Ann Toxicol Anal. 2010; 22(2): 69-74 c Socit Franaise de Toxicologie Analytique 2010 DOI: 10.

1051/ata/2010012

Disponible en ligne www.ata-journal.org

Revue gnrale Prparation dchantillons pour analyses en immunochimie

Sample preparation for immunoassay analysis in toxicology
Bertrand Brunet , Yves Papet, Patrick Mura
Centre Hospitalier Universitaire, Service de toxicologie et pharmacocintique, BP 577, 86021 Poitiers Cedex, France
Rsum Introduction : Malgr lessor des techniques chromatographiques couples la spectromtrie de masse,

limmunoanalyse revt toujours une importance capitale dans les laboratoires hospitaliers et de mdecine lgale. Nous nous attacherons ici dcrire quels pourraient tre les protocoles mettre en uvre pour utiliser ces tests immunochimiques sur des matrices non conventionnelles (sang total laqu, cheveux. . . ) et sur les prparations ncessaires pour analyser ces chantillons. Mthodes : Direntes techniques immunochimiques avec leur aptitude accepter des matrices dites alternatives seront voques. Une application utilisant une dfcation du sang total avec de lactone est propose. Quatre paramtres importants en toxicologie (paractamol, phnobarbital, digoxine et valproate de sodium) ont t tests sur plasma et sur sang total avec cette technique. Les corrlations entre les rsultats obtenus sont prsentes. Un point particulier est fait sur la prparation dchantillons en vue de lanalyse de matrices alternatives (cheveux, humeur vitre, salive. . . ) avec des mthodes immunochimiques. Rsultats : La procdure prsente ici pour lanalyse du paractamol, du phnobarbital, de la digoxine et du valproate de sodium dans le sang total par mthode CEDIA donne de bons rsultats avec des corrlations satisfaisantes entre les valeurs obtenues sur plasma le jour du prlvement et les valeurs obtenues sur sang total quelques semaines aprs. Conclusion : Les avantages des tests immunochimiques sont bien connus ; ils peuvent tre automatisables, permettent une grande cadence et un rsultat rapide. Leur utilisation en toxicologie mdico-lgale reste complique par la nature des chantillons disponibles. Sils peuvent tre utiles dans un but de screening, une conrmation par mthode chromatographique reste indispensable.
Mots cls : Immunoanalyse, matrices alternatives, prparation dchantillons Abstract Introduction: Despite the breakthrough of chromatographic techniques coupled to mass spectrometry,

immunoanalysis is still a key component of the various techniques used in clinical or forensic toxicology. This article describes dierent procedures to use immunoassays on unconventional biological matrices such as clotted blood or hair specimens. A focus is made on sample preparation needed to analyse such matrices. Methods: Various immunoassay techniques and their ability to accept unconventional matrices are discussed. An application using protein precipitation with acetone is proposed for the analysis of four relevant compounds in toxicology: valproic acid, acetaminophen, digoxin and phenobarbital. Correlations between results obtained on plasma and whole blood after several weeks of storage are presented. A focus is made on sample preparation for hair specimens, vitreous humor and saliva before analysis with immunoassay tests. Results: The procedure presented for the analysis of valproic acid, acetaminophen, digoxin and phenobarbital with CEDIA reagents gives satisfactory results in whole blood. Good correlations are obtained between whole blood and plasma for the same samples. Conclusion: Advantages of immunoassay testing are well known, it is a high capacity, rapidity and possibility of automation. The use of immunoassays in forensic toxicology is complicated by the nature and the quality of the samples available. These immunochemical methods can serve as screening techniques but conrmation of positive results is always recommended.
Key words: Immunoanalysis, alternative matrices, sample preparation

Reu le 17 fvrier 2010, accept aprs modications le 2 avril 2010 Publication en ligne le 26 mai 2010

