosa Sharpe) Broth 52,2 gram dalam 1 L aquades. dan MRS (de Mann Rogosa Sharpe) Agar 66,2 gram dalam 1 L aquades, Kristal violet. Lugol atau iodium, Larutan Alkohol 70%, larutan safranin dan aquades.

Metoda Isolasi DNA dan Amplitikasi PCR Gen 1)53 dari Jaringan Kanker Kolorektal Isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan Wizard Genoinic DNA Purification Kit. DNA basil isolasi dicek menggunakan elektroforesis, dengan agarosa 2% dalam TBE 0,5x. Selanjutnya DNA hasil isolasi diamplifikasi PCR dengan menggakan primer gen p53 exon 7 dan exon 8. Program PCR yang digunakan adalah 35 siklus. denaturasi 95C selama 5 menit, 94C selama 30 sekon, Anealing 56C selama 30 sekon exon 7 dan 58C selama 30 sekon dan 72C selama 90 sekon dan untuk final ekstension 72C selama 7 menit. Hasil amplifikasi PCR dicek lagi menggunakan agarosa 2%. Sctelanjutnya basil amplifikasi PCR gen p53 disekuensing.

Isolasi dan Identifikasi Mikroflora Usus Besar, serta Amplifikasi PCR 16S rRNA Untuk isolasi dan identifikasi mikroflora usus besar dimulai dengan pembuatan media cair dan padat yaitu media MRS Broth, MRS Agar untuk bakteri gram positif dan Mac Conkey dan Pepton Water untuk bakteri grain negatif Selanjutnya sampel feses dari pasien kanker kolorektal dikulturkan ke dalam medium cair MRS Broth dan pepton water. Setelah diinkubasi 24 jam, kultur yang diperoleh diencerkan dan dilakukan penanaman pada medium padat MRS Agar dan Mac Conkey dan dinkubasi selama 24 jam untuk kultur pada media Mac Conkey dan 48 jam untuk kultur pada media MRS Agar. Setelah dinkubasi koloni bakteri yang tumbuh, diidentifikasi dengan melakukan pewarnaan gram dan uji biokimia (TSIA, SCA dan semi solid). Setelah pewarnaan gram selanjutnya koloni tunggal yang tumbuh dari setiap isolat dikultur lagi pada medium cair, dan diinkubator seker selama 16 jam. Selanjutnya kultur bakteri yang tumbuh diisolasi DNAnva menggunakan Wizard* Genomic DNA Puri'. ication Kit. DNA basil isolasi dicek dengan elektroforesis menggunakan agarosa 0.75%. Selanjutnya DNA hasil isolasi diamplifikasi PCR dengan primer 16S rRNA. Program PCR yang digunakan adalah denaturasi pada 96C selama 5 menit, DNA diamplifikasi melalui denaturasi pada tcmperatur 96C selama 30 sekon, annealing pada temperatur 55C selama 30 sekon, elongasi pada temperatur 72C selama 1 menit, dan ekstensi pada temperatur 72C selama 7 menit. Hasil amplifikasi PCR dapat dicek menggunakan elektroforesis gel agarosa 1,5% sebagai marker digunakan 1kb DNA ladder (Promega). Hasil dan Pembahasan Table 1. deskripsi data pasien No I 2 3 4 5 Nomor Pasi en 40C 43C IOC 14C 21C Jens Kelamin Perempuan Perempuan Laki-laki perempuan Laki-laki V mur (Tahun) 56 60 56 68 68 Lokasi Kanker Rectum Rectum Rectum Sigmoid Sigmoid

