DISERTASI ISOLASI METABOLIT SEKUNDER DARI BUAH, KULIT BATANG DAN DAUN MAHKOTA DEWA (Phaleria macrocarpa (Scheff.

) Boerl.) SERTA UJI ANTIOKSIDANNYA

Disertasi untuk memperoleh derajat Doktor dalam Ilmu Kimia pada Universitas Gadjah Mada

SUSILAWATI 08/276701/SPA/217

PROGRAM STUDI S3 ILMU KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS GADJAH MADA YOGYAKARTA

Tahun 2012

229

RINGKASAN ISOLASI METABOLIT SEKUNDER DARI BUAH, KULIT BATANG DAN DAUN MAHKOTA DEWA (Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.) SERTA UJI ANTIOKSIDANNYA Susilawati NIM. 08/276701/SPA/217

PENDAHULUAN Buah, kulit batang dan daun mahkota dewa di Indonesia secara empiris telah digunakan untuk mengatasi berbagai macam keluhan dan penyakit dan hasilnya dapat menyembuhkan dengan memuaskan. Mahkota dewa merupakan salah satu tumbuhan tradisional Indonesia yang belum memiliki acuan informasi yang lengkap guna pemanfaatan secara optimal. Uji fitokimia pendahuluan terhadap ekstrak metanol kasar bagianbagian tumbuhan mahkota dewa dengan FeCl3 menunjukkan adanya senyawa fenolat pada ekstrak metanol kasar buah, kulit batang dan daun. Senyawa fenolat atau polifenolat adalah merupakan senyawa antioksidan alami tumbuhan. Penelitian tentang mahkota dewa telah banyak dilakukan, tetapi kebanyakan tentang uji bioaktivitas (anti mikroba, brine shrimp, sitotoksik, antikanker, farmakologi dan aktivitas antioksidan) dari ekstrak buah, biji dan daun. Senyawa derivat asam naftoat, isofalerin A dan faleriaelide belum pernah dilaporkan dari buah mahkota dewa. Makronon dengan aktivitas antioksidannya belum ada dilaporkan dari kulit batang mahkota dewa. Selain itu, benzofenon aglikon dengan aktivitas antioksidan yang sangat kuat, isofalerin B dengan aktivitas antioksidannya belum ada dilaporkan dari daun mahkota dewa. Oleh sebab itu maka tujuan penelitian ini adalah untuk mengisolasi senyawa metabolit sekunder dari ekstrak aktif antioksidan buah, kulit batang dan daun mahkota dewa dan menentukan struktur molekul senyawa hasil isolasi dengan analisis spektroskopi serta untuk mengetahui keaktifan senyawa hasil isolasi yang mengandung gugus fenol sebagai antioksidan.

230

TINJAUAN PUSTAKA Tumbuhan mahkota dewa termasuk kedalam genus Phaleria dan famili Thymelaeaceae. Kandungan kimia yang telah diisolasi dari buah mahkota dewa antara lain asam galat (Faried dkk., 2007), seskuiterpen glikosida (icarisida C3), ksanton glikosida (mangiferin) (Oshimi dkk., 2008), dan lignan yang mirip dengan syringaresinol (Lisdawati dkk., (2007). Benzofenon glikosida (6,4dihidroksi-4-metoksibenzofenon-2-O--D-glukopiranosida) telah diisolasi dari ekstrak kloroform, ekstrak etil asetat dan ekstrak butanol buah mahkota dewa (Oshimi dkk., 2008, Hakim dkk., 2004, Tambunan dan Simanjuntak, 2006). Senyawa ini merupakan satu-satunya senyawa yang telah diisolasi dari kulit batang mahkota dewa (Winarno dan Katrin, 2009). Satu senyawa yaitu falerin (4,5-dihidroksi-4-metoksibenzofenon-3-O--D-glukopiranosida) telah diisolasi dari daun mahkota dewa (Hartati dkk., 2005). Kandungan kimia famili Thymelaeceae telah diisolasi seperti diterpen tipe dafnan yang terasilasi oleh asam lemak tak jenuh dari akar Stellera chamaejasme L (Jiang dkk., 2002). Ullah, dkk., (1999) telah mengisolasi lignan yang berkonjugasi dengan kumarin dalam bentuk glikosida dari Daphne oleiodes. Benzofenon glukosida (6,4-dihidroksi-4-metoksibenzofenon-2-O--D-

glukopiranosida) juga telah diisolasi dari Gnidia invoclurata (Ferrari dkk., 2000).

LANDASAN TEORI Pada penelitian ini ekstraksi terhadap sampel dilakukan secara maserasi dengan pelarut metanol dan bantuan pemanasan. Ekstraksi dengan pelarut metanol dapat dilakukan secara efisien berdasarkan prinsip bahwa ukuran molekulnya yang kecil dapat menembus sampai ke dalam dinding sel dan vakuola sel tumbuhan tempat dimana metabolit sekunder tersebut berada. Metanol dapat mengeluarkan semua metabolit sekunder yang berada dalam vakuola. Metanol melarutkan metabolit polar bersama dengan medium dan senyawa-senyawa non polar diekstrak dengan cosolubilization ((Silva dkk., 1998). Jadi pada ekstrak metanol kasar terkandung ekstrak non polar sampai polar. Proses maserasi yang memakai pemanasan pada suhu 60 oC (di bawah titik didih metanol) akan