1 Introduction
Les techniques chromatographiques en phase liquide ou gazeuse couples la spectromtrie de masse sont utilises
Correspondance : Bertrand Brunet, Tl. 05 49 44 41 14, Fax 05 49 44 49 55, bertrand.brunet@chu-poitiers.fr

en routine dans la plupart des laboratoires de toxicologie hospitaliers ou mdico-lgaux. Si ces techniques spciques et sensibles sont devenues indispensables, limmunoanalyse tient toujours une place importante dans lventail des techniques analytiques dont dispose le toxicologue. Les avantages de limmunoanalyse ont t largement dcrits [1]. La possibilit
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Article publi par EDP Sciences

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dautomatisation, une grande cadence et des rsultats rapides sont les atouts de ces techniques largement utilises en toxicologie clinique pour leur aptitude rpondre lurgence. La sensibilit de ces tests immunochimiques doit tre adapte la substance doser et la spcicit doit tre maximale pour limiter le risque de rsultats faussement positifs. Les tests commerciaux utilisables en toxicologie clinique ou en mdecine lgale sont valids par les fournisseurs et font lobjet dun marquage CE (Communaut Europenne) garantissant leur performance sur une ou plusieurs matrices donnes (urine, plasma, sang total. . . ). Limmunochimie est un ensemble de techniques diverses qui regroupe des mthodes bases sur la raction entre un antigne et un anticorps. Direntes techniques ont t dveloppes depuis les annes 1970 : RIA (radio immuno assay), EMIT (enzyme multiplied immunoassay technique), EIA (enzyme immuno assay), ELISA (enzyme linked immuno sorbent assay), FPIA (uorescence polarization immuno assay), CEDIA (cloned enzyme donor immuno assay), immunochromatographie. . . Ces techniques bases sur le mme principe se classent en deux catgories suivant la prsence ou non dune tape de sparation ou de lavage permettant dliminer des substances potentiellement interfrentes. Il existe donc des techniques en phase homogne sans tape de sparation (EMIT, CEDIA, FPIA) ou en phase htrogne avec tape de sparation (RIA, ELISA, EIA) [2]. Cette distinction sera importante sur la capacit de ces tests accepter direntes matrices ainsi que sur leur niveau de sensibilit. En eet, le toxicologue peut souhaiter utiliser parfois des tests immunochimiques de manire tendue, cest--dire sur une matrice non initialement prvue pour ce test. Cest le cas des laboratoires de mdecine lgale qui ne disposent pas systmatiquement durine ou de plasma. Souvent le sang prlev aprs autopsie est de mauvaise qualit, laqu, coagul et impossible centrifuger pour obtenir du plasma. Dans un but de screening pour obtenir des indications rapides, il est possible dutiliser des tests immunochimiques sur des matrices non conventionnelles. Cet article expose les direntes procdures dcrites dans la littrature pour la prparation dchantillons avant leur analyse en immunochimie. Dans une premire partie direntes techniques pour lanalyse du sang total sur des tests en phase homogne sont voques avec pour lune delle, une application sur quatre paramtres importants en toxicologie (paractamol, phnobarbital, digoxine et valproate de sodium). Dans une seconde partie, lutilisation de tests immunochimiques pour lanalyse de matrices alternatives comme les cheveux, la salive, lhumeur vitre ou les tissus est aborde.

