XIX. METABOLISMUL NUCLEOTIDELOR XIX.1.

ASPECTE GENERALE Nucleotidele ocup un loc central n procesele biochimice, ele fiind: a) precursori n biosinteza acizilor nucleici, b) principalele rezervoare de legturi macroergice, c) componeni ai mai multor coenzime i d) efectori allosterici. Ca urmare, transformrile metabolice ale acestora constituie un aspect esenial pentru toate celulele. ARN din diferite celule i clase este continuu hidrolizat la nucleotide i resintetizat dup necesiti (turnover) n toate celulele. Procesul este mai rapid n acele celule sau organe n care eliminarea de secreii bogate n proteine sau restructurarea diferitelor ci metabolice necesit o biosintez proteic activ: glandele digestive exocrine i ficat. Unele tipuri de celule au o via relativ scurt (celulele epidermei, mucoasei intestinale, celulele sangvine), n cazul lor fiind supus unui proces asemntor i ADN, evident la nivelul ntregului organism. Transformrile metabolice ale nucleotidelor libere formeaz o schem unitar n care biosinteza este corelat cu biodegradarea la diferite nivele prin circuite de recuperare. Se pot face cteva precizri generale: 1. nucleotidele sunt constant degradate pn la nucleozide i apoi la bazele azotate corespunztoare i ribozo-1-fosfat (sau dezoxiribozo1-fosfat); 2. nucleozidele, bazele azotate i ribozofosfatul pot fi reutilizate n ci de recuperare pentru resintez de nucleotide; 3. o parte din bazele purinice sunt catabolizate pn la acid uric care se elimin, iar cele pirimidinice pn la intermediari metabolici din alte ci; 4. ribozofosfatul poate fi utilizat n calea pentozofosfatului; 5. nucleotidele pot fi sintetizate de novo pornind de la intermediari simpli anumii aminoacizi (glicocol, acid aspartic, glutamina),

dioxid de carbon i grupri C1 activate (legate de acizi tetrahidrofolici);

ATP P NTP AMP

P-O-CH2

O OH OH

OH

Mg+2 ATP-fosforibozil transferaza (PRPP sintetaza)

P-O-CH2

O O-P-O-P OH

OH

6. reutilizarea bazelor i biosinteza lor de novo sunt controlate prin disponibilitatea formei activate a ribozo-5-fosfatului cum ar fi 5ribozo--D.rinbozil pirofosfat (PRPP); enzima care-l formeaz PRPP-sintetaza (sau ATP fosforil transferaza) este activat de fosfatul anorganic i inhibat allosteric de nucleotide, asigurnd concentraia lor constant. XIX.2. HIDROLIZA ACIZILOR NUCLEICI Lanurile lungi ai acizilor nucleici sunt hidrolizate de ctre nucleaze n fragmente scurte. Ele sunt, n general, de dou tipuri. I.Exonucleaze care desfac succesiv nucleotidele de la una din capete, fiind 5 sau 3 specifice i necesit un anumit mod de terminare (cu sau fr fosfat) a captului atacat. II.Endonucleazele care desfac legturile situate n interiorul lanului formnd astfel lanuri oligonucleotidice sunt cunoscute numeroase asemenea enzime cu localizri i roluri diferite. Aciunea lor poate fi specific pentru un tip de acid nucleic (ADN sau ARN) sau nespecific hidrolizndu-le pe amndou. Specificitatea poate privi i alte aspecte cum ar fi existena ADN ca molecul dublu sau monolan, mai ales pentru unele exonuxleaze, recunoaterea unui anumit nucleotid dintre cele dou unite prin legtura atacat (unele endonucleaze) sau a unei secvene ntregi de nucleotide din vecintate (enzime de restricie). Nucleazele intervin n digestia acizilor nucleici din alimente sau n prelucrarea i distrugerea acizilor nucleici endogeni (cu numeroase aspecte). Digestia acizilor nucleici are loc n duoden. Sub aciunea endonucleazelor pancreatice (ribonucleaza i dezoxiribonucleaza) se

10

elibereaz oligonucleotide din care diesterazele intestinului subire elibereaz 5 i 3 nucleotide.

LANTURI POLINUCLEOTIDICE
ribonucleaz H2O dezoxiribonucleaz

OLIGONUCLEOTIDE + NUCLEOTIDE
H2O fosfodiesteraz

5'-NUCLEOTIDE
H2O P nucleotidaze fosfomonoesteraze

NUCLEOZIDE
P nucleozid fosforilaze R-1-P (dR-1-P) CALEA PENTOZOFOSFATULUI

BAZE PURINICE BAZE PIRIMIDINICE

fosfoglucomutaza

R-5-P (dR-5-P)

XIX.3. CATABOLISMUL GENERAL AL NUCLEOTIDELOR LA BAZE PURINICE I PIRIMIDINICE Nucleotidele sunt hidrolizate specific de ctre 5-nucleotidaze la nucleozide i fosfat. Exist o mare variatate de asemenea enzime, unele secretate de mucoasa intestinal cu rol n digestie, altele general rspndite n organism cu localizare pe membrana periplasmatic, n lizozomi, microzomi sau citoplasm, care intervin n metabolismul nucleotidelor endogene. Membrana periplasmatic este impermeabil pentru nucleotide dar permite ptrunderea nucleozidelor. Ecto-5-nucleotidaza fixat pe faa extern a plasmei d posibilitatea utilizrii nucleotidelor, extracelulare (mai ales a AMP) hidrolizndu-le vectorial la nucleozide (adenozin). n hematii exist o 5-nucleotidaz specific pentru nucleotidele pirimidinice. Cea mai mare parte din adenozin-5-monofosfat este catabolizat printr-o dezaminare la inozin-5-monofosfat. Adenilat deaminaza are mai multe izoenzime, una din ele fiind abundent n muchi. Aa cum se va vedea IMP este primul nucleotid purinic format prin sinteza de novo i prezint un punct de ncruciare ntre cile catabolice i cele anabolice.

11

Adenozina care rezult din restul AMP-ului este, la rndul ei, dezaminat de ctre adenozin deaminaz la inozin. O mare parte de adenozin provine n urma hidrolizei S-adenozilhomocisteinei (SAH), format din S-adenozilmetionin n urma procesului de metilare. Un caz particular l prezint celulele musculare ale miocardului. Ele sun lipsite de adenilatdeaminaz iar AMP produs, n urma contraciei, este fie hidrolizat la adenozin, care se elibereaz n snge, fie refosforilat pn la ATP. Ajungnd pn la arterele coronare, adenozina cauzeaz vasodilataia i consecutiv creterea debitului circulator. Cum producerea adenozinei crete proporional cu hipoxia, efectul ei primete semnificaia unei autoreglari a fluxului sangvin n funcie de necesitile miocardului. Desfacerea nucleozilelor poate decurge prin dou tipuri de aciuni enzimatice i anume hidrolitic i fosforolitic. Nucleotidazele ntr-o reacie ireversibil hidrolizeaz nucleozidele la baze purinice i pirimidinice i riboz (sau dezoxiriboz).
NUCLEOZID + H2O
nucleozidaz

BAZA
(purinica sau pirimidinica)

RIBOZA
(dezoxiriboza)

Astfel de enzime sunt rspndite n diferite esuturi fr a se cunoate numrul i specificitatea lor exact. Nucleozidfosforilazele scindeaz cu ajutorul fosfatului anorganic i elibereaz din nucleozide bazele azotate i ribozo-1-fosfat (sau dezoxiribozo-1-fosfat). Exist nucleozid fosforilaze specifice pentru purine i pentru pirimidine. Purinnucleozid fosforilazele nu pot folosi ca substrat adenozina. Din acest motiv este necesar ca AMP i adenozina s fie n prelabil dezaminate. Aciunea acestor fosforilaze este reversibil, ele putnd servi i n biosintez, dei sensul fiziologic este catabolic.
NUCLEOZID + FOSFAT
purin-pririmidinnucleozidfosforilaz

BAZA
(purinica sau pirimidinica)

+ R-1-P (dR-1-P)

n digestie se absorb nucleozide, catabolizate n interiorul celulelor intestinale ca produi finali. Din acest motiv majoritatea bazelor azotate din nucleotidele alimentare nu pot fi utilizate de ctre organismul uman.

12

XIX.4. CATABOLISMUL BAZELOR PURINICE Conform celor discutate mai sus din nucleotide purinice rezult dou baze principale hipoxantina (din inozin) i guanina (din guanizin). Ele sunt oxidate mai departe pn la acid uric, produs final de catabolism la om, primate, psri i unele reptile. Guanina este dezaminat, n prealabil, pn la xantin de ctre o xantinoxidaz sau o xantindehidrogenaz, enzime complicate formate din dou subuniti identice (M = 150000), fiecare conine un ion Mo+6, o molecul de FAD i un grup Fe4S4 (sau dou Fe2S2). Ionul Mo+6 este legat prin intermediul unei tetrahidrobiopterin formnd molibdobiopterina. O HN N H N N H

C S Mo

C CH-CH2-O-P S OH

Molecula enzimei este un mini lan transportor de electroni, care trec de la substrat la ionul Mo+6, care se reduce la Mo+4 , de aici ionii Fe+3 redui la Fe+2 , apoi la FAD (care trece n FADH2) i de aici la acceptorul final. Acceptorul este oxigenul molecular n cazul xantinoxidazei redus la peroxid de hidrogen, iar n cazul xantindehidrogenazei, NAD+ redus la NADH+H+. Xantinoxidaza este format xantindehidrogenaz prin scindarea unui fragment polipeptidic bogat n grupe -SH, sau chiar prin simpla oxidare a acestora la -S-S-.
OH N H2N
-2

OH N
fosfomonoesteraz (nespefific) H2O P

N H2N HO-H2C N O N

N O

purinnucleozid fosforilaza P R-1-P

O3PO-H2C

OH

OH

OH

guanizin-5'-fosfat

OH

guanizin

13

OH N H2N N N H N H2N HN

O N N N H
OH N N O N
fosfomonoesteraz (FME) H2O P

O
guanaz

HN O
NH3

N N H N H

H2O

guanin

xantin

OH N
-2

N N HO-H2C O N

purinnucleozid fosforilaza P R-1-P

O3PO-H2C

OH

inozin-5'-fosfat

OH

OH

inozin

OH

OH N N N H N HN

O N N N H

NAD+ sau sau H2O+O2

NADH+H+

O HN O N H N H N

H2O2

hipoxantin

xantin

14

NH2 N
-2O PO-H C 3 2

NH2 N N N CH2-S-H2C CH2 O N N

N O

OH
AMP H2O

OH
FME

CHNH2 COOH NH2

P

S-adenozilhomocisteina H2O

OH

OH

P 5-metioninadenozinfosforilaza 5-metio-R-1-P

homocisteina

NH2 N N N H N

N N N O

HO-H2C

adenina xantinoxidaza

adenozina

OH

OH

NH2 N N N H N OH

OH N N HO-H2C O N N

8-hidroxiadenina NAD+ NADH+H+

NH2 N N N N H

inozina

OH

OH

2,8-dihidroxiadenina

15

O HN O N H N H N

H2O+O2 sau

H2O2

O HN O N H N H NH O

xantin

NAD+

NADH+H+

acid uric

n mod normal, n celule, se formeaz foarte puin adenin liber, provenind din fosforilarea 5-metioninadenozinei. Adenina nu poate fi catabolizat direct organismul uman fiind lipsit de adenindeaminaz, prezent doar la bacterii i nevertebrate, care s-o transforme n hipoxantin. Cea mai mare parte din adenin este utilizat n cile de recuperare. n cazul unor deficite enzimatice ereditare sau n aportul alimentar crescut, excesul de adenin este oxidat de ctre xantinoxidaz la 8-hidroxiadenin i apoi la 2,8dihidroxiadenin, substan puin solubil, care formeaz calculi renali. n organismul uman xantinoxidaza se gsete mai ales n mucoasa intestinal i n ficat, restul organelor prezentnd doar urme de activitate. n consecin purinele din alimente formeaz direct acid uric, iar sursa major de acid uric endogen este ficatul. O parte din acidul uric este excretat n intestin prin bil. n general acidul uric din organismul uman (n jur de 1,2 g) provine din trei surse principale: 1. din nucleotidele alimentare; 2. catabolismul purinelor endogene i 3. transformarea direct a IMP sintetizat de novo. Concentraia normal de acid uric n ser este ceva mai mare la brbai (6,9-7,5 mg/dl) dect la femei (5,7-6,6 mg/dl). Hiperuricemii apar n guta primar i secundar, hipouricemii n deficiene de xantin oxidaz ereditar sau n cadrul unei insuficiene hepatice. Eliminarea urinar este ntre 400 i 800 mg/24 ore variind i n funcie de alimentaie. Rinichiul uman elimin acidul uric ntr-un proces destul de complicat. La nivelul glomerulilor este filtrat, apoi reabsorbit n tubii contori distali. O serie de medicamente interfereaz cu aceste procese renale. n afara semnificaiei sale de produs final al catabolismului purinic, acidul uric servete pentru eliberarea amoniacului la psri i unele reptile, fiind puin solubile acestea se elimin sub form de past economisindu-se ap. Astfel de animale se numesc uricotelice i nu posed enzimele necesare formrii de uree. Mamiferele, cu excepia primatelor, descompun n continuare acidul uric n prezen de uricaz la alantoin pe care o elimin prin urin. La alte
16

specii degradarea merge mai departe prin aciunea alantoinazei la acid alantoic, sau continua datorit alantoicazei pn la uree i acod glioxilic. n fine flora intestinal descompune ureea cu ureeaz la dioxid de carbon i amoniac, la unele nevertebrate.
O HN O N H N H NH O
H2O O2 uricaz CO2 H2O2

