Animal cell culture can be described as in vitro maintenance and propagation of animal cells using a suitable nutrient media.

Culturing is a process of growing animal cells artificially. The most important and essential step in animal cell culture is selecting appropriate growth medium for in vitro cultivation. The selection of the medium depends on the type of cells to be cultured and also the purpose of the culture: growth differentiation, or even production of desired products like pharmaceutical compounds. Animal cells are cultured using a completely natural media, or an

artificial media along with some of the natural products.

In the early years of this in vitro cultivation of animal cell culture technique natural media are obtained from biological sources were used. For eample 1. Body fluid such as plasma, serum, lymph, amniotic fluid and much more are used. These fluids used as animal cell culture media after testing for toxicity and sterility. 2. Tissue extract such as extract of liver, spleen, bone marrow and leucocyes also used as animal cell culture media. But most commonly used tissue extract is from chick embryo. 3. Plasma clots are also used as media for animal cell culture and now they are commercially produced as

culture media. 4. Bovine embryo extract are also prepared using bovine embryos of up to 10days age, and are used as animal cell culture media.

1. The artificial media contains partly or fully defined components. 2. The basic criteria for choosing a artificial media for animal cell culture are the culture media should provide all the required nutrients to the cell. 3. Media should maintain the physiological pH at around 7 with the help of buffering system. 4. The animal cell culture media should be sterile, and isotonic to the culturing cells. The basis for the animal cell culture media is the balanced salt solution, which are used to create a physiological pH and osmolarity required to maintain the animal cells in vitro or in laboratory conditions. 5. For promoting cell growth and proliferation, many types of animal cell culture media are designed by adding or varying different constituents. For example serum containing media and serum-free media.

PLASMA
Digunakan terutama pada kultur jaringan tradisional: Koagulum

Ross Harison : Menumbuhkan potongan kecil jaringan (1907) dari dekat pipa syaraf dalam jendalan limpe katak Carrel (1910) : Jendalan plasma sbgai media kultur

Sekarang bukan sebagai media kultur melainkan sbg matriks melekat sel /penyokong

1. Menyediakan

substrat dan struktur

penyokong yang mengandung nutrisi pada berbgai tipe kultur Penyediaan matriks bagi sel baru selama proses penyembuhan luka pada tubuh
2. Memfasilitasi perlekatan permukaan gelas

sel pada 3. Menyediakan sarana proteksi terhadap trauma terhadap sel akibat proses sub-kultur dan pergantian media 4. Menyediakan kantung medium di sekitar sel

Karena : 1. plasma lebih jernih 2. Kadar Ca darah lebih konstan 3. koagulum lebih kental 4. Hewan sumber mudah didapat 5. Prosedur pembuatan sederhana dan mudah

Ayam Jantan muda

Pengambilan darah Ayam: sayap, jantung , arteri carotid Mamalia: carotid arteri, jantung Perlu penambahan antikoagulan: heparin dan EDTA

Centrifugasi darah Pengambilan plasma

Gambar 1. Pengambilan darah dari vena Gambar 2.

Pengambilan darah intrakardial cara 1.

Gambar 3. Pengambilan darah intrakardial cara 2.

Gambar 4. Arteri carotis pada ayam

Pengambian darah ayam dari vena branchial

Caudal Peduncle Caudal vain puncture Cardiac cut puncture

Serum: plasma tanpa fibrinogen

Dapat digunakan sebagai medium utuh atau sebagai suplemen des Ligneris (1928): kultur sel mamalia Parker (1933, 1936): kultur jaringan ayam Simms (1936), Simms dan Sanders (1942): ultrafiltrat serum sebagai madium dasar untuk berbagai tujuan ternasuk

menumbuhkan virus Risher et al. (1948): growth factor bermolekul rendah penting untuk kultur

1. Serum media is an example for natural media. Natural media are very useful and convinient for a wide range of animal cell culture. But they also have got some disadvantages such as poor reproductability due to lack of knowledge of exact composition of these natural media. 2. Major reasons for using synthetic media are for immediate survival of cells, for prolonged survival, for indefinite growth and also for specialized functions. a. Balanced diet solution with specific osmotic pressure and pH are used for the immediate survival b. Serum or balanced salt solution along with amino acids, oxygen, vitamins and serum proteins are used for long survival. c. Minimum Essential Medium also known as Eagles media are used for mammalian cell culture d. Role of serum in animal cell culture is very complex and also it contains mixture of many biomolrcules such as growth factors and also growth inhibitory factors.

