n tt nghip

Trng Th Thu Hin

LI CM N
hon thnh c lun vn tt nghip ny, trc ht em xin by t lng bit n chn thnh v su sc n PGS.TS Nguyn Th Xun Sm, TS. L Quang Ha ngi tn tnh ging dy v hng dn em trong sut qu trnh hc tp v nghin cu hon thnh bn lun vn ny. Em cng xin by t lng bit n n ton b cn b Vin CNSH v CNTP trng HBK HN gip v hng dn em tn tnh trong qu trnh nghin cu ti phng th nghim :cng ngh Protein enzyme v k thut gen. Qua y, em cng xin chn thnh cm n n gia nh, bn b v nhng ngi thn ng vin, gip v to iu kin cho em hon thnh bn lun vn ny. H Ni, ngy 28 thng 5 nm 2007 Sinh vin Trng Th Thu Hin

Trang 1

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

MT S T VIT TT Ch vit tt: VSV UHT(Ultra heat treatment) PCR(Polymerase Chain Reaction) dNTP DNA EDTA TE CFU( colony forming units) Ngha tng ng: Vi sinh vt X l tit trng sa Phn ng chui trng hp Deoxynucleotide-triphosphate Deoxyribonucleic acid Ethylendiamin etetraacetic acid TRIS-EDTA n v hnh thnh khun lc

Trang 2

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

DANH MC CC BNG V HNH V

Bng 1. Tiu chun vi sinh vt cho mt s sn phm sa Bng 2. Kt qu ly tm vi E.Coli Bng 3. Kt qu ly tm vi Bacillus Bng 4. Kt qu la chn mi trng tng sinh Bng 5. Kt qu la chn thi gian tng sinh vi E.coli. Bng 6. Kt qu la chn thi gian tng sinh vi Bacillus. Hnh 1 Hnh thi Escherichia coli Hnh 2. Hnh thi Bacillus cereus. Hnh 3. S mt s phng php ca k thut Real Time PCR Hnh 4. th chun ha ca phn ng Real-time PCR Hnh 5. Quy trnh pht hin Bacillus v E.coli trn sa tit trng khng ng mt nhim ban u 1CFU/1ml Hnh 6. Quy trnh pht hin Bacillus trn sa tit trng khng ng mt nhim ban u 1CFU/25ml Hnh 7. ng quan h tuyn tnh gia gi tr mt quang v mt t bo ca Bacillus Hnh 8. ng quan h tuyn tnh gia gi tr mt quang v mt t bo ca E.coli Hnh 9. Kt qu la chn thi gian ly tm thch hp thu sinh khi t bo vi sinh vt.

Trang 3

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

M U Sn lng sa v nhu cu tiu th sa trn th trng Vit Nam ang tng mt cch ng k, trong 10 nm qua mc tiu th l 15 ln. c tnh n nm 2010, nhu cu v cc sn phm sa nc ta s gia tng khong 10-15% mi nm t mc khong 10kg/u ngi /nm. Vn l mt thc phm b dng, sa cng l mi trng thch hp cho cc vi sinh vt gy bnh. Do vy, cng tc kim tra, v m bo v sinh cho sn phm sa l mi quan tm hng u ca cc nh sn xut sa v ngi tiu dng. Tuy nhin vi cc phng php phn tch hin nay, mt s hin tng nhim tp vi sinh vt gy bnh thng c pht hin mun, kt qu l cc bin php x l k thut t c hiu qu v nh hng nhiu n qu trnh sn xut Vic xc nh cc vi sinh vt c kh nng nhim tp trong cc sn phm sa bng cc phng php truyn thng thng t chnh xc, nhy khng cao v thi gian di. Cc kt qu phn tch hu nh khng c tnh ngn nga ch l cn c gii quyt hu qu ca s nhim tp. S chm tr ca phng php ny s lm tn tht ln cho cc nh my khi c s c nhim VSV ti Hon thin quy trnh pht hin nhanh Bacillus cereus v Escherichia coli, trong sa tit trng vi s h tr ca k thut Real Time PCR c la chn cng nhm gp phn gim bt nhng hn ch trn ca vic pht hin nhng vi sinh vt nhim tp. t mc tiu trn, ni dung nghin cu ca ti gm cc phn sau: La chon thi gian ly tm thu sinh khi t bo vi sinh vt La chn mt mi trng tng sinh cho vi sinh vt. La chn thi gian tng sinh thch hp cho vi sinh vt ng dng k thut Real time PCR pht hin nhanh cc vi sinh vt B.cereus v E.Coli
Trang 4

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

PHN I: TNG QUAN

I. Hin trng ngnh cng nghip sa Vit nam: Ngnh cng nghip Sa Vit Nam l mt ngnh cng nghip c nhiu trin vng v hin gi cc nh sn xut trong nc mi ch p ng c 11% nhu cu tiu th. Nhu cu sa trn th trng cng tng khng ngng, nm 1990 tnh bnh qun trn u ngi mi ch mc 0,47kg/nm, n nm 2000 con s ny tng n 6,5 kg/nm v n nm 2005 t ti 9kg/ nm. Cng vi s gia tng v nhu cu tiu th th sn lng sn xut sa tng ln ng k. Theo s liu thng k nm 2000, sn lng sa trong nc t 54.000 tn, nm 2003 tng hn gp hai ln(112000 tn) v n nm 2004 con s ny tng ln thnh xp x 198000 tn. Sn lng sa c d bo cn tng nhanh hn na trong giai on ti. mc d c su tng trng tt v sn lng tiu th v sn xut nhng ngnh sa Vit Nam vn cn rt nhiu vn cn gii quyt trong bn thn cc nh my cng nh c ch qun l sao cho m bo cht lng sn phm v quyn li ngi tiu dng. Hin nay, c nhiu chng trnh chn nui b sa cc vng min tuy nhin vn cha em li li nhun kinh t ng k v nhng nguyn nhn nh mc u t cha ln, k thut cha p ng v qun l cha hiu qu.Chnh v nguyn nhn trn m ngnh chn nui b sa cn vp phi vng lun qun l ngun thu t bn sa ti cha u t c s vt cht k thut tt. II. Cc vi sinh vt nhim tp trong qu trnh ch bin sa 1. Cc nhm vi sinh vt thng gp