2 Prparation dchantillons pour analyse du sang total en immunochimie

Dans de nombreux laboratoires de toxicologie ayant la double comptence en clinique hospitalire et en mdecine lgale, les automates danalyses en immunochimie sont des outils indispensables de par leur rapidit et leur exibilit. Ils permettent le dosage de nombreux mdicaments dans le srum
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et la recherche de diverses drogues dans lurine. Cependant dans de nombreux cas, notamment en mdecine lgale, seul le sang total (de qualit variable selon les circonstances et le dlai post-mortem) est disponible. Selon le principe du test immunochimique, lanalyse du sang total sera possible avec ou sans prparation. En eet tous les tests immunochimiques en phase htrogne sont assez exibles quant la nature de lchantillon utilis. Ceci est d la conception mme du test qui comprend une phase de sparation entre la substance doser qui est lie aux anticorps immobiliss sur le test et les substances interfrentes non lies [2]. Cette tape peut tre un lavage dans le cas des tests ELISA ou microplate EIA (mEIA), une chromatographie dans le cas des immunotests ux latral ou encore une centrifugation pour les tests RIA. Les tapes de lavage sont trs ecaces et permettent aux tests ELISA et mEIA daccepter diverses matrices et notamment du sang total sans pr-traitement particulier. Toutefois ces tests sont plus coteux que les tests en phase homogne et leur automatisation nest intressante que lorsque lon eectue de grandes sries. Les tests en phase homogne ne comportent pas dtape de lavage et sont donc beaucoup plus sensibles la nature de lchantillon utilis. Ils sont en gnral destins une matrice bien dnie : srum pour les mdicaments, urine pour la recherche de drogues ou certaines classes de mdicaments. Le taux de protines, la turbidit du srum, ou encore les rsidus dhmoglobine peuvent perturber les tests et entraner lapparition de messages derreur [3]. Pour tre utilisables sur dautres matrices que celle prvue lorigine, les procdures de ces tests vont donc devoir tre adaptes. Une tape de prparation du sang total (extraction, dilution, prcipitation) va devoir tre pratique pour rendre lchantillon utilisable. Une calibration sur la nouvelle matrice ainsi quune modication des seuils de sensibilit doit aussi tre envisage. En eet le seuil de dtection des drogues dans lurine nest pas compatible avec les concentrations recherches dans le sang. De nombreuses procdures sont disponibles dans la littrature pour la prparation du sang total : prcipitation par le mthanol [4,5], lactone [68], lacide trichloractique [9], le dimethylformamide [10] ou encore le sulfate de zinc [11]. Une extraction liquide-liquide reste videmment possible mme si le temps dextraction limite lintrt de lutilisation de limmunochimie par la suite. Un mlange de chloroforme et dthanol [12] ou encore du chlorobutane seul [13] peuvent tre utiliss pour lextraction. Globalement nimporte quelle technique dextraction liquide-liquide ou SPE utilise avant une mthode chromatographique peut tre employe condition de reprendre lextrait nal par un tampon adapt ou du srum physiologique. Certains auteurs prconisent aussi une simple dilution de lchantillon de sang total dans le srum physiologique [14]. Iwersen-Bergmann et Schmoldt, en 1999, ont test le passage des chantillons de srum et de sang total sur un automate Hitachi 911 avec des ractifs CEDIA DAU destins lurine [15]. Ils ont compar des calibrations faites avec les ractifs urinaires puis avec des calibrateurs reconstitus dans le srum et le srum hmolys. Ils nont pas constat de dirence signicative en termes de signal sur les trois direntes mthodes de calibration. Aprs des essais sur des