231

membuat senyawa metabolit sekunder lebih cepat dan sempurna keluar dari vakuola sel tumbuhan mahkota dewa. Proses maserasi yang memakai pemanasan pada suhu 60 oC akan membuat senyawa metabolit sekunder lebih cepat dan sempurna keluar dari vakuola sel tumbuhan mahkota dewa. Ekstraksi cair-cair digunakan untuk memisahkan ekstrak metanol kasar dengan pelarut berdasarkan kepolarannya seperti dengan n-heksana, kloroform, etil asetat sehingga akan diperoleh ekstrak dengan jumlah komponen lebih sederhana yaitu non polar, semi polar dan polar. Dalam prakteknya, terbentuk bidang batas antara ekstrak yang polar dengan yang lebih non polar sehingga dapat dipisahkan. Masing-masing ekstrak, dari non polar sampai polar dapat dipisahkan dan diuapkan sehingga diperoleh ekstrak kering. Ekstrak non polar yaitu ekstrak n-heksana tidak mengandung senyawa fenolat sehingga aktivitas antioksidannya tidak diuji. Ekstrak n-heksana mengandung komponen yang mudah menguap sehingga diidentifikasi

menggunakan GC-MS untuk menentukan struktur senyawa non polar. Ekstrak kloroform, ekstrak etil asetat dan ekstrak metanol yang mengandung senyawa fenolat diuji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH. Ekstrak yang mempunyai aktivitas antioksidan selanjutnya dimurnikan menggunakan

kromatografi kolom. Proses pemurnian dengan kromatografi kolom menggunakan silika gel secara meluas telah digunakan sebagai fase diam untuk pemisahan bahan alam. Permukaan silika gel terdiri dari gugus silanol/ gugus hidroksi yang merupakan pusat aktif dan potensial untuk membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa yang dikromatografi. Potensial ikatan hidrogen yang lebih kuat akan ditahan lebih kuat oleh silika gel. Contoh : senyawa polar mengandung gugus karboksilat dengan kuat diserap pada silika gel. Senyawa non polar seperti terpen atau senyawasenyawa lain yang kekurangan gugus fungsi polar akan kurang ditahan oleh silika gel. Kekuatan suatu senyawa untuk ditahan oleh silika gel tergantung pada polaritas dari pelarut. Pelarut yang mempunyai ikatan hidrogen lebih kuat akan lebih baik mengelusi senyawa polar yang ditahan pada silika gel kolom. Begitu

232

juga, pelarut yang non polar digunakan untuk mengelusi senyawa non polar. Contoh pelarut non polar adalah n-heksana, contoh pelarut polar adalah metanol (Salituro dan Dufresne, 2008). Proses elusi dapat dilakukan dengan menggunakan pelarut yang sama dari awal sampai akhir yang disebut isokratik. Jika kepolaran pelarut dinaikkan maka disebut peningkatan kepolaran secara bertingkat atau SGP. Untuk kromatografi fase normal, peningkatan kepolaran secara bertingkat dapat dilakukan dengan pemakaian pelarut dari non polar ke polar. Metode SGP dapat memisahkan solut dengan sifat dan waktu retensi berbeda secara meluas pada suatu pemisahan tunggal. Metode SGP sering menghasilkan pemisahan komponen dengan lebih baik karena adanya gradien dapat memperjelas pita-pita kromatografi. Tetapi metode ini membutuhkan banyak peralatan dan waktu yang lebih lama dibandingkan metode isokratik (Cannell, 1998). Pemurnian senyawa organik tahap akhir dilakukan dengan teknik rekristalisasi karena senyawa organik yang diperoleh membentuk zat padat (kristal/amorf) jika pelarutnya telah menguap. Pelarut yang baik untuk rekristalisasi adalah pelarut yang dapat melarutkan dengan baik dalam keadaan panas, tetapi tidak melarutkan pada suhu kamar. Rekristalisasi dapat juga menggunakan campuran pelarut, misalnya suatu senyawa larut baik dalam metanol tetapi hampir tidak larut dalam air, maka zat yang akan direkristalisasi dilarutkan dengan metanol, kemudian dipanaskan ditambahkan air, jika terjadi kekeruhan atau gumpalan merupakan indikasi bahwa dapat terjadi rekristalisasi lalu dibiarkan mengkristal pada suhu kamar. Jika terjadi kristal maka disaring atau didekantasi (Fessenden dkk., 2001) Uji bioaktivitas antioksidan yang dipilih dalam penelitian adalah metode DPPH, suatu metode kalorimetri yang cepat dan efektif untuk memperkirakan aktivitas antiradikal. Molekul DPPH adalah sumber radikal bebas stabil yang mengandung nitrogen organik ditunjang oleh delokalisasi dari kelebihan elektron cadangan molekul. Radikal bebas DPPH berwarna violet dengan absorbansi kuat pada maks 515 nm. Bila DPPH dicampur dengan senyawa antioksidan akan meningkatkan DPPH bentuk tereduksi dengan menghilangkan warna violet

233

berangsur menjadi warna kuning pucat. Perubahan warna ini dapat diukur secara spektrofotometri.

Gambar 1 Mekanisme penangkapan radikal DPPH oleh molekul donor

Radikal akan bereaksi lebih lanjut dengan kontrol stoikiometri dimana jumlah molekul DPPH tereduksi sebanding dengan 1 molekul reduktan. Reaksi di atas berhubungan dengan sistem oksidasi (Molyneux, 2004). Salah satu metode dari mekanika kuantum adalah metode semiempirik. Perhitungan dengan metode semiempirik dapat dijalankan lebih cepat karena tidak semua persamaan diselesaikan secara eksak dan elektron yang diperhitungkan hanyalah elektron valensi saja. Analisis sifat senyawa seperti spektrum UV, NMR dan IR dapat ditentukan dengan metode semiempirik. Pada metode semiempirik, parameter dioptimasi untuk memberikan kedekatan dengan sifat molekular yang dihasilkan dari perhitungan eksperimental. Metode semiempirik AM1 dan PM3 dirancang untuk memproduksi struktur dari sejumlah besar molekul organik. Parameterisasi dari metode semiempirik ini dapat bersumber dari data eksperimen. Itulah sebabnya harus dilakukan pemilihan metode semiempirik dengan memperhatikan golongan senyawa yang akan dianalisis. Untuk keperluan khusus seperti analisis spektrum harus dilakukan pemilihan metode semiempirik yang parameterisasinya didasarkan pada data spektroskopi. AM1 dan PM3 sangat baik untuk sistem yang bervariasi terutama senyawa organik eksperimen. Data yang dihasilkan dari metode ini tidak selalu sesuai dengan data eksperimen dan sering menunjukkan kekuatan dan kelemahan dari

234

pada variasi analisis struktur dan energi molekul. Metode AM1 dan PM3 cukup baik untuk memprediksi cincin beranggota 6 (Pranowo, 2011).