H2N O

O N H N H

NH O

alantoinaz H2O

acid uric

alantoin

H2N O H

COOH NH 2 O H

alanoicaz H2O

H2N O NH2

+ H2N
ureea

NH2 O

COOH CHO

acid glioxilic

acid alantoic ureaz

2(CO2 + 2NH3)

La om se elimin prin urin n mod normal i cantiti mici de hipoxantin, xantin i adenin. Bazele purinice minore, de exemplu, 7metilguanina, nu pot fi catabolizate i se elimin ca atare. XIX.5. BIOSINTEZE DE NOVOA NUCLEOTIDELOR PURINICE
N1
2 6 5 3 4 9

N7
8

N H

Nucleotidele purinice pot fi sintetizate n citoplasm printr-o succesiunea de zece reacii enzimatice, heterociclul bazei fiind construit etap de etap direct din ribozo-5-fosfat.

Primul compus purinic format este un nucleotid, acidul inozinic (IMP), nu o purin liber. Atomii din heterociclul purinei provin din compui simpli. Glicocolul contribuie cu toat molecula pentru formarea din poziiile C 4, C5 i N7, atomii N9 i N3 provin din gruparea amido a glutaminei, N1 din gruparea a acidului aspartic, C6 din CO2 respirator, iar C8 i C2 din gruprile C1 activ legate de

17

tetrahidrofolat (THF). Aceste precizri au putut fi efectuate prin administrare de compui marcai la porumbei. 1o. Prima etap este catalizat de o aminotransferaz care trece gruparea NH2 a glutaminei pe PRPP (fosforibozopirofosfat) pentru a forma fosforibozil amina. Enzima are proprieti allosterice i este etapa principal de reglare a biosintezei de novo.
O HO-P-O-H2C OH OH OH O O O
amidotransferaz Mg+ Gln+H2O Glu+PP

O HO-P-O-H2C OH OH O

O-P-O-P-OH OH OH

NH2

OH

2o. n a doua etap prin hidroliza ATP se asigur energia necesar condensrii glicocolului cu fosforibozilamin pentru a da fosforibozilglicinamida, sub aciunea unei sintetaze. Reacia este reveribil dar produsul reaciei este ndeprtat n mod continuu deplasnd echilibrul.
7 5 4

O HO-P-O-H2C OH OH O

NH2 NH
9

NH2 + HOOC-CH2-NH2 OH
sintetaz Mg+ ATP ADP + P

O HO-P-O-H2C OH

O=C O

OH

OH

3o. De pe N5,N10-metenil-tetrahidrofolat, o transferaz, trece, folosind o molecul de ap, o grup formil pe atomul de azot provenit din glicocol. n acest fel se completeaz atomii din ciclul pentatomic al purinei.

18

O HO-P-O-H2C OH

O=C O

5 4

NH2 NH
transferaza
9

O HO-P-O-H2C OH

O=C O

5 4

NH2 NH
9

CH=O
8

OH

OH

N5,N10-metilenTHF

THF

OH

OH

4o. Fosforibozil-N-formilglicina din etapa precedent se transform prin aciunea unei sintetaze care schimb CO a amidei cu NH provenit de la glutamin. Reacia necesit hidroliza ATP. Produsul format este fosforibozilN-formil glicinamidin.
7 7 5 4

NH2 NH
9

O HO-P-O-H2C OH

O=C O

CH=O
8

Gln Mg+2 ATP H2O P

O
Glu

HN=C O

5 4

NH2 NH
9

CH=O
8

HO-P-O-H2C OH

OH

OH

ADP

OH

OH

5o. Utiliznd energia liber eliberat prin hidroliza unui rest fosfat din ATP, o alt sintetaz nchide ciclul de cinci atomi i formeaz 5-fosforibozil5-aminoimidazol. Grupa =NH adugat, n reacia anterioar, apare acum ca un substituient amino al ciclului.
5 4

O HO-P-O-H2C OH

HN=C O

NH2 NH
9

CH=O
8

O
Mg+2

7N H2N-C 4 9 8 CH 3

HC5

HO-P-O-H2C
ADP+P

ATP

OH OH OH

OH

OH

19

6o. n etapa urmtoare se adaug un grup carboxil din dioxid de carbon. Carboxilaza este enzima care formeaz, astfel, 5-fosforibozil-5aminoimidazol-4-carboxilat nu are ca grupare prostetic biotina i difer ca mecanism de alte enzime care adaug grupri carboxil.
6 7N H2N-C 4 9 8 CH 3

HC5

HOOC-C5
3

O HO-P-O-H2C OH

O HO-P-O-H2C OH
CO2

7N H2N-C 4 9 8 CH

carboxilaza

OH

OH

OH

OH

7o. O sintetaz condenseaz acidul aspartic cu produsul anterior de reacie consumnd o legtur macroergic din ATP. Condensarea are loc ntre grupa amino a acidului aspartic i carboxilul imidazolului. Intermediarul 5-fosforibozil-4-(N-succincarboxamid)-5-aminoimidazol, care rezult, servete pentru introducerea atomului N1 din inelul purinic.
HOOC-CH2-CH-COOH
6

HOOC-CH2-CH-COOH
7N 6

NH2 + HOOC-C5 O HO-P-O-H2C OH OH OH

4 9 8 CH H2N-C 3 N

ATP Mg+2

ADP+P

NH-OC-C5
1

7N

O HO-P-O-H2C OH

4 9 8 H2N-C CH 3 N

sintetaza

OH

OH

8o. Produsul reaciei anterioare este scindat de ctre o liaz la 5fosforibozil-4-carboxamid-aminoimidazol i acid fumaric. Reaciie (7) i (8) se aseamn sintezei argininei din citrulin din ciclul ureogenetic.

20

HOOC-CH2-CH-COOH
6

6 7N

NH-OC-C 5 3
1

O HO-P-O-H2C OH

H2N-C4 9 8 N O

H2N-OC-C 5 3
1

CH
adenolosuccinatliaza

O HO-P-O-H2C

7N 4 9 8 H2N-C CH

acid fumaric

OH OH OH

OH

OH

9o. n etapa urmtoare este transferat o grup formil de pe N 10formiltetrahidrofolat ducnd la 5-fosforibozil-4-carboxamid-5formamidoimidazol, care conine toi atomii ciclului purinic.
1 6 7N 1 9 8 CH 6 7N 9 8 CH

H2N-OC-C5 O HO-P-O-H2C OH OH OH H2N-C 4

3

H2N-OC-C5 O
formiltransferaza K+

OHC-HN-C 4
2 3

O
N5,N10-formil THF

HO-P-O-H2C OH OH

THF

OH

10o. n fine, n ultima etap prin eliminare de ap de ctre ciclohidrolaz se nchide i inelul de ase atomi ducnd la apariia primului nucleotid purinic, acidul inozinic (IMP).
OH H2N-OC-C O OHC-HN-C O N N CH
ciclohidrolaza CO2

N O HO-P-O-H2C OH N O N

HO-P-O-H2C OH OH

OH

OH inozinmonofosfat

OH

21

Se poate observa c pentru sinteza IMP se consum ase legturi macroergice, considernd i formarea PRPP. Ambele activiti formiltransferazice din reaciile (3) i (9) sunt, de fapt, date de aceeai protein. Proteina face parte dintr-un complex multienzimatic format din patru lanuri polipeptidice dintre care dou au aciune dubl. Complexul asigur pe lng transferul gruprii formil, formarea acidului N5, N10-metilentetrahidrofolic i interconversiuni ale acestuia. Reaciile catalizate de complex sunt urmtoarele (polipeptidele I, II i III).
I. serina + THF
serinhidroximetil transferaz

glicocol + N5,N10-metilen-THF

II. reactiile formiltransferazice (3) si (9) mentionate

III. N5,N10-metilen-THF + NADP+
dehidrogenaz

N5,N10-metilen-DHF + NADPH+H+

N5,N10-metilen-THF + H2O THF + ATP + HCOOH

ciclohidrolaz

N10-metilen-THF + H+

sintetaz

N10-metilen-THF + ADP + P

XIX.6. FORMAREA NUCLEOTIDELOR ADENILICE I GUANILICE Din precursorul comun (IMP) sunt sintetizai att AMP-ul ct i GMP-ul prin dou cte etape succsesive. Biosinteza AMP ncepe prin aciunea unei sintetaze (11) similar cu cea din etapa (7) care condenseaz IMP (forma lactamic) cu acid aspartic pentru a forma acidul adenilosuccinic (AMPS). Ca surs de energie este utilizat hidroliza GTP-ului i nu a ATPului. n cea de a doua reacie (12) este desfcut de aceeai liaz care intervine n reacia (8), rezultnd AMP i acid fumaric.

22

OH N O HO-P-O-H2C OH OH OH inozinmonofosfat N O N N O HO-P-O-H2C OH HN

+ HOOC-CH-CH2-COOH N NH2
(11) adenilat succinat sintetaz -H2O

N O

OH

OH

HOOC-CH-CH2-COOH N HN O HO-P-O-H2C OH OH OH N O N N

HH2
(12) adenilat succinat liaz -H2O

N O HO-P-O-H2C OH OH OH N O N

N + H-C-COOH HOOC-C-H

Conversia la GMP cuprinde oxidarea (13) a IMP la xantozin-5monofosfat (XMP) de ctre o dehidrogenaz NAD-dependent. O sintez similar cu reaciile (1) i (4), transfer gruparea amino a glutaminei cu formare de GMP. Reacia necesit hidroliza ATP la AMP i pirofosfat. Astfel sinteza complet a AMP necesit hidroliza a apte legturi macroergice.
O HN O HO-P-O-H2C OH
IMP

O N HN
(13) IMP-dehidrogenaz H2O+NAD+ NADH+H+

N N H N O
Glu Gln (14)

N O

HO-P-O-H2C OH
XMP

OH

OH

OH

OH

23

O HN
ATP (14)

N N O N

H2N

HO-P-O-H2C
AMP+PP

OH
GMP

OH

OH

AMP i GMP prin aciunea a dou kinaze specifice, adenilat i guanilat kinaza sunt fosforilai pe seama ATP-ului la ADP i GDP. Adenilat kinaza este abundent n muchi de unde i denumirea de mokinaz. AMP + ATP GMP + ATP
adenilatkinaz guanilatkinaz

ADP + ADP GDP + ADP

Ambii nucleozidifosfai sunt fosforilai n continuare de ctre acelai nucleozid-difosfat-kinaz (NDK) la ATP i GTP. ADP(sau GDP) + ATP
NDK