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chantillons rels, ils concluent que cette mthode sans prtraitement est possible pour le dosage des drogues (amphtamine, benzoylecgonine, morphine et THC-COOH) et pour certains mdicaments (mthadone et benzodiazpines) dans le sang. Les auteurs signalent cependant que sans aucune adaptation des seuils analytiques de la technique immunochimique, le dosage des amphtamines nest pas assez sensible (seuil 500 ng/mL). Les autres seuils utiliss (15 ng/mL pour le THC-COOH et 100 ng/mL pour les autres analytes) ne sembleraient dailleurs pas satisfaisants actuellement. Il faut ajouter que les auteurs rapportent aussi dinvitables problmes de pipetage de lautomate lorsque lchantillon est trop visqueux. Le meilleur compromis entre rapidit de prparation et qualit de lchantillon semble tre obtenu aprs dfcation ou prcipitation. Les publications utilisant cette technique de prparation sont les plus nombreuses. Lactone semble tre utilise le plus frquemment, le surnageant obtenu est moins color avec moins de particules en suspension par rapport aux prcipitations par le mthanol [16]. Les auteurs de cette dernire publication rapportent une technique simple de dfcation lactone adapte dun article de Lillsunde et coll. [17]. Un millilitre de sang total est plac dans un tube hmolyse. Tout en vortexant le tube pendant une minute, 3 mL dactone sont ajouts. Lensemble est centrifug 4000 tr/min pendant 5 min. Le surnageant est rcupr puis vapor pendant approximativement 15 min, temps ncessaire pour vaporer uniquement lactone contenu dans le surnageant. Le reste de surnageant est centrifug de nouveau 9000 tr/min pendant 3 min. Le surnageant obtenu est alors analysable en immunochimie. Dans cette publication les auteurs utilisent cette procdure pour doser les opiacs, les amphtamines et les cannabinodes dans le sang total par technique EMIT. Les seuils de positivit de la mthode ont t abaisss en augmentant la prise dchantillon par lautomate. Les seuils obtenus sont de 60 ng/mL pour les amphtamines, 50 ng/mL pour les opiacs et 10 ng/mL pour les cannabinodes. 50 100 chantillons rels ont t analyss par cette technique, les auteurs rapportent une sensibilit de 100 ; 85,7 ; 97,6 % et une spcicit de 83,3 ; 93,3 et 51,0 % respectivement pour les opiacs, les cannabinodes et les amphtamines. Comme pour la plupart des tests immunochimiques sur le march, les amphtamines prsentent la plus faible spcicit. Cependant limportant pour ce genre de test servant uniquement dans un but de screening est avant tout de minimiser les faux ngatifs, les auteurs estiment que cette technique relativement rapide est utilisable en routine dans un laboratoire de toxicologie. Dans un article de 2003, Kroener et coll. comparent les performances de 4 tests immunochimiques pour le dosage de 6 classes de drogues ou mdicaments (opiacs, cocane, amphtamines, cannabis, mthadone et benzodiazpines) dans le sang total [18]. Deux tests en phase homogne (FPIA : Adx ; CEDIA : Hitachi 911) et deux tests en phase htrogne mEIA (Mashan MTP et Pyxis 24) sont valus. Le pr-traitement pour lanalyse en FPIA est une simple dfcation de 1 mL de sang par 1 mL dactone puis centrifugation et analyse directe du surnageant. La procdure avant analyse par ractif CEDIA est similaire celle dcrite prcdement par Hino et coll. Pour les deux tests en phase htrogne le sang total est utilis directement sans pr-traitement selon les recommandations des

fournisseurs. Aprs analyse de plus de 80 chantillons rels, les seuils de positivit respectifs des tests ont t revus. Pour les deux tests en phase homogne les seuils ont t abaisss pour amliorer la sensibilit, et pour les tests en phase htrogne les seuils ont t lgrement augments pour diminuer le nombre de faux positifs. Les rsultats obtenus montrent peu de dirence entre les deux types de tests (homogne ou htrogne), la sensibilit tant denviron 90 % pour les tests FPIA et CEDIA et de 95 % pour les tests en mEIA. La spcicit est de 80 % environ pour les quatre tests. Les auteurs concluent en indiquant que la dirence de sensibilit nest pas primordiale compte tenu des dirences de prix de revient (les tests mEIA tant beaucoup plus coteux). Ces direntes publications portent sur lanalyse des drogues dans le sang laide de ractifs initialement destins lurine. Il est donc ncessaire dadapter les seuils de positivit aux concentrations retrouves dans le sang, voire de faire de nouvelles calibrations avec la matrice issue du sang total. Une validation de la nouvelle application est indispensable si elle doit tre utilise en routine dans un but de screening avant conrmation. Dans le but dvaluer cette procdure de dfcation lactone, il nous a sembl utile de tester la dirence entre les dosages eectus en routine sur du plasma puis sur les mmes prlvements des dosages sur sang total aprs dfcation. Pour cela quatre paramtres utiles en pharmacologie ou toxicologie ont t choisis : le paractamol, le phnobarbital, lacide valproque et la digoxine. Les dosages de patients hospitaliss ont t raliss une premire fois le jour mme du prlvement sur du plasma avec des ractifs CEDIA (Microgenics). Puis 3 5 semaines plus tard (les tubes ayant t conservs 4 C), un nouveau dosage est eectu sur sang total aprs dfcation selon la procdure dcrite par Hino et coll. Aprs vaporation de lactone le surnageant est complt avec du srum physiologique pour obtenir un volume nal de 1 mL et ainsi permettre une comparaison des quantications. Le surnageant est ranalys avec des ractifs CEDIA sur un automate CD 90 (ThermoFisher). 10 12 chantillons par paramtre ont t tests permettant dtudier la corrlation entre les rsultats obtenus sur plasma et sur sang total aprs prise en compte du facteur de distribution entre le plasma et le sang total pour chaque analyte (rapport plasma/sang total respectivement de 1,0 ; 0,93 ; 1,8 et 0,93 pour le paractamol, le phnobarbital, lacide valproque et la digoxine). Des chantillons ngatifs nont pas montr dinterfrence avec les dirents dosages. Les rsultats obtenus sont prsents dans la gure 1. Les corrlations obtenues sont bonnes, une tendance la sous-estimation tant cependant note avec la technique de dfcation plus spcialement pour le phnobarbital qui donne des rsultats entre 70 et 75 % de ceux obtenus sur plasma. Une certaine instabilit de la molcule ou une variabilit dans la distribution entre plasma et sang total par rapport au coecient thorique font partie des explications possibles ce phnomne. Quoi quil en soit lors dune analyse mdico-lgale, il est donc possible partir de tests immunochimiques sur du sang total davoir une bonne indication sur la prise ou non dun mdicament voire sur la possibilit dune intoxication. Ces tests restant plus ou moins semi-quantitatifs, une conrmation simpose.
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3 Prparation dchantillons pour analyse de matrices alternatives en immunochimie