METODE PENELITIAN 1. Alat dan Bahan Penelitian Alat yang digunakan : neraca analitik, seperangkat alat destilasi sederhana, maserator (panci infus), evaporator Buchii (R-124), corong pisah, kolom khromatografi, kertas Whatman no 1, bejana TLC, lampu UV, alat pengukur titik leleh (Electrothermal 9100), polarimeter Atago Polax-D, spektrofotometer UV-vis (Spectronic 3000, Genesis 10), spektrofotometer IR (Shimadzu IRPrestige-21), spektrometer NMR (JEOL JNM ECA-500, operasi pada 500 MHz (1H-) dan 125 MHz (13C-)), GC-MS-QP2010S Shimadzu dan perangkat lunak kimia komputasi yaitu HyperChem for Window versi 7.0 (Hypercube). Bahan yang digunakan : sampel, metanol (teknis, didestilasi dan p.a), nheksana (teknis, didestilasi) etil asetat (teknis, didestilasi), kloroform p.a (Merck), aseton p.a (Merck), etanol (Merck), FeCl3 (Merck), bubuk Mg (Merck), HCl (Merck), KOH (Merck), NH4OH (Merck), dragendorff (Merck), asam asetat anhidrid (Merck), asam sulfat (Merck), plat TLC silika gel GF254 (Merck), silika gel 60 (Kieselgel 0,063-0,200 mm) (Merck), TLC glass preparatif, DPPH (Merck) dan natrium sulfat anhidrat (Merck).

2 Prosedur Penelitian 2.1 Persiapan sampel Sampel (buah, kulit batang dan daun mahkota dewa) dibersihkan, dipotong kecil-kecil dan dikeringkan selama beberapa hari dalam ruangan terbuka dan terlindung dari sinar matahari 2.2 Uji fitokimia Pemeriksaan fenolat dan polifenolat Ekstrak yang akan diperiksa dimasukkan ke dalam plat tetes kemudian ditambahkan beberapa tetes larutan FeCl3 (5% dalam air atau etanol). Pewarnaan

235

biru atau biru ungu memberikan indikasi positif fenolat. Adanya endapan coklat menunjukkan senyawa polifenolat Pemeriksaan flavonoid (Shinoda Test) Ekstrak yang akan diperiksa dimasukkan ke dalam plat tetes kemudian ditambahkan bubuk Mg dan beberapa tetes HCl. Pewarnaan oranye, pink merah sampai merah lembayung memberikan indikasi adanya flavon, flavonol dan atau ksanton (Silva dkk., 1998, Wagner dkk., 1984). 2.3 Ekstraksi Sampel buah, kulit batang dan daun mahkota dewa yang telah dikering anginkan selama beberapa hari diekstraksi secara maserasi menggunakan metanol selama 7 jam pada 60 oC kemudian dibiarkan semalam pada suhu kamar. Kemudian ekstrak metanol kasar didekantasi, disaring dan dipekatkan dengan evaporator rotasi untuk menguapkan pelarut sehingga diperoleh ekstrak metanol kasar pekat. Ekstraksi cair-cair dilakukan menggunakan corong pisah berturut-turut dengan n-heksana, kloroform dan etil asetat. Ekstrak n-heksana, ekstrak kloroform, ekstrak etil asetat dan ekstrak metanol kemudian dievaporasi dengan evaporator rotasi untuk menghasilkan ekstrak kering. 2.4 Uji fitokimia ekstrak Uji ekstrak n-heksana, ekstrak kloroform, ekstrak etil asetat dan ekstrak metanol dilakukan dengan pereaksi fitokimia dengan cara yang sama dengan uji fitokimia pendahuluan pada ekstrak metanol kasar (prosedur 2.2). 2.5 Uji antioksidan ekstrak Uji aktivitas antioksidan terhadap ekstrak kloroform, ekstrak etil asetat dan ekstrak metanol dilakukan dengan metode DPPH. Sebanyak 250 L masingmasing ekstrak ditambahkan 1 mL DPPH 0,4 mM dan ditambahkan metanol sampai 5 mL, kemudian didiamkan 30 menit. Absorban dibaca pada 515 nm pada spektrofotometer UV-vis. Sebagai blanko digunakan pelarut metanol dan sebagai kontrol negatif digunakan 1 mL DPPH yang ditambahkan 4 mL metanol tanpa ekstrak sampel (Molyneux, 2004).

