(11)

Metode razdvajanja
HROMATOGRAFIJA
Adsorpciona hromatografija u koloni Podeona (particiona) hromatografija Jonoizmenjiva~ka hromatografija

ELEKTROFOREZA
Elektroforetsko razdvajanje sme{e Fe(II) i Fe(III) jona

HROMATOGRAFIJA
(gr~ki chroma boja i graphein pisati)

Hromatografija je postupak koji omogu}ava razdvajanje, izolovanje, identifikaciju i odre|ivanje sastojaka sme{e na osnovu procesa koji se de{avaju na granici dve faze koje se ne me{aju. Jedna faza je stacionarna i mo`e biti porozno ili granulisano ~vrsto telo, te~nost, tanak sloj te~nosti adsorbovan na ~vrstom telu i jonoizmenjiva~. Druga faza je mobilna i mo`e biti gas ili te~nost. Hromatografski proces sastoji se u tome {to se rastvor sme{e u mobilnoj fazi propu{ta kroz stacionarnu fazu, pri ~emu dolazi do raspodele komponenata sme{e izme|u mobilne i stacionarne faze. Ovaj prelazak komponente iz jedne u drugu fazu de{ava}e se sve dok odnos koncentracija komponente u stacionarnoj (cs) i mobilnoj fazi (cm) ne dostigne konstantnu vrednost, koja se naziva koeficijent raspodele a izra`en je Nernstovim (Nernst) zakonom raspodele:

Teorijski princip

K=

cs cm

(1)

Koeficijent raspodele zavisi od osobina faza, afiniteta komponente prema fazama i temperature. Razdvajanje supstancija uzrokovano je fizi~kohemijskim procesima kao {to su adsorpcija, razli~ita raspodela (rastvorljivost) sastojaka sme{e izme|u dve te~ne faze i jonska izmena. Prema ovim procesima hromatografija se deli na: J adsorpcionu, J podeonu (particionu) i J jonoizmenjiva~ku. Podela hromatografskih metoda mo`e se izvr{iti i na druge na~ine koji zavise od postavljenih kriterijuma: agregatnog stanja mobilne i stacionarne faze, na~ina pomeranja faza i tehnike izvo|enja hromatografije.

Eksperimentalna fizi~ka hemija

239

Adsorpciona hromatografija u koloni

Slika 1. Adsorpciona hromatografija u koloni

Zasniva se na procesima adsorpcije rastvorene supstancije na granici faza ~vrsto/te~no. Kao stacionarna faza koriste se ~vrste supstancije, koje predstavljaju dobar adsorbens za komponente analizirane sme{e (slika 1). Naj~e{}e se koriste aluminijum-oksid, silikagel, magnezijum-silikat, magnezijum-oksid, a re|e aktivni ugalj. Dobrim adsorbensima smatraju se supstancije koje su porozne, {to zna~i da imaju veliku aktivnu povr{inu. Mehanizam adsorpcije se zasniva na fizi~kim i hemijskim vezama izme|u adsorbensa i adsorbata, {to je detaljnije obja{njeno u poglavlju Procesi na granici faza. Punjenje kolone vr{i se tako {to se adsorbens u granulama, koje moraju biti pribli`no istog pre~nika, oslobodi od sopstvenog praha i suspenduje u rastvara~u koji se kasnije koristi kao mobilna faza. Suspenzija se polako sipa u kolonu koja je prethodno do jedne tre}ine napunjena istim rastvara~em. Slavina na koloni se delimi~no otvori tako da rastvara~ isti~e u kapima. Time se adsorbens izdvaja iz suspenzije i sle`e u koloni. Prema na~inu razdvajanja komponenti iz sme{e razlikuju se slede}e metode: J frontalne analize J istiskivanja J eluiranja Sastoji se u tome da se ispitivana sme{a kontinuirano propu{ta kroz kolonu. Ako sme{a sadr`i komponente A, B i C sa redosledom koeficijenata raspodele KA > KB > KC, iz kolone prvo izlazi ~ista komponenta C, jer se najslabije adsorbuje. Zatim izlazi sme{a komponenata B i C i na kraju eluat koji sadr`i komponente A, B i C u istom odnosu u kome su unete u kolonu. Ovom metodom mo`e se dobiti samo deo ~iste komponente C, odnosno ona koja se prva izdvaja iz kolone, pa ova metoda nema ve}i analiti~ki zna~aj. Izvodi se tako {to se mala koli~ina sme{e, koja sadr`i komponente A, B i C, nanese na vrh kolone. Zatim se kroz kolonu kontinuirano propu{ta rastvor komponente D, koja se mnogo ja~e vezuje za adsorbens od komponenata analizirane sme{e. Komponenta D potiskuje komponente sme{e, koje obrazuju zone. Zbog stalnog dejstva komponente D, komponente sme{e se ne mogu potpuno razdvojiti, ve} se zone me|usobno dodiruju. Do izlaska iz kolone, sve tri zone se kre}u istom brzinom, a po{to izme|u njih nema razmaka, metoda se ne mo`e pouzdano koristiti za razdvajanje u analiti~ke svrhe.