ATP(sau GTP) + ADP

Biosinteza de novo a nucleotidelor purinice are loc mai ales n ficat, alte celule (hematii,leucocite polimorfonucleare) neavnd de loc sau prea puin PRPP-amidotransferaz (neuroni). Numeroi antibolii i exercit aciunea de inhibitori ai etapelor individuale din biosinteza nucleotidelor purinice. Astfel, azaserina i diazonorleucina (DON), prin analogie cu glutamina inhib reaciile care utilizeaz, respectivi (1) i (4). N=N=CH-C-O-CH2-CH-COOH O NH2 N=N=CH-C-CH2-CH2-CH-COOH O NH2

24

XIX.7. CI DE RECUPERARE A PURINELOR Cea mai mare parte din nucleozide i baze libere, produse endogen, este recuperat pentru formarea nucleotidelor. Recuperarea bazelor purinice libere poate avea loc n dou moduri: a. prin aciunea invers a purin nucleozid fosforilazei, cnd din hipoxantin i guanin se formeaz nucleozidele corespunztoare (cele de importan secundar), Hipoxantin sau + ribozo-1-fosfat guanin inozin sau guanizin + fosfat

b.

prin aciunea unor fosforibotransferaze, adenilfosforibozil transferaza (APRT) i hipoxantin- guanin fosforibozil transferaza (HGPRT), care utilizeaz fosforibozilpirofosfatul (PRPP) i bazele corespunztoare rezultnd: Adenin + PRPP
APRT

AMP + pirofosfat IMP sau + pirofosfat GMP

hipoxantin sau + PRPP guanin

HGPRT

Peste 90% din PRPP este utilizat n aceast cale. Fosforibozil trasferazele sunt, n general, rspndite n esuturi i permit astfel utilizarea bazelor sintetizate de novo n ficat. Vehicularea lor s-ar face sub form de nucleotide prin mijlocirea hematiilor. Fosforibozil transferazele pot forma nucleotide i cu analogi sintetici nefiind direct specifice. Astfel APRT poate utiliza 6-mercaptopurina i 2floradenina, iar HGPRT poate utiliza alopurinolul, 6-mercaptopurina, 8azaguanina etc. Recuperarea nucleozidelor se realizeaz n esuturile umane prin aciunea adenozinkinazei, care poate utiliza ca substrat i alte ribo- sau dezoxiribonucleozide purinice. Participarea enzimelor din cile de recuperare alturi de cele din calea biosintetic i din catabolismul nucleotidelor realizeaz circuite de interconversie. Astfel, n muchii scheletici este prezent un ciclu al AMP rezultat din ATP, n timpul contraciei. O izoenzim a adenilat deaminazei (miodenilat deaminaz) produce IMP i amoniac din AMP. Apoi IMP este
25

utilizat pentru resinteza AMP prin aciunea AMPS-sintetazei i a IMPSliasei. Activitatea monoadenilat deaminazei este corelat cu contracia muscular fiind o enzim allosteric inhibat de ATP i GTP (abundente n repaus) i activat de ADP, AMP, GDP i GMP, care apar n timpul activitii. Reamintim c adenilat kinaza servete n muchi utilizrii integrale a legturilor macroergice genernd din 2ADP, ATP i AMP (2 ADP ATP + AMP). Ciclul descris ndeprteaz AMP-ul deplasnd echilibrul reaciei. AMP adenozin IMP
GMP+PP adenilo succinat sintetaz GTP PP hipoxantinguanin fosforibozil transferaza PRPP Asp adenilo succinat liaz ac. fumaric H2O ADP

inozin AMP

hipoxantin

AMPS
NH3

IMP (GMP)

adenilat deaminaz P

AMP

adenozin kinaz ATP

hipoxantin (guanin)

H2O

adenozina

purin-5'-nucleotidaz

R-1-P purinnucleozid fosforilaz P

inozin (guanizin)

adenozin deaminaza

NH3

H2O

n esuturi, IMP i GMP (dIMP i dGMP) sunt trecute printr-un ciclu de reacii, nti la nucleozide de ctre 5-nucleotidaze apoi la baze prin aciunea nucleozid fosforilazei i din nou la nucleotide cu ajutorul AGPRT. AMP (dAMP) poate fi deaminat la IMP (dIMP) sau defosforilat la adenozin (dezoxiadenozin). Aceasta este fosforilat la AMP de ctre adenilat kinaz. Se poate, astfel, realiza un ciclul al adenozinei, cuprinznd secvenele:

26

XIX.8. DEFICIEN METABOLICE DATORATE NUCLEOTIDELOR PURINICE Guta este una din cele mai rspndite boli de metabolism cu o frecven de 0,3% la populaia Europei. Sub aceast denumire sunt incluse, de fapt, un grup heterogen de boli caracterizate toate prin hiperuricemie, care duce la depunerea uratului de sodiu n sinoviala articulaiilor i de aici atacuri acute de artrite, formarea unor depozite masive de urat, adesea deformate, tofi n jurul articulaiei periferice i foarte frecvent la apariia urolitiazei. Hiperuricemia, aspectul primordial al bolii, poate aprea din numeroase cauze, unele determinate genetic, altele dobndite. Nu orice hiperuricemie duce, ns, la apariia gutei. n unele cazuri acesta poate persista toat viaa fr a profoca modificri patologice, mai mult, chiar s-a observat c este foarte frecvent la persoanele cu performane intelectuale superioare. Guta poate fi primar, ca o boal ereditar de metabolism n sine, sau secundar dezvoltndu-se ca o consecin a altor boli ereditare sau dobndite. Guta secundar poate s apar n deficien de glucozo-6fosfataz (glicogeneza de tip I) sau n deficiena total a hipoxantin-guanin fosforibozil transferazei, precum i n boli de distrugeri celulare masive: anemii hemolitice, leucemii, policitemii, psioreazis etc. Tratamentul cu medicamente citotoxice n neoplazii poate declana apariia secundar a gutei, ceea ce impune asocierea acestora cu inhibitori ai xantinoxidazei. O alt posibilitate a gutei secundare este n urma unei afeciuni renale cu scderea capacitii de excreie. n majoritatea cazurilor de gut primar nu se cunoate defectul enzimatic cauzal, putdu-se evidenia doar diferite situaii generale. Astfel, poate s fie vorba de 1. o hiperproducie endogen a acidului uric sau 2. o scdere a eliminrii renale sau 3. o scdere a proteinei serice de vehiculare 1- 2 - globulina de legare a uratului. La o parte din bolnavi s-a putut identifica defecte enzimetice caracteristice. Unele cazuri de gut se datoresc unei PRPP-sintetaze anormale hiperactiv, datorit fie: a) unei vmax mai mare dect cel normal; b) unui KM pentru R-5-P sczute fa de cea obinuit sau c) rezistenei enzimatice la inhibiia allosteric prin nucleotide. La ali bolnavi s-a evideniat o deficien parial de HGPRT. Apariia gutei se explic, n asemenea cazuri, prin creterea biosintezei de novo ca urmare a disponibilitii crescute de PRPP, sintetizat n exces sau utilizat insuficient de cile de

27

recuperare. Ambele enzime sunt codificate de cromozomul X, iar transmiterea bolii este legat de sex. Sindromul Lesch-Hynan. Lipsa complet a activitii hipoxantinguanin fosforil transferazice, datorit unei mutaii diferite de cea care provoac guta primar duce la apariia sindromului Lesch-Hynan. Boala se manifest prin instalarea progresiv ncepnd cu primii ani de via a unor tulburri neurologice: spasticitate muscular, micri dezordonate i a unui comportament agresiv bizar. Bolnavii au tendina de a muca persoanele din jur i de a se automutila provocndu-i rni ale degetelor i n palm. Adesea se asociaz o anemie megaloblastic i guta secundar. Afectarea neuropsihic este probabil asociat de faptul c n creier biosinteza de novo este redus. Deficiena adeninfosfotransferazei, este o boal ereditar care se manifest ca o litiaz renal prin calculi de 2,8-dihidroxiadenin. n lips de APRT, adenina provenit mai ales din 5-metiltioadenozin nu poate fi recuperat i sufer aciunea xantinoxidazei. Boala se transmite autozomal recesiv, gena enzimei fiind localizat pe braul lung al cromozomului 16. Deficiena adenozindeaminazei (ADA), se manifest ca o imunodeficien sever. Deficitul vizeaz att limfocitele T responsabile pentru imunitatea mediat celular ct i limfocitele B care produc anticorpii i dau imunitate mediat umoral. n consecin apar infecii severe, variate i frecvente cu bacterii, ciuperci, virusuri, protozoare etc. Un factor important n producerea bolii l-ar constitui acumularea adenozinei i mai ales a dezoxiadenozinei. n loc s fie catabolizat dezoxiadenozina este fosforilat pn la dATP care inhib allosteric ribonucleotid reductaza. n felul acesta este mpiedecat formarea dezoxiribonucleotidelor (mai ales dCTP) necesare duplicrii AND, n procesul de difereniere a limfocitelor. O alt cauz ar fi acumularea retrograd a S-adenozilhomocisteinei (SAH) a crei hidroliz este reversibil. n afar de acesta, dezoxiadenozina acioneaz ca un inhibitor suicidal asupra SAH-hidrolazei. O cretere a activitii adenozin deaminazei de 40-70 de ori fa de normal a fost observat n cteva cazuri de anemie hemolitic ereditar. Explicaia ar consta n scderea concentraiei ATP, adenozina fiind transformat n cea mai mare parte n inozin. Deficiena de purin nucleozid fosforilaz (POP) se manifest clinic prin infecii nebacteriene (cu fungi i virusuri) datorate unui deficit de aprare imun mediat celular (al limfocitelor T). Boala este caracterizat prin hipouricemie i hipouricozurie nsoit de eliminarea urinar a inozinei (dezoxinozinei) i a guanizinei (dezoxiguanizinei). Explicaia apariiei

28

deficitului limfocitelor T ar consta n particularitatea acestora de capta foarte eficient dezoxinucleozidele purinice din snge. Gena codificat se gsete pe cromozomul 14 iar boala se transmite autozomal recesiv. Deficiena de mioadenilat deaminaz, o boal ereditar rar transmis autozomal recesiv se caracterizeaz prin instalarea oboselii, crampelor i durerilor musculare dup exerciii fizice moderate. Contraciile musculare nu se nsoesc de producere de amoniac i IMP iar concentraia ATP rmne sczut un timp mai ndelungat. Toate acestea indic importana ciclului adenilic n muchi. Xantinuria ereditar, o boal relativ blnd, adesea asimptomatic se datoreaz deficitului de xantinoxidaz. Bolnavii prezint adesea hipuricemie i hipouricozurie cu eliminri renale de xantin i hipoxantin. Xantina fiind mai puin solubil dect acidul uric poate forma calculi renali. Exist dou variante ale bolii, a) clasic n care este afectat numai xantinoxidaza i b) deficiena de cofactor-Mo n care este afectat i activitatea unei alte enzime dependente de Mo (sulfic oxidaza). XIX.9. CATABOLISMUL PIRIMIDINELOR Cile specifice catabolismului pirimidinelor privesc uracilul i timina. Nucleotidele i nucleozidele citozinei sunt dezaminate la compui ai uracilului. Exist dezaminaze specifice pentru CMP i dCMP, citidin i dezoxicitidin nu ns i pentru citozin liber (cu excepia unor bacterii). Nucleotidele i nucleozidele sunt catabolizate pn la baze libere prin aciunea 5-nucleotidazelor i a piridin fosforilazelor. Degradarea uracilului i a timinei prezint o succesiune de reacii. ntr-o prim reacie are loc reducerea nucleului pirimidinic (cu NADPH), apoi o hidroliz a legturilor ntre N3 i C4 urmat de o hidroliz a produilor liniari pentru a da dioxid de carbon, amoniac i un aminoacid. Din uracil se formeaz -alanin, din timin acid -aminoizobutiric. Se tie c aminoacizii sufer o transaminare, semialdehidele rezultate fiind catabolizate prin ci nc neprecizate la dioxid de carbon i ap.