Trang 5

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

Trong sa lun cha mt lng vi sinh vt nht nh ngay c khi sa c thu hoch trong iu kin v sinh tt. H vi sinh vt trong sa cng rt a dng bao gm nm men, mn mc, vi khun v x khun. Trong cc i tng trn th vi khun c quan tm hn c v trong sa chng thng pht trin vt tri hn. Vi khun trong sa hay gp nht l nhm vi khun lactic nh Streptococcus lactic, S.diaxetylactic, S. Paracitrovous, Lactobacillus bulgaricum, L.acidophilum, L. Lactic, L.helveticum. [4] Nhm vi khun ny dng vai tr quan trng trong sn xut cc sn phm ln men t sa nh sa chua, phomt. Tuy nhin nu chng c xut hin trong cc sn phm sa ti tit trng hoc sa ti thanh trng th s l tc nhn lm hng sn phm di dng to kt t protein. Da vo kh nng chu nhit ngi ta chia cc vi sinh vt thng nhim trong sa thnh cc nhm chnh sau: 1.1 Vi sinh vt chu lnh (Psychrotrophs) L nhng vi sinh vt c kh nng pht trin c nhit di 7 oC. Trong cng ngh sn xut sa nhm vi sinh vt chu lnh hay gp trong mu sa hng l nhm trc khun Gram (-), thng c xc nh thuc loi Pseudomonas. hu ht nhng vi sinh vt chu lnh ny s nhanh chng lm hng sa khi c bo qun khong nhit t 0 n 10 oC. Tuy nhin n li b tiu dit d dng trong cc qu trinh gia nhit v vy sn phm qua gia nhit th thng hay b ti nhim sau gia nhit do iu kin v sinh khng m bo. 1.2 Vi sinh vt a m (Meso philic)

Trang 6

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

Nhng vi khun a m quan trng nht l Streptococci, Lactobacilli v Coliforms, nhng vi khun ny sn sinh axit, sinh kh v lm mt mi sa. Tuy nhin chng li d dng b tiu dit trong qu trnh gia nhit Pasteur. 1.3 Vi sinh vt chu nhit (Thermoduric) L nhm c th khng b tiu dit trong qu trnh gia nhit pasteur hoc cc x l nhit khc. Tuy nhin nhm ny khng pht trin nhit gia nhit Pasteur. Ging chu nhit hay gp nht l Mcrobacterium, Corynebacterrium, Micrococos, Streptococcus v Bacillus 1.4 Nhm a nhit (Thermophilic) L nhm vi khun pht trin tt trong iu kin nhit x l Pasteur. Loi a nhit thng thy nht trong 2 nhm Bacillus v Clostridium. 1.5 Nhm a nhit c th pht trin trong iu kin lnh (Thermoduric Psychrotrophs) l mt s t cc vi sinh vt chu nhit hoc to bo t chu nhit nn vn c th sng st sau khi gia nhit nhng chng cng c kh nng pht trin c trong iu kin lnh. Nhm ny thng pht trin chm sau gy hng sn phm trong qu trnh lu thng sn phm. thng hay gp nht trong nhm ny l Bacillus.[16] 2.Tng quan v Bacillus v E.coli E.coli v Bacillus l hai vi sinh vt gy bnh thng gp v pht trin tt trong mi trng sa, ngoi ra Bacillus cn l vi sinh vt d rng sinh bo t v bo t rt d ny mm v th gy kh khn trong qu trnh bo qun. 2.1 Escherichia coli

Trang 7

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

E.coli l vi sinh vt hiu kh tu hin din trong ng rut ca ngi v cc loi ng vt mu nng. Hu ht cc dng E.coli khng gy hi v ng vai tr quan trng trong vic n nh sinh l ng rut. Tuy nhin c 4 dng c th gy bnh cho ngi v mt s loi ng vt l Enteropathogenic E.coli (EPEC), Enterotoxigenic E.coli (ETEC), Enteroinvasive E.coli (EIEC) v Enterohaemorrhagic E.coli (EHEC) hay E.coli O157:H7.[2]

Hnh 1 Hnh thi Escherichia coli Cc loi E.coli hin din rng ri trong mi trng b nhim hay phn cht thi hu c, pht trin v tn ti rt lu trong mi trng. Gn y ngi ta cn chng minh c rng E.coli cng hin din trong nhng vng nc m, khng b nhim cht hu c. Do s phn b rng ri trong t nhin nn E.coli d dng nhim vo thc phm t nguyn liu hay thng qua ngun nc trong qu trnh sn xut, ch bin. Cc dng E.coli gy bnh gy ra cc triu chng
Trang 8

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

ri lan ng tiu ho. Cc triu chng lm sng thay i t nh n rt nng, c th gy cht ngi ph thuc vo mc nhim, dng gy nhim v kh nng p ng ca tng ngi. 2.2 Bacillus cereus Bacillus cereus l trc khun Gram dng, sinh bo t, k kh tu tin, tng trng c trong khong nhit 5-50oC, ti u 35-40oC, pH dao ng t 4,5-9,3, d to bo t v bo tu ny mm rt d dng. Vi khun ny hin din trong t, bi, cc loi thc phm (Sa, tht, rau qu, cc loi sn phm kh...)[2]

Trang 9

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

Hnh 2 Hnh thi Bacillus cereus Vi khun ny sinh ra hai loi c t chnh l diarrhoeal toxin gy tiu chy v emetic toxin gy nn ma. Ng c thc phm gy ra bi B.cereus khi thc phm c chun b m khng c gi trong iu kin lnh trong vi gi trc khi s dng. Thc phm cha vi khun mt 10 6 t bo/g gy ng c. Triu chng ng c gy ra bi B.cereus ch yu l au bng, tiu chy, khng st, bt u 4 n 16 gi sau khi n thc phm b nhim v ko di trong 12-24 gi. Mt dng triu chng ng c khc l bun nn v nn sau 1-5 gi n phi thc phm nhim khun, khng b tiu chy, ko di khong 24 gi III. Tiu chun vi sinh vt cho mt s sn phm sa Gii hn ti a v vi sinh vt cho php c mt trong cc sn phm sa khc nhau l khc nhau. Trong cng mt sn phm nhng mi quc gia khc nhau th gii hn ny cng khc nhau Tiu chun Vit Nam Hin nay Vit Nam ang p dng tiu chun v gii hn vi sinh vt trong cc sn phm sa theo quyt nh s 3742/2001/Q-BYT ngy 31 thng 08 nm 2001 ca B trng B Y t (Bng 1)[8]

Nhm sa a. Sa kh, sa bt ....

TSVKHK Coliforms E.coli

Trang 10

5.104 10 0

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

S.Aureus Salmonella*

0 0 5.104 10 3 0 10 0 0 0 0 104 10 0 0

b. Sa ti tit trng theo phng php Pasteur.

TSVKHK Coliforms E.coli Salmonella* TSVKHK Coliforms E.coli S.Aureus Salmonella*

c. Sa ti tit trng theo phng php U.H.T.

d. Sn phm ch bin ca sa : b, sa chua, pho- TSVKHK mat, ...( - dng trc tip, khng qua x l nhit trc Coliforms E.coli khi s dng ). S.Aureus Salmonella*

0 (*) Salmonella : Khng c c trong 25g thc phm Bng 1 Tiu chun vi sinh vt cho mt s sn phm sa

IV. Cc phng php pht hin vi sinh vt trong mu thc phm kim sot vi sinh vt th c nhiu phng php khc nhau. Da vo thi gian cho kt qu, ngi ta c th chia thnh hai nhm phng php chnh l phng php truyn thng v phng php phn tch nhanh.
Trang 11

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

1. Cc phng php truyn thng Nhm cc phng php ny da trn c im pht trin ca vi sinh vt trn cc mi trng c trng v c im sinh l, sinh ho ca cc chng, cc loi vi sinh vt khc nhau. u im ca phng php ny l thao tc n gin, d lm, khng phi u t dng c, thit b t tin. Tuy nhin vi nhm phng php ny cn mt s hn ch nh nhy khng cao, tn nhiu nhn cng v thi gian phn tch thng ko di do hn ch trong cng tc phng nga.