236

2.6. Pemurnian Ekstrak kloroform, ekstrak etil asetat dan ekstrak metanol dari buah, kulit batang dan daun yang mempunyai aktivitas antioksidan selanjutnya dilakukan pemurnian menggunakan kromatografi kolom. Pemilihan eluen dengan analisis TLC dilakukan untuk mendapatkan eluen yang menghasilkan pemisahan terbaik pada kromatografi kolom. Silika gel disuspensikan dengan eluen yang diperoleh dari TLC, dijaga agar tidak ada gelembung udara, kemudian dimasukkan ke dalam kolom gelas yang dibagian bawahnya diberi glasswall. Eluen yang ada dalam kolom dibiarkan mengalir perlahan-lahan sambil diketok sehingga diperoleh susunan partikel yang homogen, kemudian kolom ditutup dan didiamkan selama 1 malam. Eluat dalam kolom dikeluarkan sampai bersisa 1 cm dari permukaan kolom. Sampel dimasukkan dengan hati-hati ke dalam kolom, eluen di permukaan sampel dijaga agar masih berlebih kira-kira 0,5 cm selanjutnya dielusi perlahan dan hati-hati dengan eluen yang cocok. Eluat yang turun ditampung dengan botol vial kosong. Setiap eluat dalam botol vial dimonitor dengan TLC, eluat yang memberikan noda yang sama digabung sebagai satu fraksi. Jika dengan kolom pertama ini telah diperoleh noda tunggal, maka kristal dimurnikan lebih lanjut dengan cara rekristalisasi. Bagi fraksifraksi yang belum memberikan noda tunggal maka dilakukan kromatografi ulang atau TLC preparatif. Karakterisasi kristal atau senyawa murni dilakukan dengan TLC menggunakan beberapa eluen, pengukuran titik leleh dengan alat Electrothermal dan reaksi warna dengan pereaksi fitokimia untuk menentukan golongan senyawa. 2.7 Elusidasi struktur senyawa hasil isolasi Untuk elusidasi struktur senyawa hasil isolasi dilakukan analisis spektra UV, IR, dan 1H NMR dan
13

C NMR, HMBC, HMQC, COSY, DEPT serta MS.

Pengambilan spektra UV, IR, MS dan GC-MS di Laboratorium Kimia Instrumen Organik UGM, sedangkan untuk spektra NMR, NMR 2D di LIPI Serpong.

237

2.8 Uji antioksidan senyawa hasil isolasi Aktivitas antioksidan dari senyawa hasil isolasi diukur dengan metode DPPH seperti pada uji antoksidan ekstrak. Kemampuan menangkap radikal DPPH dihitung sebagai persentase berkurangnya serapan larutan yang mengandung senyawa bioaktif yang menangkap radikal DPPH dibandingkan dengan larutan kontrol dengan rumus perhitungan sebagai berikut :

Pada penelitian ini dilakukan uji aktivitas sebagai penangkap radikal DPPH dari senyawa isolasi pada beberapa variasi konsentrasi dengan 3 kali pengulangan (triplo). Sebagai kontrol positif digunakan kuersetin (antioksidan alami) Dari data prosentase aktivitas pada variasi konsentrasi selanjutnya digunakan untuk menentukan harga IC50 (konsentrasi sampel yang memiliki aktivitas 50%) dari masing-masing sampel menggunakan persamaan regresi liner y = ax + b. 2.9 Analisis Spektrum UV, IR dan NMR secara Kimia Komputasi Analisis spektra UV, IR dan NMR (1H NMR dan 13C NMR) dari senyawa hasil isolasi saling menunjang untuk elusidasi struktur. Struktur senyawa hasil isolasi yang diperkirakan dari elusidasi struktur secara spektroskopi terlebih dahulu digambar secara 2 dimensi dengan menggunakan perangkat lunak HyperChem tanpa add hydrogens pada menu draw. Dengan menggunakan menu build maka struktur dapat dibentuk, selanjutnya dipilih add H & build pada menu mode build untuk membentuk struktur tiga 3 dimensi. Untuk senyawa yang merupakan stereoisomer, perubahan R menjadi S atau sebaliknya dengan cara mengaktifkan mode draw (atom C) kemudian tekan secara bersamaan Ctrl dan Shift dan diklik pada atom khiral yang akan diganti konfigurasinya. Pemilihan metode semiempiris yang paling sesuai dilakukan untuk menampilkan struktur senyawa hasil isolasi dengan konformasi yang paling stabil dan energi molekul terendah. Pemilihan metode ini dilakukan dengan membandingkan geometri hasil optimasi metode AM1 dan PM3 terhadap data eksperimen (UV, IR dan NMR). Metode dengan hasil perhitungan optimasi

238

geometri yang paling mendekati data eksperimen dianggap sebagai metode semiempiris yang paling representatif untuk langkah perhitungan komputasi selanjutnya. Optimasi geometri dilakukan pada menu Compute terhadap struktur tadi untuk memperoleh struktur dengan konformasi yang paling stabil dan energi terendah. Setelah itu baru dilakukan penentuan spektra UV, IR dan NMR. HASIL DAN PEMBAHASAN Pada penelitian ini telah diisolasi 7 senyawa dari buah, kulit batang dan daun mahkota dewa, 6 diantaranya merupakan senyawa baru. 1. Derivat asam naftoat Ekstrak etil asetat buah mahkota dewa dimurnikan dengan kromatografi kolom, fraksi 1-7 diperoleh positif fenolat, fraksi 8-11 negatif fenolat. Fraksi 1 dimrnikan kembali dengan kromatografi kolom ulang dan diperoleh 5 fraksi yang semuanya positif fenolat. Fraksi 1.2 diperoleh berupa kristal putih sebanyak 6 mg (0,0011%). Noda berfluoresensi oranye pada TLC di bawah UV366. Senyawa hasil isolasi mempunyai titik leleh 223-226 oC dan bukan merupakan senyawa fenolat karena negatif dengan FeCl3. Spektrum UV(CHCl3) dari senyawa hasil isolasi menunjukkan absorbansi maksimum pada 257, 311 dan 359 nm yang

menunjukkan kehadiran senyawa asam aromatik. Dari analisis data spektroskopi (H dan C-NMR, HMQC, COSY, HMBC) diperkirakan bahwa senyawa hasil isolasi adalah derivat asam naftoat dengan rumus molekul C27H38O4 atau Asam (E)-6,8-dimetoksi-3-(3,7,10-trimetilundek-1-enil)-1-naftoat.

