27

BAB 3. METODOLOGI PENELITIAN 3.1 Jenis Penelitian Jenis penelitian yang digunakan adalah True Experimental Laboratories (Pratiknya, 1993). Penelitian ini menggunakan desain post test only control group design. 3.2 Rancangan Penelitian
P I S I

KI M R KII KII KI KV
P I P 0 P 0

I
S

OI
II

I I I E0
S

OII OIII OIV A

III

IV

OV

Gambar 3.1 (Skema Rancangan Penelitian)

Keterangan: M R KI,II,III,IV,V PI P0 I SI SII : mencit : randomisasi : kelompok perlakuan 1, 2, 3, 4, dan 5 : mencit distimulasi dengan ekstrak Bangle dosis 22,6 mg/25gBB/hari : mencit tidak distimulasi ekstrak Bangle : mencit diinfeksi dengan Plasmodium berghei : mencit diterapi ekstrak Bangle dengan dosis 22,6mg/25gBB/hari : mencit diterapi ekstrak Bangle dengan dosis 22,6 mg/25gBB/hari dan artemisin dosis 0,728 mg/25gBB/hari

28

SIII SIV Eo OI,II,III,IV,V A

: mencit diterapi artemisin dengan dosis 0,728 mg/25gBB/hari : mencit tidak diterapi : mencit tidak diberi stimulasi dan tidak diterapi : observasi perlakuan 1, 2, 3, 4, dan 5 : analisis data

3.3 Populasi dan Sampel Penelitian 3.3.1 Populasi Penelitian Populasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit Balb/C karena strain ini dapat menimbulkan respon imunitas pada Plasmodium berghei dengan berat antara 20-30 gram dan umur 2-3 bulan. 3.3.2 Jumlah Sampel Sampel dibagi ke dalam 5 kelompok, yaitu : Kelompok I, II, III, IV, dan V. Jumlah sampel minimal yang digunakan dalam penelitian ini adalah 4 ekor tikus wistar betina untuk masing-masing kelompok sehingga jumlah total sampel adalah 20 ekor mencit. Sebanyak 15 ekor mencit untuk uji produksi NO, sedangkan 15 ekor mencit lainnya untuk uji produksi MDA. 3.4 Waktu dan Tempat Penelitian 3.4.1 Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan pada bulan Maret 2013 sampai Juli 2013.. 3.4.2 Tempat Penelitian Proses ekstraksi etanol Bangle dilakukan di Laboratorium Biologi Fakultas Farmasi (Biofarmasi) Universitas Jember dan Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Jember, uji jumlah produksi Nitric Oxide (NO) dilaksanakan di Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gajah Mada dan uji jumlah produksi Malondialdehyde (MDA) dilaksanakan di Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Gajah Mada.

29

3.5 Variabel 3.5.1 Variabel Bebas Variabel bebas pada penelitian ini adalah pemberian ekstrak etanol Bangle (Zingiber cassumunar Roxb.). 3.5.2 Variabel Terikat Variabel terikat pada penelitian ini adalah produksi Malondialdehyde (MDA) dan Nitric Oxide (NO), diukur jumlah NO dari supernatan serum menggunakan reagen Griess dengan modifikasi menurut Green et al. (1982) dan Ding et al. (1988). 3.5.3 Variabel Terkendali Variabel terkendali dalam penelitian ini meliputi umur hewan coba, jenis kelamin dan galur hewan coba, lama perlakuan pada hewan coba, berat badan hewan coba, dosis artemisin, Plasmodium berghei serta pemeliharaan dan perlakuan pada hewan coba. 3.5.4 Variabel Tidak Terkendali Variabel tidak terkendali dalam penelitian ini meliputi imunitas, psikologis, dan faal mencit. 3.6 Validitas dan Realibilitas 3.6.1 Validitas Validitas merupakan derajat ketepatan antara data yang terjadi pada objek penelitian dengan data yang dapat dilaporkan oleh peneliti. Dengan demikian data yang valid adalah data yang tidak berbeda antara data yang dilaporkan oleh peneliti dengan data yang sesungguhnya terjadi pada objek penelitian (Sugiyono, 2007). Validitas pada penelitian ini dijaga dengan : a. Menyamakan kondisi mencit.

