Biologie Cellulaire en 30 Fiches

Jean-Claude CALLEN
Biologie cellulaire
en 30 ches
re d n e r p Com traner et sen ent facilem
Jean-Claude CALLEN
Biologie cellulaire en 30 fiches
Dunod, Paris, 2009 ISBN 978-2-10-054193-5
Avant-propos
Cet ouvrage est destin aux tudiants en Biologie (L1 et L2 SV). Comme tous les volumes de cette collection, il vise leur faire acqurir les bases dune vritable dmarche exprimentale en Biologie Cellulaire. Longtemps rduite la seule description des structures cellulaires : la Cytologie, cette discipline sest enrichie, au cours du temps, des mthodes de la Biochimie, de la Biophysique, de la Physiologie Cellulaire et plus rcemment de la Biologie Molculaire. Il suffit simplement de feuilleter un journal scientifique ddi la Biologie Cellulaire moderne pour se convaincre de la multiplicit des approches qui caractrisent cette discipline. Afin de coller au plus prs lactualit de la Recherche, lenseignement universitaire se doit donc de former les tudiants aux dmarches et aux outils les plus rcents ; il est bien loin le temps o les sances de Travaux Dirigs consistaient reproduire le plus fidlement possible des clichs de Microscopie lectronique ! Actuellement, il est indispensable quun tudiant en Biologie Cellulaire connaisse un grand nombre de techniques, de plus en plus sophistiques. Et si le fractionnement cellulaire et llectrophorse ne doivent plus avoir de secrets pour lui, il lui faut aussi matriser les bases de limmunocytochimie et de lhybridation in situ, connatre le principe dun microscope confocal et dun trieur de cellules, mais aussi savoir construire un protocole utilisant un systme de traduction in vitro ou la GFP. Cest dans cet esprit et avec cet objectif que cet ouvrage est construit. Il est divis en 30 fiches de 5 pages, couvrant 10 grands thmes classiques de la Biologie Cellulaire. Chacune delles inclut une page de rappels de notions indispensables et une page dcrivant une technique prcise, en rapport (dans la mesure du possible) avec le sujet de la fiche ; trois pages sont donc consacres des exercices semblables ceux effectus dans des Travaux Dirigs. Sur les 62 exercices proposs, prs de la moiti consistent en des analyses dauthentiques expriences de laboratoire (mme si certaines sont ncessairement simplifies !), avec leurs techniques et leur dmarche hypothtico-dductive caractristique. Dautres exercices, refltant la diversit des outils pdagogiques notre disposition, sont proposs part sensiblement gale : calculs effectuer, figures lgender, sries de propositions vraies ou fausses identifier. Tant il est vrai que, sil faut savoir raisonner (ce qui est donn une majorit dtudiants !) et exercer son esprit critique pour russir en Biologie, il faut galement disposer dune somme toujours plus importante de connaissances sur lesquelles sappuyer, et sans lesquelles il nest hlas pas possible de progresser. J.-C. Callen Cest la profonde ignorance qui inspire le ton dogmatique
Dunod La photocopie non autorise est un dlit.
Jean de La Bruyre
FICHE
Table des matires
Partie 1 : Les cellules ; le monde vivant

Fiche 1 Fiche 2 Fiche 3 Fiche 4 Fiche 5 Fiche 6 Fiche 7 Fiche 8 Fiche 9 Les plans dorganisation cellulaire La diversit du monde vivant Les membranes biologiques Les transports membranaires Lendocytose, lexocytose et le bourgeonnement Les jonctions membranaires des cellules animales Le rle architectural du cytosquelette Les rles dynamiques du cytosquelette Lorganisation du noyau ; la chromatine 4 9 14 19 24 29 34 39 44 49 54 59 64 69
Partie 2 : Structure et fonctions des membranes
Partie 3 : Structure et fonctions du cytosquelette
Partie 4 : Structure et fonctions du noyau

Fiche 10 La cytologie de la transcription ; le nuclole Fiche 11 La cytologie de la rplication de lADN
Partie 5 : Les divisions et le cycle cellulaire

Fiche 12 Les chromosomes ; les divisions cellulaires Fiche 13 Lappareil mitotique ; la cytodirse Fiche 14 Le cycle cellulaire et son contrle
Partie 6 : La voie de scrtion des protines

Fiche 15 Le rticulum endoplasmique Fiche 16 Ladressage des protines vers le RER Fiche 17 La voie de scrtion des protines Fiche 18 Lappareil de Golgi Fiche 19 Les lysosomes : les vacuoles vgtales 74 79 84 89 94 99 104 109 114 119 124 129 134 139 144 149 154 156 157 158
Partie 7 : Les organites convertisseurs dnergie

Fiche 20 Les mitochondries ; morphologie et organisation Fiche 21 Les fonctions des mitochondries Fiche 22 Les plastes : organisation et diversit Fiche 23 Les fonctions des chloroplastes Fiche 24 Les peroxysomes et organites apparents
Partie 8 : La biognse des organites

Fiche 25 La biogense des mitochondries et des plastes Fiche 26 Ladressage des protines vers le noyau
Partie 9 : Les cellules dans leur environnement

Fiche 27 Les matrices extracellulaires
Fiche 28 La signalisation cellulaire Fiche 29 La diffrenciation cellulaire
Partie 10 : Les virus

Fiche 30 Les virus Liste des exercices Liste des techniques dcrites Bibliographie, Illustrations, Remerciements Index
Table des matires
FICHE
Les plans dorganisation cellulaire
I La cellule, unit structurale et fonctionnelle du vivant

Tous les tres vivants sont constitus dunits invisibles lil nu : les cellules. Cette notion est relativement rcente par rapport lhistoire de la Biologie, car elle repose sur la mise au point doutils dobservation performants : les microscopes (la thorie cellulaire a t nonce en 1838). Les organismes unicellulaires ne sont donc pas directement accessibles notre conscience, bien quils reprsentent le plus grand nombre despces prsentes sur la Terre et constituent la plus grande partie de la biodiversit actuelle, tandis que les tres multicellulaires, parfois de trs grande taille, font partie de notre monde visible et familier. Plans dorganisation des cellules : au plan strictement structural, lensemble des tres vivants actuels se rpartit en deux grands groupes seulement : les Procaryotes, ou bactries, au sens large, dont les cellules sont de trs petite taille : ordre de grandeur = 1 m, avec quelques exceptions, ne prsentant pas ou peu de compartimentation au sein de leur cytoplasme (absence dorganites limits par des membranes), les Eucaryotes, dont les cellules, de taille comprise entre 10 et 100 m, en gnral, sont beaucoup plus volumineuses et prsentent un cytoplasme hautement structur, contenant une grande diversit dorganites tels que : le noyau, les mitochondries, le rticulum endoplasmique Unicellulaires et pluricellulaires : les Procaryotes sont en gnral unicellulaires (bien quils donnent parfois des populations visibles lil nu), tandis que les Eucaryotes sont la fois reprsents par des organismes unicellulaires (les Protistes, trs divers au plan phylogntique), et des tres multicellulaires (les Animaux, les Vgtaux verts et les Champignons ; cf. fiche 2). Chez ces derniers, lexception des Champignons, la pluricellularit saccompagne toujours dune diffrenciation morphologique et fonctionnelle des cellules, qui se regroupent en tissus, formant des organes, eux-mmes organiss en appareils, dont lensemble constitue un organisme.
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II Outils et mthodes de la cytologie

Les biologistes disposent de deux types principaux doutils pour lobservation des cellules : le microscope photonique et le microscope lectronique. Bien que bass sur un principe identique, savoir la dviation dun flux de particules traversant lobjet observer, ces instruments utilisent des particules diffrentes, respectivement les photons et les lectrons. Le microscope photonique ou lumire : la lumire traversant lobjet (on parle dobservation en transmission) est dvie par deux systmes successifs de lentilles en verre appels objectifs et oculaires , avant de former une image agrandie sur notre rtine (ou tout systme de capture dune image). La limite de rsolution de cet appareil (la plus petite distance entre deux points de lobjet vus de faon distincte) est au mieux de 0,25 m, ce qui permet de distinguer peine la plupart des bactries ; on rappelle que cette limite, pour lil nu, est de 100 m environ. Le microscope lectronique transmission : le flux dlectrons, acclr par une trs haute tension, est dvi par des lentilles lectromagntiques au sein dune enceinte dans laquelle un vide trs pouss a t ralis. Ceci est indispensable pour que les lectrons ne soient ni ralentis ni dvis par des particules gazeuses ; une premire consquence est que, la diffrence du microscope photonique, des objets vivants ne peuvent pas y tre observs. La limite de rsolution de cet appareil (0,1 nm) est trs infrieure celle du microscope photonique, ce qui explique son intrt. La ralisation de coupes fines : les objets observer sont le plus souvent massifs, de grande taille, et non transparents la lumire ou aux lectrons, ce qui implique la ralisation de coupes fines (0,5-5 m) ou ultrafines (50-80 nm) selon le type de microscope utilis. Cette technique ncessite que le matriel biologique soit fix (tu par un mlange de composs chimiques ne modifiant pas les structures cellulaires), puis imprgn dune substance durcissant lchantillon (tape dinclusion en paraffine ou en rsine), afin dtre dbit en tranches les plus fines possibles (tape de micro- ou ultramicrotomie). Une dernire tape de coloration (par de vrais colorants pour la microscopie photonique, ou par des composs renforant les contrastes en microscopie lectronique) doit tre ralise avant toute observation. Dautres types de microscopes et dautres protocoles dobservation existent, tant dans le domaine de la microscopie photonique que dans celui de la microscopie lectronique ; ils seront prsents dans les chapitres suivants. Il sagit, en particulier, du microscope photonique fluorescence (cf. fiche 8) et du microscope lectronique balayage (cf. fiche 5) ; les protocoles de cryofracture, dimmunocytochimie et de coloration ngative seront galement dcrits dans les fiches 6, 7 et 11.
FICHE 1 Les plans dorganisation cellulaire
Cellules procaryotiques et eucaryotiques

Voici des schmas et des photos de diffrents types de cellules. Avec laide des barres dchelle, calculez leurs dimensions exactes et identifiez celles que vous considrez comme procaryotiques ou eucaryotiques ; parmi ces dernires, savez-vous distinguer les cellules animales des cellules vgtales ? Justifiez vos rponses.
Solution
Les cellules 1 et 4 sont de trs petite taille (respectivement 1,5 m et 3,4 m) et visiblement non ou peu compartimentes ; il sagit de Procaryotes. Les cellules 2 et 3 sont de taille bien suprieure (respectivement 80 m et 14 m) et possdent de nombreux organites, dont le noyau, volumineux et trs reconnaissable ; il sagit donc dEucaryotes. La cellule 2, qui possde de grandes vacuoles, des chloroplastes et une paroi paisse, est une cellule vgtale ; la cellule 3 est donc de type animal.
Volumes cellulaires compars

Une cellule bactrienne de type coque , une cellule animale de type hpatocyte (cellule du foie) et une cellule de parenchyme vgtal sont compares du point de vue de leurs volumes. Toutes les trois sont sphriques, et leurs diamtres respectifs sont les suivants : 2 m, 20 m et 100 m.
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1. Calculer le volume de la cellule bactrienne et prvoir, sans faire les calculs directs, les rapports existant entre les volumes des deux autres types de cellules et celui de cette bactrie. 2. Prvoir galement, sans faire les calculs directs, lvolution du rapport Surface cellulaire/Volume cellulaire quand on passe dun type de cellule lautre, et en tirer les consquences physiologiques concernant les liens entre changes avec le milieu et mtabolisme cellulaire. On donne : surface dune sphre = 4r2 ; volume dune sphre = 4/3r3.
Solution
1. Le volume de la bactrie (rayon = 1 m) est de 4,18 m 3. Le rayon de la cellule animale tant 10 fois plus grand que celui de la bactrie, son volume est 1 000 fois suprieur (on lve 10 au cube) et vaut donc 4 180 m 3. Celui de la cellule vgtale tant 50 fois plus grand, son volume est 125 000 fois suprieur celui de la bactrie, soit un volume de 522 500 m 3. Ces calculs simples montrent que les cellules eucaryotiques sont beaucoup plus volumineuses que les cellules procaryotiques ; ceci explique aisment pourquoi les premires peuvent faire lobjet dune compartimentation et/ou dune diffrenciation pousses, absentes chez les dernires. 2. Sans avoir faire de calculs, on constate que la surface est une fonction du carr de la dimension de la cellule, alors que son volume est une fonction du cube de cette mme dimension ; plus les cellules sont grosses et plus le rapport S/V diminue. Ceci a des consquences importantes pour lactivit cellulaire, car cest travers la surface que se font les ncessaires changes nutritifs avec le milieu, alors que lactivit mtabolique concerne lensemble du volume cellulaire. Il est admis que le passage volutif du plan dorganisation procaryotique au plan eucaryotique, avec une grande augmentation de la taille des cellules, na pu tre ralis quau prix dune compartimentation interne pousse et de lacquisition/invention dorganites diversifis prenant en charge des activits remplies par la membrane plasmique des Procaryotes. Voir la notion de thorie endosymbiotique : cf. fiche 20.
Combien de cellules dans une colonie bactrienne ?

Une colonie bactrienne a t obtenue sur un milieu de culture glos par multiplication dune seule cellule initialement dpose sa surface (mme espce que celle tudie dans lexercice prcdent). Cette colonie a une forme lenticulaire et mesure 4 mm de diamtre sur 1 mm de hauteur ; on admettra que son volume est approximativement gal la moiti du volume dun cylindre de mmes dimensions.
FICHE 1 Les plans dorganisation cellulaire
1. Si lon admet aussi que la moiti du volume de cette colonie est reprsent par de leau (ou de la solution nutritive) remplissant les espaces intercellulaires, pouvezvous calculer le nombre de cellules contenues dans cette colonie ? 2. Cette colonie ayant t obtenue aprs un temps de culture de 36 h, quel est le temps de gnration (dure de la priode entre 2 divisions) chez cette bactrie ? 3. Quelle serait la longueur thorique dun filament obtenu en mettant bout bout toutes les cellules de cette colonie, et seriez-vous capable de le voir lil nu ? On donne : surface dun cercle = r2 ; la valeur de 29 est trs voisine de 500 (512), et celle de 210 est trs voisine de 1 000 (1 024).
Solution
1. Le volume total de la colonie, quivalent au demi-volume du cylindre, est donc gal : 3,14 4 1/2 = 12,56/2 mm3, soit 6,28 mm3. Si les cellules seules reprsentent la moiti de ce volume, on obtient la valeur de 3,14 mm3. Sachant que 1 mm3 reprsente 109 m 3 et que le volume dune cellule bactrienne est de 4,18 m 3, on calcule un effectif de 7,5 108 cellules pour cette seule colonie. Cette valeur est telle que, dans seulement 10 colonies de cette taille, il y a plus de cellules bactriennes que dtres humains sur notre plante ! 2. La croissance dune population de bactries suit une progression exponentielle : 2n, n tant le nombre de gnrations (divisions). On peut aisment calculer ce nombre sachant que 210 = environ 1 000 ; la valeur de 7,5 108 se dcompose donc en 750 1 000 1 000. Si on considre que 750 est lgrement suprieur 29, on obtient : 29 210 210, soit 229 ; il a donc fallu 29 gnrations pour passer de 1 cellule la colonie finale, ce qui a t ralis en 36 h. Une gnration dure donc 36/29 h = 1,24 h, ce qui quivaut 75 minutes environ. La rapidit de division des bactries est impressionnante et, en milieu de culture liquide (plus favorable la croissance), les temps de gnration atteignent 20 minutes. Ces simples remarques permettent de comprendre aisment pourquoi les micro-organismes en gnral, et les bactries en particulier, ont constitu un moyen irremplaable de recherche de mutants (par dfinition extrmement rares) et donc dtudes gntiques. Les dveloppements rapides de la Gntique et de la Biologie Molculaire, dans la deuxime moiti du XXe sicle, sont essentiellement dus leur utilisation (Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Neurospora crassa). 3. La longueur du filament obtenu avec les 7,5 108 cellules (diamtre individuel : 2 m), est de 1,5 109 m, soit 1,5 km ! Et pourtant, un tel filament, trs long mais trs fin, ne pourrait tre observ lil nu, car sa limite de rsolution est de 100 m.
FICHE
La diversit du monde vivant
I La diversit du vivant ; larbre du vivant

Si lon considre le seul plan dorganisation cellulaire, qui est bien connu depuis les dbuts de la microscopie lectronique, lensemble du monde vivant se rpartit en Procaryotes et Eucaryotes. Depuis la fin des annes 1970, cependant, de nouvelles donnes biochimiques et molculaires ont conduit reconsidrer ce dcoupage et envisager trois grands groupes dtres vivants quivalents au plan phylogntique : les Bacteria (Bactries, Eubactries) et les Archea (Arches, Archbactries), qui sont des Procaryotes, et enfin les Eucarya (Eucaryotes). Les arbres phylogntiques : les donnes de plus en plus abondantes concernant les squences dADN de gnomes dorganismes trs divers permettent de calculer des degrs de parent entre eux de plus en plus fiables, et donc de tracer des arbres phylogntiques extrmement prcis. Larbre du vivant est dsormais disponible. Les Bacteria : ce sont les bactries classiques , tudies depuis les dbuts de la Microbiologie, et dont font partie des organismes-modles tels que Escherichia coli ou Bacillus subtilis. On distingue deux grands groupes, sur la base de lorganisation des membranes et de la paroi : les Gram ngatives et les Gram positives. Les Archea : ces micro-organismes se distinguent des Procaryotes prcdents par de multiples caractristiques. Au plan physiologique, ils sont remarquables par leurs aptitudes vivre dans des conditions denvironnement exceptionnelles (anoxie absolue, temprature, acidit ou salinit extrmes). Sur le plan biochimique, ils possdent des molcules et des voies de biosynthse uniques dans le monde vivant ; du point de vue molculaire, les mcanismes gntiques quils mettent en uvre possdent des points communs la fois avec les Bacteria et les Eucarya. Les Eucarya : il sagit des groupes bien connus suivants : les Animaux (Mtazoaires), les Vgtaux verts (Mtaphytes), les Champignons (Eumyctes) et les Protistes (tres tous unicellulaires). Ces derniers reprsentent, la diffrence des groupes prcdents, un ensemble polyphyltique trs htrogne dont la diversit dpasse, et de trs loin, celle rencontre chez tous les multicellulaires runis.
FICHE 2 La diversit du monde vivant
Larbre du vivant
Cet arbre du vivant extrmement simplifi a t tabli partir de ltude comparative des ARN ribosomiques 16 et 18 S ; toutes les donnes obtenues partir danalyses portant sur des gnes de protines trs divers confirment cette phylognie. Les squences concernant les mitochondries et les chloroplastes sont mentionnes pour montrer leur enracinement chez les Bactries (Bacteria) Gram ngatives.
II Lobservation des cellules vivantes au microscope photonique

Trs peu de cellules peuvent en fait tre observes directement, ltat vivant, au microscope photonique. Seules celles vivant ltat isol, telles que des bactries ou des Protistes, ou bien des cellules sanguines, des cellules pithliales (pidermiques chez les vgtaux), ou enfin des cellules en culture, sont suffisamment fines et transparentes pour tre analysables sans prparation particulire, cest--dire sans raliser de coupes. De plus, les cellules vivantes sont en gnral transparentes et incolores, ce qui rend impossible lanalyse fine de leurs structures internes. Les milieux de survie : si lobservation doit se prolonger, il faut utiliser des milieux de montage et des dispositifs appropris appels chambres de survie , dans lesquels les conditions physicochimiques sont troitement contrles. Il existe en outre des microscopes spcialement conus pour lobservation des cellules en culture, directement dans leur bote de milieu ; les objectifs sont situs sous la platine porte-objet et la lumire arrive par le dessus, puis traverse les parois transparentes de la bote de culture. On parle dans ce cas de microscope invers .
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Les techniques de coloration vitales : de nombreuses techniques de coloration utilisant des colorants dits vitaux , non toxiques, ont t dveloppes : le rouge neutre, par exemple, est un colorant qui saccumule spcifiquement dans les vacuoles vgtales. Ces mthodes sont actuellement dlaisses au profit de lemploi de microscopes photoniques auxquels des dispositifs physiques sont ajouts, de sorte que des structures incolores apparaissent visibles dans des teintes de gris plus ou moins fonces. Le microscope contraste de phase, par exemple, transforme des diffrences minimes dindice de rfraction de la lumire traversant les organites en diffrences dintensit lumineuse. Le microscope interfrentiel, bas sur un principe diffrent, fait apparatre les structures cellulaires en relief. Lutilisation de la fluorescence : les sondes dactivits mtaboliques sont des composs fluorescents permettant de visualiser actuellement tous les organites cellulaires, en temps rel, dans des cellules vivantes. De mme, linjection danticorps fluorescents qui reconnaissent des macromolcules spcifiques et les rendent ainsi visibles, sans perturber la physiologie cellulaire, est une technique trs importante. Enfin, lutilisation de la GFP (cf. fiche 28) est devenue, depuis un peu plus de 10 ans, une approche incontournable en Biologie Cellulaire.
Organisation des cellules animales