29

O HN O P-O-H2C
UMP

O HN

N
H2O P

O HO-H2C O

piridin nucleozid fosforilaz P R1P

OH

OH

OH
NH3 aminohidrolaz

uridin-5'-monofosfat

uridina

OH

O HN NH2 N O N H
uracil

NH2 N O P-O-H2C
CMP

H2O

N
H2O P

O HO-H2C O

OH

OH

OH

OH

citidin

NH2 N O P-O-H2C
dCMP

O HN O

N
H2O NH3

P-O-H2C

OH

OH

30

NH2 N O P-O-H2C
dCMP H2O 5'-nucleotidaza P

O HN O

N
H2O NH3

P-O-H2C

OH

OH
H2O 5'-nucleotidaza P

NH2 N O HN N
H2O NH3

O HO-H2C O

HO-H2C

OH
2'-dezoxicitidina

OH
2'-dezoxiuridina

O HN O
uracil

N H

31

O HN O P-O-H2C
TMP

O CH3 HN O HO-H2C O
P R1P

CH3 N O OH HN

O CH3 N H
timina

5'-nucleotidaza NH3

O
H2O

OH

OH

OH

Acidul -aminoizobutiric este catabolizat mai greu. O anomalie genetic frecvent este eliminarea acestuia prin urin. Hipersecreia acidului -aminoizobutiric se ntlnete la 5-10% din europeni i la aproximativ 90% din orientali fr a cauza vreo suferin.
O HN O N H
NADPH+H
+

timidina

O HN O
NADP
+

hidrolaze

H2N-CO-NH-CH2-CH2-COOH
acid beta-ureidopropionic

N H

CO2 + NH3

H2N-CH2-CH2-COOH

XIX.10. BIOSINTEZA DE NOVO A NUCLEOTIDELOR PIRIMIDINICE Biosinteza nucleotidelor pirimidinice cuprinde ase etape. Spre deosebire de biosinteza purinelor, primul compus sintetizat este o pirimidin liber (acidul orotic) nu un nucleotid. Nucleotidul apare ulterior prin aciunea unei fosforibozil transferaze. Cele ase enzime se gsesc sub form de proteine individuale la bacterii. La animale, ns, primele trei activiti sunt date de acelai lan polipeptidic formnd multienzima pir 5-6. Enzima 4 este localizat pe membrana intern mitocondrial. Acidul aspartic contribuie la atomii de carbon numrul 4, 5 i 6 i atomul de azot 1, glutamina pentru azotul numrul 3 i dioxidul de carbon pentru carbonul numrul 2. 1). ntr-o prim etap carbamoilfosfat sintetaza II (CPS-II) , utiliznd dioxid de carbon respirator, grupa amino a glutaminei i un rest fosfat de la ATP formeaz carbamoil fosfat. O a doua molecul de ATP este hidrolizat
32

asigurnd ireversibilitatea procesului. Enzima este diferit de enzima similar (CPS-I) din ciclul ureogenetic att ca localizare ct i ca surs de grupare amino (din glutamin i nu din amoniac). O parte din carbamoil fosfatul intramitocondrial poate trece n citoplasm pentru a fi utilizat la biosinteza bazelor pirimidinice.
carbamoilfosfat sintetaz CO2 Glu

NH2 O C O-P

H2N-OC-CH2-CH2-CH-COOH NH2

2ATP

2ADP

2). ntr-o a doua etap, catalizat de ctre aspartat transcarbonilaz (ATC-az), carbamoilul este transferat pe grupa amino a acidului aspartic rezultnd acidul carbamoil aspartic. Reacia este reversibil dar echilibrul este deplasat spre biosintez.
COOH NH2 O C O-P + H2N-CH-CH2-COOH COOH
aspartat transcarbamoilaz

H2N O=C N H

CH2 CH-COOH

3). n cea de a treia etap dehidrorotaza (DHO-aza) ciclizeaz produsul reaciei anterioare la acid dihidroorotic.. COOH H2N O=C N H CH2 CH-COOH
dehidrorotaza

O HN O N H COOH

Ciclizarea se realizeaz prin formarea unei legturi peptidice, iar enzima, asemntor cu unele peptidaze, conine Zn n centrul activ. Echilibrul reaciei depinde de pH, la pH fiziologic fiind aproape de valoarea 1. 4). Acidul dihidrorotic traverseaz membrana extern a mitocondriilor i sub aciunea dihidrorotat dehidrogenazei (DHODH-az)

33

trece la acid orotic. Enzima conine FAD i Fe+3 neheminic care transport electronii pe acceptorul final NAD+. De aici echivalenii reductori sunt folosii n lanul respirator celular. O HN O N H COOH O
NAD+ NADH+H+

O HN N H COOH

5). n continuare acidul orotic iese n citoplasm unde prin aciunea orotat fosforibozil transferazei (OPRT-az) este transferat pe PRPP pentru a forma primul nucleotid pirimidinic oritidin-5-fosfat (OMP).
O O HN O N H COOH + OH OH OH OH HN P-O-CH2 O O-P-O-P O
Mg+2 -PP

P-O-CH2 O

COOH

6). Orotin-5-fosfat decarboxilaza (ODC-aza) decarboxileaz OMPul la UMP. Enzima este inhibat de analogi sintetici ai nucleotidelor naturale, cum este nucleotidul 6-azauridinei, utilizat n tratamentul unor forme de cancer. Asocierea ultimelor dou activiti n multienzima pir 5-6 d posibilitatea canalizrii OMP. Acesta nu apare practic liber n citoplasm unde ar putea fi degradat, ducnd la o irosire a legturilor macroergice. Se observ c pentru biosinteza UMP sunt necesare patru legturi macroergice.

34

O HN O P-O-CH2 O N COOH
CO2

O HN O P-O-CH2 O N

OH

OH

OH

OH

XIX.11. FORMAREA UTP, CTP I (d)TTP UMP este fosforilat la UDP de ctre o kinaz cu specificitate dubl (pentru UMP i CMP). Formarea UTP are loc sub aciunea nucleozid difosfat kinazei (NDK). Acesta poate fi transformat n CTP de ctre CTPsintetaz care substituie hidroxilul de la carbonul nr. 4 cu grupare amino provenit de la glutamin. Biosinteza (d)TMP are loc prin transferarea unui metil din acidul N5, 10 N -metilen tetrahidrofolic pe dUDP de ctre TMP-sintetaz. n aceast reacie rezult acid dihidrofolic care trebuie redus prin consum de NADPH de ctre dihidrofolat reductaz la acid tetrahidrofolic (THF). Din aceasta serinhidroximetil transferaza regenereaz N5, N10-CH2-THF pe seama serinei care trece n glicocol. Se consider c dUMP provine fie din dUDP, o cale probabil secundar, fie din dCMP sub aciunea unei deaminaze. Dezoxiribonucleotidele dUDP i dCDP apar sub aciunea ribonucleotid kinazei. XIX.13. CI DE RECUPERARE N BIOSINTEZA PIRIMIDINELOR Recuperarea bazelor libere se face mai greu dect n cazul bazelor purinice. Totui uracilul poate fi recuperat la UMP prin reacia nespecific a oratfosforibozil transferazei: uracil + PRPP
OPRT

UMP + pirofosfat

Aceeai enzim poate utiliza 5-F-uracilul pentru a forma F-dUMP, alopirolul i oxipirolul formnd nucleotide neobinuite. Prin aciunea invers a uridin fosforilazei, uracilul formeaz uridina.

35

uracil + ribozo-1-fosfat

uridin + fosfat

Emzima poate utiliza i derivai 5-halogenai, de asemenea alo i oxipurinolul dar nu i alte baze purinice sau pirimidinice.
ATP ADP

uridina citidina

Mg+2 uridincitidin kinaza Mg+2 ATP ADP Mg+2 timidin kinaz dezoxicitidin kinaz Mg+2 ATP ADP

UMP CMP

timidina d-citidina

TMP dCMP

Dezoxinucleozidele uracilului i timinei sunt obinute prin aciunea unor fosforilaze diferite, dezoxitimin fosforilaza care utilizeaz dezoxiribozo1-fosfatul. Timidina i dezoxitimidina sunt fosforilate fiecare de o kinaz specific. XIX.13. REGLAREA BIOSINTEZEI NUCLEOTIDELOR PIRIMIDINICE La unele bacterii cum este E. coli rolul principal de reglare a biosintezei pirimidinelor l joac aspartat trascarbamoilaza , una din cele mai bine studiate enzime allosterice, considerat dim mai multe privine ca i prototip. Ea este format din ase subuniti catalitice (doi trimeri) fiecare cu M=34000 i ase subuniti reglatoare (trei dimeri) cu M=17000 fiecare. Subunitile reglatoare i locusurile de legare pentru activatorul allosteric ATP-ul i pentru inhibitorul CTP. Legarea efectorilor schimb geometria subunitilor modificnd astfel cinetica de reacie. La animale ACT-aza nu este ns o enzim reglatoare. Controlul se exercit asupra carbamoilfosfat sintetazei II din multienzima pir 1-3. Aceasta este activat de ctre ATP i alte nucleotide purinice dar mai ales de ctre PRPP i inhibat de ctre UTP i CTP.

36

XIX.14. PATOLOGIA BIOCHIMIC A METABOLISMULUI PIRIMIDINELOR Au fost descrise mai multe cazuri de orotic acidurie ereditar. n unele din acestea este vorba de o deficien combinat a orotat-fosforibozil transferazei i a orotilat decarboxilazei - orotaciduria de tip I - n altele (mai rare) deficiena privete doar orotilat decarboxilaza - orotaciduria de tip II. Clinic boala se manifest prin lipsa de cretere a noilor nscui afectai, leucopenie i anemie de tip megaloblastic. n urin se elimin cantiti mari de acid orotic care cristalizeaz, provocnd adesea litiaz renal. Administrarea de nucleozide sau de nucleotide pirimidinice duce la ameliorarea bolii. Ambele forme se transmit autosomal recesiv. Se cunoate o form de anemie hemolitic ereditar datorit deficienei de piridin 5- nucleotidaz. Boala s-ar datora acumulrii n cantitate mare a nucleotidelor pirimidinice produse prin hidroliza ARN n timpul maturrii eritrocitare. Inhibiia aceleai enzime n timpul ntoxicaiei cu plumb este unul din primele manifestri patologice i ar fi responsabil, cel puin parial, de anemia caracteristic. XIX.15. FORMAREA DEZOXIRIBONUCLEOTIDELOR Dezoxiribonucleotidele necesare biosintezei de AND rezult, toate, prin aciunea aceleeai enzime ribonucleotid reductaza. Ca substrat sunt utilizai ribonucleoziddifosfaii. Enzima este alctuit din dou proteine: B 1, mai voluminoas (M=160000) i B2 mai mic (M=78000). Fiecare din cele dou proteine conine cte dou lanuri polipeptidice identice, structura complet a enzimei fiind de forma (B1)2(B2)2. Centrul activ cuprinde regiuni din ambele subuniti, fiind esenial prezena a dou grupri -SH n subunitile B1, a unui radical liber (provenit de la tirozin) i a cte unui ion Fe+3 n subunitile B2. Unul dintre inhibitorii ribonucleotid reductazei utilizat ca medicament, hidroxiureea acioneaz tocmai prin mpiedicarea formrii radicalului liber. Reducerea C2 a ribonucleozid difosfailor se face prin intermediul a celor dou grupe -SH care trecnd la -S-S- cedeaz 2H. Grupele -SH sunt regenerate prin aciunea uneia din dou proteine mici tioredoxina i glutaredoxina. Fiecare dintre acestea conine, de asemenea, cte dou grupe -SH care se oxideaz reversibil. Grupele -SH ale tioredoxinei sunt sunt regenerate de ctre o enzim tioredoxi reductaz, care conine FAD i utilizeaz NADPH. Tiridoxin reductaza are i ea dou grupe -SH ce intervin

37

prin oxidare reversibil. Glutaredixina este redus la loc de ctre glutation reductaz pe seama NADPH. Dezoxiribonucleozid difosfaii formai sunt fosforilai n continuare de ctre nucleozid difosfat kinaz (NDK) la trifosfaii corespunztori. Dezoxiuridin trifosfatul nu se poate acumula, el este scindat rapid de ctre o dUDP difosfohidrolaz specific. dUTP + H2O dUMP + pirofosfat

Se previne astfel utilizarea dUTP n biosinteza AND i totodat este generat dUMP necesar sintezei TMP. Reglarea ctivitii ribonucleotid reductazei se realizeaz prin intermediul unor centri allosterici din subunitile B1. XIX.16. BIOSINTEZA COENZIMELOR NUCLEOTIDICE
ATP

riboflavin
O H3C H3C N N CH2 HCOH HCOH HCOH CH2OH NH

ADP

ATP

PP

kinaz

FMN

pirofosforilaz

FAD
O

H3C O H3C

N N CH2 HCOH HCOH HCOH

NH O

CH2-O-PO3-2

n general coenzimele nucleotidice sunt formate, mai ales, n ficat pornind din vitamina corespunztoare din diet. Riboflavina este fosforilat la FMN de ctre o kinaz specific. Din aceasta o pirofosforilaz catalizeaz adugarea reversibil a AMP pentru a forma FAD.