30

b. Mengambil mencit secara acak. c. Menggunakan kriteria standar

dan

dalam Nitric

menilai Oxide

jumlah (NO)

produksi dan

Malondialdehyde

(MDA)

mencit

menggunakan alat ukur yang sama. 3.6.2 Realibilitas Reliabilitas berkenaan dengan derajat konsistensi dan stabilitas data atau temuan. Dalam pandangan positifistik (kuantitatif), suatu data dinyatakan reliable apabila dua atau lebih peneliti dalam obyek yang sama menghasilkan data yang sama, atau peneliti sama dalam waktu berbeda menghasilkan data yang sama, atau sekelompok data bila dipecah menjadi dua menunjukkan data yang tidak berbeda (Sugiyono, 2007). Reliabilitas data pada uji produksi NO dijaga dengan replikasi enam kali, sedangkan pada uji produksi MDA dijaga dengan replikasi tiga kali. 3.7 Definisi Operasional 3.7.1 Ekstrak Bangle (Zingiber cassumunar roxb.) Rimpang Bangle didapatkan dari Desa Andongrejo, Kecamatan Tempurejo, Kabupaten Jember. Rimpang Bangle yang diambil adalah rimpang yang menjalar dan berdaging, bentuknya hampir bundar sampai jorong atau tidak beraturan, tebal 2-5 mm. Permukaan luar tidak rata, berkerut, kadangkadang dengan parut daun, warnanya coklat muda kekuningan, bila dibelah berwarna kuning muda sampai kuning kecoklatan. Rasanya tidak enak, pedas, dan pahit Larutan ekstrak etanolik 96% dari rimpang Bangle (Zingiber cassumunar Roxb.) diberikan kepada kelompok perlakuan mencit Balb/C ( yang diinfeksi Plasmodium berghei ) melalui sonde lambung dengan dosis 22,6 mg/25grBB/hari. 3.7.2 Plasmodium berghei

31

Plasmodium berghei merupakan salah satu parasit malaria yang menginfeksi mamalia selain manusia. Parasit ini analog dengan parasit malaria pada manusia pada hampir semua aspek penting seperti struktur, fisiologi, dan siklus hidupnya (Carter dan Diggs, 1977). Pada penelitian ini, Plasmodium berghei diperoleh dari Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gajah Mada. 3.7.3 Produksi Malondialdehyde (MDA) Parameter kadar Malondialdehyde (MDA) serum merupakan nilai penanda kerusakan oksidatif pada membran sel yang disebabkan radikal bebas. Pengambilan darah melalui medial canthus sinus orbitalis dan intrakardial. Pemeriksaan MDA dengan metode Thiobarbituric Acid Reactive Substances (TBARS). 3.7.4 Produksi Nitric Oxide (NO) Parameter kadar Nitric Oxide (NO) serum dihasilkan oleh inducible (iNOS), endothelial (eNOS), dan neural (nNOS). Produksi NO oleh iNOS dihasilkan dari makrofag selama infeksi dengan cara mengaktifkan transkripsi gen yang mengkodekan enzim nitric oxide synthase. Produksi NO serum adalah konsentrasi NO dengan satuan M yang terdapat dalam supernatan serum yang diukur dengan reagen Griess. 3.8 Alat dan Bahan 3.8.1 Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah oven, rotavapour, blender, beaker glass, spatula, saringan, perkolator, kapas, kertas saringan, kaki tiga, statif, cawan petri, hot plate, gelas ukur, timbangan digital, sonde lambung, kandang hewan coba, sentrifus, mikroskop cahaya, microplate 96 well, tabung ependorf, automated microplate reader, spektrofotometer, penangas air, tabung reaksi, tabung, sentrifuse, pipet mikro, kuvet, kuvet mikro,dan refrigator. 3.8.2 Bahan