Complter les lgendes de ce schma (observation en microscopie lectronique) :
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Solution
Organisation des cellules bactriennes

Un schma de lorganisation gnrale des cellules bactriennes (Bacteria) observes en microscopie lectronique vous est propos : 1. distinguer les deux grands types de Bactries diffrant par leurs membranes (et paroi) et, 2. complter les lgendes.
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Solution
1. Bactrie Gram ngative (2 membranes et un peptidoglycane fin) et, 2. Gram positive (1 seule membrane, cytoplasmique, et un peptidoglycane trs pais). 3. Membrane cytoplasmique (bicouche lipidique avec des protines intgres). 4. Paroi, faite de peptidoglycane (molcule gante formant lenveloppe cellulaire). 5. Membrane externe, spcifique des Bactries Gram ngatives. 6. Ribosome (particule servant la synthse des protines). 7. Nuclode : molcule dADN circulaire constituant linformation gntique. 8. Pilus : filament protique servant la reconnaissance et ladhrence. 9. Granule de rserve : stockage de polysaccharides ou de protines. 10. Plasmide : mini chromosome circulaire (information gntique accessoire). 11. Polyribosome : suite de ribosomes fonctionnant sur un mme ARN messager. 12. Flagelle locomoteur, ancr dans la membrane cytoplasmique.
Mtabolismes bactriens
Une des caractristiques majeures des bactries en gnral, est lextrme diversit des mtabolismes quelles possdent, en comparaison de ceux dcrits chez les Eucaryotes. Les propositions suivantes illustrent bien la diversit de leurs types trophiques. Rpondre par Vrai ou Faux. 1. Les Cyanobactries effectuent une photosynthse trs particulire utilisant H2S. 2. Certaines espces dEubactries fabriquent du mthane partir de CO2 et H2. 3. Les bactries anarobies strictes meurent en prsence de O2. 4. Seul lazote organique est utilis par toutes les bactries pour leur mtabolisme. 5. Les Halobactries sont insensibles aux concentrations trs leves en sels. 6. Les bactries sont capables de mtaboliser le ptrole et ses drivs chimiques.
Solution
1. Faux : tout comme les Vgtaux verts, elles utilisent leau comme molcule donneuse dH2 et produisent de lO2. Seules les Bactries photosynthtiques vertes et pourpres utilisent H2S ou des composs soufrs reduits comme donneurs dH2. 2. Faux : cette proprit est rserve certaines Archbactries : les Mthanognes. 3. Vrai : en revanche, de nombreuses espces anarobies facultatives survivent en absence dO2 et modifient alors leur mtabolisme nergtique (fermentation). 4. Faux : de trs nombreuses espces tirent leur azote des sels minraux du milieu (NO3, NH4+) ou mme du diazote (N2) atmosphrique. 5. Vrai : non seulement ces Archbactries sont insensibles des concentrations salines extrmes, mais elles sont en fait tues par des solutions salines dilues. 6. Vrai : elles sont susceptibles de dgrader tous les composs organiques connus.
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FICHE
Les membranes biologiques
I Composition chimique et architecture des membranes

Toutes les membranes biologiques sont organises de la mme faon, quil sagisse de la membrane cytoplasmique propre chaque cellule ou des membranes internes caractristiques des Eucaryotes (organites). Elles contiennent, dans des proportions variables, trois types de molcules : des lipides, des protines et des glucides. Les lipides membranaires : ils reprsentent de 25 75 % de la masse des membranes et possdent une caractristique commune, lamphiphilie (ou amphipathie), cest-dire la prsence de deux domaines ayant des proprits physico-chimiques opposes dans la molcule : un domaine hydrophile et un domaine hydrophobe, constitu de deux acides gras. Cette proprit est capitale, car elle permet lautoassemblage en une bicouche : deux feuillets lipidiques accols par leurs domaines hydrophobes. On distingue : des phospholipides, construits partir de 2 alcools (glycrol ou bien sphingosine), de 2 acides gras, dune molcule dacide phosphorique et dune molcule polaire ; des glycolipides, contenant des motifs saccharidiques (sans ac. phosphorique) ; du cholestrol, abondant dans les membranes animales seules, et qui la diffrence des autres lipides, nest pas un ester dacides gras. Les protines : elles reprsentent aussi une proportion importante de cette masse : 20 75 %, selon les membranes cellulaires. Trs diversifies, ce sont elles qui contribuent rellement leur spcificit et qui assurent leurs fonctions particulires. Les glucides membranaires nexistent jamais ltat libre, mais sont toujours associs aux lipides (glycolipides) ou aux protines (glycoprotines). Architecture : elles sont toutes organises selon le modle dune bicouche lipidique fluide dans laquelle sont enchsses plus ou moins profondment les protines membranaires. On en distingue deux types, celles dites intrinsques (intgrales), et celles dites extrinsques (priphriques). Les premires sont solidement associes la bicou-
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che, quelles peuvent traverser de part en part (elles possdent alors un ou plusieurs domaines hydrophobes), ou dans laquelle elles sont ancres par des chanes de lipides ou dacides gras. Les secondes sont hydrophiles et lies aux premires par des liaisons faibles de surface. Tout comme les lipides, les protines peuvent se dplacer par diffusion latrale, au sein des membranes, mais sont incapables de basculer dun feuillet dans lautre.
II Les techniques dtude de la structure des membranes

Un nombre considrable dexpriences concernant larchitecture membranaire a t conduit sur les hmaties de Mammifres. Ces cellules trs diffrencies constituent un excellent modle biologique pour ce genre dtudes, car elles ne contiennent plus aucun organite et leur seule membrane est la membrane plasmique, qui peut donc tre aisment purifie aprs hmolyse puis centrifugation (on parle de fantmes dhmaties) ; elles peuvent en outre tre obtenues en trs grandes quantits. Techniques dhomognisation et de fractionnement cellulaire : diffrents protocoles (cf. fiche 15) ont t mis au point afin dobtenir, partir de ces hmaties, des vsicules membranaires dont la polarit est celle de la membrane plasmique de dpart (vsicules dites normales ), ou des vsicules dites retournes , dont la polarit est inverse, cest--dire que leur face externe correspond la face interne de la membrane plasmique initiale. tude de larchitecture des membranes : elle commence par la dissolution de la bicouche au moyen de dtergents, puis lidentification de toutes les protines membranaires est ralise aprs une lectrophorse dnaturante (cf. fiche 9). De mme, lanalyse des diffrents lipides est faite grce la chromatographie (cf. fiche 22). Cette approche globale est complte par une analyse de larchitecture prcise, cest--dire la position exacte des lipides dans chaque feuillet membranaire et la manire dont les protines sont disposes dans la bicouche (tude de lasymtrie membranaire). Les protines extrinsques sont dcroches de la membrane par des traitements doux tels que des changements de pH ou de force ionique du milieu. Techniques de marquage radioactif ou chimique : il est possible de marquer enzymatiquement certains groupements fonctionnels des protines ou des lipides grce des radio-isotopes (ou des composs fluorescents ; cf. fiche 8). Ceci se ralise soit sur des cellules entires et intactes, soit sur des cellules permabilises, soit enfin sur des vsicules artificielles normales ou retournes . Le marquage se faisant in vitro et laccessibilit de ces groupements ntant pas la mme vis--vis du marquage, selon les
FICHE 3 Les membranes biologiques
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diffrentes situations, lanalyse des molcules marques (aprs lectrophorse ou chromatographie) donnera des informations prcieuses sur leur orientation dans la bicouche. Utilisation denzymes : lanalyse des protines membranaires peut impliquer leur digestion par des peptidases spcifiques, suivie par llectrophorse des peptides obtenus. Les chanes glucidiques portes par les protines ou les lipides peuvent tre dcroches par des glycosidases ; ces chanes, tournes uniquement vers lextrieur des cellules, ne sont en effet accessibles que sur des cellules entires ou des vsicules normales obtenues in vitro. De la mme faon, les lipides sont digrs par des phospholipases, ce qui permet dtudier leur asymtrie de rpartition.
Organisation gnrale dune membrane plasmique

Schma lgender, en prcisant la polarit de la membrane.
Solution
1. extrieur de la cellule 2. intrieur de la cellule 3. bicouche lipidique 4. feuillet lipidique externe 5. feuillet lipidique interne 6. protine intrinsque ( un passage) 7. glycoprotine intrinsque 8. protine intrinsque ( trois passages) 9. protine intrinsque ancre lipidique 10. protine extrinsque externe 11. phospholipide 12. glycolipide 13. hlice alpha hydrophobe 14. domaine globulaire intracellulaire 15. domaine globulaire extracellulaire 16. motifs glycosidiques
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Constitution de la membrane de lhmatie
Les principaux constituants des membranes dhmaties humaines sont les phospholipides, le cholestrol et les protines, dans les proportions respectives suivantes (en masse) : 30 %, 10 % et 50 %. Leurs masses molculaires moyennes sont les suivantes, respectivement : 750 Da, 386 Da et 120 kDa. On admet que : a. le diamtre dun phospholipide (en place dans la bicouche) et celui du cholestrol sont voisins de 0,8 nm et, b. le diamtre dune protine transmembranaire est voisin de 3 nm. Surface dun cercle = r2. On se propose de calculer : 1. le nombre relatif de molcules de lipides et de protines intrinsques (leur rapport molaire) dans cette membrane, 2. leur nombre absolu dans un m 2 de surface de membrane.
Solution
1. Le calcul du nombre relatif de ces diffrentes molcules (rapport molaire) est bas sur la relation suivante : masse relative des molcules (en %) = nombre relatif de molcules masse molculaire. Les calculs sont les suivants : Phospholipides : 30 = a 750, do a = 0,04 Cholestrol : 10 = b 386, do b = 0,026 Protines : 50 = c 120 000, do c = 0,00041 Si on prend comme rfrence une seule molcule de protine, on convertit c en c = 1, ce qui donne, par simple proportionnalit : a = 97 molcules de phospholipides et b = 63 molcules de cholestrol (160 lipides en tout). Si on traduit ensuite ces donnes en termes de bicouche lipidique, on a donc une surface membranaire reprsente par 80 lipides : 48 phospholipides et 31 molcules de cholestrol environ dans chaque feuillet, si la rpartition y est identique. 2. La surface occupe par un lipide dans une bicouche est de : 3,14 0,4 0,4 = 0,5 nm2, soit 80 0,5 = 40 nm2 pour 80 lipides. La surface occupe par une protine est de : 3,14 1,5 1,5 = 7 nm2. La surface membranaire est donc constitue en moyenne de modules comprenant une protine pour 80 lipides, dont la surface est de 7 + 40 = 47 nm2. Dans 1 m 2 de surface membranaire, on compte donc 106/47 = 2,1 104 modules de ce type, soit 2,1 104 protines pour 1,68 106 lipides.
FICHE 3 Les membranes biologiques
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Architecture de la membrane dhmatie

Ltude des protines des membranes dhmaties humaines est conduite sur des fantmes obtenus aprs hmolyse et centrifugation. Une lectrophorse des protines extraites des culots membranaires (en prsence de SDS, cf. fiche 9) donne le profil prsent dans le gel 1, aprs coloration au bleu de Coomassie. partir des fantmes, on a ensuite ralis des vsicules retournes, qui montrent sur leur face externe les protines ou les domaines protiques normalement tourns vers lintrieur de la cellule. Un traitement avec une solution saline force ionique leve permet de dcrocher toutes les protines faiblement lies situes sur la face externe de ces vsicules. Le rsultat de llectrophorse des protines restant associes aux membranes est donn dans le gel 2. Une exprience identique ralise avec des vsicules normales donne le mme profil que le gel 1. Enfin, un traitement par une glycosidase est effectu sur ces protines fortement associes aux membranes, avant llectrophorse ; pour le rsultat, voir le gel 3. Quelles conclusions tirez-vous de lanalyse des trois gels ?
Les masses molculaires des protines sont exprimes en kDaltons.
Solution
1. Le gel 1 montre lensemble des protines contenues dans la membrane de lhmatie. On en compte 12, dont les masses molculaires vont de 240 33 kDa. 2. Sur le gel 2, on nobserve plus que deux bandes (100 et 90 kDa) ; il sagit donc de protines intrinsques, car toutes les protines extrinsques internes de la membrane native ont t limines par le traitement salin. Lexprience faite avec des vsicules normales montre quil nexiste pas de protines extrinsques externes, car aucune protine na t limine (dcroche). 3. Le gel 3 montre que la plus petite des protines intrinsques, aprs action de la glycosidase, voit sa masse molculaire trs diminue : elle est donc glycosyle.
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FICHE
Les transports membranaires

I Permabilit des membranes et transporteurs membranaires
La membrane cytoplasmique, interface entre la cellule et son environnement, est le lieu de passage de trs nombreux composs minraux et organiques qui alimentent le mtabolisme cellulaire ou qui sont vacus en tant que dchets. Seules les molcules hydrophobes, les gaz dissous, leau et les molcules hydrophiles (polaires) non charges, de faible masse molculaire, franchissent les bicouches phospholipidiques avec une certaine facilit, sous laction de la seule diffusion. Les transporteurs membranaires : tous les composs polaires de masse leve, les molcules organiques charges et les ions minraux sont totalement arrts par ces mmes bicouches ; or, tous sont dune importance capitale pour le fonctionnement des cellules (mtabolisme, potentiel de membrane). Pour pntrer dans les cellules, ces derniers doivent donc emprunter des dispositifs appropris, constitus par des canaux, des pores ou des protines porteuses : il sagit de protines transmembranaires de grande taille, souvent constitues de plusieurs sous-units, qui fonctionnent de deux faons trs diffrentes. Les transports passifs facilits : ces transporteurs acclrent les transports par diffusion en constituant de simples orifices slectifs travers la bicouche (canaux ioniques et pores, tels que les aquaporines), ou en fonctionnant la manire des enzymes, cest-dire en reconnaissant la molcule internaliser au niveau dun site spcifique, et en subissant un changement de conformation qui amne la molcule de lautre ct de la membrane (protines porteuses ou permases). Les transports actifs : ils permettent de faire passer des molcules ou des ions dans le sens contraire de leur gradient lectrochimique (contre les forces de diffusion), en utilisant donc une source dnergie. On en distingue deux types : 1) les transports actifs primaires, qui utilisent lhydrolyse de lATP comme source dnergie (pompe Na/K ATP dpendante), et 2) les transports actifs secondaires, qui impliquent un transport coupl (cotransport) entre un ion dit moteur , qui suit son
FICHE 4 Les transports membranaires
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gradient lectrochimique (par diffusion) et entrane en mme temps (par symport ou antiport) le mouvement dune molcule organique ou dun autre ion dans le sens inverse de leur propre gradient (transport actif). Le maintien du gradient de lion moteur ncessite videmment lintervention dune pompe ATP dpendante. Il existe enfin une catgorie universelle et trs originale de transporteurs actifs consommant de lATP, les transporteurs dits ABC , qui ne peuvent tre tudis en dtail ici. Trs reprsents dans toutes les cellules, ils sont capables de transporter toutes sortes de composs, depuis les ions minraux jusquaux protines !
II Lutilisation de la fluorescence pour ltude des membranes

La fluorescence est la proprit dune substance capable dabsorber certaines longueurs donde de la lumire et de rmettre une lumire de longueur donde diffrente, mais toujours de moindre nergie. De trs nombreuses petites molcules artificielles, nommes fluorochromes, ont cette proprit ; ces composs peuvent tre fixs de faon covalente des protines telles que les anticorps, ce qui permet de les rendre visibles par immunofluorescence (cf. fiche 8). La technique de FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) : elle permet dtudier les proprits de fluidit des membranes. Une protine spcifique de la membrane plasmique dune cellule vivante en culture (cf. fiche 14) est dabord reconnue par des anticorps coupls un fluorochrome. Sous le microscope, cette cellule est ensuite claire trs localement par un fin faisceau laser qui dtruit le fluorochrome. La fluorescence de la zone ayant ainsi subi cette extinction (photo-bleaching, ou blanchiment) est ensuite mesure au cours du temps ; on observe habituellement que celle-ci rapparat petit petit et retrouve une valeur identique celle de la membrane environnante (mais infrieure celle mesure initialement). Ce phnomne sexplique par la diffusion latrale des protines, celles portant des anticorps intacts pntrant dans la zone irradie, et celles portant des anticorps teints diffusant dans le reste de la membrane plasmique. Selon la vitesse laquelle lhomognisation (fluorescence recovery) est atteinte, on dfinit un coefficient de diffusion latrale qui est caractristique dune protine donne. La technique de FLIP (fluorescence loss in photobleaching) : elle est base sur un principe voisin : une zone de la cellule dont les protines membranaires sont rendues fluorescentes est irradie en permanence, et on mesure la diminution de fluorescence (loss) dans une zone non irradie. La vitesse laquelle la fluorescence diminue permet de savoir quelle vitesse les protines diffusent en dehors du territoire irradi et sont remplaces par des molcules intactes irradies leur tour.
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La technique de FRET (fluorescence resonance energy transfer) : son principe est le suivant : la lumire mise par un fluorochrome peut en faire fluorescer un second si la longueur donde est approprie et si les deux molcules sont en troit contact. Si on excite le premier fluorochrome avec une lumire excitatrice donne, on peut ainsi observer la lumire rmise par le second. Grce ce principe, on peut tudier les interactions entre protines, quelles soient en solution ou quelles soient membranaires (cas des rcepteurs, par exemple ; cf. fiches 5 et 28).
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Permabilit des hmaties de Mammifre
La permabilit de la membrane des hmaties vis--vis du glucose a t tudie au moyen des isomres radiomarqus de cette molcule : le L-glucose et le D-glucose. Aprs des temps dincubation varis ( 37 C) dans une solution de glucose 10 mM de chaque type, les cellules sont centrifuges 4 C et la radioactivit associe au culot est mesure. Les courbes obtenues sont prsentes dans le graphe suivant () :
1. Quelle hypothse doit-on exclure concernant le transport du glucose travers la membrane de lhmatie ? Justifier la rponse. La mesure de la concentration intracellulaire maximale en D-glucose (atteinte en 15 minutes, courbe ), montre quelle est gale la concentration extracellulaire : 2. Quel mcanisme physique est mis en jeu dans le transport du D-glucose, et comment appelle-t-on ce type de transport ? Les transports du D-galactose et du D-mannose (isomres du glucose) radioactifs ont t tudis dans les mmes conditions exprimentales, et les rsultats sont donns dans le graphe . 3. Que pensez-vous de lefficacit du transport de ces molcules, en comparaison de celle du D-glucose ?
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Lorsquon ajoute la solution de D-glucose radioactif (10 mM) extracellulaire du Dgalactose ou du D-mannose une concentration de 200 mM, on observe que la pntration du glucose dans les hmaties est significativement ralentie. 4. En rassemblant les donnes obtenues avec ces expriences, quelles conclusions peut-on tirer concernant les mcanismes du transport du glucose dans ces cellules ?
Solution
1. Le D-glucose et le L-glucose sont des isomres (mme masse molculaire) ; on peut donc exclure un phnomne de diffusion simple, car le seul paramtre en jeu (outre les proprits physico-chimiques, ici identiques) serait ici la taille. 2. Lgalit des concentrations de part et dautre de la membrane permet de confirmer quun phnomne (passif) de diffusion rgit le transport du D-glucose. 3. Le transport du D-galactose et du D-mannose (mme masse molculaire) est possible, mais avec une efficacit beaucoup plus faible que pour le glucose. Seuls les isomres D des oses sont utilisables par les cellules et sont capables dy rentrer. 4. Si le mannose ou le galactose ralentissent la pntration du glucose, cest parce quils entrent en comptition avec lui au niveau dun transporteur spcifique (capable de discriminer des isomres). Le modle que lon peut tablir est le suivant : il sagit dun transport diffusif, susceptible dtre inhib par des analogues chimiques du D-glucose, et qui est li la prsence dune protine porteuse catalysant une diffusion facilite. Il sagit du transporteur nomm GLUT 1.
Pntration du glucose dans les entrocytes