Usia pasien pada penelitian ini berkisar dari 50-70 tahun. Tiga dari pasien berada pada rentangan usia 50-60 tahun dan dua pasien lagi berada pada rentang usia 60-70 tahun. Salah satu faktor resiko terjadinya kanker adalah pertambahan usia, kasus kanker kolorektal banyak terjadi pada usia 60-70 tahun, dan jarang terjadi pada usia di bawah 50 tahun kecuali dalam sejarah keluarganya ada yang terkena kanker kolorektal (www.TotalKesehatan Anda.com). Dalam populasi umum inseden kanker kolon meningkat setelah usia 40-45 tahun, meningkat secara dasawarsa dan mencapai puncaknva pada usia 75 tahun. Hal ini bisa disebabkan oleh kerja materi karsinogenik pada sel kolon dalam peningkatan periode. Resiko diperkirakan sama bagi laki-laki dan perempuan di atas usia 40 tahun dan bila kanker kolon muncul sebelum usia 40 tahun, biasanya terjadi bersama sejumlah faktor resiko lain, terutama familial. Hal ini juga terjadi pada sampel pasien kanker kolorektal yang digunakan, 3 dari 5 pasien berumur 60-70 tahun. Jika diperhatikan dari jenis kelamin, jumlah penderita kanker kolorektal pada lakilaki sedikit lebih banyak dari pada perempuan dengan perbandingan 19,4 dan 15,3 per 100.000 penduduk (Aru,2010). Kanker rektum lebih banyak terjadi pada laki-laki, namun resiko terjadinya kanker kolorektal sedikit lebih banyak pada wanita dibandingkan laki-laki (Zahari. 2008). Hal yang sama juga terjadi dari 5 pasien yang digunakan sebagai sampel 3 diantaranya adalah wanita dan 2 sampel laki-laki. Sampel pasien yang digunakan ditemukan 3 kasus terdapat pada rectum dan 2 kasus terdapat pada kolon sigmoid. Hal ini sesuai dengan yang dijelaskan oleh Price bahwa kanker kolorektal sekitar 60% terjadi pada bagian rektosigmoid. Berdasarkan hasil isolasi DNA dan amplifikasi PCR gen p53 exon 7 dan exon 8 diperoleh hasil elektroforesis sebagai berikut:

Gambar 1. Eloktroforesis Produk PCR Gen p53 Exon 7 (1=DNA Maker 100bp, 2-4=Hasil Amplifikasi PCR Exon 7)

Gambar 2. Elektroforesis Produk PCR Gen p53 Exon 8 (1=DNA Marker 100bp, 2.3.5.6= Hasil Amplifikasi PCR Exon 8) Hasil amplifikasi PCR gen p53 exon 7 dan exon 8 selanjutnya disekuensing dua arah dengan menggunakan primer forward dan reverse. Data hasil sekuensing dianalisis dengan program software DNAstar. Sekuen yang diperoleh dibandingkan dengan database searches yang terdapat pada NCBI internet site (http : }WWW.ncbi.nlm nih. goy ; ) menggunakan program blastn (basic local alignment search tool nucleotida). Berdasarkan data hasil blastn terscbut maka dapat dilihat pada kodon berapa terjadi mutasi exon 7 dan exon 8 pada gen p53. Dari data sekuensing dapat diketahui pada kodon berapa terjadi mutasi exon 7 gen p53 (tabel 2).

Tabel 2. Mutasi yen n53 exon 7 Nama Pasien 40C Kodon 226 230 231 232 248 249 226 230 231 232 248 226 230 231 232 248 Basa yang berubah GGCGGT ACCCC AC CCCC ATC CTC CGGCAG AGGAAG CTGCGGT ACCCC ACCCCC ATCCTC CGGCAG GGCGGT ACCCC ACCCCC ATCCTC CGGCAG As am amino GlisinGlisin Treonin TreoninProlin IsoleusinLeusin ArgininGlutamin A rgininLisin GlisinGlisin Treon in TreoninProlin IsoleusinLeusin ArgininGlutamin GlisinGlisin Treonin TreoninProlin IsoleusinLeusin ArgininGlutamin steins mutasi silient Delesi Missense Missense Missense Missense silient Delesi Miss ense Missense Missense silient Delesi Missense Miss ense Missense

43C 10C 14C

21C

Berdasarkan data hasil analisis mutasi terlihat bahwa mutasi yang terjadi pada wilayah exon 7 dari 5 sampel pasien adalah 4 mutasi berupa mutasi silent pada kodon 226 yaitu penggantian basa ketiga dari kodon 226 sistem oleh timin (GGC-+GGT). akan tetapi asam amino yang disentesa tetap glisin yang merupakan asam amino netral. Mutasi ini tidak akan merubah sintesa protein yang akan dihasilkan.

Gambar 3. Asam amino glisin Sepuluh mutasi berupa mutasi misense, 3 mutasi pada kodon 231 yaitu pegantian basa pertama dari kodon 231 Adenin oleh sistein (ACCCCC), dari asam amino treonin menjadi prolin. Pergantian asam amino yang disintesa dari

treonin yang merupakan asam amino netral dengan rantai samping polar menjadi asam amino prolin dengan rantai samping non polar.