38

O H3C H3C N N CH2 HCOH HCOH HCOH OO OO OH O N N N NH O

NH2 N

CH2-O-P-O-P-O-CH2

OH

Biosinteza NAD+ poate avea diferite puncte de pornire. Prin aciunea unei fosforibozil transferaze acidul chinolinic produs n catabolismul triptofanului d nicotinat nucleotidul.
TRIPTOFAN

PRPP

PP

COOH N

nicotinat fosforibozil transferaz

COOH N POCH2 O
+

CO2 PP

PRPP

fosforibozil transferaz

COOH COOH

OH

OH

Astfel fosforibozil transferazele utilizeaz acitul nicotinic i nicotinamina provenit din alimentaie pentru a forma nucleotida corespunztoare. Pe lng PRPP unele dintre aceste enzime necesit ATP ca i efector allosteric sau ca surs de energie (prin hidroliza unui fosfat). Mononucleotidele obinute sunt convertite la dinucleotidele corespunztoare prin aciunea unei adenil-transferaze. n fine NAD sintetaza trece o grupare amino din
39

glutamin pe carboxilul acidului nicotinic formnd NAD+. n aceast reacie se consum o legtur macroergic din ATP. NADP+ rezult prin fosforilarea NAD+ de ctre o kinaz specific. NAD+ + ATP
Mg+2

NADP+ + ADP

COOH N POCH2 O
+ adenilat transferaz ATP P P

OH
NH2 N N N O N

OH
deamino NMN

COOH O O O
ATP+Gln ADP+P+Glu +

CH2-O-P-O-P-O-H2C OH OH OH
deamino-NAD+

sintetaz

OH

OH

OH

NH2 N N N O N O O O
+

CO-NH2 CH2-O-P-O-P-O-H2C OH OH N

OH

OH
NAD+

OH

OH

40

Coenzima A este sintetizat din acid pantotenic printr-o succesiune de reacii prezentate mai jos. Se poate remarca activitatea acesteia prin fosforilare n poziia 4 apoi condensarea cu cistein, urmat de o decarboxilare pentru a da fosfopantoteina i transferul unui rest AMP pe fosfatul terminal. n final o kinaz fosforileaz riboza n poziia 3. CH3 HO-CH2-C - CH-CO-NH-CH2-CH2-COOH CH3 OH
acid pantotenic CTP+cistein CDP+P ATP kinaz ADP

CH3

HO-P-O-CH2-C - CH-CO-NH-CH2-CH2-COOH OH CH3 OH

acid 4'-fosfopantotenic

sintetaz

CH3

COOH
decarboxilaz CO2

HO-P-O-CH2-C - CH-CO-NH-CH2-CH2-CO-NH-CH-CH2-SH OH O CH3 OH

4'-fosfopantetoil cistein

CH3
decarboxilaz CO2 4'-fosfopanteina

HO-P-O-CH2-C - CH-CO-NH-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-SH OH CH3 OH

41

NH2 N N N O N O O CH3
+ATP -ADP

CH2-O-P-O-P-O-CH2-C - CH-CO-NH-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-SH OH OH OH CH3 OH

defosfo-CoA

OH

NH2 N N N O N O O CH3

CH2-O-P-O-P-O-CH2-C - CH-CO-NH-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-SH OH OPO3H2 OH CH3 OH

CoA

OH

XIX.17. BIOSINTEZA ACIDULUI DEZOXIRIBONUCLEIC. Printre marile descoperiri ale secolului XX se numr i stabilirea modelului structural al acizilor nucleici, a mecanismului biosintezei lor i al rolului pe care-l ndeplinesc n organismele vii. Experienele ntreprinse de Beadle i Tatum (1941) cu orivire la controlul genetic al reaciilor biochimice au fost continuate n diferite laboratoare i au culminat cu descoperirile lui Avery, Mcleod i McCarty (1944) care au demonstrat c ADN joac rolul fundamental n transmiterea caracterelor ereditare. Suita de lucrri tiinifice publicate ulterior de Watson i Crick (1953), Wikkins, Stokes i Wilson (1953) i Wilkins (1956) au condus la elaborarea modelului structural dublu helicoidal al macromoleculei de ADN care trebuie s explice mecanismul transmiterii informaiei genetice. XIX.17.1. Structura acidului dezoxiribonucleic (ADN) Acidul dezoxiribonucleic este un polimer alctuit din nucleotide ale dezoxiribozei, cu o mas molecular ce variaz ntre 10 6 - 109 i localizat aprope exclusiv n nucleul celular sub form de dezoxoriboproteide. La eucariote ADN nuclear se gsete aproximativ 2 mg/g esut umed i poate fi gsit, n cantiti mult mai mici, n mitocondrii i citoplasm.

42

Cantitatea de ADN n celulele unei specii date este ntodeauna constant i funcie de numrul de cromozomi. n cursul diviziunii celulare cantitatea de ADN se dubleaz pentru ca n mitoz s se reduc la jumtate i celulele fiice diploide s conin aceeai cantitate de ADN ca i celulele parentale caracteristice speciei. n celulele haploide (gamei) cantitatea de ADN este njumtit deoarece prin fecundare are loc restabilirea cantitii de ADN specific speciei date, dup cum n celulele poliploide cantitatea de And n funie de gradul de poliploidie a speciei. Compoziia chimic a AND. Macromoleculele de ADN din celule sunt alctuite din uniti mononucleotidice ale dezoxiribozei dAMP, dGMP, dTMP i dCMP legate ntre ele prin punile fosfodiesterice 3 5. Compoziia macromoleculelor de AND n baze azotate purinice i pirimidinice este caracteristic pentru fiecare organism i rmne aceeai indiferent de vrst, de condiiile fiziologice sau de condiiile ecologice. Din contr, compoziia n baze azotate a ADN variaz de la o specie la alta, dup cum variabile sunt i secvena unitilor mononucleotidice i masa molecular sau structurile chimice superioare structurii primare. De exemplu, la bacterii singurul tip de molecul de ADN este localizat n regiunea nucleului, nt-run fel de invaginare i asociat membranei celulare prin intermediul unei particule denumit mezozom i nu este asociat cu proteinele bacteriene, nu posed o structur dublu spiralat, are o mas molecular inferioar ADN de la eucariote. Speciile moleculare de ADN pot fi mprite n dou clase: tipul AT caracterizat printr-un exces de A i T i mai frecvent ntlnit i tipul GC n care predomin G i C i se ntlnete mai rar. n unele macromolecule de ADN citozina este prezent sub form de 5-metilcitozin. Succesiunea dezoxiribonucleotidelor n catenele ADN alctuiete structura primar a ADN.

43

Secvena resturilor de nucleotidedin macromolecula ADN

44

n structura de mai sus a- reprezint structura primar; b-schema legturilor C3-C5 dintre nucleotidele care alctuiesc molecula

Modelul molecular al unui fragment de ADN Configuraia moleculei de ADN. Modelul lui Watson i Crock. Studiul structurii moleculare a ADN s-a realizat cu ajutorul metodei de difracie a razelor X aplicat pe preparate nalt purificate. n 1953 Watson i Crick i Wilkins i alii bazndu-se pe studiile de difracie a razelor X, pe numeroase date experimentale privind proprietile fizico-chimice ale ADN, ndeosebi pe regula lui Chargaff (A=T i G=C, iar A+T=T+C) precum i pe rolul pe care ADN l ndeplinete n transmiterea caracterelor ereditare au postulat un model tridimensional al structurii ADN. Molecula de ADN reprezint un dublu helix de dreapta i const n dou catene polinucleotidice rsucite una n jurul celeilalte i unite ntre ele prin bazele lor azotate. Fiecare tur de spir cuprinde 10 baze azotate i are o lungime de 3,4 , ceea ce nseamn c spaiul ocupat de un nucleotid este de 3,4 , adic cel msurat experimental prin metoda difraciei cu raze X. Cele dou catene polinucleotidice sunt complementare i orientate n sens opus, adic sunt antiparalele, iar bazele purinice i pirimidinice n fiecare caten polinucleotidic se gsesc situate n planuri paralele, perpendiculare pe axul
45

dublului helix. Bazele unor catene polinucleotidice sunt perechi cu bazele catenei polinucleotidice complementare i sunt situate n aceleai planuri, formnd baze perechi i dnd natere legturilor de hidogen dintre catene. Studiul detaliat al legturilor ntre bazele azotate din structura ADN a artat c A formeaz pereche cu T, iar C cu G. n concordan cu acest model, succesiunea bazelor ntr-una din cele dou catene polinucleotidice determin sau condiioneaz n mod automat succesiunea bazelor n catena complementar, antiparalel, iar regula lui Chargaff este confirmat. Structura propus pentru ADN prezint un ax n jurul cruia se rsucete elicea. Ea este caracterizat prin faptul c permite formarea unui numr maxim posibil de legturi de hidrogen i c aceste legturi dau un maxim de stabilitate moleculei. Wilkins i colaboratorii au adus mici modificri modelului propus de Watson i Crick preciznd c exist dou feluri de fose ntre dou spire a helixului: fose mari (big deep) i fose mici (litle deep) care dau posibilitatea moleculei de ADN s se combine sau s intre n contact cu diferii constitueni celulari: histone, hormoni, antibiotice, enzime etc., fosele conferind acestor procese o oarecare specificitate. ADN monocatenar i ADN circular. Sinsheimer (1955-1959) reuete s izoleze din bacteriofagul X 174 care infecteaz celulele de E. coli un ADN alctuit dintr-o singur caten polinucleotidic liniar care conine 5500 nucleotide. Acest ADN se caracterizeaz prin A+G # T+C (ceea ce nseamn c nu poate exista sub form de dublu helix). Studiile ulterioare ale aceluiai autor au scos n eviden faptul c molecula de ADN poate coexista sub dou forme: liniar (componenta S2 fr proprieti virulente i obinut dup prelucrare cu dezoxiribonucleaz pancreatic a componentei S1 cu proprieti virulente) i circular, rezultat din forma liniar n urma apariiei unei legturi covalente ntre extremiti.

46

47

48

XIX.17.2. Replicarea macromoleculei de AND. Kornberg, Lehman, Besman i Simms (1956) realizeaz pentru prima dat sinteza enzimatic a ADN utiliznd baze azotate purinice i pirimidinice trifosforilate i enzime parial purificate din culturi de E. coli. Kornberg i colaboratorii au artat c dezoxinucleozid trifosfaii n prezena ionilor de Mg+2 i a unui sistem acelular complet obinut din E. coli, care coninea mici cantiti de ADN nativ pot polimeriza dup reacia:
ADN nativ

ADN
+2

n1dATP n2dGTP n2dCTP n1dTTP

Mg

dAMP dGMP dCMP dTMP (2n 1+2n 2) + (n 1+n 2) P-O-P

Sistemul enzimatic prezent n extractele celulare de E. coli catalizeaz polimerizarea dezoxinucleozid trifosfailor dac se ndeplinesc urmtoarele condiii: a. -prezena unor mici cantiti de ADN nativ, izolat din celulele de E. coli, n calitate de primer, de amors a reaciilor enzimatice, preparatele din ARN nu sunt capabile s amorseze aceast reacie; b. -bazele purinice i pirimidinice sub form de dezoxinucleozizi trifosfai sunt absolut necesare n cantiti echimoleculare, ATP stimuleaz biosinteza ADN; c. -reacia decurge n mod obligatoriu n prezena ionilor de Mg+2, substituirea lui cu Mn+2 schimb mersul i rezultatul reaciei enzimatice; d. -reacia enzimatic este reversibil deoarece prezena n exces a pirofosfatului determin o depozitare a ADN nou sintetizat; e. -n prezena unor amorse de ADN din dezoxiribonucleozizi trifosfai sistemul acelular poate sintetiza o cantitate de ADN care depete de 20 de ori cantitatea de ADN primer sau amors; f. -moleculele de ADN sintetizate de novo respect regula lui Chergraaf i au compoziia bazelor azotate apropiate de cea a macromoleculelor de ADN care au servit ca amors.