Metoda frontalne analize

Metoda istiskivanja

240

Medenica / Male{ev

Ovo je prakti~no jedina metoda koja se koristi za razdvajanje u analiti~ke svrhe, jer se pomo}u nje komponente sme{e potpuno razdvajaju. Mala koli~ina analizirane sme{e, koja sadr`i komponente A, B i C sa redosledom koeficijenata raspodele KA > KB > KC , nanese se na vrh kolone. Zatim se kroz kolonu vr{i eluiranje, odnosno kontinuirano propu{tanje mobilne faze, tzv. eluenta. Ako su razlike u vrednostima koeficijenata raspodele dovoljno velike, posti`u se potpuna razdvajanja, pri ~emu iz kolone prvo izlazi komponenta C, koja se najslabije vezuje za adsorbens. Pona{anje razdvojenih komponenata u hromatografskoj koloni pri procesu eluiranja prikazano je slici 2. Hromatografska traka komponente se izdvaja u gornjem delu kolone (slika 2a). Traka je uzana, zbog ~ega je odgovaraju}a koncentracija komponente najve}a. Pod koncentracijom se podrazumeva koli~ina komponente po jedinici zapremine stacionarne faze. Sa odgovaraju}eg hromatograma, odnosno krive eluiranja (slika 2b), vidi se da koncentracija komponente ima maksimalnu vrednost c1 u sredini trake. U toku eluiranja mobilnom fazom, traka se pomera nani`e i {iri (slika 2a) dobijaju}i oblik Gausove (Gauss) raspodele. Istovremeno se smanjuje i koncentracija komponente, ~ija maksimalna koncentracija na krivoj eluiranja iznosi c2 (slika 2b). Kada su radni uslovi dobro izabrani, hromatografske trake imaju simetri~an oblik. Me|utim, ako je koncentracija komponente ve}a od optimalne, dobija se traka s razvu~enim frontom i o{trim krajem, kao {to se vidi na slici 2c. Da bi se dobile o{trije trake, protok mobilne faze mora biti sporiji, a ~estice adsorbensa manje. Pre kvalitativne i kvantitativne analize razdvojenih komponenata, njihove zone se moraju odvojiti jedna od druge rezanjem delova kolone, koju prethodno treba pa`ljivo izvu}i iz cevi. Komponente se ekstrahuju iz adsorbensa pogodnim rastvara~em, a potom analiziraju fizi~kohemijskim ili hemijskim metodama. Me|utim, razdvajanje komponenata naj~e{}e se vr{i tako {to se eluiranje nastavi do izlaska rastvora iz kolone, tzv. eluata. Pomo}u frakcionog kolektora komponente se sakupljaju u niz frakcija istih zapremina, a potom analiziraju.

Metoda eluiranja

Slika 2. Hromatografska kolona pri procesu eluiranja

Eksperimentalna fizi~ka hemija

241

Podeona (particiona) hromatografija

Zasniva se na raspodeli (razli~itoj rastvorljivosti) supstancija izme|u dve te~ne faze koje se me|usobno ne me{aju. Jedna te~nost je stacionarna faza vezana za ~vrst nosa~, a druga je mobilna faza. Pored procesa koji se zasniva na razli~itoj rastvorljivosti, de{ava se delimi~no i proces adsorpcije na ~vrstom nosa~u. Deli se na: J podeonu hromatografiju u koloni i J podeonu hromatografiju na hartiji i na tankom sloju. Koeficijent raspodele u podeonoj hromatografiji naziva se podeoni koeficijent . Karakteristi~an je za sistem u kome postoji koncentraciona ravnote`a nekog jedinjenja izme|u dva odre|ena rastvara~a, pri konstantnim vrednostima pritiska i temperature. Kolona se priprema na sli~an na~in kao kod adsorpcione hromatografije, s tim {to je vezana stacionarna faza naj~e{}e voda, a mobilna su organski rastvara~i koji se ne me{aju sa vodom. Za kvalitativnu i kvantitativnu analizu sme{e, kao i u adsorpcionoj hromatografiji, uglavnom se koristi metoda eluiranja. Na primer, sme{a aminokiselina mo`e se analizirati u koloni sa silikagelom koji je nosa~ stacionarne faze vode, a mobilnu fazu ~ini neki organski rastvara~. Naziva se i hromatografija u otvorenoj koloni. Razdvajanje komponenata vr{i se na hartiji ili plo~ici preko koje je nanet tanak sloj ~vrstog adsorbensa. Protok mobilne faze kroz hartiju ili tanak sloj ostvaruje se kapilarnim prodiranjem kroz poroznu sredinu. Brzine kretanja tzv. zona ili mrlja, od kojih svaka predstavlja jednu izdvojenu komponentu, veoma su va`ne za hromatografski proces, jer od njih zavisi razdvajanje komponenata. Brzina mobilne faze zavisi, pre svega, od veli~ine pora u hartiji, odnosno pre~nika ~estica ~vrstog adsorbensa. Pri horizontalnom protoku rastvara~a (mobilne faze), tj. kada na molekule rastvara~a deluju samo kapilarne sile, a ne i sila gravitacije, front rastvara~a pre}i }e rastojanje z:

Podeona hromatografija u koloni

Podeona hromatografija na hartiji i na tankom sloju

z = (k . t)1/2

(2)

gde je: k konstanta koja zavisi od prirode sistema (povr{inski napon i vis koznost) i temperature t vreme za koje rastvara~ pre|e put z.