La permabilit de la membrane apicale des entrocytes vis--vis du glucose est tudie sur des fragments dintestin grle de Mammifre. Lpithlium intestinal est unistratifi et constitu en majorit de cellules absorbantes : les entrocytes. Des fragments dintestin grle sont prlevs et maintenus en culture ; une solution de glucose radiomarqu est introduite dans la lumire, puis la radioactivit intra-cellulaire est value aprs des temps de mise en contact croissants. Linfluence de la concentration extracellulaire en Na+ (du ct apical des cellules) sur le transport du glucose a t tudie ; les courbes suivantes traduisent les effets de concentrations croissantes en Na+ sur le rapport : concentration intracellulaire en glucose/concentration extracellulaire (identique dans les diverses expriences) :
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1. Quel est leffet de la concentration en Na+ (mM) sur le transport du glucose ? 2. Daprs lanalyse des valeurs obtenues pour le rapport des concentrations en glucose, que pensez-vous du mcanisme de transport de cette molcule ? Quel type de transporteur doit-on invoquer, dans une telle situation ? Lorsque les fragments dintestin sont mis en prsence (du ct externe) de ouabane, un compos connu pour inhiber la pompe membranaire Na/K ATPase, on observe que la pntration du glucose dans les entrocytes est trs rapidement inhibe. 3. Quel lien tablissez-vous entre cette dernire observation et le mcanisme de transport qui a t mis en vidence plus haut ?
Solution
1. La concentration extracellulaire en Na+ influe beaucoup sur la pntration du glucose ; plus celle-ci est leve du ct apical des cellules et plus il entre aisment (rappel : la concentration normale du milieu intrieur en Na+ = 145 mM). 2. Les concentrations intracellulaires en glucose peuvent tre dix fois plus leves que celle mesure lextrieur ; il sagit donc dun transport qui seffectue contre un gradient de concentration de cette molcule (dans le sens inverse de celui dict par la diffusion), et donc dun transport actif. On doit donc voquer le rle dune molcule porteuse de glucose fonctionnant en consommant une source dnergie. 3. Larrt de lactivit de cette pompe, qui chasse en permanence les ions Na+ vers le milieu extrieur, conduit rapidement laugmentation de sa concentration intracellulaire ; la diffrence de concentration entre milieu extracellulaire et cytoplasme disparat. Ce fait doit tre corrl avec larrt de lentre du glucose, qui est sous le contrle de la concentration extracellulaire en Na+. Cest en fait le gradient transmembranaire en cet ion, du ct apical de lentrocyte, qui permet un transporteur actif de type secondaire activ par le Na+, par un cotransport de type symport, lentre du glucose situ dans la lumire de lintestin grle (SGLT 1).
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FICHE
Lendocytose, lexocytose et le bourgeonnement
I Des dformations membranaires

Les cellules eucaryotiques sont capables dchanger des macromolcules ou des particules de grande taille avec leur milieu, par le biais de structures vsiculaires impliquant des dformations de la membrane plasmique, parfois de grande ampleur. Lendocytose permet lentre de matriel exogne grce des vsicules issues dune invagination de la membrane plasmique. Selon leur taille, on distingue la pinocytose (vsicules de 100 200 nm), et la phagocytose (vsicules dont la taille atteint plusieurs m). Le premier processus prsente diverses variantes ; en effet, il peut impliquer ou non des protines de structuration spcialises, telles que la clathrine, et il met en jeu ou non des rcepteurs membranaires. Ces derniers possdent un gros domaine extracellulaire permettant de fixer un ligand spcifique ; lors de lendocytose, ils sont entrans dans les vsicules, mais ils font gnralement lobjet dun recyclage, en tant renvoys vers la membrane plasmique par exocytose. Les ligands absorbs sont dirigs vers une voie de digestion intracellulaire mettant en jeu les lysosomes (cf. fiche 19), et les mtabolites obtenus passent ensuite dans le cytosol. La phagocytose est le seul moyen pour de nombreux Protistes de se procurer leur nourriture ; chez les tres multicellulaires, des cellules phagocytaires spcialises interviennent dans les processus de dfense : les macrophages, par exemple, en liminent les virus, les bactries ou les cellules vieillissantes. Lexocytose permet, grce des vsicules dorigine interne fusionnant avec la membrane plasmique, lapport de matriel cette dernire et la scrtion de divers composs dans le milieu extrieur : protines, polysaccharides et glycoprotines issus du Rticulum endoplasmique et/ou de lappareil de Golgi (cf. fiche 17). Le bourgeonnement est un phnomne plus rare ne concernant que certaines cellules infectes par des virus qui, aprs avoir t reproduits par cette dernire, la quittent en emportant un morceau de membrane plasmique (qui devient alors leur propre
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enveloppe) ; cf. fiche 30. Les bourgeons ou les vsicules ainsi forms la surface cellulaire sont aisment observables en microscopie lectronique balayage.
II Le microscope lectronique balayage

Comme tout microscope lectronique (cf. fiche 1), cet appareil utilise un faisceau dlectrons fortement acclr sous vide pour produire une image trs agrandie de lobjet. la diffrence du microscope lectronique transmission (MET), o le faisceau dlectrons traverse lobjet (ncessairement trs fin), celui-ci est ici rflchi par la surface de lchantillon. Par analogie avec les instruments doptique photonique, ce microscope est donc quivalent une loupe classique, qui permet dobserver simplement la lumire rflchie par les objets, mais nautorise pas lanalyse de leur organisation interne. Principe du fonctionnement de lappareil : un trs fin faisceau dlectrons (de lordre du nm de diamtre) est acclr sous quelques milliers de volts (rappel : 105 volts pour le MET) et focalis sur le plan de lobjet au moyen dune seule lentille lectromagntique. Ce faisceau balaye trs rapidement la surface observer ; lobjet observer est ainsi bombard par des lectrons qui rebondissent en gnral sur sa surface, sans pntrer lintrieur. En fonction de la gomtrie de cette surface, la rflexion des lectrons se fait donc dans diffrentes directions de lespace ; dautres lectrons peuvent aussi tre arrachs cette surface ; un dtecteur dlectrons est dispos dans la colonne du microscope, proximit de lobjet, et il est charg de rcuprer ceux qui sont rflchis ou rmis dans sa direction. On comprend bien que le nombre dlectrons diffuss ou mis par chaque point de lobjet, puis dtects par lappareil, est variable selon langle sous lequel le faisceau rencontre la surface de lobjet ; le signal fourni par le dtecteur est trait puis envoy vers un cran de tlvision, et le balayage rgulier du faisceau sur lobjet est coupl au balayage du spot lumineux formant limage sur lcran. Limage obtenue est ainsi forme de zones claires ou sombres donnant une impression de relief trs spectaculaire. Rsolution du microscope balayage : elle est infrieure celle du MET et atteint au mieux 2 nm ; en revanche la profondeur de champ est trs importante aux faibles grossissements, et il est possible dobserver des objets de taille relativement grande (de lordre du mm). Le matriel est en gnral fix et recouvert dune trs fine couche de mtal (par ombrage mtallique, cf. fiche 3), afin de favoriser la rflexion des lectrons, mais il peut aussi tre congel et observ directement.
FICHE 5 Lendocytose, lexocytose et le bourgeonnement
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Mcanismes de lendocytose du fer

Le Fer, comme de nombreux autres composs, circule dans le sang sous une forme lie une protine nomme apotransferrine ; le complexe form avec le Fer (une molcule de protine lie deux ions Fe3+) porte le nom de ferrotransferrine. Les cellules de notre organisme possdent leur surface des rcepteurs qui lient spcifiquement la ferrotransferrine, mais sont incapables de lier lapotransferrine seule. Ces rcepteurs chargs permettent, par endocytose, la capture du fer par les cellules ; ce dernier est indispensable de nombreuses enzymes. Les chercheurs disposent dapotransferrine purifie et marque radioactivement au 35S, dune part, et de fer radioactif (59Fe), dautre part. On peut ainsi obtenir de la ferrotransferrine marque soit sur le Fer, soit sur sa partie protique. Les expriences suivantes ont pour but dtudier les mcanismes de lendocytose du Fer. 1) Deux lots de cellules humaines en culture sont mis en prsence, pendant 30 minutes et 4 C, de ferrotransferrine marque soit grce au Fer, soit dans sa partie protique. Aprs cette incubation, les cellules sont remises en culture dans un milieu neuf, dpourvu de fer et de ferrotransferrine, et 37 C. 2) Des prlvements de cellules sont ensuite effectus dans les deux lots, au cours du temps (20 min), et deux types de mesures sont raliss sur ces cellules : la radioactivit prsente leur surface (courbe 1), mesure en dcrochant le ligand de son rcepteur grce une solution de force ionique leve ; la radioactivit prsente dans les cellules aprs ce traitement (courbe 2). Simultanment, la radioactivit du milieu de culture est mesure pendant toute la dure de lexprience (courbe 3). Les graphes suivants montrent lvolution de ces trois types de mesures, exprimes en %, au cours du temps.
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1. Pour quelles raisons les cellules sont-elles dabord mises 4 C, en prsence de ferrotransferrine radioactive ? 2. Comment la radioactivit en surface des cellules volue-t-elle au cours de ces deux expriences ? Comment interprtez-vous ces rsultats ? 3. Comment la radioactivit associe au Fer et celle associe la protine voluentelles pendant les 5 premires minutes, dans les deux expriences ? Comment interprtez-vous ces rsultats ? 4. Comment la radioactivit associe au Fer et celle associe la protine voluentelles au cours de la suite de lexprience ? Comment interprtez-vous ces rsultats ? 5. Pourquoi la radioactivit mesure dans le milieu de culture volue-t-elle diffremment dans les deux expriences ? Quelle relation faites-vous avec les rsultats analyss dans la question 3, aprs 5 min dincubation des cellules ? 6. partir de lensemble de ces donnes, schmatiser lhistoire des rcepteurs ainsi que celle de la ferrotransferrine au cours du processus dendocytose du Fer.
Solution
1. 4 C, les membranes biologiques sont figes et tous les phnomnes lis la fluidit membranaire : la diffusion latrale des protines (ici, les rcepteurs) et lendocytose, sont supprims. La fixation de la ferrotransferrine (ici, le ligand) sur son rcepteur nest pas, en revanche, affecte. Aprs 30 min dincubation, tous les rcepteurs ont li leur protine, et le passage 37 C provoquera lendocytose simultane et immdiate de tous ces rcepteurs chargs : synchronisation du phnomne to, dbut des mesures de radioactivit. 2. Au cours du temps, la radioactivit en surface diminue rapidement dans les deux expriences, ce qui montre linternalisation par endocytose de tous les rcepteurs chargs ; elle est presque complte au bout de 20 minutes. 3. Lorsquon mesure la radioactivit lie au Fer pendant les 5 premires minutes, on observe son accumulation rgulire dans le cytoplasme selon une courbe symtrique de celle vue pour la radioactivit mesure en surface ; il faut noter que 50 % de la ferrotransferrine fixe en surface par les rcepteurs est dj entre dans les cellules au bout de 5 minutes ! Lorsquon mesure la radioactivit lie la partie protique (apotransferrine) pendant les premires minutes, la courbe montre une accumulation rapide dans la cellule, mais qui semble nettement sattnuer lorsquon atteint les 5 minutes. Ceci montre galement que les rcepteurs entrent dans les cellules par endocytose. 4. La radioactivit lie au fer continue daugmenter dans les cellules, et tout le Fer fix par la ferrotransferrine est finalement absorb au bout de 25 minutes. En revanche, la radioactivit lie lapotransferrine a un comportement trs diffrent de celle du Fer puisquelle diminue partir de 5 minutes, pour atteindre une valeur quasi
FICHE 5 Lendocytose, lexocytose et le bourgeonnement
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nulle au bout de 30 minutes. Ceci montre clairement que le devenir du Fer et celui de la protine qui le fixe sont trs diffrents ; ces deux composantes de la ferrotransferrine doivent donc se dissocier un moment de cette histoire. 5. On ne retrouve jamais de radioactivit lie au Fer dans le milieu de culture, au cours de lexprience, ce qui montre que tout le fer fix est entr dans les cellules de faon irrversible. En revanche, on retrouve de la radioactivit lie lapotransferrine dans le milieu, ce qui montre que cette protine a t exocyte et donc libre de son rcepteur, aprs que ce dernier soit retourn en surface de la cellule. 6. Le rcapitulatif de tous ces vnements est donn sous la forme dun schma gnral montrant les rles respectifs de lendocytose et de lexocytose des protines impliques dans ces processus, ainsi que les compartiments mis en jeu.
Le cycle de la transferrine dans les cellules
La sortie des ions Fe3+ des endosomes se fait par un mcanisme encore mal connu.
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FICHE
Les jonctions membranaires des cellules animales

I Organisation et rles des jonctions intercellulaires
Les cellules animales diffrencies sorganisent en ensembles homognes appels tissus grce divers dispositifs membranaires qui accrochent solidement les cellules entre elles, ou assurent une communication directe entre cytoplasmes. Les pithliums, tissus qui bordent les cavits internes des organismes ou recouvrent leur surface, sont les plus riches en jonctions, qui leur confrent leur rsistance mcanique. Sur la base de leurs fonctions, on dcrit trois types de jonctions. Les jonctions tanches (ou serres ) : elles sont situes dans la partie apicale des cellules et forment une ceinture de points de soudure entre les membranes adjacentes, qui sont donc trs rapproches. Ces points de contact stablissent directement entre des protines transmembranaires identiques de chaque cellule. Les points de soudure jointifs sorganisent en nombreuses lignes ramifies plus ou moins parallles, de sorte que cette ceinture est parfaitement tanche et ne laisse passer aucun composant de part et dautre de la couche de cellules voisines. Les jonctions dancrage : il en existe deux types, celles qui accrochent les cellules entre elles et celles qui accrochent les cellules leur lame basale (cf. fiche 27) ; toutes deux ont des relations directes avec le cytosquelette (cf. fiche 7). les ceintures dadhrence sont situes dans la partie apicale des cellules pithliales ; elles sont formes de faisceaux de microfilaments dactine parallles la membrane plasmique. Les ceintures de deux cellules voisines sont en contact troit grce des protines transmembranaires de type cadhrines. les desmosomes ponctuels sont situs sur les faces latrales des cellules. Ils sont forms de deux disques intracellulaires disposs lun en face de lautre, relis par des protines transmembranaires de type cadhrines ; ils entrent en contact avec les filaments intermdiaires du cytosquelette (la kratine, par exemple).
FICHE 6 Les jonctions membranaires des cellules animales
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les hmidesmosomes et les points de contact focaux sont des dispositifs ponctuels daccrochage des cellules pithliales sur leur lame basale ; ils relient respectivement les filaments intermdiaires et les microfilaments du cytosquelette cette dernire grce des protines transmembranaires (intgrines).
Les jonctions communicantes (jonctions dites gap ) et les plasmodesmes : les premires sont spcifiques des cellules animales ; il sagit de structures en forme de disques disposs en vis--vis dans chaque cellule, forms dune multitude de petits canaux juxtaposs constitus de protines transmembranaires. Elles permettent le passage dions et de molcules de taille infrieure 1 000 Daltons. Les seconds sont des dispositifs dchange entre cytoplasmes spcifiques des Vgtaux.
II Cryofracture et cryoddapage
Ces techniques de microscopie lectronique permettent lobservation cytologique de tissus massifs dont elles donnent une vue interne trs diffrente de celle obtenue par les coupes conventionnelles, en particulier en ce qui concerne les membranes. Principe : on ralise une fixation physique de lchantillon : le matriel biologique est congel trs rapidement et trs basse temprature (azote liquide : 196 C), de faon que des cristaux de glace naient pas le temps de se former (vitrification). Le bloc congel est ensuite cass grce un petit marteau, et non coup ; on obtient ainsi une surface de fracture de lchantillon, qui nest pas plane mais rugueuse. La gomtrie de cette surface est localement dtermine par la rsistance mcanique de la matire rencontre et la forme des structures fractures. Les rpliques : le problme technique consiste visualiser les plus fins dtails de cette surface irrgulire au moyen dun microscope lectronique. Grce au protocole dombrage mtallique (cf. fiche 11), ralis de faon unilatrale et sous un angle assez inclin, on recouvre la surface de lchantillon par un trs fin film de mtal (or, platine), toujours trs basse temprature videmment. Une couche de carbone, lui aussi vaporis sous vide, permet ensuite de combler les zones de la surface non atteintes par le mtal et de renforcer la pellicule ainsi ralise. Ce trs fin moulage de la surface, appel rplique, est ensuite dcoll de lchantillon aprs dconglation, soigneusement nettoy et enfin dpos sur une grille de microscope lectronique pour une observation en transmission. Les images : le mtal stant accumul plus ou moins fortement selon les reliefs de la surface, il constitue un obstacle plus ou moins grand aux lectrons, ce qui permet de donner une image en relief des structures. Les premires images fournies par cette technique ont compltement drout les observateurs, car laspect granuleux des membra-
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nes tait inattendu, compte tenu des modles membranaires ayant cours avant lpoque de sa mise au point. Lobservation des membranes : de faon gnrale, celles-ci sont des zones de fragilit et la cassure passe trs souvent lintrieur des bicouches lipidiques ; les organites sphriques sont arrachs ou scalps et ils apparaissent alors sous la forme de creux ou de bosses. De mme, lintrieur des membranes, les protines membranaires se prsentent sous la forme de globules en relief ou de petits creux, lorsquelles ont t arraches de la bicouche.
changes entre cellules confluentes

Une culture de cellules animales a t conduite jusqu ce que pratiquement toutes les cellules recouvrent le fond de la bote de Petri (cellules dites en monocouche confluente). laide dune microseringue pilote par un micromanipulateur associ un microscope invers, il est possible dinjecter un volume de liquide de quelques nanolitres dans une seule cellule vivante, et ceci sans la dtriorer. Afin dtudier le type de relations tablies entre des cellules troitement jointives, les expriences suivantes ont t effectues : 1) Une solution de glycine (un acide amin, de masse molculaire 75 Da) radioactive a t injecte dans une cellule et la prsence de cet acide amin dans les cellules voisines a t dtecte 5 minutes aprs linjection, grce la technique autoradiographique : fixation des cellules, dpt dune mulsion photosensible sur les cellules fixes et rvlation aprs une semaine dexposition (cf. fiche 17). 2) Une solution de fluorescine (une molcule fluorescente = fluorochrome, de masse molculaire 332 Da) a t injecte de la mme faon, et la prsence de cette molcule dans les cellules voisines a t directement visualise 5 minutes aprs linjection grce un microscope fluorescence (cf. fiche 8). 3) Une solution de peroxydase de raifort (une enzyme, dont la masse molculaire est de 40 000 Da, produisant une raction vivement colore dans des cellules vivantes, si on leur fournit un substrat appropri) a t injecte de la mme faon, et la prsence de lenzyme dans les cellules voisines a t observe 5 minutes aprs linjection grce un microscope photonique classique (cf. fiche 2). titre de tmoin dans chaque exprience, quelques cellules compltement spares du lot tudi, cest--dire sans connexions directes ou indirectes avec la cellule injecte, ont t tudies de la mme faon. Les rsultats obtenus sont les suivants : pour la glycine radioactive, un grand nombre de cellules disposes de faon concentrique autour de celle injecte, mais nayant pas ncessairement de rapport direct avec elle, donnent une rponse positive lautoradiographie ;
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pour la fluorescine, seules les quelques cellules immdiatement en contact avec la cellule injecte montrent une fluorescence verte ; pour la peroxydase, seule la cellule injecte montre une coloration spcifique de la raction que cette enzyme catalyse ; dans tous les cas, une cellule nayant aucun contact direct ou indirect avec la cellule injecte ne donne jamais de rponse positive. Quelles explications pouvez-vous donner cet ensemble de rsultats et quelles autres expriences proposez-vous pour vrifier vos hypothses ?
Solution
1. Ces expriences montrent clairement que les cellules en culture, lorsquelles sont jointives, sont capables dchanger des molcules cytosoliques ; nanmoins, lintensit de ces changes diffre selon le type de molcule tudi. 2. Il est clair que la masse molculaire est un facteur dterminant : une petite molcule, comme la glycine, passe trs facilement dune cellule lautre, tandis quune macromolcule, comme la peroxydase, reste confine dans le cytoplasme de la cellule o on la injecte. La fluorescine prsente une situation intermdiaire, car au bout du mme temps, seules les cellules les plus proches de celle injecte ont rcupr cette molcule. 3. Ceci suggre lhypothse dune barrire intercellulaire fonctionnant sur le mode dun tamis, cest--dire par une slection sur la taille. Le fait que des cellules isoles ne puissent recevoir la molcule injecte montre quil ne sagit pas dun simple passage de type permation (utilisant des transporteurs ou non ; cf. fiche 4) travers la membrane plasmique, et ensuite par lintermdiaire du milieu extracellulaire. 4. Ces rsultats suggrent donc lexistence de canaux transmembranaires faisant communiquer directement les cytoplasmes de deux cellules voisines. Lobservation en microscopie lectronique des membranes latrales de ces cellules jointives, en particulier au moyen de la technique de cryofracture/cryodcapage, montre la prsence des nombreux et minuscules canaux (les connexons) organiss en disques, et constituant les jonctions communicantes. 5. Des expriences lectrophysiologiques (cf. fiche 29), qui consistent mesurer un courant lectrique circulant entre deux lectrodes plantes dans deux cellules distinctes, est aussi un moyen de montrer lexistence directe dun flux important dions entre elles. On sait que les cellules musculaires cardiaques coordonnent leur contraction grce des changes ioniques assurs par ces jonctions communicantes, et quil en est de mme pour la diffrenciation des cellules embryonnaires.
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Calcium et jonctions intercellulaires