2. Cc phng php phn tch nhanh Theo nguyn l ca cc phng php phn tch vi sinh vt c th chia phng php ny thnh hai nhm nh: nhm da trn nguyn tc ca s kt hp c hiu gia khng nguyn- khng th (phng php min dch) v nhm da trn s bt cp b sung cc nucleotit 2.1. Phng php min dch Nhm cc phng php ny da trn phn ng ca khng th c hiu vi khng nguyn b mt ca t bo vi sinh vt. Da trn nguyn tc ny c rt nhiu k thut pht trin thnh phng php pht hin nhanh vi sinh vt. K thut ELISA, khi trong mu xut hin vi sinh vt mc tiu s xy ra phn ng khng nguyn khng th v phn ng ny s c pht hin nh mt khng th cng hp gn enzym th hai lm bin mu c cht. Ngng pht hin ca k thut ny giao ng t 10 4106 cfu/ml, do vy trong phn tch pht hin vi sinh vt thng phi qua giai on tng sinh. Tuy nhin, gi y ngi ta c th

Trang 12

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

s dng bi t c gn khng th c hiu thu nhn trc tip vi sinh vt mc tiu vi mt slng ln m khng cn giai on tng sinh. K thut latex agglutination (LA), s dng cc ht cao su c mu c nh khng th c hiu nh tnh nhanh cc chng vi khun c phn lp. Khi c mt khng nguyn tng ng, qu trnh kt t (agglutination) s din ra v c th quan st trc tip bng mt thng (to ra ht hoc di c mu). K thut ny c th s dng xc nh nhanh vi sinh vt nhim tp trong mi trng thun sau khi phn lp t thc phm. 2.2. K thut lai phn t( DNA- hybridization): K thut ny c th s dng u d vi on rARN ch do vy c tnh chnh xc v nhy cao. y l k thut cho php pht hin s c mt ca nhiu loi vi sinh vt mt lc vi thi gian nhanh. Tuy nhin k thut cng phc tp v phi tn cng thit k cc mu d v s dng vt liu phng x. 2.3. K thut PCR V l thuyt k thut ny c th nhn mt on ADN ch ln hng triu bn ch trong khong hn mt gi v vy gim c rt nhiu hoc khng cn thi gian tng sinh cng c th xc nh c s c mt ca vi sinh vt ch. Tuy nhin s c mt ca cc cht c ch trong thc phm hoc trong mi trng tng sinh cng c th c ch s bt cp ca mi v lm gim kh nng khuych i on ADN ch..K thut ny cho php pht hin c nhiu loi vi sinh vt vi thi gian tng i nhanh v nhy kh cao. Phng php ny c th p dng trong cc nh my trong cng tc phng nga v pht hin. 2.4. K thut Microarray, Macroarray:
Trang 13

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

K thut ny thc cht l da trn k thut lai phn t, trn cc phin knh hoc cc mng cellulose c gn hang chc nghn mu do AND theo mt trnh t xc nh. Nh vo phn ng lai, bt cp ca AND c trnh t tng ng m s c mt ca mt oan gen ca mt vi sinh vt ch no c th c pht hin v s copy c th xc nh chnh xc. Vi k thut ny c th xc nh c nhiu gen ch ( vi sinh vt) trong cng mt thi im vi mc chnh xc cao v thi gian nhanh v chnh xc

3. Phng php pht hin vi sinh vt bng k thut Real Time PCR Nguyn tc K thut Real Time PCR hay cn gi l PCR ng v c bn da trn nguyn tc ca k thut PCR. Tuy nhin n cho php hin th v theo di trc tip qa trnh nhn bn DNA ang din ra theo tng chu trnh nhit qua s dng k thut pht hunh quang. Da vo pht hunh quang ta c th nh lng cc on DAN hnh thnh Do mi c tnh pht quang cho nn c th nh du chng vi cc cht nhum khc nhau, nh th c th nhn cc on khc nhau trong cng mt phn ng PCR. Tuy nhin phng php ny c hn ch l phi tng hp cc mu d khc nhau cho cc trnh t nhn bit khc nhau.[10]

Cc phng php nh lng bng Real time PCR Phng php s dng cht nhum mu SYBR Green: Cht nhum mu ny c gn vi rnh nh ca chui DNA kp, khi c gn vi si DNA kp th cng pht hunh quang tng ln, khi bn sao to ra cng nhiu th tn hiu pht ra ca cht mu s tng ln
Trang 14

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

theo t l thun. u im ca phng php ny l SYBR s nh vo bt c chui DNA kp no c mt. Phng php u d thu phn TaqMan: K thut ny s dng cc u d c th pht hunh quang, cc mu d l mt oligonucleotit trong mt u c gn vi cht nhum mu c pht hunh quang, u kia c gn vi cht nhum c vai tr lm tt s pht hunh quang. Khi c mt on DNA cn nhn, mu d s gn vo DNA khun vng di ca mi theo hng 5. trng thi ny khng c hin tng pht hunh quang. Khi bt u tin hnh quy trnh PCR vi s hot ng ca enzyme taq-polymerase mi c ko di cho ti khi gp mu d th mu d s b phn gii bi hot tnh 5 nuclease ca taq-DNA polymerase.S phn gii mu d s lm gii phng cht nhum mu c kh ng pht hunh quang khi nh hng km hm ca cht nhum c vai tr lm tt s pht hunh quang. S pht hunh quang ny c th nhn bit c. Phng php u d lai Trong k thut ny mt u d c gn vi mt cht cho hunh quang u 3 v mt u d th hai gn vi mt cht nhum hunh quang. Khi hai u d ny tin li gn nhau, cch nhau khong 1-5 nucleotide, cht pht quang pht ra t cht cho hunh quang s kch thch cht nhn hunh quang v kt qu l pht ra tn hiu hunh quang.