2. Isofalerin A Fraksi 1.5 dari ekstrak etil asetat buah mahkota dewa terdahulu diperoleh berupa kristal jarum krem sebanyak 10 mg (0,0018%), larut dalam metanol, positif dengan FeCl3 yang menunjukkan senyawa fenolat. Absorbansi maksimum

239

spektrum UV(MeOH) pada 210 dan 293 nm, absorbansi pada 293 nm menggambarkan sistem aromatis yang tersubstitusi keton dalam senyawa. Analisis terhadap spektrum
13

C-NMR

(CD3OD-d4,

125

MHz)

menunjukkan bahwa senyawa hasil isolasi mengandung 20 atom C. Dari analisis data spektroskopi (H dan C-NMR) ditetapkan bahwa senyawa hasil isolasi adalah isofalerin A (isomer dari isofalerin B) dengan ikatan gula pada senyawa ini adalah -glukosida.

3. Benzofenon glukosida Fraksi 2.4 dari ekstrak etil asetat buah mahkota dewa terdahulu diperoleh berupa amorf bulat kecil berwarna kuning sebanyak 70 mg (0,0127%) dengan titik leleh 281-289 oC yang larut dalam aseton dan DMSO. Senyawa ini positif dengan FeCl3 yang menunjukkan senyawa fenolat. Hasil analisis TLC menunjukkan noda berfluoresensi gelap di bawah UV366. Spektrum UV(MeOH) menunjukkan absorbansi maksimum pada 208, 226 dan 293 nm. Absorbansi pada 293 nm menggambarkan sistem aromatis yang tersubstitusi keton dalam senyawa. Spektrum IR(KBr) menunjukkan pita serapan kuat pada bilangan gelombang 3363 dan 3217 cm-1 untuk gugus hidroksil. Pita serapan pada 2877 cm-1 menunjukkan kehadiran gugus C-H alifatik. Pita serapan kuat pada 1604 cm-1 yang didukung oleh pita serapan pada 1278 cm-1 menunjukkan kehadiran hidroksi aril keton/keton aromatik. Adanya gugus karbonil keton ditunjukkan oleh pita serapan pada 1651 cm-1. Kehadiran C=C dalam cincin aromatik ditunjukkan oleh pita serapan pada 1440 cm-1. Vibrasi dari ikatan eter aromatik ditunjukkan oleh pita serapan kuat pada 1087 cm-1. Analisis terhadap spektrum 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) menunjukkan bahwa senyawa hasil isolasi mengandung 20 atom C. Dari analisis spektroskopi

240

(H dan C-NMR, HMQc, COSY, HMBC dan DEPT) diketahui bahwa senyawa hasil isolasi adalah senyawa lama yaitu 6,4-dihidroksi-4-metoksibenzofenon-2O--D-glukopiranosida dengan rumus molekul C20H22O10. Senyawa ini tidak mempunyai aktivitas antioksidan.

4. Diterpenoid glikosida (faleriaelide) Ekstrak metanol buah mahkota dewa dimurnikan dengan kromatografi kolom, diperoleh 10 fraksi, Fraksi 1-4 negatif fenolat sedangkan fraksi 5-10 positif fenolat. Fraksi 5 di TLC preparatif dan diperoleh kristal jarum putih sebanyak 4 mg (0,0007%) yang larut dalam metanol, tidak bereaksi positif dengan FeCl3, sehingga tidak menunjukkan senyawa fenolat. Hasil analisis TLC menunjukkan noda berfluoresensi biru terang di bawah UV366. Spektrum UV(MeOH) menunjukkan absorbansi maksimum pada panjang gelombang 215 dan 261 nm. Absorbansi pada 261 nm menggambarkan senyawa keton ester yang dimiliki senyawa ini. Spektrum IR(KBr) menunjukkan pita serapan kuat dan lebar pada bilangan gelombang 3387 cm-1 untuk gugus hidroksil, pita serapan pada 2931 cm-1 menunjukkan serapan C-H alifatik. Adanya gugus karbonil keton ester ditunjukkan oleh pita serapan tajam pada 1728 dan 1604 cm-1. Vibrasi dari ikatan eter aromatik ditunjukkan oleh pita serapan kuat pada 1064 cm-1. Spektrum IR ini mirip dengan diterpen tipe dafnan yang terasilasi oleh asam lemak tak jenuh dan mempunyai lingkar aromatis dari akar Stellera chamaejasme L yang mempunyai pita serapan IR pada bilangan gelombang 3448, 2925, 2855 dan 1705 cm-1. Analisis terhadap spektrum
13

C-NMR

(CD3OD-d4,

125

MHz)

menunjukkan bahwa senyawa hasil isolasi mengandung 32 atom karbon. Dari

241

spektroskopi analisis (H dan C-NMR, HMQC, COSY, HMBC), senyawa ini merupakan diterpenoid glikosida (gula ramnosa) yang dinamai faleriaelide dengan rumus molekul C32H53O18

5. Diepoksilignan (makronon) Ekstrak etil asetat kulit batang mahkota dewa dimurnikan dengan kromatografi kolom dan diperoleh 8 fraksi. Fraksi 8 dimurnikan kembali dengan kromatografi kolom ulang dan dihasilkan 7 fraksi yang semuanya positif fenolat. Fraksi 5 diTLC preparatif, direkristalisasi dan dicuci dengan kloroform, diperoleh kristal bulat anggur merah sebanyak 72,5 mg (0,0073%) dengan titik leleh 94-95
o

C. Senyawa ini larut dalam metanol dan aseton, bereaksi positif dengan FeCl3

yang menunjukkan senyawa fenolat dan mempunyai putaran optik -9,3o. Hasil analisis TLC menunjukkan noda berfluoresensi kuning di bawah UV366. Spektrum UV(MeOH) menunjukkan absorbansi maksimum pada 205, 227 dan 298 nm. Absorbansi pada 298 nm menggambarkan sistem aromatis. Absorbansi spektrum UV ini mirip dengan data spektrum UV lignan yang ditemukan Lisdawati, dkk (2007) dari ekstrak etil asetat buah mahkota dewa yaitu pada 220, 240 dan 290 nm, sedangkan dari literatur golongan senyawa lignan memberikan absorbansi khas pada 210, 230 dan 280 nm.