Une ligne de cellules de rein (cf. fiche 14) forme en culture un pithlium serr semblable celui obtenu dans lorganisme, avec une polarisation apico/basale des cellules trs nette et des jonctions sur leurs faces latrales tout fait identiques. On dispose de liposomes marqus avec des lipides fluorescents, et il est possible de les faire fusionner in vitro avec ces cellules en culture. Deux expriences sont ralises : 1) Les liposomes marqus sont mis en contact avec les cellules pithliales dans leur milieu de culture habituel. 2) Ces mmes liposomes sont mis en contact avec les cellules, mais dans un milieu dpourvu en Ca2+, condition exprimentale bien connue pour provoquer la dissociation des cellules. Lobservation ultrieure des cellules avec un microscope fluorescence montre que, dans la premire exprience, seule la face apicale des cellules est visible, alors que dans la deuxime, lensemble de la membrane plasmique est devenu fluorescent. Comment interprtez-vous ces observations ?
Solution
1. Lorsque lpithlium est intact, les liposomes introduisent des lipides marqus uniquement dans la bicouche de la partie apicale des cellules. Lobservation montre que ceux-ci restent confins dans cette zone, car seule la membrane apicale des cellules est devenue fluorescente. Or, en raison de la fluidit membranaire trs importante pour les lipides, on pourrait penser que les lipides marqus puissent rejoindre le domaine membranaire basolatral. 2. Lorsque les cellules sont dissocies, les liposomes peuvent introduire des molcules marques dans tous les domaines membranaires, et la fluorescence concerne alors toute la cellule. Ces rsultats dmontrent clairement lexistence dune barrire de diffusion latrale des lipides (qui concerne aussi les protines), situe dans la partie apicale du domaine basolatral, et constitue par les jonctions tanches, dites aussi "serres". Cette barrire est responsable de la rgionalisation des protines membranaires, qui permet la polarit fonctionnelle de ces cellules.
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FICHE
Le rle architectural du cytosquelette
I Les rseaux cytosquelettiques des cellules animales

Le cytoplasme des cellules eucaryotiques est parcouru par plusieurs rseaux denses de filaments et de tubules qui leur confrent leur solidit, organisent leur cytoplasme et participent la localisation des organites ; ils y assurent galement des fonctions dynamiques (cf. fiche 8). On rappelle que ces rseaux sont en rapport direct avec les jonctions intercellulaires (cf. fiche 6). La notion de cytosquelette na t dgage qu la fin des annes 1970, grce aux perfectionnements des techniques dimmunoddection, mme si ses lments constitutifs avaient t observs au microscope lectronique depuis les annes 1960. Les rseaux cytosquelettiques sont aisment observables grce lutilisation de limmunofluorescence, qui prsente lintrt de les mettre en vidence lchelle de la cellule entire, et permet donc de mesurer leur importance relle. Dans les cellules animales, le rseau de microtubules qui remplit le cytoplasme rayonne partir dun centre organisateur gnralement situ proximit du noyau, le centrosome ; les microfilaments se rencontrent gnralement dans la zone corticale des cellules, o ils se prsentent sous la forme de cbles rigides et souvent tendus dun ct lautre de la cellule ; enfin, un troisime rseau (absent des cellules vgtales), celui des filaments intermdiaires, plus sinueux que celui des microtubules, parcourt en tous sens le cytoplasme, sans quaucun centre organisateur soit dcelable. Les molcules et les structures cytosquelettiques : les microtubules sont des tubes de 25 nm de diamtre, forms de molcules globulaires de tubuline (dimres ) organises en 13 protofilaments polariss disposs paralllement les uns aux autres ; les microfilaments sont forms de molcules globulaires dactine disposes les unes la suite des autres pour former une sorte dhlice de 7 nm dpaisseur, elle aussi structuralement et fonctionnellement polarise ; les filaments intermdiaires sont constitus de molcules fibreuses (de type kratine dans les cellules pithliales) entortilles les unes autour des autres la manire dun cordage de 9 11 nm dpaisseur.
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Les proprits de ces trois types de filaments sont trs diffrentes, les deux premiers tant particulirement dynamiques alors que le dernier est au contraire trs stable.
II Les techniques de dtection immunocytochimiques

Ces techniques de dtection cytologique de protines individuelles (et donc des structures qui les contiennent) sont un outil danalyse trs puissant. Elles utilisent le principe dune reconnaissance spcifique entre un anticorps et la protine contre laquelle il est dirig : lantigne ; on parle alors de complexe immun. Linjection rpte de lantigne chez un Mammifre (lapin, chvre) provoque la fabrication, dans le srum de ce dernier (grce ses lymphocytes B) dun mlange dimmunoglobulines spcifiques de chacun des pitopes de lantigne. On parle danticorps polyclonaux car ce srum contient un mlange danticorps fabriqus par diffrents lymphocytes B, aprs slection clonale. Le marquage des anticorps : diffrentes molcules (marqueurs) sont greffes aux anticorps, ce qui permet de les visualiser au microscope : quand ils sont marqus grce des colorants fluorescents tels que la fluorescine ou la rhodamine (fluorochromes), il est possible de visualiser in situ les complexes immuns grce un microscope fluorescence (cf. fiches 7 et 8) ; lorsque de minuscules billes dor collodal de quelques nm de diamtre (trs opaques aux lectrons) leur sont fixes, on utilise le microscope lectronique ; si on leur greffe des enzymes telles que la phosphatase alcaline, on peut obtenir des sensibilits de rponse trs leves. En effet, lorsque celle-ci est mise en prsence dun substrat appropri, elle produit du phosphate inorganique qui est visualis travers une raction colore. Laccumulation des produits de raction tant proportionnelle au temps dincubation, des quantits infimes de complexe immun et de protine cible peuvent donc tre dtectes au microscope photonique. Limmunocytochimie indirecte : bien quil soit possible de marquer les anticorps directement dirigs contre la protine cible, nomms anticorps primaires (AC I), les performances de la technique sont grandement amliores lorsquon utilise le principe de limmunocytochimie indirecte. Des anticorps dits secondaires (AC II) reconnaissant trs spcifiquement les AC I sont alors mis en uvre ; ils sont fabriqus, de faon classique, chez une autre espce danimal que celle qui a servi obtenir lAC I, par injection dimmunoglobulines de ce dernier (qui se comportent leur tour comme des antignes). Le protocole de dtection consiste donc mettre en prsence la protine-cible avec lAC I non marqu, pour former le complexe immun, ce dernier tant ensuite mis en
FICHE 7 Le rle architectural du cytosquelette
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prsence de lAC II marqu, qui se fixe alors sur lAC I. Comme plusieurs molcules dAC II marqu se fixent sur une seule molcule dAC I, ceci conduit une forte amplification du signal par rapport la mthode directe initialement prsente.
Structures cytosquelettiques stables

Le cytosquelette des cellules animales participe lorganisation ddifices stables associs aussi bien larchitecture qu la dynamique cellulaires. Rpondre par Vrai ou Faux aux propositions suivantes qui illustrent cet aspect fonctionnel du cytosquelette. 1. Les centrioles sont de minuscules cylindres dont les gnratrices sont constitues de 9 filaments dactine groups par 3 et disposs paralllement leur axe. 2. Laxonme des cils et des flagelles comprend neuf doublets de microtubules, ainsi quune paire centrale de microtubules. 3. Les corpuscules basaux, ou cintosomes, sont situs la base des microvillosits rencontres dans les cellules absorbantes telles que les entrocytes. 4. Laxe des microvillosits est renforc par des filaments intermdiaires, trs stables, et dont le rle est de les maintenir dresses. 5. Les myofibrilles des cellules (fibres) musculaires stries sont constitues dune succession de sarcomres forms dactine et de myosine. 6. Les neurotubules des axones des cellules nerveuses sont des microtubules qui transportent dans leur lumire les neuromdiateurs, destination des synapses. 7. La lamina nuclaire est constitue de protines de type filaments intermdiaires, et elle est associe la membrane nuclaire interne, du ct interne.
Solution
1. Faux : les centrioles, qui vont toujours par paire dans les cellules (pour former un centrosome), sont constitus de 9 triplets de microtubules disposs paralllement leur grand axe ; les centrosomes sont des centres organisateurs de microtubules. 2. Vrai : les 9 doublets sont runis longitudinalement par diverses protines telles que la dynine ou la nexine ; ils sont aussi associs la paire centrale par des fibres. 3. Faux : ils ont la mme organisation que des centrioles, mais sont situs la base des cils et des flagelles ; ils sont en continuit avec les microtubules de laxonme. 4. Faux : leur axe est consolid par des microfilaments dactine organiss en un faisceau serr, et ancrs dans leur membrane apicale par leur extrmit +. 5. Vrai : les sarcomres sont les units de contraction de la myofibrille ; le glissement des faisceaux de myosine sur lactine est responsable de la contraction. 6. Faux : les neurotubules ont un rle architectural ; aucune molcule ne circule dans leur lumire. En revanche, des moteurs molculaires les utilisent cet effet.
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7. Vrai : il sagit des seuls lments cytosquelettiques qui ne soient pas cytosoliques.
Polymrisation in vitro de la tubuline

Lorsque des dimres de tubuline sont mis en solution en prsence de GTP, 37 C, on peut observer au spectrophotomtre une variation importante de la diffusion de la lumire transmise travers lchantillon ; lvolution au cours du temps (analyse cintique) de cette diffusion est reprsente dans le graphe 1. De plus, lorsque le contenu du tube est analys en microscopie lectronique par la technique de coloration ngative (cf. fiche 11), on observe que cette variation est due lapparition de microtubules au sein de la solution. 1. Pourquoi lapparition des microtubules peut-elle se traduire par une variation de la diffusion de la lumire ? 2. Comment appelle-t-on ce phnomne spontan dapparition des microtubules ? 3. Comment peut-on expliquer la prsence des trois phases vues dans la courbe ? La concentration initiale en tubuline est un facteur important dans ce processus : la phase de plateau est atteinte dautant plus rapidement (et sa valeur est dautant plus faible) que cette concentration initiale est elle-mme faible. Enfin, on montre quil existe encore de la tubuline libre dans le milieu, mme quand le plateau est atteint. 4. Comment interprtez-vous ces observations ? Lorsque de courts fragments de microtubules ou de courts fragments daxonmes de cils ou de flagelles (amorces) sont introduits dans la solution de dimres, on obtient la cintique reprsente dans le graphe 2. 5. Aprs comparaison des deux courbes, proposez une interprtation pour ce fait. Si lon utilise des amorces marques (toile) de sorte quon puisse les reconnatre en microscopie lectronique, on observe les images donnes dans la figure 3. 6. Quelle information peut-on tirer de cette dernire observation ?
FICHE 7 Le rle architectural du cytosquelette
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Solution
1. Une solution vraie de protines se caractrise par une certaine absorbance (Densit Optique, ou DO) ; si des structures de grande taille telles que des microtubules apparaissent au sein de cette solution, on imagine aisment quelles ne diffusent pas la lumire de la mme faon que des protines solubles ; on parle alors de turbidit. Il existe une relation directe entre la concentration en microtubules et la DO que permet de mesurer le spectrophotomtre (turbidimtrie). 2. Ce phnomne spontan, in vitro, porte le nom dautoassemblage. Ce concept est trs important, car il concerne un nombre considrable de processus : gense des membranes ou de particules complexes telles que des ribosomes, des virus, etc. 3. La courbe prsente une forme caractristique en S (forme dite sigmode) : la premire phase, la plus lente car la plus complexe, consiste fabriquer de trs courts microtubules, partir des dimres en solution. Une concentration leve en tubuline libre est indispensable pour que ces petites structures, qui rsultent au dpart de la rencontre alatoire des molcules, soient formes et acquirent une certaine stabilit grce des liaisons intermolculaires de plus en plus nombreuses. Ces amorces une fois formes, il suffit de les allonger, dun ct ou de lautre, en ajoutant des dimres de tubuline aux extrmits des protofilaments gnrs au cours de ltape prcdente. Cette deuxime phase progresse de faon linaire et rapide tant quil existe de la tubuline libre en concentration suffisante dans le milieu. La dernire phase, marque par lapparition du plateau, correspond au ralentissement du phnomne. En fait, la concentration en tubuline libre dans le tube (qui en contient une quantit finie) devient de plus en plus faible, et lapport de tubuline aux extrmits est donc de moins en moins efficace pour lallongement. 4. Si la quantit de tubuline au dpart est trs leve, on pourra former une quantit de microtubules (ou allonger un nombre donn de microtubules) dautant plus grande avant datteindre le plateau. Comme lallongement se fait vitesse constante dans une certaine gamme de concentrations, le plateau sera atteint plus ou moins vite. Si lon observe une certaine concentration en tubuline libre, mme lorsque des microtubules ne se forment plus, cest que le phnomne rsulte dun quilibre entre molcules lies aux extrmits des microtubules et molcules libres en solution. 5. Lorsque des amorces artificielles sont utilises, on court-circuite la phase initiale, dite de nuclation, et on dmarre tout de suite dans la phase linaire dallongement. 6. Les deux extrmits des microtubules ne sallongent pas la mme vitesse (la plus rapide est note +) ; ceci montre la polarit fonctionnelle de ces structures.
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FICHE
Les rles dynamiques du cytosquelette

I Les mouvements cellulaires
ct de son rle architectural, le cytosquelette possde un grand nombre de fonctions dynamiques concernant aussi bien les mouvements internes la cellule que ses dformations ou son dplacement. Les microtubules et les microfilaments dactine, prsents chez tous les Eucaryotes, sont responsables de ces fonctions. Le positionnement et les dplacements des organites : la plupart dentre eux (le rticulum endoplasmique, les saccules golgiens, les mitochondries) sont arrims sur des microtubules grce des moteurs molculaires, qui assurent en outre leurs dplacements contrls en fonction des tapes du cycle cellulaire (cf. fiche 14) ou des besoins physiologiques locaux. Les mouvements des multiples vsicules qui font communiquer les compartiments membranaires entre eux, ou qui permettent lendocytose et lexocytose (cf. fiche 5) sont aussi assurs par le cytosquelette. La cyclose chez les vgtaux relve aussi de ces mcanismes. Lors de la division cellulaire, la mise en place de lappareil mitotique mobilise toute la tubuline interphasique jusque-l organise en microtubules rayonnant autour du centrosome (cf. fiche 7). Cette structure trs complexe participe la bonne sparation des chromatides surs (ou des chromosomes homologues lors de la miose I) lors de la mitose. La cytodirse des cellules animales met en uvre un dispositif annulaire contractile, form dactine et de myosine, dont le rle est de sparer en deux le cytoplasme de la cellule en fin de division. Les dformations cellulaires : elles impliquent le couple actine/myosine et sont mises en uvre lors de la contraction des cellules musculaires ou lors du repliement des pithliums, phnomne frquent lors de lembryogense. Lors des dplacements des cellules isoles (cellules embryonnaires mobiles, cellules tumorales, cellules animales en culture, amibes), diverses structures base dactine sont utilises, telles que les lamellipodes ou les pseudopodes ; les points de contact focaux (cf. fiche 6) leur permettent de saccrocher transitoirement au support et servent de point dappui.
FICHE 8 Les rles dynamiques du cytosquelette
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Les structures locomotrices spcialises : les cils et les flagelles, qui sont rencontrs chez les Protistes ou chez de nombreuses cellules animales (pithliums bronchique et de loviducte, ou spermatozodes, par exemple), sont constitus de microtubules organiss en axonmes (cf. fiche 7).
II Limmunofluorescence ; le microscope pifluorescence

Limmunofluorescence est un protocole dimmunodtection cytologique (cf. fiche 7) dans lequel la visualisation des anticorps se fait au moyen de fluorochromes. Cette technique ncessite lutilisation dun microscope dit pifluorescence, qui se distingue des microscopes classiques en ce sens que la lumire clairant lchantillon traverse lobjectif et arrive par le dessus , tandis que la lumire rmise par ce dernier suit le trajet inverse avant datteindre les oculaires. Ce dispositif permet de ne pas contaminer la faible lumire mise par lchantillon par une lumire violente provenant de la source, lors de la formation de limage. Les fluorochromes sont des molcules de petite taille capables dabsorber certaines longueurs donde de la lumire et de rmettre une lumire de moindre nergie et donc de longueur donde plus leve : cest le principe de la fluorescence. Certaines molcules naturelles, comme les chlorophylles, possdent cette proprit. Les fluorochromes les plus classiques et les plus anciennement utiliss, sont la fluorescine et la rhodamine qui absorbent respectivement 490 nm (bleu) et 550 nm (vert), et rmettent 512 nm (jaune vert) et 580 nm (rouge orang) ; ces molcules sont trs aisment greffes de faon covalente aux anticorps, sans que les proprits spcifiques de reconnaissance de ces derniers soient modifies. Un trs grand nombre de fluorochromes sont actuellement disponibles pour les cytologistes. Le problme technique rencontr dans un microscope pifluorescence consiste sparer la lumire mise par la lampe (excitatrice) de la lumire rmise par lchantillon. Ceci se ralise grce un miroir dichroque dont la proprit est de rflchir certaines longueurs donde tout en laissant passer dautres, plus longues. Diffrents filtres sont intercals sur le trajet de la lumire (trs souvent dans lultra-violet), permettant ainsi dutiliser une large gamme de fluorochromes, caractriss chacun par un ou plusieurs pics dabsorption et dmission bien distincts. Le microscope pifluorescence permet galement de visualiser toutes les sondes mtaboliques fluorescentes (cf. fiche 19), ainsi que la GFP (green fluorescent protein ; cf. fiche 28). Il est aussi souvent associ des instruments nomms microscope confocal , ou microscope dconvolution , dont les principes sont dcrits dans la fiche 13.
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Les microtubules dynamiques en interphase
Les cellules animales en culture prsentent un cytosquelette interphasique typique, montrant en immunofluorescence une multitude de microtubules rayonnant partir du centrosome (qui est situ ct du noyau, non dessin ; Figure 1). En prsence de colchicine (une drogue extraite dune plante : le colchique), on observe que tous ces microtubules disparaissent, lexception de leurs racines, ancres dans un territoire proche du centrosome, et de ceux prsents dans les centrioles eux-mmes (Figure 2) Figure 1 Figure 2 1. Quelles hypothses peut-on formuler concernant laction de la colchicine ? Avec une micro-seringue, il est possible dinjecter dans ces cellules de la tubuline chimiquement modifie, mais toujours capable de former des microtubules. Des anticorps spcifiques contre cette forme de tubuline ont t obtenus, ce qui permet de connatre son devenir dans la cellule aprs injection, par immunofluorescence (pointills). Une premire analyse est conduite 2 minutes aprs linjection, et une seconde aprs 30 minutes. Les images obtenues sont donnes dans les Figures 3 et 4.
Figure 3 Figure 4 2. Comment interprtez-vous ces rsultats exprimentaux, et comment clairent-ils les observations faites avec la colchicine ? Quelle conclusion gnrale peut-on tirer concernant le fonctionnement des microtubules dans ces cellules ?
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Solution
1. Une premire hypothse est que les microtubules sont des structures stables dans les cellules, et que la colchicine les dtruit compltement ; mais dans ce cas, on explique mal pourquoi leurs racines centrosomiques et les centrioles ne sont pas affects. Une seconde hypothse est que les microtubules sont des structures dynamiques, en perptuel renouvellement, et que la drogue empche leur formation aprs quils se soient spontanment dpolymriss. Dans ce cas, les microtubules persistants appartiendraient des structures stables. 2. Aprs 2 min, seules les extrmits des microtubules sont dtectes par lanticorps spcifique de la tubuline marque qui a t injecte. Ceci montre que lallongement de ces structures (ou polymrisation) se fait par leur extrmit, et non pas par intercalation le long de microtubules dj constitus. Aprs 30 min, en revanche, ils apparaissent marqus sur toute leur longueur ; ceci ne peut tre expliqu que sils se sont spontanment dtruits dans lintervalle, et quils se sont repolymriss avec un mlange de tubuline endogne (qui a t libre) et de tubuline injecte. Cette interprtation permet de comprendre laction de la colchicine. Celle-ci se fixe sur la tubuline libre cytoplasmique, libre en permanence par les microtubules qui se dpolymrisent spontanment ; cette fixation rend alors la tubuline incapable de former de nouveaux microtubules, ce qui conduit rapidement leur disparition quasi complte. Dans ce modle, les seuls microtubules restant visibles sont ceux qui sont stables, et que lon rencontre proximit ou dans les centrosomes. Lensemble de ces expriences montre que tous les microtubules interphasiques rayonnants sont trs dynamiques et en constant renouvellement.
Les moteurs lis aux microtubules