Gambar 4. Asam amino treonin dan prolin Tiga mutasi pada kodon 232 yaitu pengantian basa pertama dari kodon 232 dari adenin menjadi sitosin (ATCCTC) dari asam amino isoleusin menjadi leusin. Pergantian asam amino yang disentesa dari isoleusin menjadi leusin yang sama-sama merupakan asam amino netral dengan rantai samping non polar. Rantai samping yang dimiliki isoleusin dan leusin sama tetapi posisi (CH3) pada rantai samping isoleusin berada pada C pertama setelah C , pada leusin berada pada C kedua setelah C.

Gambar 5. Asam amino leusin dan isoleusin Tiga mutasi pada kodon 248 yaitu pengantian basa kedua dari kodon 248 dari Guanin menjadi adenin (CGGCAG) dari asam amino arginin menjadi glutamin. Pergantian asam amino yang disentesa dari arginin yang merupakan asam amino basa dengan rantai samping polar bermuatan positif menjadi asam amino glutamin yang merupakan asam amino polar tidak bermuatan.

Gambar 6. Asam amino Arginin dan glutamin Satu mutasi pada kodon 249 yaitu pengantian basa kedua dari kodon 249 dari guanin menjadi adenin (AGGAAG) dari asam amino arginin menjadi lisin. Pergantian asam amino yang disintesa dari asam amino arginin menjadi asam amino lisin yang sama-sama merupakan asam amino basa yang bersifat polar dan bermuatan positif.

Gambar 7. Asam amino Arginin dan Lisin Tiga mutasi lagi berupa mutasi delesi yang terjadi pada kodon 230 yaitu hilangnya basa pertama dari kodon 230 ACC -CC (Gambar 10). Lokasi mutasi exon 7 gen p53 yang ditemukan pada pasien kanker kolorektal Sumatera Barat memiliki kemiripan dengan mutasi yang terjadi pada pasien kanker kolorektal di Swedia yaitu sama-sama terdapat mutasi pada kodon 248 penggantian basa kedua

dari guanin menjadi adenin (CGGCAG) dari asam amino arginin menjadi glutamin (Forslund. 2001). Pada swivel pasien kanker kolorektal yang ada di Sumatera Barat ditemukan juga wilayah mutasi yang berbeda pada gen p53 exon 7nya, yaitu pada kodon 226, 230, 231 dan 232. Mutasi kodon 249 juga ditemukan pada pasien kanker kolorektal di Sumatera Barat. Mutasi pada kodon 249 pada sampel pasien kanker kolorektal yang ada di Sumatera Barat merupakan mutasi subtitusi yaitu pergantian satu basa dari tiga basa yang terdapat pada kodon 249 AGGAAG. Wilayah mutasi yang sama juga ditemukan pada pasien kanker kolorektal Italia tetapi jenis mutasi yang terjadi adalah mutasi delesi yaitu kehilangan satu basa dari AGGAG- (Russo. 2002). Dari sampel pasien yang digunakan juga ditemukan mutasi pada exon 8 gen p53 (Tabel 3) Tabel 3. Mutasi aen o53 exon 8 Nama Pasien 40C 43C 10C 14C 21C Kodon 294 263 263 Basa vang berubah GAGGAAATA-T AAT-T Asam amino Glutamat Asparagin Asparagin Jenis mutasi Delesi Delesi Delesi -

Berdasarkan data hasil analisis mutasi terlihat bahwa mutasi yang terjadi pada wilavah exon 8 dari 5 sampel pasien adalah 3 sampel mengalami mutasi, benipa mutasi delesi yaitu 1 mutasi pada kodon 294 yaitu hilangnya basa ketiga GAG GA- (Glutamat -), 2 mutasi pada kodon 263 yaitu hilangnya basa kedua dari AAT A T (Asparagin -) dan 2 sampel pasien tidak mengalami mutasi (Gambar 11). Lokasi mutasi pada kodon 263 juga ditemukan pada pasien kanker kolorektal di Prancis, akan tetapi mutasi yang terjadi adalah mutasi insertsi 5 basa dari AAT AA(GGTAA)T (El-Mandani. 1997). Sementara itu pada sampel pasien kanker kolorektal Sumatera Barat mutasi yang terjadi tergolong delesi yaitu hilangnya basa kedua dari AAT A T. Menurut Yanwirasti (2004)

mutasi gen p53 pada penyakit kanker akan menghilangkan fungsi gen p53 sebagai pemelihara genom.