49

Concluzia acestor experiene este c moleculele de ADN primer sau de amors servesc drept matrice pentru biosinteza unor noi molecule de ADN n cadrul unui proces denumit replicare. Recunoscnd rolul de matrice al ADN-primer sau amors replicarea macromoleculei de ADN, teoretic poate fi realizat dup trei mecanisme diferite conservativ, semiconservativ i dispers. Potrivit modelului dublu helicoidal al moleculei de ADN, Watson i Crick au postulat faptul c replicarea macromoleculei de ADN are loc dup mecanismul semiconservativ. Demonstrarea experimental direct a existenei n organismele vii a acestui mecanism a fost fcut de Meselson i Stahl (1958) care au cultivat celule de E. coli pe medii de cultur care conineau n calitate de surs de azot NH4Cl i 15NH4Cl. Azotul este incorporat n macromoleculele de ADN obinndu-se, conform mecanismului semiconservativ 14N-ADN, 15N-ADN i 14N-ADN, 15N-ADN, macromolecule cu mase moleculare diferite i care pot fi separate prin ultracentrifugare n gradient de CsCl, arbitrar denumite forma grea, uoar i intermediar. Taylor (1958), Kornberg (1960) i Cairs (1961-3) au adus dovezi experimentale privind existena mecanismului de replicare semiconservativ a ADN la celulele eucariote, la bacterii i bactereofagi. Dac replicarea ADN este tip semiconservativ, urmtoarea problem care s-a pus a fost natura replicrii macromoleculei de ADN. n acest scop Cairns a studiat cromozomul bacterian n care ADN este prezent sub form de dubl caten circular. Celulele de E. coli au fost cultivate ntr-un mediu ce coninea timin marcat cu tritiu 3T i ADN sintetizat a fost examinat la diferite intervale de timp, prin metoda autohistoradiografiei (timina tritiat determin reducerea AgCl de pe placa fotografic la argint metalic care poate fi vizualizat la microscop). Comparnd imaginile obinute, Cairns ajunge la concluzia c n timpul replicrii cele dou catene polinucleotidice ale ADN bacterian nu se separ complet una de alta ci ele sunt separate treptat ntr-un singur locus n form de Y care se mic treptat dealungul cromozomului. Din aceast cauz cromozomul rmne tot timpul circular. Catena de ADN nou sintetizat se formeaz cu o vitez de 27 /minnut, ceea ce corespunde formrii a 9.104 legturi internucleotidice pe minut. Cairns presupune c n timpul replicrii cele dou catene polinucleotidice ce se despiraleaz, ceea ce implic o rotaie a moleculei parentale n raport cu molecula fiic care se sintetizeaz. Dac se ia n considerare c molecula de AND din E. coli este replicat n cursul unei singure diviziuni celulare n 30 de minute, atunci despiralarea dublului helix circular trebuie s se realizeze cu o vitez de 10000 ture/minut. Acest fapt a

50

dus la ipoteza mai multor puncte de cretere adic a mai multor locui n care ncepe sinteza de novo a moleculei fiice. XIX.17.3. Mecanisme enzimatice ale replicrii AND. n experiene n vitro Kornberg i colab. au demonstrat c biosinteza ADN este catalizat de ADN-polimeraz, enzim care realizeaz sinteza legturilor internucleotidice din amestecuri de dATP, dGTP, dCTP i dTTP. Compuii 5-di- i monofosforilai ai bazelor azotate menionate sunt inactivi n aceast sintez. Prezena concomitent a dezoxiribonucleoti-delor trifosforilate este obligatorie. Absena unui dezoxirionucleotid trifosfat conduce la stoparea procesului de replicarea a ADN. ADN-polimeraza catalizeaz adiia resturilor mononucleotidice la extremitatea 3-liber a catenei polinucleotidice ADN, direcia fiind 5 3. Reacia este puternic exergonic deoarece pirofosfatul rezultat este hidrolizat cu formare de ortofosfat de ctre pirofosfataz. ADN-polimeraza n prezena unui exces de pirofosfat, produs care rezult prin condensarea dezoxiribonucleozid trifosfailor, hidrolizeaz succesiv resturile de mononucleotide la extremitile 3 i 5 ale catenei polinucleotidice cu formare de dezoxiribonucleozid-5-monofosforilai. ADN-polimeraza a fost identificat la bacterii, plante i animale n nucleu. n mici cantiti este prezent n mitocondrii unde particip la replicarea ADN-mitocondrial. Enzima izolat de la E. coli este proteina ce conine gruparea -SH liber nesemnificativ pentru activitatea catalitic, o punte -S-S- i are M=109000. n timpul activitii ei, care poate fi concretizat prin polimerizarea a 1000 de resturi de nucleotide/minut/mol de enzim, prezena ADN drept amors este absolut obligatorie. Kornberg i colaboratorii au artat c ADN-polimeraza necesit prezena unei singure catenepolinucleotidice complementare. ADN rezultat n urma aciunii ADNpolimerazei prezint catene polinucleotidice orientate antiparalel ceea ce este n plin concordan cu modelul structural elaborat de Watson i Crick.

51

52

Folosind ADN izolat din timusul de viel i metoda de analiz a funciilor de baze din vecintatea cea mai apropiat Kornberg i colaboratorii au artat c ADN format sub aciunea AND-polimerazei este complementar tiparului de ADN primer i c enzima poate ncopora i analogii structurali ai nucleotidelor naturale, dar numai n cazul n care baza analoag nucleotidei poate forma legturi de hidrogen cu baza corespunztoare din calena polinucleotidic a primerului.

Astfel, dGTP poate fi substituit cu dezoxiinozintrifosfat, iar dTTP i cCTP de 5-bromdezoxiuridintrifosfat i respectiv de 5bromdezoxicitidintrifosfat. Aceast observaie experimental a fost folositulterior pentru marcarea catenelor polinuclotidelor de ADN. Mecanismul de aciune al ADN-polimerazei const n capacitatea de a lega ADN primer, substratele reaciei (dezoxiribonucleozidtrifosfaii) i produii de reacie. S-a artat c enzima posed un situs de legare pentru dezoxiribonucleotid-5-trifosfat indiferent de structura lor chimic) care competiioneaz ntre ei pentru aceste locuri. Un al doilea situs leag moleculele de ADN monocatenare liniare i circulare (primerii). Enzima nu este activ n cazul moleculelor de ADN dublu catenare circulare intacte. Mecanismul interaciunii dintre ADN-polimeraz i ADN monocatenar asigur marea fidelitate a procesului de replicare a ADN celular i n consecin stabilitatea materialului genetic specific speciei respective. Plecnd de la constatarea c ADN-polimeraza este activ numai n cazul macromoleculei de ADN care prezint crestturi, ntreruperea lanului polinucleotidic i de la existen fragmentele Okazaki, Kornberg i colaboratorii au elaborat o ipotez nteresant despre replicarea n vivo a
53

ADN. ADN-polimeraza interacioneaz cu catena b a unui ADN crestat (I) la nivelul extremitii 3 de la nivelul catenei polinucleotidice ntrerupte. Rezultatul acestei interaciuni este refacerea catenei b (II) i ndeprtarea spaial a extremitii 5. ntr-o etap ulterioar ADN-polimeraza sare de la catena a la catena b i replicarea moleculei continu n direcia 5 3. Noua caten polinucleotidic sintetizat b i complementaraprimei este crestat la nivelul curburii ei de endonucleaza celular (IV).
5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3'

5'
3' 3' 2' 3'

3'

3'

5'

3'

5'

3'

5'

3'

5'

(a)

(b)

(a)

(b)

(a)

(b)

(a)

(b)

II
5' 3'

III
5' 3'

IV

5'
3' 5'

5' 3'
5' 3'

3'

3'

5'

3'

5'

(a)

(b)

(a)

(b)

Rezultatele acestei operaii se materializeaz n aceea c ADN-polimeraza reia procesul de replicare a catenei la nivelul extremitii 3 a catenei polinucleotidice b (V) pn cnd se formeaz din nou puni de hidrogen ntre catenele a i b (VI). ADN-ligaza unete cele dou fragmente ale catenei b care sunt complementare ca structur a bazelor azotate din catenele polinucleotidice. n aceast form intervine din nou endonucleaza i cresteaz din nou molecula la nivelul curburii catenei b i ciclul reaciilor descrise mai sus este reluat permanent n direcia 53 pn la completa replicare a moleculei. Se postuleaz faptul c cromozomii bacteriei ADN prezeni sub form dublu catenar circular sunt ineri atta timp ct ei nu prezint crestturi. Un caz particular de replicare se ntlnete la ADN viral, cnd n celulele gazd infectate este replicat, n principal, ADN viral care se deosebete de cel al gazdei prin faptul c n loc de citozin conine oximetilcitozin. Aceast replicare se explic prin aceea c ADN viral
54

VI

codific sinteza unei dezoxiribonucleotide care distruge specific ADN-ul gazdei, dar este inert fa de ADN-ul virusului. Sinteza rapid de ARNm i ndeosebi de proteine virale necesare nmulirii virusului este explicabil dac se ia n considerare faptul c dup cteva minute dup infectarea celulelor de E. coli cu fag, se constat apariia unor noi echipamente enzimatice (kinaza care fosforileaz hidroximetildezoxi-citidin monofosfatul, kinazele specifice TMP i dGMP, diferite glicozil-transferaze, o nou polimeraz specific fagului i deosebit imunologic de polimeraza gazd. XIX.18. BIOSINTEZA ACIDULUI RIBONUCLEIC XIX.18.1. Structura acizilor ribonucleici Acizii ribonucleici sunt substane polimere alctuite din uniti structurale, monomeri, denumite ribonucleotide. Raporturile molare dintre bazele azotate purinice i pirimidinice variaz n limite largi, n funcie de sursa din care a fost izolat acidul i de tipul de ARN studiat, ns suma A+C este, de regul, egal cu suma G+U. Celulele animale, vegetale i microbiene conin ARN de mai multe tipuri: ARN ribozomal (ARNr) care intr n structura ribozomilor i alctuiete aproximativ 80% din ARN celular, caracterizndu-se prin stabilitate metabolic i o mas molecular cuprins ntre 5. 105-2.106; ARN de transport (ARNt) alctuiete aproximativ 15% din ARN celular, are o mas molecular mai mic, care variaz n jur de 25000 pn la 28000 i particip la transportul specific al aminoacizilor din citosol la poliribozomi; ARN mesager (ARNm) care formeaz numai 5% din totalul de ARN celular este metabolic activ, are o mas molecular de 5. 10 5 i uneori chiar mai mare i o perioad de njumtire scurt. La organismele superioare toate tipurile de ARN sunt biosintetizate n nucleu, pe matricea de ADN i ulterior ptrund n citoplasm unde particip la biosinteza proteinelor. Structura primar a ARN. Analiza structurii produilor de hidroliz n mediu alcalin al moleculelor de ARN a condus la concluzia c legturile dintre monomerii ribonucleozid monofosfai se realizeaz prin intermediul gruprilor fosfoesterice care unesc C3 i C5 din dou nucleotide vecine, molecula ARN prezentndu-se sub forma unei catene polinucleotidice liniare, fr ramificaii. Utilizndu-se enzime hidrolitice pure, fosfodiesteraze din veninul de arpe, ribonucleaza T 1, fosfataza alcalin etc s-a constat c lanurile polinucleotidice ale ARN izolat din virusul mozaicului galben se termin cu nucleotidele ciclice adenozin 2,3-fosfat i guanizin 2,3-fosfat.