Le dplacement de la plupart des cellules flagelles est bloqu par les sels de vanadium. On a montr in vitro que ces sels ont pour cible les enzymes de type ATPases, dont elles inhibent le fonctionnement. La principale ATPase isole partir des axonmes flagellaires est la dynine, un norme complexe protique qui relie les doublets de microtubules priphriques entre eux ; elle est bien visible en microscopie lectronique, par cryofracture (cf. fiche 6). 1. Quel lien tablissez-vous entre toutes ces donnes ? Quel autre systme dynamique connaissez-vous, dont le fonctionnement est voisin de celui dcrit ici ? Chez de nombreux animaux (les poissons, par exemple), on connat un phnomne de mimtisme d la prsence dans leur piderme de cellules spcialises : les chromatophores. Ces cellules trs aplaties contiennent dans leur cytoplasme une multitude de granules de pigment pouvant rapidement changer de localisation : sils sont concentrs au centre de la cellule (fig. 1), celle-ci apparat globalement claire, mais sils sont distribus dans tout le cytoplasme, elle apparat fonce (fig. 2).
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Il a t montr, in vitro, que ltalement des granules peut tre provoqu par lAMP cyclique (une molcule de signalisation ; cf. fiche 28), tandis que leur regroupement se fait en son absence. Si lon ajoute du vanadate dans le milieu, on observe que lAMP cyclique provoque toujours le dplacement des granules vers la priphrie, tandis quen son absence leur dplacement vers le centre de la cellule na plus lieu. 2. Quelle hypothse pouvez-vous formuler concernant le dplacement des granules ? Lobservation de lorganisation des microtubules de ces cellules (fig. 1) montre une disposition rayonnante dans le cytoplasme, insensible laction de lAMP cyclique. 3. En quoi cette nouvelle donne renforce-t-elle votre hypothse ?
Solution
1. Tout mouvement ncessite de lnergie, or on sait que lhydrolyse enzymatique de lATP (raction trs exergonique ; cf. fiche 21) est aussi associe des fonctions mcaniques. Le couplage est assur par des changements de conformation des protines lis la fixation de lATP, de lADP et du Pi, ainsi qu ltablissement de liens physiques entre protines qui se dplacent alors les unes par rapport aux autres. Lexemple le plus anciennement connu est celui du glissement de la myosine sur les microfilaments dactine dans le muscle stri. 2. Compte tenu de ce quon sait chez les cellules flagelles, et puisque le vanadate bloque le dplacement normal des granules vers le centre de la cellule, en absence dAMP cyclique, on peut faire lhypothse quune protine fonctionnant comme la dynine axonmale (cf. fiche 7) est mise en jeu. 3. La disposition des microtubules (stables en absence dAMP cyclique) renforce lhypothse dune interaction entre granules et cytosquelette. En fait, la dynine est le prototype des moteurs microtubulaires : elle permet non seulement le glissement des microtubules les uns par rapport aux autres dans laxonme, mais aussi le dplacement des organites cytoplasmiques (vers lextrmit des microtubules).
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FICHE
Lorganisation du noyau ; la chromatine
I Le noyau interphasique et la chromatine

Le noyau est le plus gros des organites des cellules eucaryotiques ; gnralement unique, il est parfois absent (hmaties des Mammifres) ou prsent en plusieurs exemplaires (cellules musculaires stries squelettiques). De forme le plus souvent sphrique, il peut tre plurilob, lenticulaire (cellules vgtales vacuolises) ou allong (spermatozodes). Aprs coloration, son aspect est le suivant : lintrieur dune membrane qui le limite, une substance granuleuse dense et trs colorable, la chromatine, baigne dans une solution incolore : le nucloplasme. Un ou plusieurs nucloles, de forme sphrique y sont galement observables (cf. fiche 10). En microscopie lectronique, on observe deux membranes limitantes formant une enveloppe perce dorifices : les complexes des pores nuclaires. La chromatine apparat forme de deux constituants : la chromatine diffuse (ou euchromatine), forme de fibres entrelaces de 30 nm dpaisseur, et la chromatine dense (htrochromatine), organise en paquets souvent volumineux et plaqus contre la membrane interne. La lamina (cf. fiche 9) double cette dernire du ct interne, permettant lancrage des complexes des pores et le lien avec la chromatine. La chromatine est un complexe form dADN et de protines diverses, parmi lesquelles les plus abondantes sont les histones ; ces petites protines basiques forment avec lADN des structures globulaires appeles nuclosomes. Le brin de chromatine sorganise lui-mme en un solnode dont chaque tour comporte 6 nuclosomes, et dont le diamtre est de 30 nm (formant leuchromatine). Dautres protines peu abondantes, mais fondamentales (dites protines non-histones), y sont associes, permettant son activit : enzymes intervenant dans la rplication et la rparation de lADN, la transcription, facteurs de transcription La chromatine peut tre compacte de faon encore plus importante par repliement du brin lmentaire en boucles pontes leur base et formation dune hlice dordre suprieur ; la structure
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obtenue (lhtrochromatine) rappelle lorganisation des chromosomes mtaphasiques (cf. fiche 12).
II Llectrophorse des protines

Les protines natives (telles quelles existent, en solution, dans les cellules), sont des macromolcules lectriquement charges et donc susceptibles de se dplacer dans un champ lectrique, ce qui permet de les sparer par lectrophorse. Une cuve lectrophorse comprend deux bacs contenant une solution saline, dans lesquels plongent des lectrodes relies un gnrateur de courant continu ; lchantillon de protines est dpos sur un support poreux (gel, feuille de papier) imbib de la mme solution et dispos entre les deux bacs de sorte que le courant lectrique puisse circuler dune lectrode lautre. En fonction de sa charge nette, une molcule donne se dirigera vers llectrode de signe oppos : charge + vers lectrode (cathode), et inversement. Deux types dlectrophorse sont dcrits : llectrophorse native : elle ncessite un support trs poreux, qui ne gne pas le dplacement des protines ; celles-ci se dplacent en fonction de leur charge lectrique globale et de leur masse, la premire faisant office de moteur , la seconde tendant les ralentir. Cette combinaison des deux paramtres assure un dplacement qui na donc rien voir avec la taille des molcules elles-mmes. Les protines analyser sont dposes mi-chemin entre les deux lectrodes. llectrophorse dnaturante : elle se ralise sur des protines traites par un dtergent ionique (le sodium dodcyl sulfate, ou SDS), qui a pour proprit de se fixer solidement sur leurs domaines hydrophobes. Ce phnomne a de multiples consquences sur les caractristiques des protines : 1) elles se dnaturent (cest dire se droulent, changent de conformation), en mme temps que leurs sous-units (dans le cas des protines oligomriques) se sparent, et 2) elles sont charges ngativement en proportion de leur taille (masse). Le rapport charge/masse tant alors le mme pour toutes les chanes polypeptidiques, leur dplacement se fera en fonction de leur seule masse condition que lon ait choisi de les faire migrer dans un gel maille serre (gel de polyacrylamide), qui fonctionne comme un tamis molculaire. Comme toutes les chanes migrent vers lanode (+), lchantillon tudi est dpos proximit de la cathode et la vitesse de dplacement des molcules (et donc leur distance de migration) est inversement proportionnelle leur taille. On fait toujours migrer, en parallle des chantillons, des protines de masse molculaire connue (marqueurs) afin de dterminer celle des protines inconnues analyses. Le gel doit enfin tre color de manire visualiser les protines.
FICHE 9 Lorganisation du noyau ; la chromatine
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Organisation de la chromatine
Il est possible, au moyen dun protocole de fractionnement cellulaire (cf. fiche 15), dobtenir une fraction hautement purifie de noyaux intacts de cellules de foie de rat. On peut ensuite les faire clater dlicatement en prsence de dtergents doux et en extraire la chromatine droule et dans un tat de prservation optimal. Cette chromatine est traite de deux manires diffrentes : 1) aprs dprotinisation (au moyen de protases), lADN est extrait puis digr par une ADNase bactrienne (extraite de Micrococcus) pendant 1 et 5 minutes ; enfin, lADN digr est soumis llectrophorse en gel de polyacrylamide ; 2) la chromatine elle-mme est traite directement par lADNase, dans les mmes conditions, puis dprotinise pour en extraire lADN ; ce dernier est soumis llectrophorse comme dans lexprience prcdente. Les rsultats de ces lectrophorses sont donns dans la figure suivante : canal 1 : ADN extrait, nu et non digr ; canaux 2 et 3 : ADN nu digr (1 et 5 minutes) ; canaux 4 et 5 : chromatine native digre (1 et 5 minutes) ; colonne 6 : taille des molcules, en nombre de paires de nuclotides (ou bases ).
1. Quelles conclusions tirez-vous des expriences de digestion de lADN nu ? 2. Mme question pour la digestion de la chromatine. Lorsque la digestion est poursuivie, dans les deux expriences, jusqu 10 minutes, on observe les rsultats suivants : pour lADN nu, on nobserve pratiquement plus dADN dans le canal, tandis que pour la chromatine, une seule et trs grosse bande est observe une position correspondant une taille de 146 paires de nuclotides. 3. Comment interprtez-vous lensemble de ces rsultats ?
Solution
1. LADN nu non digr ne migre presque pas dans le gel car sa masse molculaire (sa taille) est trs leve ; ceci montre quil na pas t cass en petits fragments au cours de lextraction, condition capitale pour la suite de lexprience. Le mme ADN
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soumis une digestion courte (1 minute) donne une longue trane continue de bandes correspondant des molcules plus petites, issues de la coupure des longues molcules de dpart. Lorsque la digestion dure 5 minutes, les produits obtenus sont des molcules encore plus petites, atteignant 200 300 paires de bases ; laction de lenzyme tant plus longue, lADN est coup en fragments plus courts. 2. La chromatine digre donne des profils diffrents de ceux vus auparavant : des bandes bien individualises apparaissent, au lieu dune trane continue, montrant une priodicit de lordre de 200 paires de bases. Dans le canal 4, lADN de la chromatine a t partiellement digr, car il reste encore beaucoup de molcules de trs haut poids molculaire ; dans le canal 5, en revanche, la digestion est plus complte car toutes les grosses molcules ont disparu et ce sont les molcules les plus courtes (200, 400, 600, etc.) qui sont les plus abondantes. Ces profils montrent que lADN au sein de la chromatine est protg, et que lenzyme ne peut le couper quen des endroits limits, apparemment toutes les 200 paires de bases seulement, en raison de la prsence des bandes correspondant des multiples de 200 dans les digestions partielles. la fin de la digestion, on attendrait donc que toutes les molcules obtenues aient cette taille. 3. Lorsque la digestion est complte, tout lADN nu est coup en minuscules fragments qui sortent du gel au cours de llectrophorse, en raison de leur petite taille. Pour la chromatine, la taille limite atteinte est de 146 paires de bases, et non pas 200. En fait, lorsque la digestion reste courte, lenzyme coupe alatoirement lADN entre les units qui le protgent, do la priodicit observe ; quand elle est complte, on observe que la longueur dADN rellement protge est de 146 paires de bases. La diffrence entre 200 et 146 correspond une longueur dADN nu accessible lenzyme, et qui peut tre totalement digre si le temps est suffisant. Ces expriences permettent de mettre en vidence les nuclosomes, rpartis en moyenne toutes les 200 paires de bases dADN, mais qui en protgent seulement 146 de faon parfaite. On dfinit ainsi les notions dADN nuclosomique (protg) et dADN internuclosomique, qui reste nu et accessible lenzyme utilise.
Organisation des nuclosomes

Ltude de lorganisation prcise des nuclosomes a t ralise partir des particules de chromatine obtenues grce aux expriences de digestion prcdentes, et dont lADN possde une taille de 200 paires de bases, aprs leur purification. Les expriences suivantes ont t conduites : 1) lanalyse biochimique quantitative de la chromatine a montr quelle contient presque exactement la mme masse de protines (les histones) et dADN ;
FICHE 9 Lorganisation du noyau ; la chromatine
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2) les protines de la chromatine ont t purifies et soumises une lectrophorse dnaturante en gel dacrylamide SDS ; 5 bandes ont t obtenues, notes H1 (21 kDa), H2A et H2B (14 et 13,7 kDa), H3 (15,3 kDa) et H4 (11,3 kDa), dont les masses molculaires sont indiques dans la figure suivante :
3) aprs llectrophorse, les bandes de protines sont dcoupes dans le gel, et les protines resolubilises peuvent tre doses prcisment. Pour un chantillon dpos sur le gel de 250 g, les masses obtenues pour chaque bande sont indiques dans la figure, en face de chacune delles (voir la figure). partir de ces donnes, et sachant que la masse molculaire dune paire de nuclotides est de 660 Da, dterminer la structure protique exacte dun nuclosome.
Solution
La comparaison des masses molculaires et des masses vraies rcupres pour chaque chane permet de calculer leur stchiomtrie dans un nuclosome. Le calcul du rapport entre masse vraie (en mg) et masse molculaire (en kDa) donne les rsultats suivants ; pour H1 : 40/21 = 1,9 ; pour H3 : 59/15,3 = 3,85 ; pour H2A : 54/14 = 3,86 ; pour H2B : 53/13,7 = 3,87 ; pour H4 : 44/11,3 = 3,89. Il ressort de ceci que pour les 4 histones les plus petites, le rapport est le mme (gal 3,87 environ) et que pour H1, ce rapport est de 1,9, soit exactement la moiti. On doit donc conclure que, dans le nuclosome, le rapport est de 2 molcules de chaque petite histone pour 1 seule molcule de H1. Afin dobtenir le nombre absolu de ces molcules par particule, on peut faire un premier calcul sur la base la plus simple de deux molcules de H2A, de H2B, de H3 et de H4, et dune de H1. On a donc, en kDa : 21 + 2 15,3 + 2 14 + 2 13,7 + 2 11,3 = 129,6 kDa. Cette masse de protines est comparer celle de lADN pour un nuclosome : 200 660 Da = 132 kDa. Cette valeur est donc trs proche de celle calcule auparavant pour les protines, avec lhypothse retenue. On doit donc conclure que dans chaque nuclosome il existe 8 molcules dhistones (4 diffrentes, 2 2 identiques) et une histone plus grosse (H1). On a montr que lADN fait presque 2 tours autour de la particule centrale (octamre), soit 146 paires de bases ; lhistone H1 solidarise les boucles dADN. Le diamtre dun nuclosome (bien visible au MET) est de 11 nm.
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FICHE
La cytologie de la transcription ; le nuclole
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I Aspects cellulaires de la transcription

Dfinition molculaire du processus : ce processus universel consiste dans le recopiage en termes dARN (sous la forme dune chane de ribonuclotides) dune squence donne dADN (lui-mme double-brin). Le matriel gntique est ainsi segment en units dinformation qui, en gnral, quittent le noyau et vont fonctionner dans le cytoplasme. La transcription ncessite les acteurs suivants : un brin dADN : un seul est utilis dans la double hlice : le brin dit matrice ; les quatre monomres prcurseurs de lARN : les ribonuclotides triphosphates ; une enzyme : lARN polymrase, qui catalyse la raction de polymrisation tout en recopiant le brin matrice en un brin complmentaire (T tant remplac par U). Les limites du segment transcrit, appel unit de transcription , sont : en amont, le promoteur, et en aval, le terminateur, que lARN polymrase reconnat. Les diffrents produits de la transcription : il existe 3 principaux types dARN impliqus dans la synthse des protines (la traduction ; cf. fiche 16) : les ARN ribosomiques (ARNr), trouvs dans les sous-units des ribosomes, trs abondants (80 %) et peu divers : il en existe 4 diffrents (nots 28S, 18S, 5,8S, 5S), chez les Eucaryotes ; les ARN de transfert (ARNt), qui ont un rle dadaptateur, tous de trs petite taille (4S), et dabondance moyenne (15 %) ; les ARN messagers (ARNm), qui constituent linformation codant la squence dacides amins des protines ; trs divers (plusieurs milliers despces diffrentes), ils sont trs peu abondants (5 %) au total, et a fortiori individuellement. La transcription dans le nuclole : cette structure nuclaire est la fois le lieu de transcription des gnes ribosomiques et le lieu daccumulation des sous-units
FICHE 10 La cytologie de la transcription ; le nuclole
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ribosomiques qui sy laborent partir des ARNr 28S, 18S et 5,8S, et de protines. Il est possible de visualiser ces processus avec diverses techniques cytologiques, telles que lautoradiographie ou lombrage mtallique (cf. fiche 11). Les images obtenues par cette dernire technique sont trs dmonstratives de lintensit du phnomne de transcription ce niveau : on y dcrit des figures dites en arbres de Nol . Ce type dimages spectaculaires est aussi observ lorsquon tudie la transcription dans des chromosomes trs particuliers, dits chromosomes gants (cf. fiche 12). La transcription dans leuchromatine : cest le lieu o sont transcrits les gnes de protines ; ltat relch du matriel gntique ce niveau est trs favorable la fixation et la progression des ARN polymrases le long de lADN. Lutilisation de prcurseurs dARN (luridine radioactive, par exemple) dans le cadre dexpriences de pulsechasse (cf. fiche 17) suivies de lautoradiographie, montre trs clairement que leuchromatine est activement transcrite, mais pas lhtrochromatine.
II Lutilisation des radio-isotopes

Les radio-isotopes sont des lments naturels ou artificiels qui se distinguent des lments stables par un rapport protons/neutrons dsquilibr ; ceci conduit une dsintgration spontane de leurs noyaux accompagne dmissions de particules ou de radiations : cest la radioactivit. Ces lments (3H, 14C, 32P, 35S) sont caractriss par leur type dmission, leur demi-vie (la priode) et lnergie de leurs missions. Lactivit spcifique dun chantillon radioactif est une mesure de la richesse de lchantillon en atomes ou en composs radioactifs. La dtection des radio-isotopes : ils sont dtects grce des compteurs dits scintillation (pour des chantillons chimiques purifis) travers la transformation des missions produites en photons mesurables par des photomultiplicateurs, ou bien par la technique dautoradiographie, qui a des applications tant en Biologie Cellulaire (cf. fiche 16) quen Biologie Molculaire (cf. fiche 23). La sensibilit extrme de cette dtection, trs suprieure toutes les mthodes chimiques, fait de cette technique un outil unique pour ltude de trs nombreux processus biologiques. Lutilisation des radio-isotopes : ils sont employs sous forme de molcules minrales (ions : Na+, K+, NH4+, CO2) ou organiques (acides amins, nuclotides, sucres, comportant un ou plusieurs atomes de C, dH ou de N radioactifs). Ils sont ainsi utiliss in vitro ou in vivo comme prcurseurs des activits mtaboliques analyses. Les molcules radiomarques ntant pas distingues des molcules normales par les enzymes et donc par les cellules (car elles ont les mmes proprits chimiques), elles sont assimiles, mtabolises de la mme faon et enfin intgres (on dit aussi : incorpores) dans leur matire ; elles agissent comme des molcules espions facilement dtectables ; on parle de traceurs .
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Les principales utilisations physiologiques des traceurs : on peut en dcrire deux catgories : 1) analyse des changes, des transports et des accumulations des ions ou des mtabolites, sans transformation dans les cellules et les organismes, et 2) analyse des transformations biochimiques au cours du temps, sous laction des enzymes et au sein des divers compartiments cellulaires. La fourniture des molcules radiomarques : les fournisseurs proposent une trs grande diversit de produits utilisables par les biologistes. Ces molcules sont ajoutes aux milieux de culture des organismes ou des cellules (ventuellement injectes), ou bien incluses dans les milieux ractionnels en Biochimie ou Biologie molculaire. Leur manipulation, compte tenu de leur toxicit forte dose vis--vis de la sant humaine, et de leur rmanence, doit tre extrmement contrle.
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Images des complexes de transcription