242

Medenica / Male{ev

Kod uzlazne ili silazne tehnike razdvajanja, gravitaciona sila smanjuje, odnosno pove}ava brzinu kretanja rastvara~a, pa tako uti~e i na pre|eni put fronta z. Da bi se dobilo dobro razdvajanje, potrebno je uskladiti vrstu tehnike, vrstu hartije ili tankog sloja, sastav mobilne faze, du`inu trake od hartije, du`inu plo~ice sa tankim slojem i drugo. Va`na veli~ina u podeonoj hromatografiji je Rf vrednost (retencioni faktor ili faktor zadr`avanja), koja je karakteristi~na za svaku komponentu u definisanom hromatografskom sistemu i slu`i za identifikaciju komponente u analiziranoj sme{i. Defini{e se kao odnos pre|enog puta komponente (a) i pre|enog puta rastvara~a (b):

Rf =

a b

(3)

Slika 3. Odre|ivanje Rf vrednosti S start R front rastvara~a a, b, c pre|eni putevi komponenata A, B i C d pre|eni put rastvara~a

Merenje puteva vr{i se od sredi{ta zone nanetog uzorka (analizirane sme{e), koje se zove startna linija, do sredi{ta zone komponente, odnosno do fronta rastvara~a, kao {to je prikazano na slici 3. Najve}u Rf vrednost ima}e komponenta koja se najbolje rastvara u organskom rastvara~u (mobilnoj fazi), jer se br`e kre}e od komponente koja se bolje rastvara u stacionarnoj fazi. Smatra se da su komponente dobro razdvojene ako je Rf > 0,05. Izvodi se u staklenoj posudi, odnosno kadi sa poklopcem koji se dobro zatvara. Time se atmosfera posude odr`ava zasi}enom parama rastvara~a, ~ime se spre~ava njegovo isparavanje sa hartije. [irina zone izdvojene komponente zavisi od {irine po~etne zone uzorka i koncentracije uzorka. Pomo}u kalibrisane kapilare ili mikropipete nanese se rastvor uzorka na nekoliko centimetara od kraja trake od hartije, koja se nalazi u horizontalnom polo`aju. Uzorak se nanosi u obliku zone, koja ne treba da ima pre~nik ve}i od 5 mm, ili u obliku {to tanje crte. Ako je koncentracija uzorka velika, uzorak se pre nano{enja razbla`i, a ako je mala, uzorak se nanosi vi{e puta na isto mesto, s tim {to se pre svakog nano{enja, prethodno naneta zona mora osu{iti na vazduhu ili u struji ne suvi{e toplog vazduha. Hartija sa nanetom zonom uzorka mo`e se postaviti u sud tako da rastvara~ kroz hartiju prolazi horizontalno, nadole ili nagore. Prema tome, razlikuju se: J horizontalna (kru`na), J silazna i J uzlazna tehnika.
Eksperimentalna fizi~ka hemija

A. Podeona hromatografija na hartiji

243

Horizontalna ili kru`na tehnika izvodi se tako {to se hartija kru`nog oblika stavi u komoru zasi}enu parama mobilne faze i uzorak nanese u centar kru`ne hartije. Pre toga se od ivice ka centru kruga ise~e uzana traka i savije normalno na ravan hartije. Kraj trake se uroni u rastvara~, koji kroz traku dospeva do centra hartije i radijalno se {iri. Na taj na~in formiraju se odvojene zone komponenti sme{e u obliku koncentri~nih krugova (slika 4).
Slika 4. Kru`na tehnika

Slika 5. Silazna tehnika (shematski prikaz)

Silazna tehnika izvodi se tako {to se kraj trake na koji je naneta sme{a pri~vrsti staklenim {tapi}em za dno rezervoara sa rastvara~em, koji se nalazi na vrhu posude (slika 5). Protok rastvara~a kroz hartiju ostvaruje se pomo}u kapilarnog pritiska, dok front rastvara~a ne pre|e zid rezervoara. Dalje se rastvara~ kre}e i pod uticajem sile gravitacije, pomeraju}i zonu uzorka, koji je nanet izvan rezervoara, nani`e. Ova tehnika se koristi za razdvajanje komponenata koje imaju male ili vrlo bliske Rf vrednosti. Rastojanje koje prelazi front rastvara~a reguli{e se du`inom hartije i visinom posude. Uzlazna tehnika se najvi{e koristi, a izbegava se samo kad su Rf vrednosti komponenata suvi{e bliske. Ovde se rastvara~ sipa na dno suda, a hartija postavi tako da donji deo hartije bude, u du`ini od 0,5 do 1 cm, potopljen u rastvara~ (slika 6). Mesto nano{enja uzorka mora biti dovoljno udaljeno (nekoliko cm) od donjeg kraja i mora biti iznad nivoa rastvara~a, u kome bi se ina~e uzorak rastvorio. Po{to rastvara~ kod ove tehnike prodire kroz hartiju pod dejstvom kapilarnih sila, zbog suprotnog dejstva gravitacije dolazi do zaustavljanja protoka rastvara~a na odre|enoj visini.