32

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel yang diambil dari darah yang diambil dari medial canthus sinus orbitalis dan intrakardial. Plasmodium bergrhei dan pakan mencit diperoleh dari Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gajah Mada. Bahan perlakuan adalah ekstrak Bangle dan artemisinin. Reagen yang dibutuhkan untuk pembuatan ekstrak adalah alkohol 96% dan suling steril. Reagen untuk uji produksi NO adalah 2%, N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride = NED (Sigma), Sulfanilamide (Sigma), 5%phosphoric acid, ZnSO 4, PBS dan NaNO2. Reagen untuk uji produksi MDA adalah larutan TCA 100%, larutan sodium TBA, HCl 0,1 N, dan Na sitrat. 3.9 Ethical Clearance Sebelum melakukan penelitian, prosedur penelitian telah dimintakan ijin ethical clearance dari Komisi Etika Penelitian Kedokteran Fakultas Kedokteran Universitas Jember. 3.10 Prosedur Penelitian 3.10.1 Ekstraksi Bangle (Zingiber cassumunar Roxb.) Bahan yang digunakan adalah rimpang Bangle (Zingiber cassumunar Roxb.). Bahan didapat dari Desa Andongrejo Kecamatan Tempurejo, Jember yang telah diidentifikasi di Herbarium Jemberiense, Jurusan Biologi, Fakultas MIPA Universitas Jember.Rimpang Bangle setelah dicuci bersih, kemudian dipotong kecil-kecil, selanjutnya diangin-anginkan. Potongan kecil rimpang Bangle dikeringkan dalam alat pengeringan (oven) bersuhu 500C, selama 4 hari dan setiap hari dibalik untuk mempercepat pengeringan. Setelah kering, potongan tersebut dimasukkan ke dalam penggilingan dengan besar lubang untuk menyaring adalah 0,75 mm. Pembuatan sediaan ekstrak rimpang Bangle dilakukan dengan cara perkolasi. Serbuk rimpang Bangle sebanyak 600 g dibasahi dengan 300 ml etanol, lalu dimasukkan ke dalam bejana tertutup dan didiamkan selama 3 jam. Filtrat sedikit demi sedikit dituangkan ke dalam perkolator sambil ditekan

33

perlahan-lahan. Penambahan larutan etanol secukupnya ke dalam perkolator sampai cairan menetes dan di atas serbuk masih terdapat larutan etanol. Perkolator ditutup dan dibiarkan selama 24 jam. Cairan filtrat dibiarkan menetes dengan kecepatan 1 ml per menit. Larutan etanol secukupnya ditambahkan berulang-ulang ke dalam perkolator agar selalu terdapat larutan etanol di atas permukaan simplisia. Lebih kurang 200 ml cairan filtrat pertama ditampung dan dipisahkan. Perkolasi dilanjutkan sampai didapat titik akhir perkolasi dengan petunjuk warna perkolat yang jernih. Hasil dari perkolasi diperas dan cairan perasan dicampur ke dalam perkolat. Pada penyaringan lanjutan ini didapat filtrat lebih kurang 4.500 ml. Filtrat pertama dan kedua dipindahkan ke dalam bejana tertutup, dibiarkan selama 2 hari di tempat yang sejuk dan terlindung dari cahaya. Pemekatan hasil filtrasi menggunakan alat rotavapor pada suhu 48 0C dengan kecepatan 200 rpm sehingga cairan habis terdestilasi. Penguapan air yang masih tersisa di dalam ekstrak dilanjutkan dengan waterbath pada ekstrak, sehingga hasil akhir ekstrak yang didapat adalah ekstrak kental. 3.10.2 Standarisasi Ekstrak Rimpang Bangle Standarisasi ekstrak dilakukan sesuai dengan prosedur dalam parameter standar umum ekstrak tumbuhan obat yang diterbitkan oleh Departemen Kesehatan RI (2000). Standarisasi dilakukan teradap beberapa parameter. Pertama, parameter non spesifik, yakni susut pengeringan. Kedua, parameter spesifik yang meliputi organopletik, kadar senyawa yang terlarut dalam pelarut air dan etanol. Ketiga, parameter kandungan kimia ekstrak yang meliputi pola kromatogram dan kadar total golongan kandungan kimia. a. Parameter Susut Pengeringan Tujuan pengukuran susut pengeringan adalah memberikan batasan maksimal tentang besarnya senyawa yang hilang pada proses pengeringan. Ekstrak ditimbang secara seksama sebanyak 1-2 gram dan dimasukkan ke dalam botol timbang dangkal tertutup yang sebelumnya telah dipanaskan pada suhu 1050C selama 30 menit dan telah ditara. Sebelum ditimbang ekstrak diratakan hingga merupakan lapisan setebal 5-10 mm. Pengeringan

