1.

Irinne Dyah P

2. Johannes Sinaga
3. Marselina 4. Muh. Fitriyadi Z

5. Munasia Hardiyanti S
6. Nelly Ariani 7. Novi Helianti

 Sequencing adalah penentuan urutan basa DNA dalam

segmen molekul DNA yang relatif pendek . Pengurutan ( sequencing ) asam nukleat memungkinkan kita mengetahui kode genetic dari molekul DNA. Sequencing merupakan metode menentukan urutan basa nukleotida, adenin, guanin, citosin, timin pada sepotong DNA.

 Urutan nukleotida menentukan urutan asam amino, yang

akhirnya menentukan struktur protein dan fungsinya.

Perubahan sekuens DNA dapat mengakibatkan

perubahan protein atau menyebabkan terbentuknya protein non fungsional Akibatnya dapat menimbulkan efek merugikan pada organisme

Sekuen DNA membawa informasi

Transcription

Translation

DNA

mRNA

Protein

 DNA sequencing menggunakan metode PCR (Polymerase

Chain Reaction) sebagai pijakannya. DNA yang akan ditentukan urutan basa ACGT-nya dijadikan sebagai cetakan (template) untuk kemudian diamplifikasi menggunakan enzim dan bahan-bahan yang mirip dengan reaksi PCR, namun ada penambahan beberapa pereaksi tertentu. Proses ini dinamakan cycle sequencing.

Pada akhir cycle sequencing, yang dihasilkan adalah fragmen-fragmen DNA dengan panjang bervariasi. Jika fragmenfragmen tersebut dipisahkan dengan elektroforesis, maka akan terpisah-pisah dengan jarak antar fragmennya satu basa-satu basa

A.

Metode Maxam-Gilbert
Metode Maxam-Gilbert merupakan metode yang didasarkan atas pemotongan DNA didaerah spesifik oleh zat-zat kimiawi selain enzim. Akan tetapi, metode ini sekarang jarang digunakan . Menggunakan chemical sequencing

B.

Metode Sanger

Metode

Sanger menggunakan dideoxynucleotide triphosphates(ddNTPs) yang memiliki sebuah H pada karbon-3 dari gula ribosa. Yang normal memiliki OH pada deoxynucleotide triphosphates (dNTPs). Dideoxynucleotides merupakan penghenti rantai. Dalam reaksi sintesis jika dideoxynucleotide ditambahkan dan bukan normal deoxynucleotide, sintesis akan berhenti karena 3OH yang diperlukan untuk penambahan nukleotida berikutnya tidak ada.

DNA Sequencing

A lot of modern DNA sequencing is based upon the following modified nucleotides.
Metode Sanger dideoxy ditemukan oleh Frederick Sanger memenangkan Nobel 1980

 DNA utas tunggal dalam jumlah cukup sebagai template

DNA Primer yang sesuai (sepotong kecil DNA yang berpasangan dengan template DNA dan berfungsi sebagai starting point untuk replikasi DNA polymerase (enzim yang mengkopi DNA, menambahkan nukleotida baru ke ujung 3 dari template Sejumlah nukeotida normal Sejumlah kecil dideoxynucleotide yang dilabel (radioaktif atau dengan pewarna fluorescent)

 Template DNA direplikasi melibatkan nukeotida

normal tetapi secara random dideoxy (DD) nukleotida diambil (dipasangkan). Penambahan dideoxy nukeotida menyebabkan reaksi berhenti Hasilnya DNA dengan panjang yang bervariasi , masing-masing berhenti pada DDnukleotida tertentu yang dilabel. Karena tiap panjang yang berbeda bergerak dengan kecepatan yang berbeda selama elektroforesis, maka urutannya dapat ditentukan.

 DNA yang akan ditentukan urutan basa ACGT-nya dijadikan

sebagai cetakan (template) untuk kemudian diamplifikasi menggunakan enzim dan bahan-bahan yang mirip dengan reaksi PCR, namun ada penambahan beberapa pereaksi tertentu. Proses ini dinamakan cycle sequencing. Saat proses ekstensi, enzim polimerase akan membuat rantai baru DNA salinan dari template , proses polimerisasi akan terhenti dan berikutnya membentuk ikatan posfodiester. Pada akhir cycle sequencing, yang dihasilkan adalah fragmen-fragmen DNA dengan panjang bervariasi. Jika fragmen-fragmen tersebut dipisahkan dengan elektroforesis, maka akan terpisah-pisah dengan jarak antar fragmennya satu basa-satu basa.

Sebuah flourimeter dan komputer dihubungkan ke gel dan mendeteksi dan mencatat warna yang berikatan dengan fragmen saat mereka melewati gel Urutan/sekuens ditentukan berdasarkan urutan warna yang keluar dari gel. Digunakan fluorescently labeled dideoxy nucleotides (yang dapat digabungkan dalam satu tabung) dan dipisahkan dengan capillary electrophoresis dan dibaca dengan laser saat DNAs melewati jendela detektor.

 Komputer akan menghasilkan kromatogram seperti yang

terlihat dibawah ini.

DNA Sequencing Metode original dengan menggunakan radiolabeled DNA.

Sejumlah kecil dideoxy nucleotides ditambahkan ke reaksi polymerase DNA.

DNA Sequencing
1.Terdapat lebih dari satu utas DNA dalam reaksi. 2. Tidak semua nukeotida adalah dideoxy. Sehingga multiple terminated products dihasilkan (tanda panah merah)

Capillary tubes Reagents

Sample tray goes here