1. Serum is bound to proteins and basic nutrient in solution. 2. Serum also contains hormones and growth factors, which play a major role in stimulating cell growth and function 3. Serum also helps in attachment of the cells 4. Serum also acts as spreading factor. 5. Serum also function as binding protein such as albumin carrying factor 6. Serum also helps in carrying hormones, vitamins, minerals, lipids and much more biological substances. 7. Serum also minimizes mechanical damage and also damage caused by viscosity 8. Serum also acts as natural buffering agent and helps in maintaining the pH of the culture media.

1. Serum may contain inadequate amount of cell specific growth factors and may need to suppliment the media or it may also contain in abundance of cytotoxic compounds. 2. Serum media has got high risk of contamination with virus, fumgi and mycoplasma. 3. There is no uniformity in the composition of serum, as still we do not know the exact composition of the serum 4. Special tests are done to maintain the quality of the each batch of serum before it is used in cell culture media. 5. Serum may also contain some of the growth inhibiting factors, these in turn will inhibit the cultured cell growth and proliferation. 6. Serum availability is restricted as they are extracted from cattle 7. Presence of serum in the culture media may interfere with the purification and isolation of cell culture products, such as pharmaceutical compounds. Due to this additional steps are added for the isolation of cell culture products.

As using serum in animal cell culture media has got some disadvantages, to overcome this serum free media are designed and developed. Advantages of Serum Free Media: 1.scientists Main andor important advantage of serum free media is researchers can control the composition growth of cultured cells as required by changing the of the media. 2. Serum free media can be designed using specific factors, which will help in differentiation of cultured cells with specific desired functions.

1. cell proliferation is very slow in serum free media. 2. Cultured cells may need more than one type of media to obtain desired cell culture products. 3. Purity of reagents used in the serum free media 4. Availability

Serum Autolog

Serum
Serum Heterolog
Manusia Dewasa

Sumber

Serum Kuda
Tali Pusar Baik Fetus sapi Paling

Penyaringan Uji Steri

Pembekuan (Jangka Panjang) Temperatur Lemari Pendingin

litas
(Beberapa Minggu)

Penyimpanan

Pengambilan

darah (tanpa anti koagulan) Pembekuan darah

Centrifugasi Pengumpulan

( 3000rpm)

serum

Healy dan Parker

Orosomukoid (a1= acid glikoprotein) a2 makroglobulin Hilang dari medium selama kultivasi mencit

Makroglobulin Dextran/ficol Molekul-molekul non-protein Ex:

Acid glikoprotein Tidak dapat digantikan
Serum sering bersifat toksik dan toksisitas dapat dikurangi dengan pemanasan 60OC selams 30 menit

Serum Darah Tangkai Ari-Ari

Dr.Gey dan Dr. Margaret Murray

Cara mendapatkan darah dari tali pusar yaitu dengan membiarkan darah menetes sendiri dan ditampung dalam suatu wadah darah

dibiarkan menjendal serum yang terbentuk dipisahkan dengan hati-hati dengan jalan memipetnya disentrifugasi disimpan dalam suhu kamar selama 2 atau 3 minggu

Pengurutan
Tuk mengel darah

Cairan Amnion
Cara:
Bagian

luar uterus sapi dicuci, digantung, area dekat pangkal uterus diolesi yodium/ betadin. Setelah kering dimasukan dalam tocar, disiapkan tabung canula dan tabung penampung

untuk menyadap cairan amnion.

Cairan

amnion disterilisasi, siap digunakan. Amnion yang paling baik adalah amnion sapi

Cairan Asites dan Cairan Pleura

Cairan

ini diperoleh dari cairan asites

pasien dengan carsinomatis peritonial.

Bahan

ini diperoleh dari rumah sakit dan dapat digunakan secepat mungkin setelah disterilkan.

Dianjurkan

untuk menguji toksisitasnya

karena beberapa pasien yang menjadi sumber cairan ini sedang mendapat terapi medik dan beberapa obat dalam cairan tersebut dapat bersifat toksik.