Trang 15

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

Hnh 3 S mt s phng php ca k thut Real Time PCR u im K thut ny khc phc c nhng nhc im ca PCR nh sau: -Khng cn chy in di kim tra kt qu PCR -C th nh lng chnh xc sn phm PCR, trong khi s dng PCR thng thng vic phn bit da trn ln ca vch thu c sau in di - c hiu v nhy cao hn, thi gian tin hnh phn ng ngn -C th tin hnh vi nhiu on DNA cng lc trong cng mt ng nghim nn gim kh nng nhim mu

Trang 16

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

PHN II: VT LIU V PHNG PHP NGHIN CU

I. Vt liu v thit b 1. Chng vi sinh vt STT 1 2 Chng chun Bacillus cereus Escherichia coli Ngun gc ATCC 10876 ATCC 25923

2. Mu sa th nghim -Mu sa ti tit trng khng c vi sinh vt ca Vinamilk.

3. Ho cht -Ha cht dng tch chit DNA tng s v ha cht real time PCR c cung cp bi Amersham Pharmacia Biotech. -Cc ha cht phn tch DNA do Invitrogen v Applied Biosystem cung cp -Ha cht mi trng nui cy do Merck v Difco cung cp

4.Mi trng Cc mi trng s dng trong ti gm c Mi trng Violet Red Bile Agar (VRBA): Dng nui E.coli Mi trng Mannitol-Egg Yolk-polymyxin(MYP) agar (g/l):Dng nui Bacillus Mi trng LB(g/l) dng trong tng sinh vi khun Trypticase soy broth yeast extract (TSBYE)
Trang 17

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

Letheen Broth Fluid Thioglycollate Medium Nutrient Broth Terrific Broth II. Phng php nghin cu

1. Xy dng ng quan h tuyn tnh gia gi tr mt quang v mt t bo ca E.coli v Bacillus c th thu c mu sa vi cc mt vi sinh vt nht nh cn phi tin hnh nhim ch ng vi sinh vt mong mun vo mu sa tit trng khng c vi sinh vt mt mong mun ph hp vi yu cu th nghim. Nh vy cn phi xy dng ng quan h tuyn tnh gia gi tr mt quang v mt t bo ca E.coli v Bacillus, nhm xc nh c mt vi sinh vt ca mt dung dch cha vi sinh vt thng qua mt quang. 1.1. Nguyn tc: Khi pht trin trong mi trng lng mt t bo thay i theo thi gian. Kh nng hp th nh sng ca canh trng ph thuc vo mt t bo trong dch nui cy. Ta s tin hnh xy dng ng quan h tuyn tnh gia gi tr mt quang v mt t bo 1.2. Cch tin hnh: -Cho 100l chng chun vo trong 10ml mi trng tng sinh TSBYE, nui lc vi vn tc lc 200 vng/pht 37oC

Trang 18

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

-Sau cc khong thi gian 2 gi, 4 gi, 6 gi, 8 gi, 10 gi, 12 gi, 14 gi tng sinh, em mu i o gi tr mt quang so vi mi trng TSBYE bc sng 600nm - Pha long dung dch ti cc thi im tng sinh, tri 100l dung dch trn mi trng c hiu. -m khun lc v xc nh mt t bo (N/ml) ca cc dung dch ti cc thi im khc nhau. -Tnh cc gi tr Log (N/ml) cho mi gi tr mt N/ml tng ng vi mi c. V ng biu din ca Log (N/ml) theo OD 600nm. Xc nh khong tuyn tnh gia log (N/ml) v OD.

2. La chn thi gian ly tm thch hp thu cn t bo trong qu trnh ly tm Vi mt vi sinh vt ban u rt thp ca mu th nghim, ta cn tin hnh ly tm c c mu v thu li sinh khi t bo. Tuy nhin, vi mt thp nh th, nu mang ly tm 50 ml mu ch c th thu c ti a 4 CFU, nh vy xy dng mt ch ly tm ph hp l mt vic rt quan trng. 2.1.Nguyn tc cng mt vn tc ly tm, thi gian ly tm cng ln th t bo sng thu c trong cn t bo cng tng, ng thi t l t bo cht trong qu trnh ly tm cng tng ln. Nn nu la chn thi gian tng sinh qu cao s lm t l vi sinh vt cht trong qu trnh ly tm tng ln, tuy nhin nu thi gian ly tm thp s khng thu ht cn t bo sng t mu sa th nghim. V vy, phn ny nhm nghin cu thi gian tng sinh ph hp nht cho c hai vi sinh vt la chn nhm thu c t l cao nht t bo vi sinh vt sng t mu th nghim c mt

Trang 19

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

vi sinh vt ban u rt thp 1CFU/25ml.Ta s tin hnh xc nh ch ly tm thch hp (c nh lc ly tm, thay i thi gian ly tm) thu t bo trc bc tng sinh. 2.2. Cch tin hnh: Vi mt thi gian ly tm nht nh, tin hnh cc bc sau: Tng sinh 100l chng chun trong 10ml mi trng TSBYE nui lc vn tc lc 200rpm trong 3-4h 37oC. o OD, da vo ng cong sinh trng ca hai vi sinh vt xy dng c xc nh pha long cn thit c th tin hnh nhim ch ng. Nhim ch ng vi nng 300 CFU/ml vo 50ml sa trong ng falcon 50ml ( Vi nng ny khi tri 100l trn a thch c hiu th s d dng m s khun lc xc nh mt vi sinh vt) + Thc hin ng thi trong 6 ng falcon. m bo nng vi sinh vt trong c 6 ng falcon l nh nhau hay qu trnh nhim ch ng c chnh xc ta tin hnh nhim ch ng 105CFU vo 300 ml sa (tng ng vi 300CFU/50ml), chia u vo 6 ng falcon 50ml (lc u trc mi ln rt t bnh Scort vo ng falcon). Ly tm 3 ng cc ch ly tm 6000 rpm, trong 3 pht, 6 pht, 9 pht, 12 pht. 3 ng cn li c dng lm kim chng. + dch ni sang ng falcon sch. Chuyn cc ng falcon vo gi lnh trong thng hn ch s pht trin ca cc vi sinh vt. + Ho tan phn kt ta sau ly tm trong 10ml m. Xc nh mt t bo trong dch kim chng, dch ho tan kt ta v trong dch ni sau ly tm:
Trang 20

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

+i vi dch ni: tri 100l dch ni trn a Petri c cha mi trng c hiu. + dch kim chng v dch ho tan kt ta sau ly tm: tri 100l dch v dch pha long 10 ln(pha long bng m photphat,pH=7.25, thanh trng) ln a Petri cha mi trng c hiu. Nui 37oC trong 24h sau m khun lc. 2.3. nh gi kt qu Sau khi xc nh c mt t bo trong dch kim chng, dch ho tan kt ta v trong dch ni sau ly tm. Ta tin hnh xc nh t l t bo sng cn li trong dch ni v t l t bo sng thu c trong phn kt ta sau ly tm. T nh gi hiu qu ly tm cc thi gian ly tm khc nhau. La chn khong thi gian ly tm thch hp nht thu c t l t bo sng trong cn t bo sau khi ly tm l ln nht. 3. La chn mi trng tng sinh thch hp cho c 2 vi sinh vt. Cc mi trng dng trong th nghim: TSBYE Letheen Broth Fluid Thioglycollate Medium Nutrient Broth Terrific Broth Milk ( sa ti tit trng vinamilk) Vi cc mi trng trn, tin hnh cc bc th nghim nh sau: Tng sinh 100l chng chun trong 10ml TSBYE trong 3-4h nui lc vi vn tc lc 200rpm. nhit 37oC