Il est possible de visualiser directement en microscopie lectronique le processus de transcription partir dchantillons de nucloles dissocis ou de chromatine purifie tals sur des supports appropris. Les images obtenues sont toujours les suivantes : un axe dADN recouvert de nuclosomes, et portant des branches latrales plus ou moins nombreuses. Les clichs suivants montrent deux exemples, lun issu dun nuclole (1), et lautre issu de la chromatine (2).
Lgender et complter le schma interprtatif gnral propos ci-dessous.
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Solution
Les molcules dARN sont toutes identiques, mais un stade dautant plus avanc quon approche de la zone de terminaison (bien noter leur orientation, ainsi que celle des brins dADN) ; lorsquelles sont trs nombreuses et denses, on parle darbre de Nol . Dans leuchromatine, la transcription est beaucoup moins intense.
Synthse et maturation des ARN ribosomiques

Il est possible, partir de fractions purifies de noyaux de cellules animales, disoler des nucloles puis den extraire les ARN spcifiques. Afin de comprendre les mcanismes de synthse des ARN qui sont transcrits au sein du nuclole, les expriences suivantes sont conduites : 1) llectrophorse des ARN nuclolaires est ralise ; la quantit dARN est ensuite mesure dans le gel par enregistrement de la densit optique 260 nm (cf. fiche 21). On obtient le profil de la fig. 1 ; 2) les cellules sont incubes dans de luridine radioactive pendant 5 minutes, les ARN nuclolaires sont extraits puis soumis llectrophorse. Le gel est ensuite dcoup en tranches de 1 mm, et leur radioactivit est mesure dans un compteur scintillation (courbes en pointills). On obtient les profils de la fig. 2 ; 3) aprs lincubation dans luridine marque, un second lot de cellules est remis dans un milieu normal pendant 15 minutes, puis trait comme auparavant ; fig. 3 ; 4) un troisime lot de cellules est trait de la mme faon, mais est remis dans un milieu normal pendant 60 minutes ; la suite de lexprience est identique ; fig. 4.
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1. Quelle est la composition en ARN des nucloles, en comparaison de celle des ribosomes cytoplasmiques (voir le texte) ? 2. Quelle molcule dARN est synthtise en premier dans les nucloles ? 3. Quel est le devenir de cette molcule 15 minutes aprs la fin de lincubation ? 4. Mme question pour une priode de 60 minutes aprs la fin de lincubation. 5. Que concluez-vous en ce qui concerne la synthse des ARN nuclolaires ?
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Solution
1. On observe 5 populations diffrentes dARN sur le gel, parmi lesquelles trois sont clairement identifiables comme tant les ARN ribosomiques : ceux nots 28S, 18S, 5,8S et 5S (confondus ici) ; le nuclole semble donc tre le lieu de synthse de ces molcules. En revanche, deux molcules, notes 45S et 32S, trs abondantes, y sont prsentes aussi, et sans rapport apparent avec les prcdentes. 2. Aprs 5 min. dincubation dans le marqueur ( pulse ), on observe que seule la molcule de 45S est marque ; elle a donc t synthtise pendant cette priode. 3. Aprs 15 min. dincubation dans le milieu normal ( chasse ), on observe que la radioactivit de lARN 45S a diminu, alors que les ARN 32S et 18S deviennent radioactifs. On peut donc imaginer que le premier soit lorigine des deux autres. 4. Le phnomne se poursuit ; les ARN 28S et 5,8-5S sont marqus leur tour. 5. Ces expriences montrent lexistence dune maturation faisant passer, par dcoupages et raccourcissements successifs, dun grand prcurseur 45S (le transcrit primaire des gnes ribosomiques) aux molcules dARN contenues dans les sous-units ribosomiques du cytoplasme. Ce phnomne est gnral chez les Eucaryotes.
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FICHE
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La cytologie de la rplication de lADN
I Aspects cellulaires de la rplication ; les yeux de rplication

La reproduction des cellules est la base de la reproduction de tous les organismes, quils soient unicellulaires ou pluricellulaires. Linformation gntique de chaque cellule, universellement constitue dADN, est contenue dans le noyau chez les Eucaryotes, ou le cytoplasme des Procaryotes. Chez les premiers, elle est duplique de faon conforme chaque division cellulaire (mitose) ou bien gntiquement brasse, dans le cadre de la reproduction sexue, lors de la miose (cf. fiches 12 et 13). Le principe de la rplication de lADN : il est contenu dans la structure mme de la molcule dADN, et bas sur la complmentarit des deux brins qui la constituent : chaque brin sert de matrice la synthse dun brin nouveau. De faon universelle, le type de rplication est semi-conservatif : quelle que soit sa longueur, la molcule dADN souvre au niveau dune ou plusieurs origines de rplication, et est ainsi recopie sur chaque brin et sur toute sa longueur. Les yeux de rplication : la rplication se manifeste ainsi par la prsence de ces structures, bien visibles en microscopie lectronique, et qui contiennent chacune deux fourches, lieux de synthse du nouvel ADN. En raison de lactivit polarise des enzymes fabriquant lADN, la synthse des deux nouveaux brins est totalement diffrente ; lun se fait de faon continue et lautre de faon discontinue, par fragments et contrecourant du sens de progression des fourches. Les acteurs de la rplication : en simplifiant, on dcrit les faits suivants : le processus ncessite, outre les deux brins-matrice, un grand nombre de protines et les substrats appropris : les quatre dsoxy-ribonuclotides triphosphates ; lhlice est ouverte par une ADN hlicase et relche par une topoisomrase ;
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une courte amorce dARN, fabrique par une ARN polymrase particulire, dmarre tout processus de synthse dADN sur le brin matrice ; la synthse des brins dADN est assure par diverses ADN polymrases ; la liaison entre les fragments dADN implique des activits ARNase et ligase ; des protines spcifiques se lient aux simple-brins dgags et les protgent.
La rplication semi-conservative
Le principe de cette rplication a t dmontr par Meselson et Stahl, en 1958, sur lADN bactrien, 5 ans aprs la dcouverte de la structure en double hlice de lADN. Il est reprsent par le schma suivant, qui illustre lexercice en fin de fiche :
II Les techniques microscopiques danalyse des formes et des surfaces

Ces techniques de microscopie lectronique sont dabord destines visualiser la morphologie externe ou la surface dobjets de trs petites dimensions, tels que des molcules, des virus, des bactries ou des organites isols ; elles permettent aussi de visualiser des surfaces de fracture obtenues dans des chantillons congels (cryofracture). Ces mthodes peuvent tre mises en parallle avec la microscopie lectronique balayage (cf. fiche 5), dont les performances sont quivalentes.
La coloration ngative consiste mettre les particules observer dans une solution aqueuse dun compos qui, aprs vaporation de leau, ne forme pas de cristaux et est opaque aux lectrons (ex : lacide phosphotungstique). Les particules suspendues dans cette solution sont dposes sur une grille de microscopie lectronique recouverte dun fin support (film de carbone). Lors de lvaporation de la solution, le colorant saccumule autour des particules, formant un halo opaque aux lectrons : les objets observer apparaissent en clair sur un fond noir. Cette mthode, rapide et trs rsolutive, est trs approprie pour lobservation de virus, de gros complexes protiques, ou ddifices tels que des microtubules ou des microfilaments ; elle permet en particulier de bien observer des structures filamenteuses fines que la technique des coupes ne parvient pas visualiser. Lombrage mtallique consiste projeter, la surface des objets observer, un trs fin film mtallique qui, selon son paisseur locale, sera plus ou moins opaque aux lecFICHE 11 La cytologie de la rplication de lADN
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trons et donnera une image en relief des structures. Le mtal (or, platine) est port trs haute temprature dans une cloche vide, et vaporis sous un vide pouss, sous un angle assez inclin par rapport au support de lobjet. Les reliefs prsents par ce dernier entranent des dpts plus ou moins pais de mtal, qui seront alors bien visibles. Cest grce cette technique que des molcules telles que lADN ou lARN, pourtant extrmement fines (1-2 nm), ont pu tre observes. On rappelle que lombrage mtallique est galement mis en uvre dans les protocoles de cryofracture-cryodcapage , utiliss dans lanalyse des surfaces membranaires (cf. fiche 6). La vaporisation dune fine couche de mtal sur la surface irrgulire qui a t obtenue permet dobtenir une rplique de la surface, qui sera ensuite rcupre aprs dconglation et observe au microscope lectronique.
Les yeux de rplication vus en microscopie lectronique
La technique dtalement de la chromatine permet de lobserver en microscopie lectronique. Au milieu de chaque il est situe une origine de rplication.
La rplication de lADN
Des cellules humaines en culture sont mises en prsence de thymidine radioactive (3H-T) pendant plusieurs gnrations successives afin que tout leur ADN soit entirement et uniformment marqu. Les expriences suivantes sont conduites : 1) les cellules sont soigneusement laves afin dliminer toute la 3H-T du milieu ; 2) elles sont ensuite mises en prsence de cytidine radioactive (32P-C) et dun analogue lourd et non radioactif de la thymidine : la bromodsoxyuridine (BrdU) ; ce dernier compos, en raison de latome de brome quil contient, alourdit significativement la molcule dADN, lorsquil y est incorpor ; 3) les cellules sont cultives pendant un ou deux cycles cellulaires, puis leur ADN est extrait par les mthodes biochimiques ; 4) cet ADN est enfin analys par une technique de centrifugation (en gradient de Cs Cl) qui permet de sparer les ADN selon leur densit, ce qui conduit bien distinguer les molcules contenant 0, 1 ou 2 brins alourdis par le BrdU. titre de tmoin de densit, on ajoute dans les tubes centrifuger une certaine quantit dADN lger marqu par la 3H-T, extrait des cellules de dpart.
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La distribution des molcules aprs la centrifugation est reprsente dans les fig. 1 (un cycle cellulaire) et 2 (deux cycles) ; les ADN lgers sont situs droite dans les graphes, et ceux lourds sont situs gauche.
1. Expliquer la position du pic dADN extrait des cellules aprs un cycle cellulaire et la distribution de la radioactivit 3H-T et 32P-C dans les molcules de cet ADN ; 2. Mme question pour les deux pics observs aprs deux cycles cellulaires ; 3. partir de ces rsultats exprimentaux, quel mcanisme molculaire proposezvous pour la rplication de lADN ?
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Solution
Les trois pics obtenus dans les tubes centrifuger reprsentent, de droite gauche : lADN tmoin, qui est un ADN lger , avec ses deux brins normaux et lgers , un ADN de densit intermdiaire (hybride) avec un brin lourd et un brin lger , un ADN lourd , ayant ses deux brins alourdis par le BrdU. 1. Aprs un cycle, lADN cellulaire a une densit intermdiaire et est donc hybride : un brin lger, issu de la molcule parentale, et un brin lourd nosynthtis ; ceci est confirm par le marquage radioactif, qui est la fois de type 3H et 32P ; 2. Aprs deux cycles, lADN cellulaire prsente deux pics : un pic de densit intermdiaire semblable en tout point celui vu dans la fig. 1, et un pic lourd marqu uniquement par le 32P. Ce dernier correspond de lADN alourdi sur ses deux brins, et donc entirement nosynthtis. 3. Ces rsultats peuvent se reprsenter schmatiquement de la faon illustre dans lencart prsent plus haut ; ils sont tout fait caractristiques dun processus de rplication semi-conservative de la molcule dADN, dont chaque brin sert de matrice pour un brin complmentaire, chaque cycle de division des cellules.
FICHE 11 La cytologie de la rplication de lADN
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Le fonctionnement des yeux de rplication

Des cellules humaines en culture sont mises en prsence de thymidine radioactive (3H-T) afin de marquer leur ADN. La dtection de lADN radioactif est ici ralise au moyen de lautoradiographie (cf. fiche 16). Le protocole est le suivant : les cellules sont incubes pendant 15 min. dans une solution de 3H-T ayant une activit spcifique (AS) de 15 curies/mMole, puis pendant 15 minutes dans une solution de 3H-T ayant une AS trois fois plus leve ; les cellules sont ensuite lyses de faon aussi douce que possible, de sorte que les noyaux clatent sans que les molcules dADN soient casses ; lADN libr est ensuite soigneusement tal et sch sur une lame de verre, et une autoradiographie est ensuite conduite ; on a obtenu les images suivantes :
1. Comment interprtez-vous ces diffrentes images, en tenant compte du fait que les cellules ont successivement incub dans deux solutions dAS diffrentes ? 2. Quelle est la vitesse de progression dune fourche de rplication ? 3. Sachant quun chromosome humain moyen contient une molcule dADN de 4 cm de long et que la dure dun cycle cellulaire est de 24 h, pensez-vous quune seule origine de rplication soit suffisante pour assurer la rplication de ce chromosome ? Combien dorigines sont ncessaires si la phase de synthse de lADN dure 6 h ?
Solution
1. Seuls sont visibles les segments dADN radioactif synthtis pendant les 30 min dincubation ; on observe des yeux de rplication ferms (1, 2) ou ouverts (3, 4). Les yeux ferms ont seulement fonctionn pendant les 30 min, alors que les yeux ouverts au milieu avaient commenc fonctionner avant le dbut de lexprience (ADN non radioactif au centre). Le sens de progression de la synthse est donn par lpaisseur du trait, le nombre de grains dargent tant fonction de lAS de l3H-T. 2. Une fourche de rplication produit 30 m dADN en 30 min, soit 60 m/h. Un il de rplication, qui fonctionne de faon bidirectionnelle, en produit 120 m/h. 3. Un chromosome moyen contient un ADN long de 4 104 m. Une seule origine de rplication situe au milieu permet de rpliquer ce chromosome en : 4 104/120 = 333 heures ! Ceci nest pas compatible avec la dure dun cycle cellulaire de 24 h. Pour effectuer la synthse en 6 h, il faudra au minimum 333/6 = 55 origines.
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FICHE
Les chromosomes ; les divisions cellulaires

I La mitose et la miose
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Il existe chez les Eucaryotes deux types de division cellulaire, lun associ la reproduction conforme du matriel gntique : la mitose, et lautre impliqu dans le brassage gntique li la reproduction sexue : la miose. Dans les deux cas, le noyau interphasique disparat et la chromatine est profondment remanie de faon permettre le partage de linformation gntique en deux (ou quatre) lots rpartis dans les cellules filles rsultant de la division du cytoplasme. Les chromosomes apparaissent sous la forme de fins filaments au sein du noyau, lorsque la cellule entre en division. Ils spaississent et se raccourcissent progressivement tout au long dun stade appel prophase. Leur condensation et leur visibilit sont maximales au stade nomm promtaphase ; ils apparaissent alors sous la forme de btonnets plus ou moins longs porteurs dun rtrcissement appel centromre, sparant deux bras termins par des tlomres. La mitose est prcde par la duplication du matriel gntique, qui implique la rplication de lADN (cf. fiche 11). Lors de la prophase, des chromatides surs strictement identiques, et accoles lune lautre, sindividualisent ; elles resteront associes jusqu la fin de la mtaphase, qui voit les chromosomes clivs en deux chromatides se disposer sur le plan quatorial. Lanaphase dbute par la sparation de ces chromatides et leur migration vers les deux ples opposs de la cellule. Aprs la sparation du matriel gntique, la cytodirse partage le cytoplasme en deux parties gnralement gales (cf. fiche 13) et donne deux cellules-filles. La miose est une succession de deux divisions se ralisant ncessairement sur une cellule diplode (2n chromosomes) ; elle conduit quatre cellules haplodes, gntiquement diffrentes entre elles, et hritant dun seul stock chromosomique (n). Elle constitue un mcanisme gnrateur de diversit, grce deux types diffrents de brassage de linformation gntique : le brassage inter-chromosomique, bas sur un phnomne alatoire de rpartition des chromosomes homologues lors de la mtaphase 1, et le brassage intra-chromosomique, qui met en jeu des changes entre chromatides
FICHE 12 Les chromosomes ; les divisions cellulaires
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de chromosomes homologues (crossing-over), lors de la prophase 1. Le rsultat global de ces vnements constitue la recombinaison gntique.
II La dtection dADN et dARN spcifiques par hybridation in situ

Ces mthodes sont bases sur la proprit bien connue que possdent les acides nucliques de pouvoir constituer des hybrides double-brin stables, sur la base de la complmentarit des bases G et C, et A et T (ou U pour lARN). La molcule dADN, aprs dnaturation (sparation des deux brins) par la chaleur, par exemple, est capable de se renaturer (reconstituer sa structure en double brin) dans certaines conditions exprimentales ; il en est de mme pour un simple brin dADN et un brin complmentaire dARN, ou bien deux brins complmentaires dARN. On parle dhybridation entre brins complmentaires initialement spars, lorsque ceux-ci sont exprimentalement mis en prsence et se rapparient. Le principe de la mthode : de mme que limmunocytochimie permet de localiser des protines sur un support ou au sein des structures cellulaires, lhybridation permet de reprer des squences particulires dADN ou dARN, grce des sondes nucliques simple-brin connues, qui sont lquivalent des anticorps. La dtection se fait aussi bien sur des structures cellulaires prsentes dans des coupes ou des crasements de cellules, en Biologie Cellulaire que sur des filtres rsultant du transfert des gels dlectrophorse, en Biologie Molculaire (cf. fiche 23). Les sondes nucliques : il sagit de fragments purifis et connus dARN ou dADN marqus de telle sorte que les hybrides forms avec leur cible prsente sur le support puissent tre aisment reprables au microscope optique ou lectronique. Le marquage des sondes est fait in vitro au moyen de prcurseurs radioactifs (sondes radiomarques ; cf. fiche 10) ou bien de prcurseurs auxquels des groupements antigniques (sondes froides) ou des fluorochromes ont t greffs chimiquement (cf. fiche 8). Selon le type de marquage ralis, les hybrides sont dtects par autoradiographie (cf. fiche 16), par immunodtection ou mme par fluorescence. Lorsque des cellules sont observes (coupes ou crasements) et que des structures contenant les acides nucliques sont recherches, on parle dhybridation in situ . La technique rcente, et trs puissante, qui utilise la fluorescence est nomme en anglais : FISH (fluorescence in situ hybridization). Les utilisations : ces mthodes permettent de localiser des gnes particuliers sur les chromosomes (normaux ou gants ; voir plus loin), ou de mettre en vidence des ARN spcifiques dans le cytoplasme des cellules. Elles sont trs utilises en Biologie du Dveloppement. Lorsque des molcules dADN sont dtectes sur filtre, aprs lectro-
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phorse, on parle de Southern blot ; dans le cas de lARN, on parle de northern blot (cf. fiche 23).
Exemples de localisation de gnes ou dARN spcifiques
Les clichs suivants montrent deux exemples dutilisation de lhybridation in situ avec des sondes radiomarques pour localiser des squences dADN ou dARN. Le clich 1 prsente la dtection par autoradiographie (cf. fiche 16) de squences de type transposons dans un chromosome gant (cf. fiche 13) de larve de Drosophile ; les points noirs sont les grains dargent marquant la prsence de la sonde radioactive hybride sur sa cible, cest--dire le gne (ici en plusieurs copies). Le clich 2 prsente le rsultat dune exprience identique destine rvler des transcrits dun gne nomm oncogne , stocks dans le cytoplasme dovocytes dun Amphibien ; lobservation en fond noir fait ici apparatre les grains dargent sous la forme de points blancs sur fond noir. Le noyau, lieu de transcription de lARN, nest clairement pas un lieu de stockage.
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Rles des divisions chez les Eucaryotes