34

ekstrak dilakukan pada suhu 1050C hingga bobot tetap, hitung susut pengeringannya dalam persen. b. Organoleptik Tujuan pemeriksaan organoleptik adalah pengenalan awal yang sederhana dan seobyektif mungkin. Pemeriksaan menggunakan panca indera untuk mendeskripsikan bentuk, warna, bau, dan rasa. Pemeriksaan dilakukan paling sedikit 20 orang. c. Kadar Senyawa yang Terlarut dalam Air dan Etanol Tujuan penentuan kadar senyawa yang larut dalan air dan etanol adalah memberikan gambaran awal jumlah senyawa kandungan. Maserasi sejumlah 5 gram ekstrak selama 24 jam dengan 100 ml air kloroform menggunakan labu tersumbat sambil berkali-kali dikocok selama 6 jam pertama kemudian dibiarkan selama 18 jam. Saring, uapkan 20 ml filtrat hingga kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara, panaskan residu pada suhu 1050C hingga bobot tetap. Hitung kadar dalam persen senyawa yang larut dalam air dihitung terhadap ekstrak awal. Hal yang sama dilakukan dengan mengganti pelarutnya dengan etanol. d. Pola Kromatogram Pola kromatogram dapat memberikan gambaran awal komposisi kandungan kimia berdasarkan pola kromatogram. Pola kromatogram ditemukan dengan metode KLT-densitometri pada lempeng silica gel GF254, fase gerak kloroform:benzene:methanol (80:15:5). Setelah discan dengan densitometer, bercak yang ada dideteksi dengan pereaksi Dragendorf untuk mengetahui bercak yang mengandung flavonoid yang ditunjukkan dengan timbulnya warna bercak yang berkisar antara kuning sampai jingga. e. Kadar Total Golongan Kandungan Kimia Pada penetapan kadar total golongan kandungan kimia, yang ditetapkan adalah kadar total flavonoid dalam hal ini adalah kurkumin.

3.10.3 Penentuan Dosis Bangle dan Artemisinin

35

a.

Dosis Bangle Dosis kurkumin yang diperlukan mencit sebagai dosis imunostimulan

adalah 30mg/hari. Sedangkan dalam 1mg Bangle terdapat 33.2 mg. Dengan rumus perhitungannya adalah Dosis Bangle = Dosis kurkumin untuk mencit 1mg Kurkumin dalam Bangle Dosis Bangle = 30 33.2 Dosis Bangle = 0.9037 untuk 1 grBB mencit. Maka dosis Bangle pada penelitian ini adalah 22.6mg/25grBB mencit. b. Dosis Artemisinin Dalam 1 tablet dihidroartemisinin piperaquin mengandung 3,2mg/kgBB dihidroartemisinin dan 16mg/kg BB piperaquin. Dengan rumus perhitungannya untuk 25grBB mencit adalah Dosis artemisinin= Dihidroartemisinin x nilai konversi x BB manusia x 25 20 Dosis artemisinin= 3,2 x 0.0026 x 70 x 1.25 Dosis artemisinin= 0.728mg/25grBB mencit. 3.10.4 Stimulasi Ekstrak Bangle Sampel diadaptasikan selama 7 hari di Laboratorium dan diberi pakan standar. Sejumlah 30 ekor mencit Balb/C jantan dibagi dalam 5 kelompok masing-masing terdiri atas 6 ekor mencit. Mencit distimulasi dengan ekstrak Bangle dosis 22,6 mg/25gBB/hari. Stimulasi ini dilakukan selama 14 hari dengan tujuan meningkatkan respon imun mencit terhadap infeksi termasuk malaria. 3.10.5 Induksi Plasmodium berghei pada Hewan Coba Stok darah terinfeksi Plasmodium berghei dari simpanan beku dicairkan pada suhu kamar. Darah tersebut disuntikkan pada mencit donor 100-200 l secara intraperitoneal. Bila tingkat parasitemia mencit donor telah mencapai 2030% maka dilakukan pengambilan darah secara intrakardial. Darah tersebut

36

kemudian diencerkan dengan larutan fisiologis hingga diperoleh tingkat parasitemia 108 eritrosit terinfeksi parasit per ml. Sejumlah 0,2 ml larutan ini (2x107) diinjeksikan secara intraperitoneal atau intravenous ke kelompok mencit coba. 3.10.6 Pemberian Ekstrak Bangle Terapi ekstrak Bangle dengan dosis 22,6 mg/25gBB/hari ataupun dengan artemisin dosis 0,728 mg/25gBB/hari diberikan apabila telah ditemukan adanya plasmodium di dalam darah mencit. Lama pemberian terapi selama 4 hari. Selama 4 hari perlakuan, derajat parasitemia tetap diperiksa. 3.10.7 Pengambilan serum mencit Mencit diterminasi dengan narkose menggunakan kloroform. Darah mencit dapat diambil melalui medial canthus sinus orbitalis dan intrakardial. Darah dari intrakardial dapat diambil dengan menggunakan spuit 3cc, sedangkan darah dari medial canthus sinus orbitalis diambil dengan menggunakan pipa kapiler hematokrit. Selanjutnya, darah yang telah diambil dimasukkan ke dalam tabung ependorf dan setelah itu diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit. Pada tahap berikutnya, darah disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang telah terbentuk dipindahkan ke tabung ependorf lainnya. Serum disimpan dengan suhu -200C pada refrigator. 3.10.8 Uji Produksi Nitric Oxide (NO). Serum mencit sebanyak 200l diencerkan dengan PBS 200l kemudian ditambahkan dengan ZnSO4 sebanyak 20l kemudian disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Penambahan ZnSO 4 ini bertujuan untuk deproteinase. Selanjutnya, supernatan yang telah terbentuk diambil sebanyak 100l dan kemudian dimasukkan ke dalam sumuran pada microplate 96 wells. Reagen Griess (reagen chromogenic) ditambahkan sebanyak 100l dan dimasukkan dalam setiap sumuran. Standar NO juga dimasukkan sebanyak 100l dan ditambahkan juga dengan 100l reagen griess pada sumuran yang