Isolasi dan Identifikasi Mikroflora Usus Besar Sampel feses pasien kanker kolorektal pertama-tama dikultur pada medium cair yaitu pada medium MRS Broth dan Pepton Water, selanjutnya diinkubasi selama 24 jam. Setelah diinkubasi selama 24 jam pada medium cair, hasil kultur pada medium cair tersebut dilakukan pengenceran bertingkat sampai pengenceran 10-8. Setelah itu sampel pada pengenceran 10-7 dan 10-8 ditanam pada medium padat MRS Agar (Al dan A2) dan Mc Conkey (B1 dan B2). Setelah itu sampel yang ditanam pada MRS Agar diinkubasi selama 48 jam pada Jar anaeoribik, dan sampel Yang ditanam pada MC Koncev diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37C. Setelah diinkubasi kita dapat mengamati bentuk koloni yang tumbuh dari setiap sampel yang digunakan.

Gambar 8. Koloni Bakteri yang Tumbuh setelah Inkubasi 24 jam (B1, B2) dan Inkubasi 48 jam (Al, A2) Selanjutnya koloni yang tumbuh pada setiap media dilakukan pewarnaan gram, untuk menentukan apakah sampel tergolong bakteri gram positif atau gram negatif (Gambar). Isolat bakteri A1 dan A2 memberikan bentuk morfologi batang, berwarna keunguan. Sementara itu isolat bakteri B1 dan B2 memberikan bentuk morfologi batang berwarna merah.

Gambar 9. Hasil pewarnaan gram sampel bakteri (A=Bakteri Gram Positif, B=Bakteri Gram Negatif). Uji biokimia yang dilakukan adalah uji Sitrat, uji TSIA dan uji motilitas. Dan uji sitrat didapatkan nilai positif dengan ciri positifnya adalah medium yang awalnya berwarna hijau berubah menjadi biru untuk kedua koloni bakteri. Dan uji TSIA didapatkan hasil positif yaitu media slant berubah warna menjadi jingga atau keorangean untuk kedua koloni bakteri. Hal ini disebabkan karena bakteri ini memfermentasi laktosa menjadi sukrosa. Pembentukan gas H2 dan CO2 hasil fermentasi dapat dilihat dari pecah dan terangkatnya agar. Uji motilitas hasilnya negatif karna tidak ada pergerakan dari sengkelit biakan yang di masukkan ke dalam media untuk koloni bakteri gram negatif, sementara itu untuk koloni bakteri gram positif memberikan hasil positif (Gambar 14). Berdasarkan uji biokimia yang diperoleh maka dapat ditarik suatu kesimpulan bahwa bakteri gram negatif yang terdapat pada sampel feses pasien kanker kolorektal ini tergolong enterobakteriaciae spesies salmonella .sp. Bakteri Isolat B1 Isolat B2 Isolat Al Isolat A2 TSIA + H2S + H2S + + SCA + + + + Motilitas

Gambar 10. Hasil Uji Biokimia Koloni Bakteri Gram Negatif (A=uji motilitas, B=Uji SCA, C=Uji TSIA) Hasil isolasi DNA dari isolat bakteri dilakukan amplifikasi PCR dengan primer 16S rRNA, didapatkan hasil elektroforesis sebagai berikut:

Gambar 11. Elektroforesis Hasil Amplifikasi PCR 16S rRNA (1=DNA Marker lkb, 3,4,5,7,8=Hasil Amplifikasi PCR 16S rRNA) Hasil amplifikasi PCR 16S rRNA selanjutnva disekuensing menggunakan metoda dideoksi sanger. Hasil sekuensing ini dapat digunakan untuk menentukan strain bakteri yang diperoleh saat isolasi dari sampel feses pasien kanker kolorektal. Dan hasil sekuensing juga dapat dilihat homologinya dengan 16S rRNA yang ada pada gen bank yang ada pada ncbi internet site (http: Iwww.ncbi.nlm nih.gov}). Tahapan sekuensing untuk sampel bakteri yang

diisolasi dari sampel feses pasien kanker kolorektal telah dilakukan akan tetapi grafik hasil sekuensing yang diperoleh tidak bagus, hal ini kemungkinan disebabkan karena rendahnya konsentrasi DNA template yang digunakan, oleh karena itu sebaiknya dilakukan kembali optimasi terhadap sampel DNA genom bakteri yang akan diamplifikasi.