242

Spektrum IR(KBr) menunjukkan pita serapan kuat dan lebar pada bilangan gelombang 3402 cm-1 untuk gugus hidroksil, 2924 cm-1 menunjukkan pita serapan C-H alifatik. Pita serapan kuat pada 1604 cm-1, didukung oleh pita serapan pada 1442, 1172, 1095 dan 825 cm-1 menunjukkan kehadiran benzena yang tersubstitusi pada kedudukan 1,4. Kehadiran C=C dalam cincin aromatik ditunjukkan oleh pita serapan pada 1512 dan 1442 cm-1. Adanya gugus karbonil yaitu keton yang berkonjugasi dengan C=C juga ditunjukkan oleh pita serapan kuat pada 1604 cm-1. Vibrasi dari ikatan eter aromatik ditunjukkan oleh pita serapan pada 1095 cm-1. Elusidasi struktur senyawa ini tertuju kepada 7,9:7,9 diepoksilignan karena pada COSY terlihat adanya 8 proton aromatis yang saling berkorelasi sesamanya, hal ini hanya dimungkinkan dengan penyebaran 8 proton tersebut dalam 2 aromatis yang simetris sehingga mempunyai lingkungan kimia yang sama. Kedelapan proton semuanya mempunyai J yang sama sebesar 8,4 Hz yang menunjukkan koupling orto. Analisis terhadap spektrum 13C-NMR (aseton-d6, 125 MHz) menunjukkan bahwa senyawa hasil isolasi mengandung 29 atom C. Data MS menguatkan adanya inti Diepoksilignan pada m/z = 260, dimana fragmen dengan m/z 77 merupakan puncak kation benzena. Puncak ion molekul tidak stabil sehingga tidak muncul pada spektrum MS. Dari analisa spektroskopi UV, IR, 1H-NMR,
13

C-NMR, NMR 2 dimensi

dan MS, senyawa ini diperkirakan sebagai diepoksilignan yang dinamai makronon atau 2-(4-(4,5-dihidroksi-5,6-dihidro-2H-piran-3-il)-3,6-bis(4-hidroksifenil)heksa hidrofuro[3,4-c]furan-1-il)-4,5,6-trihidroksisikloheks-4-ene-1,3-dion) dengan ru mus molekul C29H28O12. Senyawa ini mempunyai 9 atom C khiral sehingga mempunyai banyak isomer. Analisis kimia komputasi dibutuhkan untuk mendukung analisis spektroskopi. Senyawa ini dihitung dengan Hyperchem menggunakan metode semiempirik (AM1 dan PM3). Setelah menerapkan metode ini pada makronon, analisis metode semiempirik PM3 adalah paling dekat dengan data eksperimen.

243

Konformasi yang mungkin dari makronon telah dipelajari dan data yang paling dekat adalah lignan 14.
HO H OH OH

13

C-NMR

H H H O H

O OH

H HO O OH OH

Uji aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH menunjukkan nilai senyawa makronon adalah 240,14 g/mL. Nilai IC50 tersebut dikategorikan mempunyai aktivitas antioksidan yang lemah berdasarkan standar tingkat aktivitas yang dikemukakan Nihlati dkk., (2008). Uji aktivitas antioksidan menunjukkan nilai IC50 senyawa makronon dan ekstrak etil asetat berturut turut adalah 47,38 dan 240,14 g/mL. Nilai IC50 makronon 5 kali lebih besar dari ekstrak etil asetat, berarti aktivitasnya sebagai antioksidan lebih rendah, 1/5 kali dari ekstrak etil asetat, Jadi makronon bukanlah senyawa yang bertanggung jawab terhadap aktivitas antioksidan ekstrak etil asetat dari kulit batang mahkota dewa. 6. Benzofenon aglikon Ekstrak etil asetat daun mahkota dewa dimurnikan dengan kromatografi kolom menggunakan metode SGP dan dihasilkan 4 fraksi yang positif fenolat. Fraksi 1 dimurnikan kembali dengan TLC preparatif dan diperoleh kristal bulat coklat merah sebanyak 8 mg (0,0015%), larut dalam metanol, positif dengan FeCl3 yang menunjukkan senyawa fenolat. Hasil analisis TLC menghasilkan 1 noda yang berfluoresensi gelap di bawah UV366. Spektrum UV(MeOH) menunjukkan absorbansi maksimum pada 210, 220 dan 303 nm. Absorbansi pada 303 nm menggambarkan sistem aromatis yang tersubstitusi keton dalam senyawa. Spektrum IR(KBr) menunjukkan pita serapan pada bilangan gelombang 3425 dan 3232 cm-1 untuk gugus hidroksil. Pita serapan

244

pada 2924 cm-1 menunjukkan gugus C-H alifatik. Kehadiran C=C dalam cincin aromatik ditunjukkan oleh pita serapan pada 1512 dan 1442 cm-1. Adanya gugus hidroksi aril keton atau keton yang terikat pada aromatis ditunjukkan oleh pita serapan kuat pada 1604 cm-1 dan 1319 cm-1. Vibrasi dari ikatan eter ditunjukkan oleh pita serapan pada 1064 cm-1. Analisis terhadap spektrum
13

