Vebe iz predmeta sportska farmacija Katedra za analitiku lekova

Analiziranje biolokog materijala predstavlja veliki izazov: Koncentracija analita je niska Matriks je izuzetno kompleksan
Endogene materije Metaboliti Razgradni produkti Lekovi koji se istovremeno primenjuju Drugi egzogeni ksenobiotici

Venska krv, serum ili plazma Urin Saliva Likvor Dlaka kose Sputum...

Od posebnog znaaja je doping kontrola!

Pojedina ispitivanja (primena eritropoetina) zahtevaju

analizu iz krvi, ali

Najee se koristi urin od svih vrsta biolokog materijala

Jednostavan nain uzimanja Neinvazivan nain uzimanja

Uzorci biolokog materijala se ne uzimaju u idealnim uslovima Moraju se transportovati do akreditovanih laboratorija
Moe oteati analitiki postupak Moe umanjiti tanost analitikog postupka

Urin je podloan mikrobiolokoj kontaminaciji, to moe smanjiti reprezentativnost uzorka (npr. ispitivanje nedozvoljene upotrebe steroida)

Definicija:
Validacija bioanalitkih metoda ukljuuje sve postupke koji dokazuju da razvijena metoda koja je namenjena kvantitativnoj analizi leka ili njegovih metabilita u biolokom matriksu bude pouzdana i reproduktivana za predloenu namenu. Izvodi se prema smernicama:
The International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) Food and Drug Administration (FDA) European Medicines Agency (EMEA)

Validacija obuhvata ispitivanje:

Selektivnost Osetljivost (limit detekcije, LD) i donji limit kvantifikacije (eng. lower limits of quantification, LLOQ) Opseg Linearnost Preciznost Tanost Stabilnost Ispitivanje efikasnosti postupka preiavanja biolokog materijala

U okviru postupka validacije uvek se preporuuje izvoenje prevalidacije, odnosno, ispitivanje nekih od parametara validacije pre drugih:
Limita detekcije LLOQ Selektivnost metode Opseg kalibracione krive
Ovo se radi zbog utede vremena. Ukoliko se pokae da metoda nije selektivna, dovoljno osetljiva ili da kalibraciona kriva ne moe biti u odgovarajuem opsegu, neophodno je ponovo pristupiti razvoju bioanalitike metode.

Za metodu se moe rei da je specifina ukoliko se registruje odgovor koji potie iskljuivo od jednog analita (spektrofotometrijske, titrimetrijske metode). Selektivnost metode predstavlja sposobnost da se meri odgovor ispitivanog analita i razlikuje od ostalih odgovora koji ne potiu od analita od interesa (za separacione metode). Kako su bioanalitike metode uglavnom separacione termin selektivnost je ee prikladnije koristiti.

Potvruje se ispitivanjem uzoraka biolokog materijala dobijenih od najmanje 6 dobrovoljaca razliitih godina i pola za koje znamo da nisu koristili u sportu zabranjene supstance - prazan uzorak.

Nakon izvoenja postupka preiavanja praznih uzoraka uzorci se ispituju prema interferirajuim supstancama poreenjem sa svee pripremljenim uzorcima biolokog materijala optereenim standardnim rastvorima ispitivanih supstanci u LLOQ koncentraciji.

Interferencije kod biolokog materijala mogu biti endogenog i egzogenog porekla.

Endogenog porekla su: metaboliti analita kao i njihovi prekursori degradacioni proizvodi analita lekovi koji se istovremeno primenjuju vitamini i njihovi metaboliti i / ili degradacioni proizvodi supstance koje se normalno nalaze u krvi kao to su hormoni, proteini, lipidi Egzogenog porekla su: neistoe koje potiu iz reagenasa koji se koriste za pripremu uzoraka supstance koje se koriste u proizvodnji laboratorijske opreme (npr. plastifikatori)

Limit detekcije predstavlja najmanju koncentraciju ispitivanog analita koja se moe detektovati predloenom bioanalitkom metodom. Na ovaj nain definie se osetljivost bioanalitike metode. Potvrda da je osetljivost metode zadovoljavajua, dobija se analizom uzoraka biolokog materijala uzetih od ispitanika i na taj nain se potvruje da li je osetljivost postavljene metode zadovoljavajua.

LLOQ je ona koncentracija u kojoj je odgovor analita 5 puta vei u poreenju sa odgovorom praznog uzorka biolokog materijala na tom retencionom vremenu. Pikovi ispitivanih supstanci bi trebalo da budu jasno uoljivi, odvojeni od pikova koji potiu iz biolokog materijala i reproduktivni sa preciznou od 20 % i tanou u opsegu 80 % 120 %. Za procenu preciznost i tanost u LLOQ koncentraciji koristi se po 5 rastvora za ispitivanu supstancu. Tanost je izraena kao Recovery vrednost (%), dok se preciznost izraava kao relativna standardna devijacija (RSD, %). Prva taka na kalibracionoj krivoj je u LLOQ koncentraciji.