Les divisions cellulaires interviennent dans de nombreux processus chez les tres unicellulaires et les organismes multicellulaires ; les propositions suivantes illustrent cette diversit. Rpondre par Vrai ou Faux. 1. Chez les Protistes, il existe un seul type de division cellulaire : la mitose. 2. Il nexiste pas, chez les Vertbrs adultes, dorganes dans lesquels se produisent rgulirement des divisions, en dehors des organes sexuels. 3. Les mristmes des Vgtaux suprieurs sont les seuls lieux de division cellulaire active assurant la croissance des organes. 4. Chez certains Animaux, on rencontre des phnomnes de prolifration localise ou de bourgeonnement pouvant tre lorigine dune reproduction asexue.
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5. Chez les Vgtaux, la croissance est continue tout au long de la vie, alors que chez tous les Animaux, elle est stoppe lorsque lge de la reproduction est atteint. 6. Lorsque la diffrenciation cellulaire est trs pousse, la capacit de division et de prolifration des cellules est gnralement perdue. 7. Au cours du dveloppement embryonnaire, certaines divisions cellulaires peuvent seffectuer plus rapidement que chez les bactries.
Solution
1. Faux : bien que chez ces tres unicellulaires, la mitose assure la multiplication des individus et laccroissement des populations, la majorit des espces pratique la reproduction sexue, qui implique la miose et lalternance des phases 2n et n. 2. Faux : dans de nombreux tissus et organes, il existe un renouvellement constant des cellules par division mitotique. Cest par exemple le cas des pithliums, des cellules sanguines, des cellules osseuses ; le taux de renouvellement est trs variable. 3. Vrai : les mristmes caulinaires (tige) et racinaires (racine) assurent seuls lallongement et laccroissement en diamtre de ces organes. 4. Vrai : les Mtazoaires infrieurs, tels que les Spongiaires et les Cnidaires, ou bien les Cestodes et les Annlides, montrent des phnomnes de prolifration cellulaire et dorganogense localiss qui sont lorigine de processus de reproduction asexue. 5. Faux : chez certains Animaux, la croissance est continue toute la vie ; cest le cas des Crustacs et des Poissons, par exemple. Les Mammifres et les Insectes, en revanche, cessent toute croissance ltat adulte. 6. Vrai : de faon gnrale, une diffrenciation pousse est incompatible avec la division : il suffit de penser aux cellules musculaires et aux cellules nerveuses, qui possdent des morphologies et des structures trs labores empchant la division. 7. Vrai : lors de la segmentation, les cellules peuvent se diviser en moins de 30 min.
Le brassage interchromosomique chez lHomme

Lors de la miose dune cellule diplode 2n, on obtient diffrentes combinaisons haplodes des chromosomes homologues dorigine paternelle et maternelle (brassage inter-chromosomique). Le nombre N de combinaisons possibles est de : N = 4, si n = 2 ; N = 8, si n = 3 ; N = 16, si n = 4. 1. Dduire la loi mathmatique simple qui prdit le nombre N en fonction de n. 2. Sachant que, chez lHomme, une cellule diplode contient 46 chromosomes, calculer le nombre thorique de combinaisons N que lon peut obtenir, si on considre un trs grand nombre de cellules sexuelles en miose. 3. Quel commentaire ce rsultat vous suggre-t-il ?
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Solution
1. Cette loi simple est la suivante : N = 2n. 2. Chez lHomme, n = 23 ; on a donc N = 223. Si on admet que 210 = environ 103 (1024), on a : 23 210 210 = environ 8 103 103 = 8 millions de combinaisons ! 3. La production effective des ovules, dans la vie dune femme, tant trs rduite (en simplifiant, on calcule moins de 600 ovules pondus), on conclut que toutes les possibilits gntiques ne sont pas explores , dans ces conditions. Ceci dautant plus quil faut ajouter ce brassage alatoire celui li aux crossing over, qui augmente considrablement le nombre potentiel de combinaisons gntiques.
Organisation des chromosomes

LADN est extrmement compact au sein des chromosomes mtaphasiques, de faon faciliter mcaniquement la distribution du matriel gntique lors de la division. Divers niveaux dorganisation ont t mis en vidence, dont lefficacit de compaction est value par les calculs suivants. Un chromosome humain moyen contient une molcule dADN de 4 cm de long. En mtaphase, la longueur dune chromatide moyenne est de 4 m environ, et son paisseur est de 0,7 m ; la microscopie lectronique montre que la structure de base de son organisation est la fibre de 30 nm (cf. fiche 9). 1. Quel est le degr de compaction de lADN nu dans une chromatide ? 2. Sachant que, dans la fibre nuclosomique serre, un nuclosome fait passer une longueur dADN nu denviron 200 paires de bases (10 paires de bases = 3,4 nm) une bille de 11 nm de diamtre, quel degr de compaction est ainsi obtenu ? 3. Dans la fibre de 30 nm, on compte 6 nuclosomes par tour de solnode, chacun deux pouvant tre reprsent par un disque dpaisseur de 11 nm. Si on admet que ces disques sont bien jointifs, quelle compaction est obtenue grce cette structure ? 4. Quels niveaux dorganisation suprieurs doit-on invoquer pour pouvoir construire une chromatide condense ?
Solution
1. Le facteur final de compaction est de : 40 103 m/4 m = 104. 2. On calcule que 200 paires de bases correspondent 68 nm ; un nuclosome de 11 nm permet donc de compacter lADN dun facteur gal 68/11 = 6,18. 3. Avec 6 nuclosomes par tour, pour une mme paisseur de 11 nm, le facteur de compaction devient : 6 6,18 = 37,1. On est donc trs loin du facteur 104. 4. La fibre de 30 nm doit tre compacte, de faon tre encore raccourcie. Dans un premier temps, elle forme des boucles de 300 nm denvergure, pontes leur base par diverses protines ; dans un second temps, cette structure est organise en une superhlice permettant datteindre les dimensions dune chromatide. On considre quil existe ainsi plusieurs centaines ou milliers de boucles dans chaque chromatide.
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FICHE
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Lappareil mitotique ; la cytodirse
I Aspects dynamiques de la division

La division est une phase dynamique trs spectaculaire dans la vie des cellules. Les chromosomes apparus au cours de la prophase sont distribus en deux lots dans les deux cellules filles, dont le cytoplasme provient du partage en deux parts, le plus souvent gales, du cytoplasme de la cellule-mre : la cytodirse. On dcrit donc deux types de mouvements, assurs par des lments diffrents du cytosquelette : les microtubules pour les chromosomes, et les microfilaments pour la cytodirse. Lappareil mitotique des cellules animales (dcrit aussi lors de la miose !) est constitu de trois types de microtubules manant des deux centrosomes situs aux deux ples de la cellule en division (cf. fiche 8). Les microtubules astriens sont situs vers lextrieur, par rapport au noyau, et ils sont ancrs dans la membrane plasmique. Le fuseau mitotique est form de deux types de microtubules : ceux dits kintochoriens, qui capturent les chromosomes par leur extrmit + et participent leur mouvement centrifuge lors de lanaphase, et ceux dits polaires, qui forment une sorte darmature rigide dans la zone centrale de la cellule, facilitant la sparation. La cytodirse chez les cellules animales se ralise grce un pincement du cytoplasme au niveau du plan quatorial de la cellule. Un anneau contractile form dactine associe de la myosine assure la dformation et la constriction du cortex, comme le ferait un minuscule muscle circulaire . La croissance des microtubules polaires du fuseau et leur glissement relatif, assur par des moteurs molculaires (cf. fiche 8), permettent lallongement de la cellule lors de lanaphase. Dans certaines cellules, la cytodirse na pas lieu aprs sparation des chromatides, ce qui conduit la formation de cellules plurinucles (cellules hpatiques, par exemple) ou lapparition de chromosomes gants (phnomne dendorplication). Les spcificits des Vgtaux suprieurs (Angiospermes et Gymnospermes) : les cellules de ces organismes sont dpourvues de centrosomes et ne possdent donc pas de centre organisateur de microtubules diffrenci. Elles ne possdent pas dasters et leurs microtubules forment, lors de la prophase, un anneau situ dans le plan quatorial.
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En raison de la paroi rigide qui les entoure (cf. fiche 2), la sparation du cytoplasme met en jeu une structure originale appele phragmoplaste ; celui-ci volue en une plaque cellulaire dorigine golgienne qui est directement lorigine de la premire paroi sparant les cellules-filles.
II Le microscope confocal ; le microscope dconvolution

Ces techniques relativement rcentes de microscopie en fluorescence (annes 1980) reprsentent une avance considrable par rapport au microscope pifluorescence classique (cf. fiche 8). Elles sont particulirement adaptes lobservation dobjets pais, tels que des cellules entires et de grande taille, voire des fragments de tissus. Principe de la microscopie confocale : dans un microscope pifluorescence conventionnel, la lumire excitatrice traverse lobjet et tous les plans illumins contribuent la formation de limage finale, en plus de celle du plan particulier sur lequel la mise au point est faite. Les images se superposent, interfrent les unes avec les autres, ce qui contribue un brouillage important de limage attendue, en particulier lorsque les objets ont une paisseur suprieure 5-10 m. Le microscope confocal ralise en revanche une coupe optique trs fine et parfaite de lobjet, et il permet dobtenir successivement toutes les coupes optiques possibles dans cet objet. Les images quil fournit sont dune nettet et dune esthtique exceptionnelles. Le microscope confocal ncessite un dispositif dclairage utilisant un faisceau laser trs fin et focalis sur un seul point de lobjet. Ce dernier traverse lobjectif et balaie trs rapidement la prparation microscopique, dabord dans le plan horizontal, puis dans le sens vertical (paisseur de lobjet), par plans successifs distants de 0,1 1 m. Limage du point illumin se forme au niveau dun photomultiplicateur trs sensible, aprs que la lumire ait travers un minuscule orifice, de sorte que seule celle mise ou rmise par ce point unique soit capte ; tout point situ au dessus ou au dessous ne participe donc pas la formation de limage. Les images obtenues sont ncessairement traites de faon lectronique et observes sur un cran dordinateur. Ce dernier permet aussi de reconstituer le volume observ dans lespace, de faire tourner lobjet sur lui-mme, den raliser des coupes dans laxe vertical, de projeter les coupes dune structure donne sur un seul plan, etc. Le microscope dconvolution permet de raliser des coupes optiques dans des objets pais, mais son principe est trs diffrent. Ici, la lumire diffuse par un point lumineux est collecte dans les plans de focalisation suprieurs ou infrieurs, puis calcule, et rassigne automatiquement (et instantanment) ce point particulier. Des programmes informatiques trs labors, manipulant une somme norme de donnes
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FICHE 13 Lappareil mitotique ; la cytodirse
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mathmatiques sont ncessaires pour obtenir ces images idales . Ce dispositif est suprieur au microscope confocal, car il permet dobserver des sources lumineuses de trs faibles intensits, et ce dans des cellules vivantes.
Les chromosomes gants polytniques
Ces chromosomes trs particuliers se rencontrent dans les cellules des larves de certains Insectes et chez divers Protistes. Ils sont visibles au sein de noyaux interphasiques et ninterviennent pas dans la division. Leur caractristique principale est leur taille anormalement grande (10 m de diamtre et jusqu 500 m de long) ; ils possdent aussi une striation transversale trs typique, aprs coloration. Le clich suivant montre un tel chromosome chez une larve de Chironomus.
Lorganisation de ces chromosomes, qui explique leur gigantisme, est la suivante : ils sont constitus de plusieurs centaines de chromatides identiques, accoles sur toute leur longueur, rsultant de processus de rplications successives de lADN sans cytodirse et sparation dans des cellules filles ; on parle dendorplications ; les chromatides sont trs peu condenses ; les zones o lADN est localement compact sont toutes les mmes sur les diverses chromatides (chromomres), do la striation vue aprs coloration, qui est directement lie la concentration en ADN.
Cytodirse et surface de membrane plasmique

La division dune cellule saccompagne videmment de laugmentation de la surface totale de la membrane plasmique dans les deux cellules-filles. Une question majeure lie la cytodirse est donc celle de lorigine des constituants de cette nouvelle membrane. Quelques calculs simples permettent de prendre la mesure de cet accroissement rapide de surface et dvaluer les besoins cellulaires.
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Les cellules animales en culture, dont la forme est assez gomtrique, sont trs appropries pour ce genre de calcul : aplaties sur leur support, et presque discodales en interphase, elles deviennent bien rondes lors de la division cellulaire. Cette modification de forme se fait volume constant et saccompagne elle seule dun changement de surface membranaire. Les deux cellules filles sont de taille identique. Les donnes (avec des hypothses simplificatrices) sont les suivantes : une cellule normale est un disque de 4 m de haut et de 20 m de diamtre ; une cellule en division, ainsi que ses deux cellules filles, sont des sphres ; surface dun cercle = r2 ; circonfrence dun cercle = 2 r ; volume dune sphre = 4/3 r3 ; surface dune sphre = 4 r2. Quels commentaires vous suggrent les rsultats de ces calculs, et quelles solutions la cellule en division peut-elle trouver ces problmes biologiques ?
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Solution
1. Si on considre que le volume de cytoplasme ne varie pas lors de la division, on doit donc tout dabord le calculer partir des dimensions de la cellule initiale : V = r2 h ; V = 3,14 102 4 = 1 256 m 3. 2. La surface membranaire S1 de cette cellule est celle dun disque de mmes dimensions, savoir celle de deux cercles, plus la surface latrale : S1 = 2 r2 + 2 r h = 2 r (r + h) = 2 3,14 10 14 = 879 m 2 3. Le diamtre de la cellule sphrique en division est calcul de la faon suivante : V = 4/3 r3 ; 1256 = 4/3 3,14 r3 ; do on tire r3 = 300, r = 6,7 et D = 13,4 m 4. La surface S2 de cette cellule sphrique est donne par : S2 = 4 r2, avec r = 6,7 m ; S2 = 4 3,14 6,72 = 563,8 m 2 5. Le volume de chaque cellule fille est la moiti de celui de la cellule initiale (pas de synthse protique en mitose), et est donc de 628 m 3 ; le rayon r de chaque cellule fille est calcul comme dans la rponse 3, et est donc de : 628 = 4/3 3,14 r3, do on tire r3 = 150 et r = 5,31 m. 6. La surface S3 de chaque cellule fille est donne par : S3 = 4 r2, avec r = 5,31 m ; S3 = 4 3,14 5,312 = 354,1 m 2. La surface membranaire des deux cellules filles est donc de 708,2 m 2. 7. On a donc trois valeurs de surface, pour la cellule aplatie, la cellule sphrique et les deux cellules sphriques issues de la division, savoir : 879, 564 et 708 m2. Lorsque la cellule sarrondit pendant la mitose, la surface de sa membrane diminue de 35,8 % (on sait que la sphre a le rapport S/V le plus faible de tous les volumes). Le gain de surface, quand on passe dune cellule sphrique deux, est de 25,5 % seulement. Ces donnes suggrent que la question de la surface de la membrane plasmique, qui change rapidement et dans les deux sens pendant la mitose, nest sans doute pas rgle par des phnomnes de dgradation ou de synthse de ses constituants. De plus,
FICHE 13 Lappareil mitotique ; la cytodirse
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sachant que cette membrane ne reprsente que quelques % du vaste rseau endomembranaire de la cellule, lhypothse la plus vraisemblable est que les changements rapides de la surface cellulaire sont rgls par des phnomnes dendocytose, de stockage de vsicules dans le cytoplasme et dexocytose.
Les poisons de lappareil mitotique

Diverses substances tires de plantes sont connues pour perturber la division cellulaire ; une des plus anciennement connues est la colchicine (cf. fiche 8). Des racines vivantes de bulbes doignon sont mises en prsence dune solution de colchicine 0,1 % pendant 12 heures, puis elles sont fixes et lapex est color pour mettre en vidence les noyaux et les chromosomes. On obtient le clich suivant :
1. Pour quelle raison choisit-on de colorer lapex des racines pour cette tude ? 2. Quelle technique de coloration peut-on utiliser pour colorer les noyaux ? 3. Quelle image attendez-vous dune exprience identique, mais sans colchicine ? 4. Comment interprtez-vous ces images atypiques obtenues avec la colchicine ? 5. Quelle application biomdicale a t dveloppe partir de ces observations ?
Solution
1. Cest l que se situe le mristme, zone de prolifration cellulaire intense. 2. On utilise la raction de Feulgen, le carmin actique ou un colorant fluorescent. 3. On devrait observer des noyaux interphasiques et des figures typiques de division. 4. Les chromosomes apparaissent bien tals, dissocis en chromatides ou pas, mais jamais disposs selon les images connues. Ceci tient au fait que les microtubules du fuseau ont disparu cause de la colchicine, et la division est bloque divers stades. 5. La colchicine, qui entrane simultanment un bon talement des chromosomes et un blocage des cellules en division, est couramment utilise pour raliser des caryotypes humains.
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FICHE
Le cycle cellulaire et son contrle

I Les cellules parcourent un cycle troitement contrl
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La vie de toutes les cellules est ponctue de phases de croissance spares par des phases de division. Ceci dfinit un cycle, nomm cycle cellulaire, bien que ce soit en fait une succession de cellules qui en traverse les diffrents stades ; il existe une trs grande diversit de situations, au sein des organismes, concernant sa dure. Les phases du cycle : deux grandes priodes doivent dabord y tre distingues : linterphase, pendant laquelle le noyau a son aspect classique, et la division, lorsque la cellule donne naissance deux cellules-filles, caractrise, entre autres, par lapparition des chromosomes et de la machinerie permettant de les sparer. La mesure de la quantit dADN nuclaire au cours de la vie dune cellule montre que ce dernier est synthtis pendant une priode restreinte de linterphase : la phase S ; les phases encadrant cette dernire sont nommes G1 (aprs la division) et G2 (avant la division). La quantit dADN nuclaire en G2 est double de celle en G1.
Les diffrents types de cycles : au sein dun organisme complexe, animal ou vgtal, trs peu de cellules parcourent un vritable cycle ; en fait, seules celles qui se multiplient normalement en permanence, comme les cellules souches (sanguines, pithliales ou sexuelles) peuvent tre reconnues comme subissant un cycle. La grande majorit des cellules ne se divise pas du tout, ou bien trs lentement (une fois par an pour le foie, environ) ; les cellules tumorales sont une exception tragique cette rgle. Les cellules animales en culture, qui se divisent normalement toutes les 24 h, peuvent tre qualifies de prolifrantes , et elles constituent videmment un modle privilgi pour les tudes sur le cycle. Le contrle des tapes du cycle : le cycle cellulaire est une squence ordonne dtapes qui ne peuvent se mettre en route que si les prcdentes se sont droules correctement. Il existe plusieurs points de contrle, qui permettent aux cellules de vrifier la fois si lenvironnement est propice la division, et si certains paramtres internes
FICHE 14 Le cycle cellulaire et son contrle
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sont corrects : taille de la cellule en G1, rplication correcte de lADN en S et G2, positionnement des chromosomes en mtaphase. Il a t montr que le cur de ce contrle est un complexe protique form dune kinase (une protine qui en phosphoryle dautres) et une protine volution cyclique, qui lactive, la cycline. Plusieurs de ces complexes kinase/cycline se succdent au cours du temps, qui enclenchent des cascades de ractions de phosphorylations, dont le rsultat est le passage dune tape du cycle la suivante.
II Les cultures de cellules animales