Slika 6. Uzlazna tehnika (shematski prikaz)

244

Medenica / Male{ev

Dvodimenzionalna tehnika je poseban vid tehnike i koristi se kod supstancija sa bliskim Rf vrednostima. Kad se zavr{i razdvajanje silaznom tehnikom, traka se osu{i, okrene za 90 i protok rastvara~a, naj~e{}e nekog drugog, usmeri normalno na pravac kretanja prvog rastvara~a (slika 7). Na taj na~in razdvajaju se komponente koje se nisu prvobitno razdvojile. Da bi dvodimenzionalno razdvajanje uspelo, potrebno je da prethodni rastvara~ potpuno ispari ili da bude hemijski inertan u odnosu na drugi rastvara~.

Razvijanje hromatograma podrazumeva proces razdvajanja komponenata na hromatografskoj hartiji. Proces je zavr{en kad front rastvara~a do|e do unapred odre|ene du`ine ili kad pro|e prethodno izmereno vreme razdvajanja komponenata. Olovkom se zabele`i front rastvara~a, a zatim se hartija osu{i na vazduhu ili u struji toplog vazduha, koja se propu{ta paralelno sa pravcem prostiranja trake. Odre|ivanje polo`aja zona podrazumeva primenu hemijskih ili fizi~kih procesa da bi se zone hromatograma u~inile vidljivim. Fluorescentne supstancije otkrivaju se pomo}u UV lampe, a polo`aj zona radioaktivnih supstancija odre|uje se ure|ajem za merenje radioaktivnosti. U drugim slu~ajevima se, za detekciju zona, naj~e{}e koristi hemijska metoda koja se sastoji u tome da se osu{ena traka prska odgovaraju}im rastvorom koji hemijski reaguje sa zonama, daju}i obojena jedinjenja.

Slika 7. Dvodimenzionalna tehnika

Eksperimentalna fizi~ka hemija

245

Kvalitativna analiza komponenata izvodi se odre|ivanjem Rf vrednosti i njihovim pore|enjem sa tabli~nim. Ovaj na~in nije dovoljno pouzdan, jer Rf vrednost zavisi od vi{e faktora, kao {to su priroda komponenti, sastav mobilne faze, temperatura, vrsta hartije i dr. Zato se pri publikovanju Rf vrednosti moraju definisati i uslovi pod kojima su one odre|ene. Pouzdaniji na~in identifikacije sastoji se u tome da se ise~e deo hartije sa zonom nepoznate supstancije i izvr{i ekstrakcija zone pogodnim rastvara~em. Dobijeni rastvor mo`e se ispitati hemijskim, fizi~kohemijskim metodama ili hromatografski, pore|enjem sa hromatogramima referentnih supstancija. Kvantitativna analiza komponenata mo`e se izvr{iti na dva na~ina: direktnim odre|ivanjem koli~ine supstancije u zoni ili ekstrakcijom supstancije iz zone pogodnim rastvara~em. Supstancije se odre|uju u izdvojenim zonama direktno na hartiji (in situ) spektrofotometrijskim metodama, uglavnom na osnovu reflektovane svetlosti. Drugi na~in se odnosi na hemijsko i fizi~kohemijsko odre|ivanje koli~ine supstancije u rastvoru dobijenog ekstrakta. B. Podeona hromatografija na tankom sloju Izvodi se istim tehnikama kao i hromatografija na hartiji: horizontalnom, silaznom i uzlaznom. Aparatura za razvijanje hromatografskih plo~a prikazana je na slici 8.

Slika 8. Komore za razvijanje hromatografskih plo~a (shematski prikaz) (a silazna; b uzlazna; c horizontalna tehnika)

Da bi se dobila ravnomerna zasi}enost parom u svim delovima komore, unutra{nji zidovi se obla`u filtar-hartijom natopljenom rastvara~em, koji slu`i kao mobilna faza.