55

Structura secundar a ARN. Structura secundar a moleculelor de ARN a fost mai puin studiat dect structura secundar a ADN i n prezent este bine cunoscut numai pentru numeroase molecule de ARNt i pentru 5 S ARN izolat din E. coli. n soluie cu trie ionic mic moleculele de ARN se comport ca lanuri polinucleotidice tipice, iar prin creterea triei ionice a soluiilor lanurile se scurteaz, fenomen nsoit de reducere greutii specifice i de modificarea constantei de sedimentare. Utilizarea preparatelor sintetice, obinute cu ajutorul polinucleotid fosforilazei (din ADP i UDP enzima sintetizeaz catene polinucleotidice de poli A i poli U) a demonstrat c ntre dou catene polinucleotidice poli A i poli U se formeaz legturi de hidrogen ntre A i U. Aceti polimeri au fost analizai prin metoda difraciei razelor X i a dovedit c acest complex reprezint o structur dublu spiralat, unei spire i revine 10 baze azotate, iar pasul spirei este de 34 . Studiul acestor polimeri sintetici n UV a evideniat efectul hipocrom, iar nclzirea la 60oC, n mediu neutru i n soluii saline de NaCl 0,15 M a reprodus efectul hipercrom (specific pentru structurile secundare ale ADN) nsoit de o micorare sensibil la 589 nm. Aceste experiene au fost reproduse i n cazul unor preparate de ARN ribozomal izolat din virusul mozaicului tutunului ceea ce conduce la concluzia c pe alocuri molecula de ARN se nfoar pe anumite poriuni n aa fel nct resturile adeninei i a uracilului, pe de o parte, i resturile guaninei i citozinei, pe de alt parte, se formeaz legturi de hidrogen, deci o structur secundar. Prin metoda difraciei razelor X s-a demonstrat c molecula de ARN reprezint de fapt o caten polinucleotidic care prezint segmente scurte spiralate, ce alterneaz cu regiuni nespiralate. Se presupune c la formarea acestor segmente spiralate pot participa ntre 40-70% din resturile de mononucleotide ale moleculei.

56

57

ARN-ul viruilor plantelor i animalelor sunt mult mai uor separai i au fost obinui n stare pur cristalizat. ARN-ul virusurilor vegetale constituie ntre 5 i 40% din nucleoproteidele din care acestea sunt alctuite. ARN-ul din virusul mozaicului tutunului este o macromolecul, cu masa molecular de 2 milioane, formeaz aproximativ 5% din masa virusului i se prezint sub forma unei singure molecule spiralate nfurate n exterior ntro protein (masa molecular 38 de milioane) alctuit din 2100 subuniti proteice, dispuse sub form de spiral). Bacteriofagii, de asemenea, pot conine n structura lor numai ARN. De exemplu, fagii MS2, r17, f2 care paraziteaz E. coli i fagul 7S, care infecteaz Pseudomonas aeruginosa conine ARN. Coninutul procentual al ARNul bacteriofagilor poate ajunge pn la 31% din masa particulelor. Primele indicaii cu privire la rolul ARN n sinteza proteinelor au fost obinute de Casperson (1942) i Brachet (l950) care cu ajutorul histochimiei au demonstrat c celulele n care au loc sinteze intense de proteine sunt bogate n ARN. ntre anii 1950-1960 au fost descoperite i parial caracterizate fizico-chimic specii moleculare de ARN - ARNm, ARNs, ARNr, ARNn - iar Gale i Spiegelman au artat c sinteza proteinelor n sistemele acelulare obinute de la microorganisme i de celulele animalelor depinde de prezena ARN, n timp ce Zamecnik, Hoagland i alii au subliniat importana ribozomilor n acest proces. XIX.19.2. Biosinteza acidului ribonucleic mesager (ARNm)

58

Acidul ribonucleic mesager (ARNm) este denumit dup rolul ndeplinit n celul, el este sintetizat n nucleu i transmite informaia genetic de la macromolecula de ADN la nivelul ribozomilor unde are loc procesul de tranzlaie a informaiei n structura proteinelor, deci este un mesager alctuiete numai cteva procente din totalul de acizi ribonucleici celulari. Studiul structurii primare a ARNm este dificil, pe de o parte, datorit vitezei relativ mari cu care se sintetizeaz, iar pe de alt parte, perioadei de njumtire, deosebit de scurt - 2,5 minute la 25 oC la microorganisme, 3-4 ore la celulele HeLa pn la cel mult cteva zile n reticulocitele anucleate. Viteza de biosintez i perioada de njumtire a ARNm sunt puse n direct legtur cu durata ciclului de reproducere celular i cu diferenierea tisular. ARNm se caracterizeaz, de asemenea, printr-o mare diversitate a masei moleculare care variaz n limite foarte largi - de la 1-2. 10 3 pn la 2-5. 106. De exemplu, ARNm care particip la sinteza unei catene polipeptidice a hemoglobinei, protein cu mas molecular de 16500, are o mas molecular de aproximativ 150000, n timp ce la biosinteza histonelor, alctuite din 100200 de aminoacizi, particip un ARNm care depete de aproximativ 8-9 ori masa molecular a proteinei. Compoziia n baze azotate este complementar cu cea a ADN i peste 55% din bazele azotate sunt reprezentate de A i U. ARNm nu conine baze rare sau baze azotate modificate posterior procesului de biosintez. n experienele efectuate cu substane marcate cu izotopi radioactivi 14 32 C i P s-a constatat c extractele acelulare de Micococcus lyso-deikticus i E. coli este sintetizat un ARN a crui perioad de injumtire este de aproximativ 2 minute. Acest tip de ARN a fost denumit ulterior ARN mesager i perioada lui de inoire la bacterii este de cteva secunde timp n care particip n medie de 10-20 ori la biosinteza proteinelor. La mamifere perioada de injumtire este simitor mai mare, de exemplu, n ficatul de obolan este de 8-12 ore. Jacob i Monod au formulat n anul 1961 ipoteza acidului ribonucleic mesager conform creia fraciunea celular de ARN, cu o vitez de renoire att de mare, poate funciona ca tipar pentru sinteza proteinelor celulare i pentru biosinteza enzimelor elaborate sub aciunea unui inductor. Jacob i Monod presupun c ARNm care precede sinteza proteinelor este o specie molecular de ARN care poart informaia genetic din ADN cromozomilor din nucleu la nivelul ribozomilor citoplasmatici. Ei postuleaz c ARNm se formeaz enzimatic, este complementar cu structura primar unui fragment dintr-una din catenele ADN i conine informaia complet pentru biosinteza unei proteine, a uneia sau a mai multor catene polipeptidice.

59

La extractele acelulare trebuie s se adauge pentru a se sintetiza ARN urmtoarele componente: ATP, UTP, GTP, CTP, MnCl2, spermininfosfat, enzime, ADN-amors, Mg+2, reacia are loc la pH 7,5 n tampon Ttris i este inhibat de pirofosfat. Dac extractul acelular este tratat cu dezoxiribonucleaz nainte de adugarea componentelor el este activ numai dup adugarea de ADN-amors. Compoziia ARN sintetizat este n funcie de natura ADN folosit ca amors. Cantitatea de ARN sintetizat n prezen de ADN amors poate depi de 60 de ori concentraia ADN introdus n mediu. Procesul de transmitere a informaiilor genetice cuprinse n macromolecula de ADN moleculei de ARNm poart denumirea de transcripie i se realizeaz enzimatic. Stevens, Weiss i Hurwitz au izolat n 1960 independent unul de altul i aproape concomitent ARN-polimeraza-ADN-dependent., adic enzima capabil s sintetizeze ARN din ribonucleozid-5-trifosfai, dar numai n prezena ADN care servete drept tipar n aceast sintez, deoarece moleculele de ARN sintetizate sunt complementare ca structur unei catene polinucleotidice a ADN. ARN-polimeraza-ADN-dependent necesit prezena ionilor de magneziu, a celor patru ribonucleozid-5-trifosfai i sintetizeaz n prezen de ADN un ARN ce conine legturile 3,5fosfodiesterice, adugnd uniti mononucleotidice la extremitatea 3-OH liber i determinnd, n felul acesta, creterea moleculei de ARN n direcia 35 a catenei polinucleotidice. Aceast enzim a fost ulterior identificat n celulele animale, vegetale, microbiene i este localizat ndeosebi n nucleul acestora, dar a fost gsit i n mitocondrii, unde particip la transcripia ADN mitocondrial. ARN-polimeraza-ADN-dependent izolat din E. coli are M=700000 i sufer modificri ale strii de agregare in funcie de concentraia ei n soluie i cea a substratului. Pentru transcripita ADN i pentru activitatea enzimei sunt necesare dou proteine, una denumit sigma () care iniiaz catena de ARN, iar cea de a doua protein omega ( ) formeaz legturi internucleotidice cu lanul polinucleotidic n cretere. Se presupune c factorul ndeplinete un rol important n reglarea transcripiei. Analiza compoziiei n baze purinice i pirimidinice prin metoda frecvenei bazelor vecine a demonstrat c amorsa ADN i produsul sintezei de ARNm au structuri perfect complementare, iar catena polinucleotidic de ARNm are o polaritate invers celei a catenei corespunztoare amorsei ADN. n timpul procesului de transcripie ntre ARNm i ADN-amors nu se formeaz legturi de tip covalent. Faptul c n experienele n vivo este utilizat numai o caten polinucleotidic de ADN n procesul de transcripie nu este concludent
60

pentru a considera cea de a doua caten a acestuia neactiv sau de prisos. ARN sintetizat n experiena in vitro n sisteme acelulare de ctre ARNpolimeraza-ADN-dependent, n prezen de ADN nativ dublu catenar, stimuleaz incorporarea de aminoacizi n proteine, deci este inactiv biologic. Dac ADN denaturat este renaturat sau ADN monocatenar este trecut sub aciunea enzimei ADN-polimeraz n form dublu catenar ARN sintetizat peste astfel de amorse este activ biologic. Din acset fel de experiene s-a tras concluzia c biosinteza unui ARNm biologic acziv necesit o amors ADN dublu spiralat. Exist dovezi experimentale c ADN conine puncte de iniiere specifice de unde ncepe s acioneze ARN-polimeraza-ADNdependent i c aceste puncte sunt semnalate printr-o secven specific de baze din ADN, iar primul ribonucleotid sau ribonucleotidul de iniiere este incorporat de ctre 5-trifosfat. n celulele de E. coli exist o singur ARNpolimeraz-ADN-dependentp care sintetizeaz trei tipuri de ARN i anume ARNm, ARNt i ARNr utiliznd ADN din cromozomi. Toate cele trei tipuri de ARN hidrolizeaz cu ADN cromozomial i sinteza lor este inhibat de rifamicin. XIX.18.3. Biosinteza ARN ribozomal. ARN ribozomal (ARNr) alctuiete pn la 90% din totalul de ARN celular i a fost izolat din ribozomi de diferite proveniene i este localizat n cea mai mare parte n citoplasm, unde este asociat cu proteinele ribozomale. Acizii ribonucleici reprezint, probabil, scheletul structural al ribozomilor pe care se ataeaz, n locuri specifice, proteinele ribozomale. Spirin i Gavrilov (1969) au artat c acizii ribonucleici ribozomali prezint o structur secundar parial organizat sub forma unui dublu helix. Regiunile dublu helicate ale ARNr sunt legate prin intermediul unor fragmente flexibile monocatenare. Structura lor secundar care cuprinde 70% din molecul este dat de punile de hidrogen formate n principal, dac nu aproape exclusiv, ntre A-U i GC. Prezena regiunilor de helix i masa molecular mare a ARNr i confer acesteia o structur teriar bine conturat. Spre deosedire de celelalte specii moleculare de ARN, molecula de ARNr cu constante de sedimentare mai mari de 18 S sunt metilate postranscripional, 80% din metilare avnd loc la atomul C 2, al ribozei iar restul de 20% la nivelul bazelor azotate. Dup mrimea lor speciile moleculare de ARNr se mpart n: - specii moleculare mari de ARNr separate de la bacterii, plante i animale cu mase moleculare de 1,1.10 6; 1,3.106 i 1,7.106 daltoni i constante