Humor Akuosa
Humor akuosa dari mata telah diusulkan sebagai suatu nutrien yang baik untuk kultur karena in vivo cairan ini sebagai satusatunya sumber nutrisi untuk epitel retina Sumber Terbaik Mata

lembu jantan

Serum Ultrafiltrasi
Komponen penting dalam serum adalah molekul molekul yang lebih besar: protein dan material yang terikat pada protein.
Serum

nutrien

yang diultrafiltrasi merupakan pensuplemen yang sangat

berguna.
Pembuatannya Serum

memerlukan alat khusus.

ultrafiltrasi telah tersedia secara komersial dan dapat dipakai sebagai suplemen berdaya guna dalam menumbuhkan jaringan yang sangat dibutuhkan.

Serum Dialisis
Strain

sel yang tumbuh dalam medium

buatan seluruhnya sangat sedikit Strain sel kebanyakan tumbuh dalam medium buatan yang diberi suplemen dialisis. Dalam media ini sangat tepat menetapkan

komponen molekul kecil Cara: Tetapkan volume didialisis dengan air suling selama 48 jam tambahkan 1/5 volume x stok BSS Volume dijadikan 2x volume asli dengan ditambahkan air suling filtrasi menggunakan filter Millipolar material yang tersususn 50% serum dialis

Hemolimph Insekta
Digunakan sebagai basis untuk beberapa media kultur jaringan insekta. Hemolimph dapat diperoleh dengan memotong dua atau tiga segmen pupa yang besar dan mengeluarkan cairan

Kolagen
Substrat fibrin cenderung menjadi cair Dibuat dari tendo ekor tikus/cakar ayam Sebelum digunakan didialisis/diencerkan dalam aquades Baik untuk kultur dalam tabung dan gelas penutup Untuk pengkajian morfologik

EKSTRAK JARINGAN
Hampir seluruh media kultivasi jar. mengandung salah satu ekstrak jaringan. ex: Ekstrak embrio

Sel dapat tumbuh tanpa ekstrak embrio dan beberapa jaringan telah berhasil dikultivasi dengan sukses dalam serum

dan larutan balans. Komponen paling penting dalam ekstraks embrio terletak pada fraksi-fraksi molekul kecil dan bisa diganti secara efektif oleh suplemen sintetik yang biasanya sebagai campuran asam amino

Pembuatan Ekstrak Embrio

Ada dua macam: 1. Ekstrak embrio yang dibuat dengan kerusakan jaringan yang minim.

2. Ekstrak embrio yang melibatkan penghancuran secara total jaringan embrio sampai terbentuk homogenat.

Pembuatan Ekstrak Embrio Ayam

Cara: Embrio dari telur yang diinkubasi lebih dari 10 hari dihancurkan 2 atau 3 embrio diletakkan dalam tabung injeksi 20 ml steril, tekan dengan kuat ke dalam penampung steril

 Tambahkan larutan garam balans sampai 50 %, kemudian disentrifugasi supernatan yang dihasilkan mengandung ekstrak embrio (ekstrak embrio 50:50)

Gambar 5. Pembuatan Ekstrak Embrio ayam.

Pembuatan Ekstrak Embrio Sapi

Uterus sapi yang mengandung embrio sapi dicuci setelah kering, dilumuri iodin. cairan amnion amnion dikeluarkan. Uterus diletakkan pada nampan steril, diiris memanjang. Dinding yang diiris dilipat

keluar, embrio diambil, dipotong-potong dan dimasukkan dalam blender ditambah dengan BSS dan dihomogenkan. Ekstrak dipindahkan ke tabung sentrifugasi, supernatan yang keruh merupakan EE-50 embrio sapi.

Ekstrak embrio ultrafiltrasi

Kelompok Earle memperlihatkan bahwa ekstrak embrio yang telah diultrafiltrasi memili potensi untuk menyokong pertumbuhan yang sama seperti ekstrak embrio sendiri

Suplemen Medium
Suplemen yang paling berguna adalah:

1. Laktabumin hidrosilat (Nutritional Biochemical) yang dipakai pada konsentrasi 0,10,5% 2. Difco bactopecton 0,5% yang

dipakai untuk menggantikan komponen asam amino buatan 3. Ekstrak dehidrasi yeast 0,1% sebagai sumber vitamin dan Co-enzim

Medium yang digunakan untuk menjaga stok sel dalam laboratorium virologi mengandung 0,5% laktabumin hidrosilat, 0,5% ekstrak yeast dan 5-10% serum anak sapi atau manusia.