246

Medenica / Male{ev

Izbor adsorbensa zavisi od prirode supstancija koje se razdvajaju. Silikagel se koristi u analizi aminokiselina, alkaloida, {e}era, masnih kiselina, lipida, neorganskih katjona i anjona. Aluminijum-oksid se koristi kod razdvajanja aminokiselina, alkaloida, fenola, steroida, boja u `ivotnim namirnicama. Celulozni prah se koristi kod aminokiselina, alkaloida, nukleotida, boja u `ivotnim namirnicama, a magnezijum-oksid kod ugljovodonika. Pored ovih, koriste se i komercijalne plo~e sa tankim slojem koje sadr`e specifi~ne aditive. Priprema tankog sloja. Sloj adsorbensa na plo~i, koja je naj~e{}e od stakla, mora biti odre|ene i ujedna~ene debljine. Samo u tom slu~aju dobijaju se reproduktivne Rf vrednosti za kvalitativnu analizu. Nano{enje tankog sloja adsorbensa vr{i se pomo}u specijalnog ure|aja po [talu (Stahl). U nedostatku ovog ure|aja, tanak sloj se mo`e naneti i ru~no. Posle nano{enja sloja, plo~ica se su{i oko 10 minuta na vazduhu, a zatim oko 30 minuta u su{nici na temperaturi od 100C. Ako se za pripremu suspenzije ne koristi voda ve} organski rastvara~, plo~e se su{e na temperaturi manjoj od 100C. Nano{enje uzorka izvodi se na taj na~in {to se mala koli~ina analizirane sme{e nanese na 1,52 cm od kraja plo~e, tako da obrazuje vla`nu zonu pre~nika 25 mm. Rastvor se nanosi mikropipetom ili kalibrisanom kapilarom. Vrh pipete se primakne povr{ini sloja, tako da formirana kap dodirne sloj i pre|e na njega, bez kontakta pipete sa tankim slojem. U slu~aju o{te}enja sloja pipetom do{lo bi do poreme}aja protoka rastvara~a, {to bi izazvalo deformisanje zona i onemogu}ilo pravilno razdvajanje supstancija bliskih Rf vrednosti. Pre razvijanja hromatograma, naneta zona uzorka mora biti suva. Razvijanje hromatograma na tankom sloju sli~no je opisanom postupku razvijanja na hartiji, a izvodi se u komorama koje su prikazane na slici 7. Da bi se pove}ala efikasnost razdvajanja supstancija, plo~a se mo`e razvijati: a) vi{e puta u istom pravcu sa istim rastvara~em; b) sa dva rastvara~a u istom ili u dva pravca (dvodimenzionalna hromatografska tehnika); c) uz stalnu promenu rastvara~a. Ovaj poslednji postupak primenjuje se za razdvajanje jedinjenja koja se znatno razlikuju po svojim osobinama. Odre|ivanje polo`aja zona vr{i se istim metodama kao kod hromatografije na hartiji.

Eksperimentalna fizi~ka hemija

247

Kvalitativna analiza razdvojenih komponenti, odnosno identifikacija, mo`e se izvr{iti odre|ivanjem Rf vrednosti, ali je ova metoda jo{ manje pouzdana od one kod hromatografije na hartiji. Uzrok le`i u dodatnim faktorima koji uti~u na kretanje zona, kao {to su priroda, aktivnost i debljina sloja adsorbensa, kao i zasi}enost atmosfere komore parama rastvara~a. Ako se supstancija ne mo`e sa sigurno{}u identifikovati pomo}u Rf vrednosti ili bojenim reakcijama, sloj adsorbensa sa zonom supstancije pa`ljivo se skine sa plo~e, zona se ekstrahuje pogodnim rastvara~em i odre|uje nekom od fizi~kohemijskih metoda. Kvantitativna analiza se mo`e vr{iti direktno na plo~i spektrofotometrijskim metodama, uglavnom na osnovu merenja intenziteta reflektovane svetlosti, pod uslovom da su zone obojene, da fluoresciraju ili reaguju sa pogodnim reagensom, daju}i obojeno jedinjenje. Ako se zona skida zajedno sa slojem adsorbensa, onda se analiza vr{i nekom klasi~nom kvantitativnom metodom. Hromatografija na hartiji i na tankom sloju ima veliku primenu u istra`iva~kim i rutinskim odre|ivanjima. Sa razvojem hromatografije na tankom sloju, kao i gasne, odnosno te~ne hromatografije, smanjena je primena hromatografije na hartiji. Tankoslojna hromatografija na{la je {iroku primenu u farmaciji. U ispitivanju i kontroli lekova primenjuje se kako u analizi polaznih sirovina, tako i me|uproizvoda i finalnih proizvoda. Tako|e se koristi i u pra}enju stabilnosti lekova, zatim za odvajanje i odre|ivanje aktivnih principa lekova i njihovih degradacionih proizvoda. Ova metoda se mo`e primeniti i na lek i na biolo{ki materijal. U biohemijskim i farmakolo{kim ispitivanjima primenjuje se za odre|ivanje metabolita lekova u telesnim te~nostima. U analizi `ivotnih namirnica koristi se za odre|ivanje npr. ostataka pesticida, za odvajanje i identifikaciju aminokiselina ili za odre|ivanje boja koje se koriste kao aditivi. U toksikolo{kim analizama koristi se za odre|ivanje npr. insekticida u razli~itim materijalima. Ovde su pomenuti samo neki karakteristi~ni primeri primene tankoslojne hromatografije u farmaciji.