61

de sedimentare de 23, 25, 28 i 30S, cuprinznd aproximativ 5000 de nucleotide; - specii moleculare mici de ARNr separate din aceleai surse cu mase moleculare de 5,6.105 i 7.105 daltoni i constante de sedimentare de 16S la bacterii, 18S la plante i animale, n scara filogenetic se constat o tendin de cretere a coninutului de GC ceea ce a condiionat o cretere a regiunilor din molecul cu structur secundar, fapt confirmat experimental. Biosinteza acetui acid nucleic se realizeaz printr-o transcripie a unui fragment de ADN, deoarece numai 0,4% din ADN celular are o structur complementar cu ARN din ribozomii 16S i 23S i poate forma cu acetia hibrizi. Studiul de sintez a ARNr i la numrul de gene care particip la aceast sintez n celulele de HeLa a artat c fiecare gen poate fi transcris simultan de ctre mai multe ARN-polimeraze (Craig, 1974). n experienele efectuate pe eucariote (ficat de obolan, timus de bovine etc) s-a demonstrat existena n nucleu a diferitelor clase de ARN-polimeraze-ADN-dependente i faptul c sinteza ARNr este realizat de o ARN-polimeraz I sau A, care este diferit de ARN-polimerazele nucleoplasmatice prin structur i proprietile fizico-chimice i cinetice. Cercetrile efectuate pe ARNr izolate din diferite surse biologice au artat c masa molecular a acestora variaz n limite foarte largi, de la molecule mici de ARNr izolate de la eucariote (masa molecular cca 7.10 7 daltoni-18S) pn la ARNr a vertebratelor inferioare 1,5-1,6.10 6 daltoni sau a mamiferelor 1,7.106. Aceste date experimentale au condus la ideea c moleculele de ARNr au o evoluie a dimensiunilor lor i la baza acesteia st un precursor iniial de ARNr care poate fi identificat dup urmtoarele caracteristici: - marcarea lui rapid i omogen cu izotopi radioactivi; - prezena gruprilor metil n structur; - localizarea nucleolar; - o mare sensibilitate fa de actinomicina D. XIX.18.4. Biosinteza ARNt Aceste specii macromoleculare de ARN au fost descoperite de Allen i Shweet (1960) i au fost denumite ARN de transfer sau de transport deoarece ele transfer (transport) aminoacizii din citoplasm la nivelul polizomului unde se realizeaz sinteza proteic. Moleculele de ARNt sunt cele mai cunoscute deoarece au o mas molecular mic i sunt alctuite dintr-un numr de 75-85 resturi de

62

nucleotide. O particularitate a acestor molecule rezid n aceea c ele conin o cantitate apreciabil de baze neobinuite sau rare, care de cele mai multe ori sunt derivai de substituie, de regul metilai, ai bazelor azotate. De exemplu, ARNt izolat din drojdia de bere conine 8 baze metilate, n concentraii mai mari fiind pseudouridina, riboziltimina (5-metiluridina), N6-meziladenozina, 2-O-metilguanizina, N-2,N-2- dimetil guanizina etc. n moleculele de ARNt au fost identificate i baze azotate care conin sulf, de exemplu, tiouridina. Numeroase cercetri au demonstrat c bazele minore ntlnite n structrura moleculelor de ARNt sunt rezultatul unui proces de metilare care are loc dup sinteza acestor molecule i se realizeaz n nucleol. Acest proces de metilare a nucleotidelor din ARNt necesit participarea unor enzime sintetizate n nucleu n concordan cu cu informaia codificat n succesiunea nucleotidelor n ADN nuclear. Modificrile ce au loc dup biosinteza speciilor moleculare de ARNt pot afecta toate bazele azotate - purinice i/sau pirimidinice -i avergura lor poate atinge pn la 1/4 din molecul. Ele pot consta n metilare, pseudo- i dihidrouridilare, formare de citokinine, tiolare i altele, dar la mamifere procesul de metilare este specific pentru o baz azotat dat i este de specie specific. Procesul de tiolare al ARNt este important i sub aspectul c permite formarea de puni disulfurice intramoleculare. Procentul modificrilor post biosintetice ale ARNt crete progresiv de la fagi, la micoplasm, bacterii, drojdii i la animale i este pus n strns legtur cu evoluia vieuitoarelor.

63

64

Biosinteza ARNt se produce n nucleu dup mecanismul descris mai sus i numai 0,025% din ADN celular conine fragmente complementare ca structur cu ARNt. Funcia bazelor neobinuite prezente n molecule de ARNt rmne insuficient de bine studiat. Structura primar i secundar a ARNt. Prima structur primr a unei molecule de ARNt a fost stabilit de Holley. Moleculele de ARNt, indiferent de aminoacidul pe care-l transport au unele caracteristici comune ale structurii lor primare: - extremitatea 3-terminal se ncheie cu o succesiune de nucleotide comun pentru toate moleculele . CCA; - la extremitatea 5-terminal n majoritatea cazurilor secvena nucleotidelor (ultimelor 7) este aceeai i se ncheie cu G; - moleculele de ARNt sunt acilate la nivelul restului A din poziia 3, aminoacidul formnd o legtur eteric cu gruparea hidroxil din poziiile 2 i 3 a ribozei; - diferitele tipuri de molecule de ARNt conin regiuni n care secvena nucleotidelor este omolog; Ebel a artat c dac moleculele de ARNt sunt mprite n ase regiuni distincte, alctuite din acelai numr de nucleotide, numrul secvenelor omologe n aceste molecule creste. n moleculele de ARNtAla exist unele secvene n care secvena nucleotidelor este antiparalel i complementar, n care lipsesc bazele minore, i se formeaz legturi de hidrogen ntre bazele azotate din nucleotidele complementare. Se presupune c forma cea mai posibil de existen a ARNt este modelul frunzei de trifoi, model care permite i o comparare a structurii diferitelor molecule de ARNt. n figura de mai jos este prezentat structura secundar a unei molecule de ARNt i structura primar i secundar a moleculelor de ARNtAla, ARNtSer i ARNtVal. Dn figur se poate constata c: - regiunile n care nucleotidele complementare formeaz puni de hidrogen, dup compoziia lor, sunt diferite de la o molecul la alta; - regiunile fr puni de hidrogen conin nucleotide asemntoare, uneori identice, un numr mare de nucleotide metilate; - mperechierea nucleotidelor complementare ncepe ntodeauna de la cea de a cincea nucleotid de la extremitatea 3-terminal i prima nucleotid din extremitatea 5-terminal, ceea ce face posibil ca un trinucleotid terminal CCA s fie mereu liber. n molecula de formil-Met-ARNt prima baz de la extremitatea 5 formeaz o punte de hidrogen cu a asea baz de pe extremitatea 3, constituind singura excepie de acest fel cunoscut;

65

- n regiunea care nu posed o structur secundar, bazele azotate nu formeaz puni de hidrogen, sunt mult mai reactive fa de aciunea enzimelor i a agenilor chimici. Structura teriar a ARNt. Datele experimentale privind structura ARNt converg spre existena unei structuri teriare i funciile lor pot fi mult mai numeroase i mai complexe dect se presupune n prezent. Structura anticodonului sau nodocului n ARNt. Dup descoperirea codului genetic i descrierea general a schemei ADNARNprotein se presupunea c moleculele de ARN ndeplinesc i funcia de matrice pe care sunt sintetizate proteinele. Din punct de vedere energetic aceast ipotez era foarte probabil, presupunndu-se c aminoacizii reacioneaz sub form de derivai activai.Crick formuleaz
66

pentru prima dat ipoteza adaptorului, conform creia aminoacidul, cu ajutorul unui mecanism enzimatic oarecare, se leag de o trinucleotid, complementar ca structur cu codonul ARN i dup aceea acest complex trinucleotid - ARN interacioneaz cu matricea ribonucleic, procesul fiind similar interaciunii dintre cele dou catene polinucleotidice complementare ale ADN. Crick presupune un rol important n acest n acest proces l au enzimele care particip la legarea specific a aminoacizilor la molecula adaptorului. n privina acestuia se presupune c este o molecul de dimensiuni mici capabil s formeze n mod specific legturi de hidrogen cu matricea nucleotidic a ARN. n ipoteza adaptorului, formulat de Crick, se postula c o succesiune de nucleotide complementare din molecula adaptorului (a ARNt) probabil, o triplet, este capabil s formeze legturi de hidrogen cu unul din codonii ARNm. Aceast regiune din molecula ARNt a fost denumit anticodon sau nodoc. Din punct de vedere teoretic anticodonul trebuie s conin o secven nucleotidic complementar codonului. n molecula diferitelor tipuri de ARNt exist o secven de trei nucleotide care satisface aceaste cerine, dac inozina i metilguanina sunt echivalente guaninei, iar pseudouridina echivalent uridinei. Molecula de ARNt ARNtAla ARNtTyr ARNtSer ARNtPhe ARNtVal Codonul GCC UAC UCC UUC GUC Anticodonul CGI AG AGI AAG CAI

Plecnd de la observaia c trei din cei 20 de aminoacizi au cte doi codoni - serina: UCZ i AGY; arginina: CGZ i AGX iar leucina UUX i CUZ - care nu se deosebesc ntre ei dect prin natura nucleotidului din poziia 1 sau 2 s-a reuit izolarea a cte dou sau trei tipuri de ARNt pentru fiecare aminoacid, fiecare tip de ARNt reacionnd numai cu unui din cei doi codoni. Stabilirea exact a numrului de specii moleculare de ARNt prezente ntr-o celul este, dup opinia lui Novelli, imposibil. Totui pentru celulele mamiferelor au fost menionate prezena a minimum 80 de specii moleculare de ARNt, ceea ce corespunde la aproximativ 60 de codoni (numrul total al acestora este 64). XIX.18.5. Biosinteza ARN-ARN dependent
67

Extractele obinute din unele microorganisme (Azobacter vinelandi, M. lysodeicticus, Escherichia coli) sunt capabile s sintetizeze ARN n prezena ARN-amors nativ sau sintetic, a unui cation bivalent (Mn+2) i a nucleozidtrifosfailor, cu extractele din tumora ascitic Krebs II, pe unele carcinoame ascitice i pe microorganisme infestate cu virusuri care au ca acid nucleic numai ARN, s-a demonstrat c ARN-sintetizat este direct dependent printr-o serie de proprieti fizico-chimice. Noua enzim a fost denumit ARN-polimeraz-ARN-dependent, nu este inactivat de dezoxiribonucleoaz, are o activitate maxim la pH 9,5 i este inhibat de ionii de Mn+2 i de mercaptoetanol, nu este inhibat de actinomicin D i este stimulat de prezena n mediu a ribonucleozid-5-fosfailor. XIX.20. CATABOLISMUL ACIZILOR NUCLEICI. La nivelul cavitii gastrice nucleoproteidele din alimente sunt hidrolizate de enzimele sucului gastric cu formare de proteine i nucleine. Proteina rezultat este degradat n continuare sub aciunea pepsinei. Acizii nucleici sunt hidrolizai sub aciunea sucului pancreatic de urmtoarele enzime care au specificitate absolut de aciune i de substrat: polinucleotidaze, oligonucleotidaze, nucleotidaze i nucleo-zidaze. Polinucleotidazele hidrolizeaz moleculele acizilor nucleici cu formare de oligonucleotide i nucleotide (n proporie mai mic). Din aceast categorie fac parte dezoxiribonucleazele care acioneaz specific asupra ADN i ribonucleazele care hidrolizeaz specific ARN. Oligonucleotidazele hidrolizeaz specific oligonucleotidele cu formare de mononucleotide, care la rndul lor sunt hidrolizate de nucleotidaze specifice cu punere n libertate de nucleozide i fosfat anorganic. Nucleozidele sunt scindate hidrolitic de ctre nucleozidaze cu formare de baze azotate i pentoz.

68