,
Outre le sang total, les laboratoires de toxicologie mdicolgale sont amens traiter de nombreuses autres matrices notamment lorsque le sang et lurine ne sont pas disponibles. Dans un souci de rapidit et aussi dune faible prise dchantillon les tests immunochimiques peuvent tre utiliss dans un but de screening sur dautres matrices.
3.1 Les cheveux

Les cheveux sont devenus lheure actuelle une matrice incontournable dans dirents domaines de la toxicologie (mdico-lgal, dopage, mdecine du travail, restitution du permis de conduire). La prparation pour lanalyse des cheveux en immunochimie nest pas dirente de celle pour la spectromtrie de masse. En eet la prparation est une mthode classique en trois tapes : dcontamination, broyage ou dcoupage puis incubation. La seule dirence intervient au nal pour la reconstitution de lextrait. La prparation des chantillons de cheveux tant aborde ailleurs dans ce numro spcial des annales de toxicologie analytique, nous nous attarderons uniquement sur les points particuliers des analyses en immunochimie. Deux points cruciaux sont prendre en compte pour lanalyse de cheveux en immunochimie [19] : les anticorps doivent tre dirigs contre les molcules mres ou les mtabolites rencontrs dans les cheveux (cocane, 6-acetylmorphine. . . ) ; la sensibilit du test doit tre adapte aux concentrations gnralement rencontres dans les cheveux. Ces caractristiques font que seuls les tests en phase htrogne sont lheure actuelle susamment sensibles. Les analyses de cheveux sont faites essentiellement par techniques ELISA ou mEIA, voire plus rarement par RIA.
3.2 La salive

Fig. 1. Corrlations entre les dosages eectus sur plasma puis sur sang total avec les ractifs CEDIA . En abscisse : rsultats obtenus pour le plasma multiplis par la valeur du rapport de distribution sang total/plasma. En ordonne : rsultats pour le sang total obtenus aprs dfcation lactone. 72

Lintrt de la salive en tant que matrice alternative est grandissant depuis la mise en service des tests immunochimiques pour le dpistage des stupants dans le cadre de la conduite automobile. La plupart des tests actuellement sur le march sont des immunotests ux latral (immunochromatographie). Le traitement de lchantillon dans ce cadre est minimis, il sagit le plus souvent dune simple dilution dans un tampon permettant dextraire les composs du collecteur utilis pour rcuprer la salive [20]. Ces tampons, dont la composition est dicile obtenir auprs des fournisseurs, ont un rle prpondrant pour la rcupration des analytes et notamment du 9-THC, compos trs lipophile et dicile extraire du collecteur. Enn comme pour les cheveux les anticorps doivent tre dirigs contre les molcules prsentes dans la salive et non contre les mtabolites urinaires comme ce fut le cas pour de nombreux tests salivaires avec le 9-THC-COOH. La sensibilit du test doit l aussi tre adapte aux concentrations gnralement rencontres dans la salive et une fois encore cela pose le problme du 9-THC, trs peu excrt dans la salive, pour lequel les seuils des tests immunochromatographiques actuels sont pour la plupart insusants.