248

Medenica / Male{ev

Zasniva se na razlikama u afinitetu jonskih vrsta u rastvoru prema izmeni sa jonima aktivnih grupa koje poseduju neki adsorbensi. Takvi adsorbensi mogu biti neorganskog i organskog porekla, sinteti~ki i prirodni. Prema tome da li u aktivnim grupama sadr`e mobilne katjone ili anjone, dele se na katjonske i anjonske izmenjiva~e. Primena jonskih izmenjiva~a u analiti~ke svrhe je razli~ita: razdvajanje elemenata sli~nog hemijskog pona{anja (npr. lantanida i aktinida), odvajanje jonskih od nejonskih vrsta, razdvajanje jona, razdvajanje katjona od anjona, koncentrisanje jona metala iz vrlo razbla`enih rastvora i odre|ivanje koncentracije. U praksi se, uglavnom, koriste visokopolimerne smole koje sadr`e aktivne kiselinske ili bazne grupe, ~iji se joni izmenjuju sa jonima iz rastvora. Katjonski izmenjiva~i sadr`e kiselinske grupe, kao {to su SO3H i COOH, a anjonski izmenjiva~i sadr`e bazne grupe, kao {to su OH ili amino grupe NH2, NHR i NR2. Mehanizam izmene katjona izme|u katjonskog izmenjiva~a i analiziranog rastvora, npr. NaCl, zasniva se na ravnote`noj reakciji: RSO3H + NaCl RSO3Na + HCl a mehanizam izmene anjona izme|u anjonskog izmenjiva~a i rastvora NaCl: ROH + NaCl RCl + NaOH Jonoizmenjiva~ka hromatografija se naj~e{}e izvodi u koloni, koja se mo`e puniti raznim vrstama organskih katjonskih i anjonskih izmenjiva~kih smola (slika 9). Suspenzija izmenjiva~a u vodi sipa se u kolonu koja je delimi~no napunjena vodom, pri ~emu treba paziti da u kolonu ne u|e vazduh. Na kraju se ispusti vi{ak vode, ali tako da iznad smole uvek mora postojati sloj te~nosti, bez obzira da li je kolona u pripremi ili je u toku jonska izmena. Pri prvom kori{}enju izmenjiva~i nisu dovoljno ~isti za analiti~ke svrhe, pa ih je potrebno pre~istiti. Katjonski izmenjiva~i se vi{e puta naizmeni~no ispiraju sa: 2 mol L1 HCl, destilovanom vodom, 2 mol L1 NaCl i ponovo destilovanom vodom. Ako je potreban izmenjiva~ u Hobliku, poslednje ispiranje se vr{i kiselinom, a kad se `eli Naoblik, poslednji se propu{ta NaCl. Na kraju se izmenjiva~ ispira destilovanom vodom do negativne reakcije na odgovaraju}i jon (H+ ili Na+). Anjonski izmenjiva~i se naizmeni~no ispiraju sa: 2 mol L1 NaCl, destilovanom vodom, 2 mol L1 NaOH i ponovo

Jonoizmenjiva~ka hromatografija

Slika 9. Kolona sa smolom

Eksperimentalna fizi~ka hemija

249

destilovanom vodom. Ako je izmenjiva~ potreban u OHobliku, poslednje ispiranje vr{i se sa NaOH, a kad se `eli u obliku soli, npr. hloridne, poslednji se propu{ta NaCl. Na kraju se izmenjiva~ ispira destilovanom vodom do negativne reakcije na OH ili Cl jon. Jonskom izmenjiva~u se, pre upotrebe, mora odrediti kapacitet, koji se defini{e kao koli~ina jednovalentnog jona u milimolovima koju mo`e da razmeni jedan gram suvog izmenjiva~a. Kapacitet ve}ine katjonskih i anjonskih izmenjiva~a koji se danas koriste iznosi oko 4 mmol g1 H+ jona, odnosno 4 mmol g1 OH jona. Poznavanje kapaciteta je neophodno u kvantitativnoj jonoizmenjiva~koj hromatografiji, jer se mora voditi ra~una o odnosu izme|u broja molova propu{tenog analiziranog jona i broja grama smole u koloni. Ako je ovaj odnos ve}i od kapaciteta smole, jedan deo analiziranih jona ne}e biti izmenjen i pre}i }e u eluat. Po{to se koncentracija ispitivanih jona odre|uje posredno, preko koncentracije jona koji su iz smole putem izmene dospeli u eluat, rezultat za koncentraciju ispitivanih jona, u ovom slu~aju, bi}e smanjen. Kapacitet (npr. katjonske) smole odre|uje se na slede}i na~in: odmeri se 0,5 g katjonske smole i prenese u erlenmajer od 250 mL. Doda se 50 mL vode i 3 g natrijum-hlorida, ~ija koli~ina prevazilazi kapacitet odmerene smole. Time je postignuto da svi aktivni joni u smoli u~estvuju u izmeni. Sme{a se mu}ka nekoliko minuta da se kvantitativno izvr{i izmena jona, doda 23 kapi fenolftaleina i titruje sa 0,1 mol L1 rastvorom NaOH. Kapacitet C jonskog izmenjiva~a izra~unava se iz izraza:

C=
gde je: V zapremina utro{enog titranta c molarna koncentracija titranta m odmerena masa smole.