C-NMR

(CD3OD-d4,

125

MHz)

menunjukkan bahwa senyawa hasil isolasi mengandung 14 atom C. Berdasarkan analisis spektroskopi (H dan C-NMR, HMQC, COSY, HMBC, DEPT) diyakini bahwa senyawa hasil isolasi adalah 2,6,4-trihidroksi-4-metoksibenzofenon dengan rumus molekul C14H12O5. Penemuan senyawa ini adalah yang pertama kali pada mahkota dewa. Senyawa benzofenon aglikon ini adalah non polar dan keluar pada kromatografi kolom pada fraksi 1. Senyawa 2,6,4-trihidroksi-4-metoksibenzofenon dan ekstrak etil asetat menunjukkan aktivitas antioksidan pada metode DPPH dengan IC50 berturut turut adalah 10,57 dan 101,06 g/mL. Nilai IC50 dari 2,6,4-trihidroksi-4metoksibenzofenon adalah lebih rendah 10 kali dari ekstrak etil asetat, atau aktivitas antioksidannya 10 kali lebih tinggi dari aktivitas antioksidan ekstrak etil asetat. Ini berarti bahwa ekstrak etil asetat mengandung senyawa antagonis yang mengurangi aktivitas antioksidan. 2,6,4-Trihidroksi-4-metoksibenzofenon (IC50 10,57 0,72 g/mL) dapat merubah warna DPPH dari violet ke kuning dengan sangat cepat, hampir mendekati aktivitas antioksidan standar kuersetin (IC50 2,93 2,12 g/mL). Berdasarkan standar tingkat aktivitas yang dikemukakan Nihlati dkk., (2008) maka 2,6,4-trihidroksi-4-metoksibenzofenon (IC50 10,57 g/mL) dikategorikan mempunyai aktivitas antioksidan yang sangat kuat.

245

7. Isofalerin B Ekstrak etil asetat daun mahkota dewa dimurnikan dengan kromatografi kolom menggunakan metode SGP dan menghasilkan 4 fraksi yang semuanya positif fenolat. Fraksi 4 menghasilkan amorf jarum putih sebanyak 45 mg (0,0085%), titik bakar 187-195 oC, larut dalam metanol, positif dengan FeCl3 yang menunjukkan senyawa fenolat. Hasil analisis TLC menghasilkan 1 noda yang berfluoresensi gelap di bawah UV366. Spektrum UV(MeOH) menunjukkan absorbansi maksimum pada pada 210, 220 dan 290 nm. Absorbansi pada 290 nm menggambarkan sistem aromatis yang tersubstitusi keton dalam senyawa. Senyawa ini adalah konstituen mayor dalam daun mahkota dewa, karena ekstrak metanol kasar daun tersebut juga memiliki absorbansi maksimum pada daerah yang hampir sama yaitu 207, 220 dan 286 nm. Spektrum IR(KBr) menunjukkan pita serapan kuat pada bilangan gelombang 3363 dan 3209 cm-1 untuk gugus hidroksil. Pita serapan pada 2924 cm-1 menunjukkan gugus C-H alifatik. Kehadiran C=C dalam cincin aromatik ditunjukkan oleh pita serapan pada 1504 dan 1442 cm-1. Kehadiran gugus hidroksi aril keton/keton aromatik ditunjukkan oleh pita serapan kuat pada 1604 cm-1 dan 1278 cm-1. Adanya gugus karbonil ditunjukkan oleh pita serapan pada 1651 cm-1. Vibrasi dari ikatan eter ditunjukkan oleh pita serapan kuat pada 1087 cm-1. Analisis terhadap spektrum
13

C-NMR

(CD3OD-d4,

125

MHz)

menunjukkan bahwa senyawa hasil isolasi mengandung 20 atom C. Berdasarkan analisis spektroskopi (H dan C-NMR, HMQC, COSY, HMBC, DEPT) diketahui bahwa senyawa hasil isolasi adalah isofalerin B atau 4,6 trihidroksi-4metoksibenzofenon-2-O--D-glukopiranosida dengan rumus molekul C20H22O10.

246

Benzofenon glukosida ini lebih polar dari benzofenon aglikon sehingga keluar pada fraksi ke-4 pada kromatografi kolom. Benzofenon glukosida lebih polar dari benzofenon aglikon disebabkan oleh sejumlah gugus OH yang dikandung glukosa. Uji aktivitas antioksidan menggunakan pereaksi DPPH menunjukkan nilai IC50 senyawa isofalerin B (4,6-dihidroksi-4-metoksibenzofenon-2-O--D-

glukopiranosida) dan ekstrak etil asetat berturut turut adalah 101,06 dan 402,70 g/mL. Nilai IC50 senyawa hasil isolasi lebih besar dari ekstrak etil asetat, berarti aktivitasnya sebagai antioksidan lebih rendah. Berdasarkan standar tingkat aktivitas yang dikemukakan Nihlati dkk., (2008) maka senyawa isofalerin B (dengan IC50 402,70 g/mL) dikategorikan mempunyai aktivitas antioksidan yang lemah. Aktivitas antioksidan disebabkan oleh kehadiran gugus fenol dalam isofalerin B. Aktivitas yang rendah disebabkan oleh salah satu OH fenol diikat oleh gula glukosa.

KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan 1. Hasil uji antioksidan ekstrak mahkota dewa menunjukkan bahwa ekstrak yang aktif sebagai antioksidan adalah ekstrak etil asetat kulit batang, ekstrak metanol buah, ekstrak kloroform daun, ekstrak kloroform kulit batang, ekstrak etil asetat daun dan ekstrak etil asetat buah. 2. Senyawa yang berhasil diisolasi dari buah mahkota dewa adalah derivat asam naftoat (0,0011%), isofalerin A (0,0018%), benzofenon glukosida (0,0127%), dan faleriaelide (0,0010%). Senyawa yang berhasil diisolasi dari kulit batang mahkota dewa adalah makronon (0,0073%). Senyawa yang berhasil diisolasi dari daun mahkota dewa adalah benzofenon aglikon (0,0015%) dan isofalerin B (0,0085%). 3. Urutan aktivitas antioksidan dari isolat senyawa golongan fenolat adalah benzofenon aglikon (sangat kuat), makronon (lemah), isofalerin B (lemah) dan benzofenon glukosida (tidak mempunyai aktivitas).