Kalibraciona kriva uspostavlja vezu izmeu odgovora detektora i poznatih koncentracija analita Da bi se dobila odgovarajua veza odgovora detektora i koncentracije analita neophodno je koristiti dovoljan broj standarda:
praznog uzorka biolokog materijala nulti uzorak (prazan uzorak biolokog materijala optereen internim standardom) 6 8 praznih uzoraka materijala optereenih rastuim koncentracijama ispitivanog analita

Opseg koncentracija se bira u odnosu na oekivane koncentracije u biolokom materijalu koji e biti dobijen od pacijenata

Preciznost metode predstavlja stepen rasipanja pojedinanih rezultata dobijenih iz vie paralelnih odreivanja iz homogenih uzoraka pod istim uslovima. Preciznost metode se odreuje u tri tzv. QC (eng. Quality Control) koncentracije (niska, srednja i visoka) i to po 5 uzoraka za svaku koncentraciju. Preciznost se odreuje: u toku jednog dana - intraday preciznost i u toku tri uzastopna dana- interday preciznost Preciznost se izraava kao RSD (%) za svaku od tri navedene QC koncentracije. Zahtev prema FDA smernicama je da preciznost mora biti 15 %, osim za LLOQ, gde se dozvoljava 20 %.

Tanost metode predstavlja meru usaglaenosti eksperimentalno dobijenih rezultata predloenom metodom sa pravim vrednostima. Tanost metode se odreuje u tri tzv. QC koncentracije (niska, srednja i visoka), i to po 5 uzoraka za svaku koncentraciju. Tanost metode se izraava kao Recovery vrednost (R, %). Zahtev prema FDA smernicama je da tanost mora biti 85 % 115 %, sem za LLOQ gde se dozvoljava 80 % 120 %.

Stabilnost analita u biolokom materijalu zavisi od:

hemijskih osobina ispitivanih supstanci prirode matriksa ambalae u kojoj se analit uva.

Shodno tome, stabilnost analita u razliitim biolokim matriksima i u razliitoj vrsti ambalae se mora posebno ispitivati. Uslovi pri kojima se ispituje stabilnost biraju se na taj nain da realno odraavaju uslove kojima e uzorci biolokog materijala biti izloeni.

Prema FDA predlau se sledee vrste stabilnosti koje je potrebno ispitatiti:

Stabilnosti analita tokom analize uzoraka (eng. post preparative stability) Stabilnost analita pri ponovljenom zamrzavanju i topljenju uzoraka (eng. freeze thaw cycles) Kratkorona temperaturna stabilnost (eng. shortterm temperature stability) Dugorona stabilnost (eng. long term stability)

U sluaju da za potrebe ispitivanja velikog broja uzoraka biolokog materijala uzorci moraju biti due u autosampleru preporuuje se i ispitivanje stabilnosti analita tokom analize uzoraka i u duem vremenskom periodu od 24 h.

Da bi se izvrila procena ove vrste stabilnosti QC uzorci se preiste, a zatim uvaju propisano vreme na sobnoj temperaturi.

Ispituje se zamrzavanjem uzoraka na temperaturi od 20 C i postepenim topljenjem na sobnu temperaturu u tri ciklusa.

Ovim ispitivanjem potvruje se stabilnost i mogunost zamrzavanja i odmrzavanja uzoraka dobijenih od ispitanika kako bi se analiza ponovila.

Kratkorona temperaturna stabilnost uzoraka ispituje se nakon otapanja uzoraka do sobne temperature i uvanja na ovoj temperaturi 4 h 24 h.

Ova duina uvanja na sobnoj temperturi je izabrana shodno oekivanju da se uzorci mogu uvati na sobnoj temperaturi tokom analize.

Na ovaj nain potvruje se stabilnost analita u biolokom materijalu za vreme sakupljanja i preiavanja uzoraka.

Ispitivanje dugorone stabilnosti podrazumeva uvanje uzoraka na temperaturi od 20 C. Preporueno je ispitvanje stabilnosti:
3 meseca za uzorke urina i 6 meseci za uzorke plazme.

Stabilnost se procenjuje poreenjem srednjih vrednosti koncentracija nakon odreenog perioda uvanja uzoraka i inicijalnih koncentracija ispitivanih analita. Stabilnost analita u biolokom materijalu ispituje se u 2 QC koncentracije (nioj i vioj). Za svaku koncentraciju pravi se najmanje po 3 rastvora.

Osim ispitivanja stabilnosti bitno je preduzeti i neke mere opreza kako bi se ouvala stabilnost analita u biolokim matriksima i smanjio gubitak analita.
Zamrzavanje uzoraka na niskim temperaturama od -80 C ili u tenom azotu, kako bi se smanjio stepen degradacije. Upotreba odgovarajuih aditiva (antioksidansi, inhibitori enzima, puferi). Derivatizacija odmah nakon prikupljana uzoraka, kako bi se dobili stabilni derivati (npr. kaptopril u punoj krvi). Brza ekstrakcija analita iz biolokog matriksa i uvanje u rastvarau u kome je dokazano da je analit stabilan ili nakon uparavanja do suva. Ukoliko nita od opisanog nije zadovoljavajue, preporuuje se brza ekstrakcija analita koja je praenja brzom analizom ispitivanog uzorka.

Prilikom preiavanja biolokog materijala nije neophodno da Recovery vrednost analita bude 100 % ve da Recovery analita i internog standarda bude dokazano stalan, precizan i reproduktivan. Recovery eksperimenti se sprovode u tri koncentracije (niska, srednja i visoka). U svakoj od navedenih koncentracija pravi se po 5 rastvora i porede se rezultati dobijeni iz uzoraka nakon preiavanja i standardnih rastvora koji nisu preiavani, i koji predstavljaju 100 %. Na osnovu dobijenih rezultata moe se zakljuiti da li efikasnost postupka preiavanja zavisi od koncentracije, kao i da li priroda biolokog materijala pokazuje znaajan uticaj na Recovery vrednosti analita.

Cilj