Trang 21

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

o OD v da vo ng cong sinh trng xy dng xc nh mt t bo v pha long thch hp. Nhim mu ch ng cc mu sa tit trng khng c vi sinh vt cc vi sinh vt B.cereu E.Coli sao cho mt vi sinh vt t 10CFU/ml (Thc hin ng thi trong 6 ng : nhim khong 3.103 CFU vo 300ml sa ri chia u vo 6 ng( lc u trc khi rt)) Ly tm ch ly tm thch hp xc nh trn.(gi lnh mu nu cn thit). dch ni. Cho vo mi ng 10 ml mt loi mi trng trn. Lc u cho tan kt ta mang nui 37oC, lc 200rpm, trong 4h. Tri 100l dch pha long trn a Petri c mi trng c hiu. Mi nng tri trn 3 a. Nui 37oC trong 24h.. nh gi kt qu: -m s lng khun lc t cc a peptri. So snh v nh gi hiu qu tng sinh gia cc mi trng chn. -La chn ra mt mi trng tng sinh thch hp nht cho tt c cc vi sinh vt la chn. 4. La chn thi gian tng sinh thch hp: 4.1. Mc ch: Xc nh c thi gian tng sinh ti thiu thu c mt vi sinh vt thc hin phn ng Real time PCR t mt vi sinh vt ban u l 1CFU/25ml 4.2. Cch tin hnh: Tng sinh 100l chng chun trong 10ml TSBYE trong 3-4h nui lc vi vn tc lc 200rpm. nhit 37oC
Trang 22

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

o OD v da vo ng cong sinh trng xy dng xc nh mt t bo v pha long thch hp. Nhim mu ch ng cc mu sa tit trng khng c vi sinh vt cc vi sinh vt B.cereu, E.Coli sao cho mt vi sinh vt t 1CFU/25ml (Thc hin ng thi trong 3 ng 3 nng 1 CFU/25ml, 1/3 CFU/25ml v 3CFU/25ml m bo chc chc thu oc gi tr 1 CFU/25ml). Tri trn da peptri kim tra li nng vi sinh vt nhim vo. Ly tm ch ly tm thch hp xc nh trn.(gi lnh mu nu cn thit). dch ni. Cho vo mi ng 10 ml mt loi mi trng trn. Lc u cho tan kt ta mang nui 37oC, lc 200rpm, trong 3 gi ,4gi, 5 gi. Tri 100l dch pha long trn a Petri c mi trng c hiu. Mi nng tri trn 3 a. Nui 37oC trong 24h.. 4.3 nh gi kt qu -m s lng khun lc t cc a peptri. Xc nh ng c nng nhim ng 1 CFU/25ml -Xc nh mt vi sinh vt thu c sau khi tng sinh 3 gi, 4 gi, 5 gi -Da vo nhy ca phn ng Real time PCR xc nh khong thi gian tng sinh ti thiu c th pht hin s nhim tp ca vi sinh vt 5. Tch chit DNA tng s 5.1. Nguyn tc Thnh t bo vi khun c ph v bng nhit cao, sau ly tm loi xc t bo. 5.2. Tin hnh

Trang 23

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

-Sau khi nui cy cc VSV la chn trong mi trng, pha long dch nui cy n cc nng khc nhau, nhim ch ng vo 10 ml sa. -Chuyn 1ml dch nui cy trong sa sang ng eppendorf, thm 0,3ml EDTA 0,25M ly tm 13000vng/pht trong 5 pht thu cn t bo -Ra cn t bo hai ln bng nc ct, ly tm 13000 vng/pht, dch ni -Thm 100l nc kh ion. -Tch chit DNA 99oC trong 15 pht -X l dch thu c thu DNA tng s phn dch trong vo mt eppendorf mi -Gi -20oC cho phn ng Real Time PCR

6. Phn tch DNA bng in di trn gel agarose. 6.1. Nguyn tc: Cc axit nucleic (DNA, RNA) do cha gc phosphate trong phn t nn pH kim hay trung tnh chng s l nhng poly anion tch in rt m Trong din trng chng s chuyn ng v pha cc dng khng ph thuc vo in tch ca phn t DNA, m ph thuc vo kch thc phn t DNA v tnh cht ca gel agaroza. Sau in di DNA c th c pht hin v phn tch bng cch nhum gel bi ethium bromide. Ethium bromide l cht c kh nng lin kt c hiu vi DNA v cht hunh quang khi b kch thch bi nh sng t ngoi. 6.2. Tin hnh: Cho agaroza vo dung dch 1X m TAE c nng 1%. Dng l vi sng un n khi agaroza nng chy. ngui bt ri dch vo khay ng thch.

Trang 24

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

Pha long m 10X m TAE thnh 1X TAE Trn mu DNA cn in di vi m chm mu. Tra mu vo ging Cm dy ni bnh in di vo ngun mt chiu 100 V c nh. Ch thuc nhum xanh trong mu chy n vch cui cng. Nhum bn gel vo dung dch ethium bromide 0.5l/ml trong vng 15 pht, nhc khay thch ng mu v agaroza ln ging nilo soi ln my soi gel v quan st

7. K thut Real time PCR 7.1. Nguyn tc: K thut Real Time PCR cho php hin th v theo di trc tip qu trnh nhn bn DNA ang din ra theo tng chu k nhit qua s dng k thut pht hunh quang. Da vo cng pht hunh quang m c th nh lng c cc on DNA hnh thnh. C 3 k thut c s dng cho real time PCR: SYBR Green, TaqMan (phng php 5 nuclease), u d lai. Trong phng php nhum mu SYBR Green l phng php n gin v kinh t hn c cho php pht hin v nh lng sn phm PCR trong phn ng Real time. SYBR Green gn vi rnh nh ca chui DNA mch kp. Do vy, khi sn phm PCR c tch ly, cng pht hunh quang s tng ln . - u im ca phng php SYBR Green: r tin, d s dng, nhy. - Nhc im: do SYBR Green lin kt vi bt k mt DNA mch kp no trong phn ng, bao gm c primer- dimers v nhng sn phm khng c hiu khc, dn ti kt qu cao hn so vi nng ch.