247

4. Konformasi yang mungkin dari makronon (diepoksilignan) telah dipelajari secara kimia komputasi menggunakan Hyperchem dengan metode semiempirik PM3, stereoisomer yang mempunyai nilai paling dekat dengan data eksperimen adalah lignan 14.

Saran 1. Disarankan untuk mensintesis, menguji efek toksisitas dan farmakologi dari benzofenon aglikon (2,6,4-trihidroksi-4-metoksibenzofenon) yang

mempunyai aktivitas antioksidan yang kuat untuk dimanfaatkan sebagai salah satu alternatif antioksidan 2. Disarankan untuk menghidrolisis benzofenon glukosida dan isofalerin B yang mempunyai aktivitas antioksidan lemah kemudian menguji kembali aktivitas antioksidan benzofenon aglikon yang diperoleh. 3. Disarankan untuk melakukan isolasi terhadap ekstrak kloroform dari kulit batang dan daun mahkota dewa.

DAFTAR PUSTAKA Cannell, R.J.P., 1998, How to Approach the Isolation of a Natural Product in Natural Products Isolation, editor Richard, J.P. Cannell, Humana Press, Totowa, New Jersey Faried, A., Kurnia, D., Faried, L.S., Usman, N., Miyazaki, T., Kato, H. and Kuwano, H., 2007, Anticancer Effect of Gallic Acid Isolated from Herbal Medicine, Phaleria macrocarpa, (Scheff.) Boerl., on Human Cancer Cell Lines, Int. J. Oncol., 30, 605-613 Ferrari, J., Terreaux, C., Sahpaz, S., Msonthi, J.D., Wolfender, L. and Hostettmann, K., 2000., Benzophenone Glycosides from Gnidia invoclurata, Phytochemistry, 54, 883-889 Fessenden, R.J., Fessenden, J.S. and Feist, P., 2001, Organic Laboratory Techniques, 3rd edition, Brooks/Cole, Canada Hakim, R.W., Nawawi, A., Adnyana, I.K., Achmad, S.A., Makmur, L., Hakim, E.H., Sjah, Y.M. dan Kitajima, M., 2004, Glukosida Benzofenon dari Buah Merah Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa) serta Uji Aktivitas terhadap DPPH dan Sel Murin Leukimia P-388, Bull. Soc. Nat. Prod. Chem (Indonesia), 4, 67-70

248

Hartati, M.S., Mubarika, S, Gandjar, I.G., Hamann, M.T., Rao K.V. and Wahyuono, S., 2005, Phalerin, a New Benzophenoic Glucoside Isolated from the Methanolic Extract of Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.) Leaves, Majalah Farmasi Indonesia, 16, 1, 51-57. Jiang, Z., Tanaka, T., Sakamoto, T., Koung, I., Duan, J., Ao, Z. and Rong H., 2002, Biflavanones, Diterpenes, and Coumarins from the Roots of Stellera chamaejasme L, Chem. Pharm. Bull, 50, 1, 137-139 Lisdawati, V., Wiryowidagdo, S., Kardono, L. dan Broto S., 2007, Isolasi dan Elusidasi Struktur Senyawa lignan dan Asam Lemak dari Ekstrak daging buah Phaleria macrocarpa, Buletin Penelitian Kesehatan, 35, 3, 115-124 Molyneux, P., 2004, The Use of the Stable Free Radical Diphenylpicryl-hidrazyl (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity, Songklanakarin J. Sci. Technol., 26, 2, 211-219 Nihlati, A.P., Rohman, A. dan Hertiani, T., 2008, Daya Antioksidan Ekstrak Etanol Rimpang Temu Kunci (Boesenbergia pandurata (Roxb. Schlecth) dengan Metode Penangkapan Radikal DPPH, J. of Traditional Medicines, 13, 45, 136-144 Oshimi, S., Zaima, K., Matsuno, Y., Hirasawa, Y., Iizuka, T., Studiawan, H., Indrayanto, G., Zaini, N.C. and Morita, H., 2008, Studies on the Constituents from the Fruit of Phaleria macrocarpa, J. Nat. Med., 62, 207-210 Pranowo, D.H., 2011, Kimia Komputasi, Pusat Kimia Komputasi IndonesiaAustria, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta Salituro, G.M., Dufresne, C., 1998, Isolation by Low-Pressure Column Chromatograpy, in Natural Products Isolation, editor Richard, J.P. Cannell, Humana Press, Totowa, New Jersey Silva, G.L., Lee, I. and Kinghorn, A.D., 1998, Special Problems with the Extraction of Plants, in Natural Products Isolation, editor Richard, J.P. Cannell, Humana Press, Totowa, New Jersey Tambunan R.M., dan Simanjuntak, P., 2006, Penentuan Stuktur Kimia Antioksidan Benzofenon Glikosida dari Ekstrak n-butanol Buah Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl.), Majalah Farmasi Indonesia, 17, 4, 184-189 Ullah, N., Ahmeed, S., Muhammad, P., Ahmed, Z., Nawaz, H R. and Malik, A., 1999, Coumarinolignoid glycoside from Daphne Oleoides, Phytochemistry, 51, 103-105

249

Wagner, H., Bladt, S. and Zgainski E.M., 1984, Plant Drugs Analysis A Thin Layer Chromatography, Atlas, Springer-Verlag, Berlin Winarno, H. and Katrin W.E, 2009, Benzophenone Glucoside Isolated from the Ethyl Acetate Extract of the Bark of Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.) and its Inhibitory Activity on Leukimia L1210 Cell Line, Indo. J. Chem., 9, 1, 142-145