37

masih kosong. Selama 5 menit kemudian, diobservasi adanya perubahan warna dan stabilisasi. Pengukuran absorbansi pada 550 nm menggunakan automated microplate reader. Pada tahap pembacaan nitrit standar digunakan analisis regresi linier sederhana atau simple setelah itu dihitung konsentrasi nitrit dalam sampel berdasarkan kurva standar atau rumus regresi. Pembuatan reagen chromogenic melalui beberapa tahap. Pertama, pembuatan reagen A memerlukan N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride=NED (Sigma) sebanyak 0,1g kemudian dilarutkan dalam 100 ml air suling. Kedua, pembuaten reagen B memerlukan Sulfanilamide (Sigma) sebanyak 1g kemudian dilarutkan dalam 100 ml 5% phosphoric acid. Reagen A dan B harus disimpan pada lemari pendingin dalam botol gelap dan dapat digunakan dalam 6 minggu atau selama tidak berubah warna menjadi lebih gelap. Selanjutnya, kedua reagen tersebut dicampurkan dengan volume sama banyak dan dapat digunakan 1 jam setelah disiapkan. Pembuatan nitrit standar memerlukan 69 mg NaNO2 kemudian dilarukan dalam 500 ml air suling (2 mM stock), selanjutnya dibuat pengenceran bertingkat dari 0 200 M dengan cara melarutkan larutan stok menggunakan PBS. 3.10.9 Uji Sekresi Malondialdehyde (MDA) serum Sebanyak 3 ml darah mencit diambil melalui medial canthus sinus orbitalis. Darah tersebut dimasukkan ke dalam tabung yang mengandung Na sitrat. Selanjutnya, darah disentrifus pada 3000 rpm selama 15 menit dan kemudian darah yang telah disentrifus diambil serumnya. Serum darah tersebut diambil sebanyak 0,5 ml untuk tiap masing-masing tabung, tabung sebagai tes dan kontrol. Pada masing-masing tabung ditambahkan sebanyak 100 ul TCA 100% kemudian divortex. Setelah itu ditambahkan lagi 250 ul HCL 0,1N kemudian divortex kembali. Pada tahap berikutnya, tabung tes dan kontrol disentrifus pada 3000 rpm selama 10 menit dan kemudian diambil supernatannya serta disaring dengan glass wool. Untuk tabung tes, ditambahkan 100 ul sodium thio barbituric acid, sedangkan tabung kontrol tidak

38

ditambahkan. Selanjutnya, semua tabung tersebut divortex dan setelahnya dipanaskan dengan waterbath 1000C selama 25 menit. Angkat hasilnya dan biarkan dalam suhu ruang. Pada tahap terakhir, hasil yang didapat dibaca pada spektrofotometer 531,6 nm. 3.11 Analisis Data Data hasil penelitian dengan uji produksi Nitric Oxide (NO) dan Malondialdehyde (MDA) plasma dianalisis menggunakan uji One Way ANOVA dan dilanjutkan uji Post Hoc LSD. Perbedaan dianggap bermakna apabila nilai p<0,05 dengan 95% interval kepercayaan. Analisis statistik dibantu dengan program SPSS 13 for windows.

3.12 Alur Penelitian

39

rimpang Bangle segar disortasi dicuci dikeringkan

simplisia kering diblender diayak Diperkolasi sampai didapat titik akhir perkolasi dengan petunjuk warna perkolat yang jernih

Ekstrak etanol

Stimulasi Ekstrak Bangle (dosis)

Infeksi Plasmodium berghei

Ekstrak Bangle (dosis)

Ekstrak Bangle (dosis) dan Artemisinin KII

Artemisinin

KI

KIII

K IV

KV

pengumpulan data Data analisis data Kesimpulan

Gambar 3.2 Alur Penelitian