Trang 25

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

Trong ti ny em tin hnh pht hin ng thi s c mt ca E.coli v Bacillus nhim tp trong sa tit trng v vy s dng tc nhn gn ln DNA SBYR Green. Cht nhum mu ny c gn vi rnh nh ca chui DNA kp, khi c gn vi si DAN kp th cng pht hunh quang tng ln, khi bn sao to ra cng nhiu th tn hiu pht ra ca cht mu s tng ln theo t l thun.. 7.2. Tin hnh: La chn cc cp mi. Cc cp mi c s dng y c la chn da trn nguyn tc c thit k v nghin cu tnh c hiu, tnh bao trm vi kt qu tng i c th chp nhn c t cc tc gi i trc trong lnh vc ny Thc hin phn ng Real- time PCR vi cc thnh phn cho mt phn ng l 50l nh sau: - Buffer: - Mg2+ : - dNTP : - Primer: - Taq -DNA: : 5l 5l 2l 0.5l 3l (5U/l) 5l

- DMSO/SYBR Green: 2.5l - H2O cho ti 50l 7.3 nh gi kt qu

Trang 26

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

Hnh 4. th chun ha ca phn ng Real-time PCR

Cp: Cross point: L s liu thng k s gia tng ng k ca R c pht hin u tin. Cp cng nh th gen biu hin cng mnh. R: hiu s so snh gia kt qu phn ng PCR c mu vi kt qu phn ng PCR khng mu hoc trong nhng chu k u tin da trn cng pht hunh quang ca SYBR Green [5]. Cp: l ch s hiu chnh chun ha Chn mu c Cp ca nh nht lm chun, t tnh lch theo chun i vi cc mu s suy ra Cp ca tng mu. Tnh ton Cp ca cc gen sau phi tr i lch chun. 8. Kim tra nhy ca phn ng Real time PCR Nguyn tc
Trang 27

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

kim tra nhy ca phn ng Real time PCR ta tin hnh xc nh nng thp nht cc vi sinh vt la chn cho ta kt qu ca phn ng Real Tima PCR r nt. Th nghim tin hnh nh sau: -Pha long dch nui cy c cc nng khc nhau -X l xc nhit cho huyn ph tch chit DNA nh trn lm khun cho phn ng Real Time RCR - Tin hnh phn ng Real time PCR theo ng quy trnh xy dng vi cc mu c nng khc nhau nh trn. - Xc nh nng nh nht cc vi sinh vt la chn cho kt qu phn ng Real time PCR r nt.

Trang 28

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

PHN III: KT QU V THO LUN

I. xut phng n hon thin quy trnh pht hin B.cereus v E.coli trong sa tit trng 1. Quy trnh c xy dng T ti liu tham kho, em nhn thy nhng ngi i trc nghin cu v a ra quy trnh pht hin nhanh E.coli v Bacillus nhim tp trong sa ti tit trng nh sau [4]: mt nhim ch ng 1 CFU/1ml

Ly 40ml sa 4ml EDTA 0,25M Ly tm 9000 vng/pht trong 10 pht

Thu cn t bo 10ml m phosphat pH 7,2 Ly tm 9000 vng/pht, 5pht

Thu cn t bo 10ml TSBYE

Tng sinh 4h (3h i vi E.coli) 37 , lc 200 vng/pht

Trang 29

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

Ly 1ml cho vo ng eppendoft

Ly tm 10000 vng/pht, 10 pht

Thu cn t bo 1ml TE Ly tm 100vng/pht, 5 pht

Thu cn t bo 200ml H2O vo t lnh -20 oC trong 15 pht

Ly ra, ph v t bo trn my lc gia nhit 96 oC trong 15 pht, 5 pht voltex 1 ln

Ly tm 10000 vng/pht trong 10 pht

Thu dch ni cho phn ng PCR

Trang 30

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

Hnh 5. Quy trnh pht hin Bacillus v E.coli trn sa tit trng khng ng mt nhim ban u 1CFU/1ml mt nhim ch ng 1 CFU/25ml Ly 200ml sa 20ml EDTA 0,25M Ly tm 10000 vng/pht trong 10 pht

Thu cn t bo 10ml m phosphat pH 7,2

Ly tm 10000 vng/pht, 5pht

Thu cn t bo 30ml TSBYE Tng sinh 5h 37 , lc 200 vng/pht Ly tm 10000 vng/pht, 10 pht

Thu cn t bo 1ml TE

Trang 31

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

Ly tm 10000vng/pht, 5 pht

Thu cn t bo 200ml H2O vo t lnh -20 oC trong 15 pht

Ly ra, ph v t bo trn my lc gia nhit 96 oC trong 15 pht, 5 pht voltex 1 ln

Ly tm 10000 vng/pht trong 10 pht

Thu dch ni cho phn ng PCR Hnh 6. Quy trnh pht hin Bacillus trn sa tit trng khng ng mt nhim ban u 1CFU/25ml

2. Hn ch ca quy trnh ti trn a ra hai quy trnh pht hin Bacillus v E.coli [4]. i vi quy trnh pht hin mt nhim ch ng 1 CFU/1ml (Hnh 5) thnh cng vi c Bacillus v E.coli. nhy ca quy trnh l 1CFU/1ml, thi gian tng sinh cho phn ng PCR dng tnh l 4 gi vi Bacillus v 3
Trang 32

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

gi vi E.coli. nhy ca quy trnh ny thp (1CFU/1ml ), i vi mt s tiu chun th nhy ny yu cu cao hn na. i vi quy trnh pht hin mt nhim ch ng 1 CFU/25ml (Hnh 6) mi ch thnh cng vi c Bacillus m cha a ra c kt qu vi E.coli. nhy ca quy trnh l 1CFU/25ml, thi gian tng sinh cho phn ng PCR dng tnh l 5 gi. Quy trnh ny tn ti nhung hn ch sau: Quy trnh tin hnh cng knh, phc tp qua nhiu bc, thi gian tng sinh cho phn ng PCR di. Quy trnh thc hin vi mt lng mu ln (200ml) nn rt kh khn v phc tp trong qu trnh ly tm v tch chit DNA. Mt nhiu thi gian v d b nhim. Khng th tin hnh phn tch ng thi c hai vi sinh vt E.coli v Bacillus trong mt phn ng PCR. Cn phi chy in di v vic phn bit kt qu da vo ln ca vch thu c sau in di. Cc bc tin hnh cha c ti u.

3. xut phng n nghin cu hon thin quy trnh Vi mc tiu ca ti l hon thin quy trnh pht hin E.coli v Bacillus nhim tp trong sa tit trng v khc phc nhng hn ch ca quy trnh trn, em xin xut phng phn nghin cu hon thin quy trnh nh sau: La chn thi gian ly tm thu sinh khi t bo vi sinh vt nhm mc ch thu uc ti a lng t bo vi sinh vt sng trong cn t bo trong qu trnh ly tm.
Trang 33

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

La chn mt mi trng tng sinh thch hp nht tng sinh c E.coli v Bacillus nhm gim ti a thi gian tng sinh cho cho quy trnh La chn thi gian tng sinh thch hp cho vi sinh vt cho kt qu dng tnh ng dng k thut Real time PCR pht hin nhanh cc vi sinh vt B.cereus v E.Coli nhm tng nhy, c hiu ca phn ng v gim thi gian cho quy trnh xut mt quy trnh pht hin nhanh E.coli v Bacillus n gin hn, hiu qu hn v nhanh chng hn.