Kesimpulan Berdasarkan hasil dan pembahasan terhadap penelitian mengenai deteksi mutasi DNA gen p53, isolasi dan identifikasi mikroflora probiotik usus besar pada pasien kanker kolorektal dapat disimpulkan bahwa: 1. Berdasarkan analisis terhadap 5 pasien kanker kolorektal diperoleh data mutasi gen p53 exon 7 terjadi pada kodon 226. 230, 231, 232, 248 dan 249, dengan jenis mutasi antara lain mutasi misense, mutasi delesi dan mutasi silent, mutasi gen p53 exon 8 terjadi pada kodon 294 dan 263, dengan jenis mutasi delesi. 2. Berdasarkan data isolasi dan identifikasi bakteri yang terdapat pada sampel feses pasien kanker kolorektal didapatkan hasil koloni bakteri berupa bakteri gram negatif berupa bakteri genus enterobakteriaciae dengan spesies golongan salmonella sp dan grain positif berupa bakteri asam laktat (Lactobacillus sp).

Daftar Pustaka Am, Wisaksono Sudovo. Apakah Oxaliplatin atau Irinotecan yang Digunakan Sebagai Terapi Anivan Kanker Kolorektal? Sebuah Polalanan ,Sejarah Dalam Kemoterapi Kanker Usus Besar. Medicinus Scientific Journal of Pharmaceutical Development and Medical Application. 2010.Volume 23, No.2, Edisi Juni-Agustus 2010. ISSN 1979.39X: 4-6. Aswiyanti, Asri. 2004. Pengaruh Pemberian Perasan Seledri Terhadap Aktivitas Proliferasi Sel, Indeks Apoptosis dan Perubahan Histopatologi Mukosa Kolon Wistar. Tesis. Semarang. Megister Ilmu Biomedik, Program Pascasarjana Universitas Diponegoro.

Asril, Zahari. Deteksi Dini. Diagno.sa dan Penatalaksanaan Kanker Kolon clan Rektuin. Majalah Kedokteran Andalas. 2008. dalam rangka Dies Natalis 53 FK UNAND. El-Mandani, N. J-C Vailant: M Guiget: S Prevot; V Bertrand: C Bernard: R Parc: G Bereziat dan B Hermelin. Overexpression of p53 mRNA in Colorectal Cancer and its Relationship to p53 Gene Mutation. British Journal of Cancer. 1997. Vol. 75(4). Halaman 528-536. E Prangdimurti. NS Palupi dan FR Zakaria. 2007. Modal e-Learning ENBP, Departernen Ilmu dan Teknolgi Pangan Fateta IPB Forslund, Ann: Cristina Lonnroth: Marianne Andersson: Hans Brevinge: and Kent Lindholm. Mutations and Allelic Loss of p53 in Primary Iiimor DNA From Potentially Cured Patients With Colorectal Carcinoma. Journal of Clinical Oncology. 2001. Vol 19. No 11, 1 Juni 2001: pp 2829-2836. Geutskens, Sacha Diana JM Van den

Wollenberg: Marjolijin M van der Eb; Hans van Ormondt: Aart G Jochemsen: Rob C Hoeben. Characterisation of the p53 Gene in The Rat CC531 Colon Carcinoma. Gene Therapy and Molecular Biology. 2000. Vol 5:81-86. http//:WWW.TotalKesehatanAnda.com. diakses 15 September 2010, pukul 09:04 AM. Price, Sylvia Anderson; Lorraine McCarty Wilson. 2006. Patofisiologi Konsep Klinik Proses proses Penyakit. Edisi 6. Penerjemah Adji Dhanna. Penerbit Buku Kedokteran EGC. Russo, A: Manuela, M; Ines. Z. p53 Mutation in L3-Loop Zinc-binding Domain, DNAPlo/dy, and S Phase Fraction Are Independent Prognostic Indicators in Colorectal Cancer: A Prospective Study with a Five-Year Follow-Up. Cancer Epidemiology, Biom arkers and Prevention. American Association for Cancer Research. 2002. Vol 11. Halaman 1322-1331. Yanwirasti. 2004. Gen p53 "The Guardian of Genom-. Orasi 1lmiah. Dies Natalis Ke 49 Fakultas Kedokteran Universitas Andalas. Padang Zarychanski, Ryan; Yue Chen: Charles N. Bernstein: Paul C. Hebert. Frequency of Colorectal Cancer screening and the Impact of Family Physicians on Sreening Behaviour. CMAJ. Canadian Medical Association or its L censos. 2007. Vol 177(6): 593-598.