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3.3 Lhumeur vitre

Rfrences
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Lhumeur vitre peut tre un prlvement utile en toxicologie mdico-lgale. Plusieurs publications traitent de son utilisation pour un screening de direntes drogues. Lin et coll. en 1997 ont tudi le dosage des opiacs dans lhumeur vitre par technique FPIA [21]. Chronister et coll en 2001 et 2008 ont tudi le dosage des opiacs et de la cocane dans lhumeur vitre par technique CEDIA [22, 23]. Enn Fucci et coll. en 2006 ont test la possibilit dutiliser lhumeur vitre sur des immunotests ux latral [24]. Pour tous ces articles les auteurs ne prconisent aucune prparation dchantillon autre quune centrifugation. La sensibilit des tests doit tre adapte, il convient de prendre en compte que les xnobiotiques ne se distribuent pas tous dans lhumeur vitre, notamment ceux qui sont les plus lis aux protines plasmatiques.
3.4 Tissus et autres uides biologiques

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7.

Peu de donnes sont disponibles dans la littrature sur lanalyse de bile, de contenu gastrique ou de tissus laide de tests immunochimiques. Une publication de Slightom en 1978 traite de lutilisation de limmunoanalyse sur des chantillons de bile et de tissus [12]. En 1997, Moore et coll. prsentent lutilisation de tests ELISA pour le screening de neuf classes de substances (amphtamines, metamphtamines, barbituriques, benzodiazpines, cocane, LSD, opiacs, cannabinodes et PCP) sur du sang post-mortem ou des tissus [25]. Malheureusement la prparation des chantillons de tissus, de bile ou de uides de dcomposition nest pas dcrite dans cet article. Globalement, comme pour les cheveux, la prparation de ce type dchantillon nest pas dirente de ce qui est fait avant une technique chromatographique : dilution de la bile ou du contenu gastrique, homognisation des tissus avant extraction liquide-liquide ou par SPE. La reprise de lextrait sec se fait par un tampon appropri pour le test immunochimique choisi.

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10.

11.

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13.

4 Conclusion
La varit des tests immunochimiques, leur rapidit et leur grande cadence en font des outils indispensables un laboratoire de toxicologie. Mais leur utilit en toxicologie notamment mdico-lgale est limite par la nature des chantillons qui peuvent tre analyss avec ce type de technique. Les tests en phase htrogne du type ELISA sont plus exibles sur ce point et peuvent tre utiliss sur une gamme de prlvements plus large. De nombreuses procdures sont disponibles dans la littrature pour largir la gamme des prlvements accessibles pour les automates utilisant une technique en phase homogne. En routine de telles procdures peuvent tre appliques mais elles demandent un travail de validation du test immunochimique sur la nouvelle matrice. Par ailleurs elles ne doivent servir que de technique de screening et tous les rsultats positifs devront tre conrms par une mthode chromatographique plus spcique.
Conit dintrt. Les auteurs dclarent ne pas avoir de conit
14. 15.

16.

17.

18.

dintrt.

Annales de Toxicologie Analytique 2010; 22(2): 69-74 19. Spiehler V. Hair analysis by immunological methods from the beginning to 2000. Forensic Sci Int. 2000; 107(1-3): 249-259. 20. Langel K, Engblom C, Pehrsson A, Gunnar T, Ariniemi K, Lillsunde P. Drug testing in oral uid-evaluation of sample collection devices. J Anal Toxicol. 2008; 32(6): 393-401. 21. Lin DL, Chen CY, Shaw KP, Havier R, Lin RL. Distribution of codeine, morphine, and 6-acetylmorphine in vitreous humor. J Anal Toxicol. 1997; 21(4): 258-261. 22. Chronister CW, Walrath JC, Goldberger BA. Rapid detection of benzoylecgonine in vitreous humor by enzyme immunoassay. J Anal Toxicol. 2001; 25(7): 621-624.

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