I. Xy dng ng quan h tuyn tnh gia gi tr mt quang v mt t bo ca E.coli v Bacillus. c th thu c mu sa vi cc mt vi sinh vt nht nh v xc nh c mt vi sinh vt ca mt canh trng vi khun nhm tin hnh nhim ch ng vi sinh vt mong mun vo mu sa tit trng khng c vi sinh vt mt mong mun ph hp vi yu cu th nghim, cn phi xy dng ng quan h tuyn tnh gia gi tr mt quang v mt t bo ca E.coli v Bacillus, nhm xc nh c mt vi sinh vt ca mt dung dch cha vi sinh vt thng qua mt quang 1.Nguyn tc:

Khi pht trin trong mi trng lng mt t bo thay i theo thi gian. Kh nng hp th nh sng ca canh trng ph thuc vo mt t bo. Do gi tr OD600 biu th mt t bo trong dch nui cy. Kt qu c th hin hnh 4 v hnh 5
Trang 34

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

Log(N/ml)
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 0.5 1 1.5 Bacillus

OD600
2

Hnh 7. ng quan h tuyn tnh gia gi tr mt quang v mt t bo ca Bacillus

Log(N/ml)
12 10 8 6 4 2 0 0 1 2 3 E.coli

OD600

Hnh 8. ng quan h tuyn tnh gia gi tr mt quang v mt t bo ca E.coli

Trang 35

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

Hai th trn biu din mi quan h tuyn tnh gia mt t bo trong dung dch v gi tr mt quang bc sng 600nm. Khi gi tr OD 600 cng cao th mt t bo vi sinh vt trong dung dch cng ln, tuy nhin n mt gi tr no th mt t bo vi sinh vt khng tng ln na m bt u gim mc d gi tr mt quang khng gim. Khi sang giai on vi sinh vinh vt bt u cht nn c khng tng na. Da vo th ny ta s xc nh c mt t bo ca cc dung dch da vo mt quang.

II. La chn thi gian tng sinh thch hp thu sinh khi t bo vi sinh vt

1. Mc ch: thu c lng t bo sng ln nht t mu th nghim ban u, ta cn tin hnh ly tm c c mu. Bc nghin cu ny nhm tm ra thi gian tng sinh mang li hiu qu cao nht, tc l thu c lng t bo sng ln nht t mu ban u.

2. Kt qu v tho lun: T cc th nghim ly tm thu sinh khi vi sinh vt cc thi gian ly tm 3pht, 6 pht, 9 pht, 12 pht 6000 vng/pht, thu c cc kt qu nh sau:

Trang 36

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

Stt

Thi gian T l TB sng thu T l t bo sng T l t bo cht ly tm (pht) c trong cn TB trong dch ni (%) (%) 14,1 21,2 22,8 26,1 28,9 57 55,8 23 68,9 8,3 70,1 3,8 Bng 2. Kt qu ly tm vi E.Coli (%)

1 2 3 4

3 6 9 12

Stt

Thi gian T l TB sng thu T l t bo sng T l t bo cht ly tm (pht) c trong cn TB trong dch ni (%) (%) 4,54 6,1 8,5 32,8 40,9 54,56 59,9 34 80,1 11,4 56,5 10,7 Bng 3. Kt qu ly tm vi Bacillus (%)

1 2 3 4

3 6 9 12

T cc kt qu trn, d dng nhn thy rng, khi thi gian ly tm tng ln th t l t bo sng thu c trong cn t bo sau khi ly tm cng tng dn. Tuy nhin, khi thi gian ly tm tng ln, ng thi cng lm t l t bo cht tng dn. Khi thi gian ly tm qu ln, t l t bo cht tng nhiu th t l t bo sng thu c trong cn t bo bt u gim. Vi mc tiu thu c mt lng t bo sng ln nht t mu th nghim sau qu trnh ly tm, ta nh gi t l t bo sng thu c trong cn t bo, t l t bo cn li trong dch ni v t l t bo b cht. T so snh c

Trang 37

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

hiu qu tng sinh cc thi gian ly tm khc nhau v xc nh c mt thi gian ly tm thch hp nht cho c E.coli v Bacillus nh gi c hiu qu ly tm vi c hai vi sinh vt v la chn mt ch ly tm chung cho c hai vi sinh vt ta c th biu kt qu ny trn th th hin mi lin h gia thi gian ly tm v mt t bo sng thu c trong cn t bo sau qu trnh ly tm nh sau:

T l TB sng thu c (%)

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 3 6 9 12
Thi gian ly tm (pht)

E.Coli Bacillus

Hnh 9. Kt qu la chn thi gian ly tm thch hp thu sinh khi t bo vi sinh vt. Vi mc ch thu c s lng t bo sng ln nht t mu sa th nghim sau qu trnh ly tm, ta c th chn thi gian ly tm ph hp nht cho c 2 vi sinh vt E.Coli v Bacillus l 9 pht. thi gian ly tm ny,t l t bo

Trang 38

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

sng thu c trong cn t bo c 2 vi sinh vt l ln nht. Hay thi gian ly tm 9 pht v tc ly tm 6000 vng/ pht s cho hiu qu ly tm l ln nht.

III. La chn mi trng tng sinh thch hp tin hnh pht hin nhanh ng thi cc vi sinh vt la chn trong thi gian ngn nht vi nhy cao ca quy trnh th bc tng sinh ng thi cc vi sinh vt l bc rt cn thit. Tuy nhin khng phi bt c mi trng tng sinh no cng ph hp cho ng thi cc vi sinh vt la chn. V vy vi mt t bo vi sinh vt l 1CFU/25ml trong mu th nghm th vic la chn mt mi trng tng sinh thch hp ng thi cho cc vi sinh vt chn lc rt quan trng. Bc ny gip ta thu c mt t bo cc vi sinh vt ln thc hin phn ng Real time PCR t mt mt rt thp ca mu th nghim 1CFU/25ml. Thi gian tng sinh l 4 gi, tin hnh tng sinh cc vi sinh vt thu c sau khi ly tm trong cc mi trng la chn. Tuy nhin, vi mt vi sinh vt ban u l 1 CFU/25ml, th sau 4 gi tng sinh mt vi sinh vt vn cn thp, nn vic xc nh mt vi sinh vt bng phng php m khun lc truyn thng gp kh khn, bn cnh cng kh nh gi s khc nhau trong hiu qu tng sinh ca cc mi trng. V vy, trong th nghim la chn mi trng ny, em s tin hnh vi mt vi sinh vt ban u ca mu th nghim l 10 CFU/ml. Vi 4 mi trng c la chn tng sinh vi sinh vt TSBYE Letheen Broth Fluid Thioglycollate Medium Nutrient Broth Terrific Broth
Trang 39

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

Milk ( sa ti tit trng)

Mt vi sinh vt ban u trong mu th nghim l 10CFU/ ml, sau 4 gi tng sinh trn cc mi trng khc nhau, bng phng php m khun lc truyn thng ta xc nh c mt vi sinh vt nh kt qu sau:

Stt 1 2

Mi trng Trypticase soy broth yeast extract Letheen Broth

E.Coli (CFU/ml) 21200 25700

Bacillus (CFU/ml) 21600 31500

3 4 5

Fluid Thioglycollate Medium Nutrient Broth Terrific Broth

8300 23600 13600

18900 11200 9800

Sa ti tit trng

41000

30800

Bng 4. Kt qu la chn mi trng tng sinh Vi mc ch thu c mt ln vi sinh vt t mu sa c mt 1 CFU/25ml, phn nghin cu ny nhm tm ra mt mi trng tng sinh ph hp nht cho ng thi cc vi sinh vt chn lc. Mi trng tng sinh ph hp c la chn s l mi trng tng sinh thu c mt vi sinh vt cao nht sau 4

Trang 40

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

gi tng sinh t mu th nghim ban u i vi c hai vi sinh vt. Mi trng ny s c la chn tng sinh ng thi c hai vi sinh vt trong cc th nghim sau. T kt qu trn, ta nhn thy rng sau 4 gi tng sinh th mt vi sinh vt khi tng sinh bng sa i vi c hai vi sinh vt u cao. Hay mi trng tng sinh ph hp nht cho c hai vi sinh vt l sa ti tit trng. Nh vy, t cc th nghim sau ta s chn sa tit trng lm mi trng tng sinh cho c hai vi sinh vt.