V.c m

(4)

Kvalitativna analiza jonskih vrsta u sme{i bi}e uspe{na ako se eluent izabere tako da razlika izme|u koeficijenata raspodele jona koji se razdvajaju bude dovoljno velika. I kod kvalitativne i kvantitativne analize mora se voditi ra~una da uzorak ne sme biti jako kiseo kada se analizira u katjonskom izmenjiva~u niti jako bazan kad se tretira anjonskim izmenjiva~em. Jake kiseline i jake baze sadr`e veliku koncentraciju H+ i OH jona, koji smanjuju kapacitet smole, a time i mogu}nost izmene jona.

250

Medenica / Male{ev

Razdvajanje jona u koloni vr{i se na osnovu afiniteta odre|enih jona prema smoli. Afinitet zavisi od vi{e faktora. U vodenim rastvorima afinitet prema smoli raste sa pove}anjem naelektrisanja jona. Ako razli~ite jonske vrste imaju jednaka naelektrisanja, ve}i afinitet prema smoli ima jon manjeg radijusa. Kvalitativna analiza se naj~e{}e vr{i metodom eluiranja. Ako se na vrh kolone sa anjonskom smolom sipa odre|ena zapremina analizirane sme{e kiselina, a zatim vr{i eluiranje vodom, u gornjem delu kolone do}i }e do izmene anjona smole sa anjonom ja~e kiseline, prema kojoj smola ima najve}i afinitet. Zatim }e se izmeniti slabija kiselina, pa ostale. Na ovaj na~in posti`e se razdvajanje kiselina u anjonskim i baza u katjonskim izmenjiva~ima, ~ija razlika u pK vrednostima mo`e biti manja od 0,05 jedinica. Kvantitativna analiza se vr{i tako {to se odre|ena zapremina analiziranog rastvora sipa na vrh kolone, a zatim vr{i sporo eluiranje vodom da bi se izvr{ila kvantitativna izmena jona. Ako se u katjonskom izmenjiva~u odre|uje koncentracija rastvora NaCl, u eluatu }e se, prema prikazanoj reakciji izmene katjona, na}i ekvivalentna koli~ina HCl. Eluiranje vodom vr{i se do neutralne reakcije, {to se proverava lakmus-trakom. Eluat sa HCl, sakupljen u erlenmajeru, titruje se rastvorom NaOH poznate koncentracije uz metiloran` kao indikatorom. Iz utro{ene zapremine NaOH i poznate zapremine analiziranog NaCl, izra~unava se koncentracija NaCl, prema izrazu:

MNaCl =
gde je: M koncentracija u mol L1 V zapremina rastvora.

MNaOH .VNaOH VNaCl

(5)

U slu~aju da se rastvor NaCl propu{ta kroz anjonski izmenjiva~, u eluatu }e biti NaOH, a kao titrant koristi}e se rastvor HCl poznate koncentracije. Upotrebljene smole mogu se regenerisati i vi{e stotina puta, a da ne do|e do smanjenja kapaciteta. Regenerisanje katjonskih smola vr{i se sa 2 mol L1 hloridnom kiselinom, a anjonskih sa 2 mol L1 natrijum-hidroksidom, da bi se aktivne grupe ponovo zasitile aktivnim jonima. Eluiranje pomo}u kiseline, odnosno baze izvodi se vi{e puta, a zatim se ispira destilovanom vodom do neutralne reakcije.

Eksperimentalna fizi~ka hemija

251

Jedna od najva`nijih primena smola za izmenu jona je pre~i{}avanje vode tzv. hladnim postupkom bez destilacije. Tako se dobija dejonizovana voda koja je ~esto boljeg kvaliteta nego ona dobijena klasi~nom destilacijom. Postupak se sastoji u propu{tanju vode prvo kroz jak katjonski, zatim kroz jak anjonski izmenjiva~ i na kraju kroz kolonu sa sme{om anjonskog i katjonskog izmenjiva~a. Jonski izmenjiva~i se veoma uspe{no koriste i za pre~i{}avanje radioaktivnih voda. Pomo}u katjonskih izmenjiva~a razdvajaju se aminokiseline, masne kiseline, kiseline od baza, koje su rastvorne u vodi. Anjonski izmenjiva~i se koriste za razdvajanje alkaloida, hlorofenola, hemoglobina, aldehida, ketona, organskih kiselina male molarne mase i drugo.

252

Medenica / Male{ev

URADITE SAMOSTALNO ... Adsorpciona hromatografija u koloni

Zadatak eksperimenta
I Kvalitativna analiza katjona u sme{i.