Suplemen lain yang bermanfaat:

Yeast 2. Aryptic meat both 3. Susu krim 4. Medium filde

1. Ekstrak

2. MEDIA BUATAN
Media kultur jaringan yang komponen penyusunnya sudah diketahui dengan pasti

Initial

studies used body fluids

Plasma, lymph, serum, tissue extracts

Early

basal media

Salts, amino acids, sugars, vitamins supplemented with serum

More

Cell specific extremely complex

defined media

Inorganic Trace

ions

Osmotic balance cell volume

Elements Acids

Co-factors for biochemical pathways (Zn, Cu)

Amino

Protein synthesis Glutamine required at high concentrations

Vitamins

Metabolic co-enzymes for cell replication

Energy

sources

glucose

Basic

nutrients and growth factors and spreading factors

Hormones

Attachment Binding

proteins (albumin, transferring) carrying hormones, vitamins, minerals, lipids inhibitors buffer

Protease pH

Freshney.(1992) Animal Cell Culture.

Media diklasifikasikan menjadi 4 kelompok : 1. Esensial untuk pertumbuhan sesaat 2. Esensial untuk memperpanjang keberhasilan tumbuh 3. Esensial untuk pertumbuhan yang tidak terbatas 4. Esensial untuk fungsi fungsi spesial

Pertimbangan dalam pemilihan bahan media

1. Kelarutan bahan : Beberapa bahan kimia yang dipakai di dalam media sintetik harus sebagai sumber yang sangat mudah larut & sangat penting untuk menyiapkan

menjadi bahan yang mudah larut. 2. Kesesuaian komponen : Di dalam mengkombinasikan bahan-bahan tertentu, harus diingat bahwa material yang digunakan kemungkinan saling bereaksi sehingga menghasilkan substansi yang sangat berbeda

3. Kemurnian bahan :

Beberapa komponen yang langka dari beberapa media hanya mungkin dijumpai dalam keadaan murni sekitar 85 % 4. Ketidakstabilan kimiawi : Berbagai komponen yang ditambahakan ke dalam media sintetik kadang tidak stabil sehingga pemyimpanan perlu mendapat perhatian 5. Larutan stok : Kemungkinan penyimpanan media dalam jumlah besar & dalam waktu yang lama dapat diatasi dengan membuat media

menjadi serangkaian stok, yang nantinya dapat dikombinasikan untuk membuat medium yang komplit pada saat diperlukan

Larutan Garam Balans (Balance Salt Solution = BSS)

Seluruh media yang digunakan di dalam kultur jaringan berbasis pada suatu campuran sintetik garam garam anorganik yang disebut larutan garam fisiologik atau larutan garam balans (BSS) Fungsi : a. Menjaga pH b. Menjaga tekanan osmotik di dalam medium c. Menyediakan konsentrasi yang mencukupi ion ion

anorganik esensial Larutan garam fisiologik dibagi menjadi 2 tipe : 1. Larutan garam yang diperuntukkan berekuilibrasi dengan udara 2. Larutan garam yang diperuntukkan berekuilibrasi dengan fase gas yg mengandung tekanan karbon dioksida (C02) tinggi (sekitar 5 %)

Penyiapan Larutan Garam Balans

Kesulitan utama : pencegahan timbulnya endapan kalsium magnesium karbonat dan posfat

Basal

cell culture media: Cell Culture Media:

BME, DMEM, MEM, E199 and Fischer's media

Improved The

199 (HB), DMEM (HED) and MEM (HBS)

Balance Salt Solution: Natural Media:

199 Earle's , Hanks and Dulbeco's

Substituted Serum Low

SUB-1, SUB-2 and SUB-H

Free Media:

199 SAF CHO and SAF NSO

serum Culture Media:

SXQ-1, 199 SLM, 199 SLM-BR and MEM SLM (HB),

DMEM (HED) and MEM (HBS)