IV. La chn thi gian tng sinh thch hp 1. Mc ch: Vi mt vi sinh vt thp ca mu th nghim 1 CFU/25ml, ta cn xc nh khong thi gian tng sinh ti thiu, hay thi gian tng sinh ngn nht trong mi trng la chn trn thu c mt mt vi sinh vt c th xc nh bng phng php real time PCR. 2. Kt qu v tho lun: Mt vi sinh vt ban u trong mu th nghim l 1CFU/ 25ml, sau 3gi, 4 gi v 5 gi tng sinh trn mi trng sa tit trng, bng phng php m khun lc truyn thng ta xc nh c mt vi sinh vt. Sau ly tm cn dch t bo thu c sau cc khong thi gian 3gi, 4 gi v 5 gi tng sinh, tin hnh tch chit DNA t cn t bo sau ly tm v xc nh khi lng DNA thu c sau tch chit ta thu c kt qu c tng hp trong bng sau.

Trang 41

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

Stt

Thi gian tng sinh (gi)

Mt vi sinh vt (CFU/ml) 250 2100 12100

1 2 3

3 4 5

Bng 5. Kt qu la chn thi gian tng sinh vi E.coli.

Stt

Thi gian tng sinh (gi)

Mt vi sinh vt (CFU/ml) 110 1160 7480

1 2 3

3 4 5

Bng 6. Kt qu la chn thi gian tng sinh vi Bacillus.

Hai bng trn th hin mt t bo vi sinh vt sau 3 gi, 4 gi v 5 gi tng sinh. T kt qu xc nh nhy cho phn ng real time PCR ta nhn thy thi gian tng sinh 5 gi th mt t bo thc hin phn ng Real time PCR i vi c E.coli v Bacillus. Vy la chn c thi gian tng sinh ph hp l 4 gi.

VI. xut quy trnh pht hin nhanh Bacillus v E.coli nhim tp trong sa tit trng Ly 50ml mu sa tit trng
Trang 42

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

Ly tm 6000vng/pht trong 9 pht thu sinh khi

Tng sinh trong 10ml sa 3h, 37 oC, lc 200 vng/pht

Ly 1ml ly tm 13000vng/pht trong 5 pht (B sung 0.3ml EDTA 0,25M) 1ml nc ct Ly 1ml ly tm 13000vng/pht trong 5 pht

Ph v t bo trn my lc gia nhit 96 oC trong 15 pht, 5 pht voltex 1 ln

Quy trnh pht hin nhanh Bacillus v E.coli c nhy 1 CFU/25ml v thi (1,5 h) gian pht hin ca ton b quy trnh l 5,5 gi. Quy trnh c nhng u im so vi nhng quy trnh trc nh sau: n gin hn, chnh xc hn

Real time PCR

Trang 43

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

nhy cao hn 1CFU/25ml C th thc hin c vic pht hin ng thi nhiu vi sinh vt vi cng mt quy trnh Thi gian ca quy trnh ngn hn Khng cn chy in di phn tch kt qu

PHN IV: NH GI V HNG PHT TRIN CHO TI

I. NH GI KT QU TI ti thu c nhng kt qu sau:

Trang 44

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

ti xy dng c quy trnh ly tm thu sinh khi vi sinh vt cho hiu qu cao nht La chn c mi trng tng sinh hiu qu nht cho c hai vi sinh vt la chn. Xc nh c thi gian tng sinh ti thiu c th pht hin 2 vi sinh vt E.coli v Bacillus nhy 1 CFU/25ml S dng k thut Real time PCR pht hin nhanh hai vi sinh vt la chn vi nhy 1 CFU/25ml hon thin quy trnh pht hin nhanh Bacillus cereus v Escherichia coli trong sa tit trng. II. HNG PHT TRIN CHO TI

Xy dng mt quy trnh pht hin chung cho ng thi mt lng ln cc loi vi sinh vt khc nhau Gim bt thi gian pht hin v tng nhy ca quy trnh Khc phc sai s dng do DNA t t bo cht

TI LIU THAM KHO Ting Vit

Trang 45

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

1. Nguyn Th Hin, Phan Th Kim, Trng Th Ho, L Th Lan Chi (2003), Vi sinh vt nhim tp trong cng ngh thc phm, NXB Nng Nghip H Ni. 2. Nguyn th Kim Hoa (2004), Pht trin k thut PCR trong phn tch listeria monocytogenes gy bnh thc phm, Lun vn thc s khoa hc, H Ni. 3. Lm Xun Thanh (2004), Gio trnh cng ngh cc sn phm sa , NXB KHKT, H Ni. 4. Phng Th Thy (2006) Gp phn kim sot s nhim tp vi sinh vt trong qu trnh sn xut sa tit trng vi s h tr ca k thut PCR, Lun vn thc s khoa hc Ting Anh

5. Applied Biosystems (AB). SYBR Green PCR and RT-PCR reagents. 2001 6. B.Janatova, J. Lukaaova(2001) heat resistaince of bacillus spp.Spore isolated from cows milk and farm ebvironment Acta Vet. .Brono,70 7. Candrian U,Furrer B, Hofelein C, Meyer R, jermini M, Luthy J.(1991), Detection of Escherichia coli and identification of enterrotoxigenic strains by primer-directed enzymatic amplification of specific DNA sequences :39-51 8. http://www.medinet.hochiminhcity.gov.vn/VSATTP/qddanhmuc/gioihan onhiem. asp 9. http://aem.asm.org/cgi/content/full/68/10/4853 10.http://pathmicro.med.sc.edu/pcr/realtime-home.htm
Trang 46

 n tt nghip

Trng Th Thu Hin

11.http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/rtpcr_vs_tradpcr .pdf 12.http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-4a.html 13.http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-14.html 14.http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-20a.html 15.http://www1.qiagen.com/products/ByLabFocus/biosecurity/B.antracis_Po ster.pdf 16. . http://foodsci.cornell.edu/mqip/BACTmilkshelf-life.doc

Trang 47