Pribor i hemikalije
G G

Staklene cev~ice Aluminijum-oksid G Stakleni levak G Analizirana sme{a katjona Postupak U dve staklene cev~ice, prethodno zatvorene na jednom kraju vatom, preko staklenog levka sipati aluminijum-oksid do oko 1 cm od otvora cevi. Pipetom ukapati po desetak kapi analiziranog rastvora u obe cev~ice, tako da se uo~avaju dva sloja adsorbovane dvokomponentne analizirane sme{e. Uporediti boje slojeva sa datim uzorcima na hromatogramu, i na osnovu toga pretpostaviti prisustvo odre|enih katjona u sme{i. Zatim u jednu cev ukapati rastvor natrijum-hidroksida, a u drugu kalijum-heksacijanoferata. Pore|enjem boja slojeva nastalih reakcijom katjona i dodatih reagenasa, sa datim uzorcima na hromatogramu, dokazati prisutne katjone i napisati reakcije identifikacije.

Eksperimentalna fizi~ka hemija

253

URADITE SAMOSTALNO... Podeona hromatografija na tankom sloju

Zadatak eksperimenta
I Podeonom hromatografijom razdvojiti komponente iz analizirane sme{e i izra~unati njihove Rf vrednosti. Grafi~ki prikazati dobijeni hromatogram.

Pribor i hemikalije
G G

Komora za hromatografiju (slika 8) Plo~ica sa tankim slojem od silikagela G Sme{a organskih rastvara~a (mobilna faza) G Analizirana sme{a za razdvajanje Priprema Komoru za hromatografiju pripremiti kao {to je prikazano na slici 8. Zidove komore oblo`iti filtar-hartijom natopljenom mobilnom fazom, da bi atmosfera komore bila ravnomerno zasi}ena parama rastvara~a. U komoru zatim sipati rastvara~ (mobilna faza) tako da pokrije dno i poklopiti komoru. Postupak Na jedan kraj plo~ice sa tankim slojem od silikagela naneti jednu kap sme{e i centar dobijene mrlje ozna~iti kao start. Plo~icu postaviti u komoru tako da se mrlja nalazi nekoliko milimetara iznad nivoa rastvara~a. Kada rastvara~ do|e skoro do kraja plo~ice, izvaditi plo~icu iz komore i obele`iti front rastvara~a. Na osu{enoj plo~ici obele`iti centre mrlja koje su se razdvojile i izra~unati njihove Rf vrednosti. Grafi~ki prikazati dobijeni hromatogram na tankom sloju.

254

Medenica / Male{ev

URADITE SAMOSTALNO ... Jonoizmenjiva~ka hromatografija

Zadatak eksperimenta
I Regenerisati smolu. I Odrediti kapacitet smole. I Odrediti koncentraciju rastvora natrijum-hlorida.

Aparatura i hemikalije
G

Kolona sa katjonskom smolom Dowex-50 (slika 9) G Hloridna kiselina G Natrijum-hlorid G Natrijum-hidroksid G Destilovana voda G Metiloran` Priprema a) Punjenje kolone Kolonu sa smolom pripremiti kao {to je prikazano na slici 9. Dno kolone zatvoriti sinterovanom plo~icom ili staklenom vunom, a zatim napuniti kolonu smolom. Kolona se priprema tako {to se vodena suspenzija smole uliva u kolonu, pri ~emu treba voditi ra~una da u koloni ne ostanu mehuri}i vazduha. Smolu treba prethodno ostaviti neko vreme da bubri u vodi. Vrh kolone u~vrstiti sa malo staklene vune. Iznad smole uvek mora postojati sloj te~nosti. b) Regenerisanje smole Kroz kolonu sa katjonskim izmenjiva~em propustiti rastvor hloridne kiseline, a zatim ispirati destilovanom vodom do neutralne reakcije, koja se proverava lakmus-trakom.

Eksperimentalna fizi~ka hemija

255

Postupak a) Odre|ivanje kapaciteta smole Kapacitet smole odre|uje se na slede}i na~in: odmeriti 0,5 g katjonske smole Dowex-50 u H+ obliku i preneti u erlenmajer od 250 mL. Dodati 50 mL vode, 3 g natrijum-hlorida, a zatim sme{u mu}kati nekoliko minuta. Dodati 23 kapi fenolftaleina i titrovati sa 0,1 mol L1 rastvorom natrijum-hidroksida. Kapacitet jonskog izmenjiva~a (C) izra~unava se iz izraza (4). b) Odre|ivanje koncentracije rastvora natrijum-hlorida Odre|enu zapreminu analiziranog rastvora natrijum-hlorida (o kojoj se mora voditi ra~una zbog kapaciteta smole) propustiti kroz jonsku smolu, a zatim ispirati destilovanom vodom do neutralne reakcije. Eluat, sakupljen u erlenmajeru, titrovati rastvorom natrijumhidroksida poznate koncentracije uz indikator metiloran`. Iz utro{ene zapremine titranta izra~unati koncentraciju hloridne kiseline u eluatu, odnosno koncentraciju analiziranog natrijum-hlorida.

256

Medenica / Male{ev

Tabela 1. Odre|ivanje kapaciteta smole (C) i koncentracije (c) rastvora natrijum-hlorida C smole (mmol g1) V NaCl (mL) c NaOH (mol L1) V NaOH (mL)

REZULTATI

c NaCl (mol L1)

Eksperimentalna fizi~ka hemija

257