Kultur sel E.

coli yang terdapat dalam tabung mikrosentrifuga yang telah mengalami perlakuan CaCl2 dalam percobaan ini menjadi sel yang kompeten yang dapat disisipi vektor DNA rekombinan. Tabung mikrosentrifuga berisi sel-sel kompeten tersebut dipipet ke dalam dua tabung berbeda masing-masing 50 l dengan menggunakan mikropipet dan diberi label tabung A dan tabung B. Kemudian tabung A ditambahkan plasmid pCAMBIA 1380 sebanyak 5 l, sedangkan pada tabung B tidak ditambahkan plasmid pCAMBIA 1380. Plasmid pCAMBIA adalah fragmen DNA asing yang ditransformasikan ke dalam sel-sel kompeten bakteri E. coli. Plasmid ini mengandung gen yang ingin diinsersikan dan gen yang menyandikan sifat resistensi terhadap kanamisin yang berperan sebagai marka seleksi. Plasmid pCAMBIA adalah salah satu vektor plasmid yang mempunyai peta retriksi seperti tersaji pada gambar berikut.

Sumber : www.cambia.org

Pada saat penambahan larutan CaCl2 sebelumnya, CaCl2 akan terionisasi dan Ca2+ akan menempel di permukaan/dinding sel bakteri. Hal ini akan menyebabkan dinding sel bakteri bermuatan positif. Kemudian pada penambahan plasmid pCAMBIA 1380 yang mana mengandung DNA dan bermuatan negatif akan menempel di permukaan dinding sel bakteri yang bermuatan positif. Kemudian masing-masing sampel disimpan kembali di dalam es pada wadah

berisi es batu selama 20 menit. Penyimpanan pada suhu dingin akan menyebabkan sel-sel bakteri mengkerut. Setelah itu sampel di heat-shock di dalam waterbath pada suhu 420 C selama 90 detik kemudian disimpan kembali di dalam es selama 20 menit. Perlakuan heat-shock dapat menstimulasi terbukanya pori-pori dinding sel bakteri setelah diberi perlakuan pada suhu dingin sebelumnya. Terbukanya pori-pori dinding sel bakteri akan menyebabkan DNA plasmid yang menempel di permukaan/dinding sel bakteri masuk ke dalam sel bakteri. Kemudian penyimpanan kembali ke dalam suhu dingin dilakukan agar dinding sel bakteri segera menutup kembali setelah DNA plasmid masuk ke dalam selnya. Selanjutnya, masing-masing tabung eppendorf ditambahkan 1 ml LB cair steril dengan 1 l kanamisin 100 mg/ml lalu diinkubasi pada suhu 370 C selama 1,5 jam. Penambahan media LB setelah perlakuan kejut panas berfungsi untuk memenuhi kebutuhan nutrisi dari bakteri setelah mengalami perlakuan yang ekstrim. Inkubasi di dalam inkubator menggunakan shaker bersama dengan plasmid akan menyebabkan masuknya plasmid ke dalam sel. Proses transformasi merupakan proses yang tidak efisien walaupun sel telah dibuat kompeten. Bagian sel yang berhasil menyerap DNA plasmid sangat rendah, sehingga diperlukan metode untuk membedakan antara sel transforman dan sel nontransforman. Sel transforman adalah sel yang berhasil menyerap DNA plasmid, sedangkan sel nontransforman adalah sel yang tidak membawa DNA plasmid. Untuk mengetahui sel yang telah mengalami transformasi maka dilakukan seleksi transforman dengan memanfaatkan sifat yang dibawa sebagai marka seleksi. Bakteri ditumbuhkan pada medium yang mengandung kanamisin. Masing-masing sampel dalam tabung sebanyak 50 l dipindahkan ke dalam cawan petri yang telah berisi 20 mL medium LB agar ditambah 20 l kanamisin. Proses pemindahan sampel dilakukan dengan menggunakan mikropipet yang berbeda untuk tiap-tiap tabung eppendorf. Setelah di pipet ke dalam cawan petri, sampel dispread dengan spreader. Hal ini bertujuan agar bakteri tersebar di

seluruh bagian LB agar dan untuk melihat jumlah koloni bakteri yang tumbuh setelah diinkubasi. Selain itu, dibuat juga media untuk kontrol positif dan negatif dengan cara satu cawan petri dibagi menjadi dua bagian. Pada bagian untuk kontrol positif ditambahkan bakteri E.coli yang sebelumnya telah diremajakan, sedangkan pada kontrol negatif tidak ditambahkan apapun kecuali hanya media. Kemudian semua cawan petri diinkubasikan pada suhu 370 C selama 16-18 jam. Dengan adanya kanamisin, maka sel E.Coli yang dapat tumbuh hanya sel transforman atau sel yang telah memasukkan plasmid. Inkubasi selama 18 jam akan menumbuhkan koloni bakteri yang berasal dari sel tunggal. Koloni yang terbentuk merupakan sekumpulan sel yang identik karena hasil pembiakan sebuah sel. Semua bakteri yang tumbuh dalam koloni tersebut akan memiliki sifat yang sama sebagai bakteri transforman.