La Biologie Cellulaire analyse, autant que possible, les processus cellulaires dans des systmes simplifis, contrls et in vitro. Les cultures de cellules animales sont un outil trs important en recherche fondamentale ; leur dveloppement, bas sur la mise au point de milieux de culture appropris, a dbut en 1907 (Alexis Carrel). Les milieux de culture : les milieux initiaux taient des mlanges complexes et non dfinis, forms dextraits biologiques : srum, plasma ou extraits dembryons. Le milieu artificiel labor en 1955 (et encore utilis de nos jours) comprend des acides amins, du glucose, des vitamines, des antibiotiques ainsi quun faible pourcentage (15 %) de srum ftal de veau ou de cheval. On sait maintenant que ce dernier composant apporte, bien quen trs faible quantit, des protines appeles facteurs de croissance , ncessaires une multiplication continue des cellules. Les diffrents types de cultures cellulaires : on obtient des cultures primaires directement partir des tissus dun organisme, dsagrgs et mis en prsence dun milieu nutritif ; les tissus embryonnaires sont ceux qui se prtent le mieux ce type de mise en culture. Les cellules ensemences se multiplient au fond des botes de Petri, et enfin le recouvrent entirement. On peut rcuprer ces cellules et, aprs dilution, ensemencer plusieurs nouvelles botes : on parle de cultures secondaires. Cette opration peut tre rpte un grand nombre de fois, mais on observe en gnral que lon ne peut pas dpasser lquivalent de 50 100 gnrations partir de la culture primaire ; aprs ce cap, les cellules cessent de se diviser et meurent. Il existe des cultures capables de multiplier indfiniment ; elles ont t obtenues partir de tumeurs cancreuses : on parle alors de lignes cellulaires immortalises. On obtient aussi de telles lignes dans des cultures secondaires normales, partir de cellules ayant survcu aprs la mort de lensemble de la population. Ces cellules sont en fait gntiquement anormales, comme dailleurs celles des lignes tumorales. Les avantages des cultures de cellules : 1) on obtient volont des populations homognes de cellules en grande quantit, 2) les cellules en culture peuvent tre congeles (azote liquide), stockes et utilises selon les besoins, 3) une trs grande diversit
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de types cellulaires plus ou moins diffrencis sont disponibles pour les chercheurs, 4) la plupart des problmes de Biologie Cellulaire peuvent tre tudis sur ce matriel, y compris maintenant ceux concernant la diffrenciation cellulaire, que lon peut dclencher in vitro au moyen de diverses drogues, facteurs de croissance ou hormones. Leur inconvnient majeur est quelles sont trs onreuses et quelles ncessitent un appareillage sophistiqu et un savoir faire trs labor.
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Dures des phases du cycle cellulaire et de la mitose
Une tude du cycle cellulaire est conduite sur une population de cellules vgtales en prolifration : le mristme apical des racines de bulbe doignon. Ce territoire trs localis peut tre dissqu, fix, cras et color de faon visualiser les noyaux et les chromosomes (cf. fiche 13). Voici quelques clichs reprsentatifs des divers types de cellules rencontres, ainsi que leurs pourcentages dans la population.
1. Identifiez et ordonnez les 8 stades observs. 2. Pensez-vous que cette population de cellules mristmatiques puisse tre considre comme synchrone, ou non synchrone ? 3. Comment utilisez-vous les valeurs numriques fournies pour valuer la dure des diffrents stades identifiables au cours du cycle cellulaire et de la mitose ? 4. Sachant que la dure du cycle dans ces cellules est de 25 h, calculez les valeurs absolues de ces diffrentes phases. Quels commentaires peut-on faire ?
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Solution
1. Clich 1 : dbut de tlophase ; clich 2 : prophase ; clich 3 : fin danaphase ; clich 4 : interphase ; clich 5 : dbut de prophase ; clich 6 : fin de tlophase ; clich 7 : mtaphase ; clich 8 : dbut danaphase. Lordre chronologique est le suivant : 4, 5 puis 2, 7, 8 puis 3, 1 puis 6. 2. Dans une population synchrone, toutes les cellules sont au mme stade. Au sein dun mristme, toutes les cellules sont clairement un stade quelconque du cycle cellulaire, de faon alatoire ; dans ce cas, on parle de population non synchrone. 3. On part du principe statistique connu que, dans une population parfaitement non synchrone, le % de chaque stade observ reflte le % de la dure de la phase correspondante dans le cycle complet. Ceci permet donc dvaluer directement les dures relatives de linterphase et de la division, dune part, et des diffrents stades de la mitose, entre elles ou dans le cycle complet. Les dures des diffrentes phases sont donc les suivantes : interphase = 39 % ; prophase = 35 % ; mtaphase = 12 % ; anaphase = 6 % ; tlophase = 8 %. 4. Avec un cycle de 25 h, on calcule les dures suivantes : interphase = 0,39 25 = 9,75 h (9 h 45 min) ; prophase = 0,35 25 = 8,75 h (8 h 45 min) ; mtaphase = 0,12 25 = 3 h ; anaphase : 0,06 25 = 1 h 30 min ; tlophase : 0,08 25 = 2 h. Ces chiffres sont bien caractristiques dune population de cellules en prolifration active, car linterphase est trs courte par rapport au cycle complet. Dans la division, la prophase est la plus longue des tapes, car elle correspond un remaniement profond de lorganisation du matriel gntique. Lanaphase, simple phase de migration des chromatides aux ples de la cellule, est toujours la phase la plus courte. La mtaphase et la promtaphase (ici confondues) sont relativement longues car elles correspondent un point de contrle important dans le cycle.
Le cycle des cellules animales en culture

Des cellules animales en culture (population non synchrone) sont mises en prsence dune solution de thymidine radioactive (3H) pendant 2 heures ; aprs lincubation, elles sont immdiatement fixes, incluses et traites pour lautoradiographie. Les cellules sont enfin observes et celles prsentant des grains dargent au niveau de leur noyau sont comptes : on observe 20 % de cellules marques. 1. Comment mesureriez-vous le temps de gnration de ces cellules en culture ? 2. Daprs vos connaissances, quelles sont les cellules qui prsenteront des grains dargent ? Justifiez votre rponse. 3. Dans quelle phase de leur cycle se trouvaient, lors de lincubation, ces cellules que lon voit marques ?
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4. Quelle est la dure de cette phase, si lon admet que le temps de doublement de la population est de 30 heures ? 5. Quelles observations ou expriences complmentaires proposez-vous pour dterminer la dure des phases du cycle qui nont pas encore t analyses ? 6. En quoi la cytomtrie en flux (cf. fiche 27) est-elle une technique approprie pour connatre, en une seule opration, les dures des diffrentes phases du cycle ?
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Solution
1. Le temps de gnration des cellules est en fait le temps de doublement de leffectif dans le milieu de culture. Quand des cellules poussent sur un support transparent (ici le fond de la bote de Petri), il suffit dutiliser un microscope invers et de compter le nombre moyen de cellules par unit de surface observe : ce comptage direct permet de mesurer le temps ncessaire pour que ce nombre double. 2. Les cellules marques par des grains dargent sont celles qui ont incorpor la thymidine radioactive dans une de leurs macromolcules, pendant la priode dincubation. Cette molcule tant un prcurseur spcifique de lADN, on la retrouvera dans le noyau cellulaire, lieu o il est synthtis et localis. 3. Ces cellules taient ncessairement en phase S du cycle, seule priode de linterphase pendant laquelle la synthse de lADN a lieu. 4. Selon le principe expos plus haut, valable pour une population non synchrone, la dure de cette phase S est donne par : S = 0,2 30 = 6 heures. 5. On ne connat pas les dures des phases G1, G2 et M (mitose). La dure de la mitose est simple dterminer : il suffit dobserver au microscope un grand nombre de cellules, un moment donn, et de dterminer le % de cellules en division. Le calcul est ensuite le mme que celui pos plus haut. La dure de G2 est plus difficile mesurer : aprs une exprience de pulse avec de la thymidine radioactive (2 h, comme prcdemment), on ralise une longue chasse pendant laquelle on fait plusieurs prlvements suivis dautoradiographie (cf. fiche 17). Le temps au bout duquel on observe les premires figures de mitoses marques (des chromosomes vus avec des grains dargent) correspond celui ncessaire, pour des cellules ayant incorpor le prcurseur marqu (en phase S tardive), pour parcourir G2 et entrer en mitose. On mesure ainsi G2. La dure de G1 est obtenue par soustraction des 3 autres phases du cycle complet. 6. Cette technique permet de comptabiliser directement les cellules en fonction de la quantit dADN contenue dans leur noyau. On obtient ainsi des % de cellules chaque stade du cycle (mais avec G2 et M confondus), ce qui simplifie les calculs !
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FICHE
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Le rticulum endoplasmique
I Un rseau membranaire complexe

La compartimentation la plus spectaculaire dans les cellules eucaryotiques est celle ralise par un vaste rseau endomembranaire nomm rticulum endoplasmique. Il sagit de sacs unimembranaires, trs aplatis, empils les uns sur les autres, ou bien de tubules ramifis de forme trs contourne. Seule la microscopie lectronique a pu dvoiler, en 1950, lorganisation intime de ces structures qui avaient t dcrites, lchelle de la microscopie photonique, ds la fin du XIXe sicle. Le rticulum endoplasmique (RE) rugueux (ou granulaire) : cet ensemble de cavits aplaties, limites par une membrane de 5 6 nm dpaisseur, est caractris par la prsence, sur sa face externe, de granules opaques aux lectrons de 20 nm de diamtre environ. Ces granules sont des ribosomes identiques ceux trouvs ltat libre dans le cytosol ; sur des coupes tangentielles aux membranes, ils apparaissent disposs en chapelets de forme arque ou mme spirale : il sagit des polyribosomes (polysomes). Ces ribosomes sont en fait en pleine activit de synthse protique, selon un mode qui sera dcrit dans la fiche suivante. Certaines cellules animales possdent un rticulum rugueux extrmement dvelopp : il sagit toujours de cellules scrtrices de protines ; parmi elles, on peut citer les enzymes digestives, les hormones polypeptidiques, les anticorps, les protines des matrices extracellulaires, les protines sriques, Le rticulum endoplasmique lisse (ou agranulaire) : il sagit de tubules plus ou moins contourns, dpourvus de ribosomes, et en continuit avec le rticulum prcdent. Il est en gnral peu abondant, sauf dans les cellules spcialises dans la synthse des lipides, telles que celles fabriquant des hormones strodiennes.
II Les techniques de fractionnement cellulaire

Elles visent purifier, et dans le meilleur tat possible, les diffrents organites ou structures cellulaires, afin de conduire in vitro des analyses de Biochimie et de Physiologie
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spcifiques. Cette approche dite rductionniste ne doit pas faire oublier que tous les organites, au sein de la cellule, fonctionnent de faon intgre. Le principe : elles sadressent des populations homognes de cellules (tissu hpatique, par exemple, cultures de cellules animales ou vgtales ; cf. fiches 14 et 24), et comportent deux tapes principales : 1) lhomognisation (ou broyage), qui implique la destruction de la membrane plasmique et donne un homognat (extrait acellulaire) et, 2) la sparation des organites par centrifugations successives. Lhomognisation a pour objectif de conduire la destruction des cellules sans dtrioration des organites. Le milieu de broyage doit respecter des exigences ioniques, osmotiques et de pH, de faon ce que les organites (en gnral des vsicules) ne subissent pas de modification chimique ou de volume. Les mthodes dhomognisation sont de type mcanique (pistons, mixers), physique (hautes pressions, ultrasons) ou chimique (destruction des membranes par des dtergents). En fait, chaque type cellulaire ncessite des conditions de broyage particulires, mais une constante est que cette opration doit tre effectue basse temprature (0-4 degrs C), et le plus rapidement possible, pour minimiser les phnomnes de dgradations chimiques lis la libration denzymes partir dorganites dtriors. La sparation des organites ou des structures cellulaires par centrifugation est base sur le fait quils se distinguent par leur taille, leur forme et leur densit. Les variations de taille sont trs importantes, puisque les noyaux peuvent atteindre 10 m, tandis que les ribosomes ou les granules de glycogne mesurent environ 20 nm. Les formes sont sphriques, filamenteuses ou complexes (les dictyosomes golgiens, par exemple). Les densits varient de 1,6 (ribosomes) 1,1 (mitochondries). Ces objets ne peuvent sdimenter au fond dun tube que sils sont soumis des champs de gravitation trs levs, allant de 1 000 g (noyaux) 100 000 g (ribosomes), et pendant des dures pouvant atteindre plusieurs jours. Ceci est ralis dans des centrifugeuses crant, par rotation dun rotor, des champs de gravitation centrifuge artificiels. Aprs cette opration, on obtient, au sein dun tube centrifuger, un culot (ou sdiment) et un surnageant contenant ce qui na pas sdiment. Grce des centrifugations successives, de plus en plus longues et donnant des champs de gravit de plus en plus levs, on fractionne lhomognat initial en une srie de culots et un surnageant final, chaque culot reprsentant un organite ou une structure donns ; on parle alors de protocole de centrifugation diffrentielle.
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Organisation du rticulum endoplasmique (RE)

Rpondez par vrai ou faux aux propositions suivantes dcrivant les caractristiques structurales des deux types de rticulum prsents dans les cellules eucaryotiques.
FICHE 15 Le rticulum endoplasmique
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1. Les cavits du RE communiquent directement avec lespace prinuclaire et avec le milieu extracellulaire. 2. La surface du RE peut reprsenter jusqu 60 % de la surface totale des membranes cellulaires. 3. Le RE lisse des cellules animales est spcialis dans la synthse et la scrtion des polysaccharides. 4. Le RE rugueux est caractris par la prsence, sur sa face luminale (interne), de ribosomes spcifiques, lgrement diffrents de ceux existant ltat libre. 5. Les RE lisse et rugueux sont compltement indpendants structurellement et fonctionnellement au sein de la cellule. 6. La fragmentation du RE rugueux, lors dun protocole dhomognisation, donne naissance de minuscules vsicules nommes microsomes rugueux . 7. Les cellules spcialises dans la scrtion des hormones polypeptidiques ont un RE rugueux trs dvelopp, de mme que celles scrtant les enzymes digestives.
Solution
1. Faux : il ny a jamais douverture directe sur lextrieur, mais elles communiquent en effet avec lespace prinuclaire, leurs membranes tant en continuit. 2. Vrai : cette valeur est trs souvent atteinte, et parfois largement dpasse dans certaines cellules trs actives en synthse de protines scrtes, comme les cellules acineuses pancratiques des Vertbrs. 3. Faux : le RE lisse est spcialis dans la synthse des lipides : phospholipides, cholestrol et hormones drives de ce dernier (strodes). 4. Faux : le RE rugueux porte, sur sa face externe (cytoplasmique), des ribosomes en tous points identiques ceux trouvs, ltat libre, dans le cytosol. 5. Faux : ils sont en continuit lun avec lautre et changent, grce la fluidit membranaire, des lipides et des protines membranaires quils synthtisent. eux deux, ils constituent une vraie machinerie de fabrication de membranes. 6. Vrai : la pulvrisation des membranes du RE rugueux lors de lhomognisation conduit la vsiculisation spontane de minuscules lambeaux de membranes, formant des microsomes rugueux . Ces vsicules possdent des ribosomes fixs sur leur face externe, et sont donc structurellement et fonctionnellement identiques au RE rugueux. Ils sont utiliss dans des expriences de synthse in vitro de protines (cf. fiche 16) pour tester le rle du RE rugueux dans les cellules. 7. Vrai : les cellules scrtant activement des protines (animales ou vgtales) sont pourvues dun abondant RE rugueux et dun volumineux appareil de Golgi.
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Comparaison de la synthse de deux protines
On compare la synthse protique dans deux types cellulaires structuralement trs diffrents : les cellules de lanthypophyse et les rticulocytes sanguins (cellules prcurseurs des hmaties) ; les premires possdent un abondant RE rugueux, tandis que les secondes sont dpourvues de tout systme membranaire interne, comme les hmaties. Ces cellules diffrent galement au plan de leurs synthses protiques ; celles de lhypophyse fabriquent majoritairement et scrtent deux hormones : la prolactine et lhormone de croissance (GH), tandis que les rticulocytes fabriquent peu prs exclusivement de lhmoglobine. Les protines totales de ces deux types de cellules sont extraites et soumises llectrophorse en prsence de SDS (cf. fiche 9). Les gels obtenus et colors sont montrs dans la figure suivante : canal 1 (rticulocytes) et canal 2 (hypophyse).
1. Quelles conclusions tirez-vous de lanalyse de ces gels ? Afin de localiser lhormone de croissance parmi les protines majoritaires des cellules hypophysaires, on procde une exprience dimmunodtection par western blot (cf. fiches 7 et 23) sur le gel 2. Le rsultat est donn dans le canal 3. 2. Quelle information cette exprience vous donne-t-elle ? Dans une deuxime srie dexpriences, on extrait les ARN messagers (ARNm) totaux partir des deux types de cellules tudis. Ces ARNm sont ensuite traduits dans un extrait acellulaire permettant la synthse protique in vitro (cf. fiche 16) ; un acide amin radioactif ajout ce systme permet de reprer les seules protines nosynthtises grce lautoradiographie (cf. fiche 17).
FICHE 15 Le rticulum endoplasmique
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Le rsultat de cette technique est prsent dans les canaux 4 (rticulocytes) et 5 (hypophyse). La dtection de lhormone de croissance dans le gel 5 par western blot , montre que la bande abondante la plus basse ragit avec lanticorps anti-GH. 3. Que montre cette exprience de synthse in vitro partir dARNm purifis ? 4. Quelle information importante apporte la technique du western blot ? Enfin, une dernire exprience de traduction in vitro est conduite, mais en ajoutant au milieu ractionnel une certaine quantit de microsomes rugueux extraits de cellules pancratiques. Les rsultats des autoradiographies obtenues pour les deux types dARNm sont prsentes dans les canaux 6 (rticulocytes) et 7 (hypophyse). 5. Daprs cette exprience, quel rle peut-on attribuer aux microsomes rugueux ?
Solution
1. Ces gels montrent bien la prsence des protines majoritaires fabriques par ces cellules : les globines et de lhmoglobine, dont les masses molculaires sont de 16 kDa environ, et les deux hormones hypophysaires, dont les masses molculaires sont trs voisines : environ 22 et 23 kDa (mais on ignore lidentit des 2 bandes). 2. Limmunodtection sur transfert du gel 2 ( western blot ) montre que la GH correspond la bande majoritaire la plus basse, savoir celle 22 kDa. 3. A partir des ARNm purifis, on fabrique in vitro les protines suivantes : a) pour les rticulocytes, on obtient une bande 16 kDa, identique celle observe pour les protines cellulaires totales ; b) pour lhypophyse, en revanche, on obtient bien deux bandes galement trs proches, mais dont les masses molculaires sont visiblement plus leves que celles observes in vivo : 26 et 27 kDa environ. 4. Le western blot montre que la protine de 26 kDa, bien que nayant pas la taille de la GH normale, y est troitement apparente puisquelle ragit avec lanticorps qui a t fabriqu contre elle. Il sagit peut-tre dune forme plus longue, immature, de la GH : on peut donc faire lhypothse dune molcule de type prcurseur de GH . 5. Lajout des microsomes rugueux au systme de traduction de base a un effet trs intressant : on retrouve, avec ces structures, des tailles de protines dhypophyse identiques celles observes in vivo, dans les extraits protiques bruts. Cet ajout na en revanche aucun effet sur la taille des globines qui reste, dans toutes les conditions exprimentales testes, invariante. Ces observations sont mettre en parallle avec les donnes structurales prsentes au dbut de lnonc : il nexiste pas de RE rugueux dans les rticulocytes, alors quil est trs dvelopp dans les cellules de lhypophyse. Les microsomes rugueux sont donc bien des chantillons fonctionnels reprsentatifs du RE rugueux. La question de savoir comment ce dernier intervient pour raccourcir in vivo une chane polypeptidique, et surtout quelle est la signification biologique de ce processus, sera analyse exprimentalement en dtail dans la fiche suivante.
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FICHE
Ladressage des protines vers le RER

I Des mcanismes molculaires et cellulaires complexes
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Le processus dinsertion cotraductionnelle : toutes les protines synthtises au niveau des ribosomes du RER possdent leur extrmit N-terminale une squencesignal hydrophobe longue de 30 acides amins environ. Sur le ribosome libre qui a commenc la traduction de lARNm, celle-ci est reconnue par une particule cytosolique nomme PRS (ou SRP : particule de reconnaissance de la squence-signal), qui bloque la traduction. La prsence de deux types de rcepteurs (lun pour la PRS et lautre pour le peptide-signal) dans la membrane du RER permet larrimage du ribosome, le relargage de la PRS et la reprise de la synthse protique. Le schma suivant rcapitule les principales tapes de ce processus complexe.
FICHE 16 Ladressage des protines vers le RER
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II Les systmes de traduction in vitro

Il sagit dextraits non cellulaires permettant la synthse contrle de protines in vitro, lorsquon leur fournit lARNm correspondant ; ils constituent donc des outils trs importants en Biologie Molculaire et Cellulaire. Les premiers systmes de ce type ont t obtenus partir de lysats bactriens. Ils ont permis, dans les annes 1960, les premires synthses in vitro de protines partir dARN viraux se comportant comme ARNm (gnomes dARN dits positifs : cf. fiche 30) et ils ont surtout permis de dchiffrer trs rapidement le code gntique universel. La composition dun systme de traduction in vitro : tous les lments ncessaires et suffisants pour quune protine puisse tre fabrique partir de son seul ARNm doivent videmment sy trouver : les 20 acides amins protiques, des ribosomes, tous les ARNt et les enzymes permettant de fixer leur acide amin (enzymes dactivation), une source dnergie (lATP, indispensable dans cette raction, ainsi que du GTP), des facteurs protiques dinitiation, dlongation et de terminaison et des ions tels que Mg 2+. La synthse dbute ds linstant o on introduit lARNm que lon veut tudier ; afin de distinguer la protine nosynthtise de toutes celles qui prexistent dans le systme, un ou plusieurs acides amins radioactifs sont utiliss comme marqueurs (seule la protine synthtise est ainsi radioactive). La diversit des systmes utiliss : trois extraits biologiques performants drivs de types cellulaires connus pour fabriquer activement des protines sont utiliss : le systme dit lysat de rticulocyte de lapin est un extrait brut de ces cellules qui sont en train de synthtiser presque exclusivement de lhmoglobine (90 %, car les ARNm des globines y sont trs abondants ; cf. fiche 15). Avant toute utilisation, on doit dtruire ces ARNm de globine par une ARNase dilue, afin que la synthse attendue soit uniquement due lARNm introduit ; le systme dit germe de bl ; ce systme eucaryotique est aussi trs efficace pour traduire toutes sortes dARNm dorigine animale, vgtale, de champignons, voire mme de certains virus ; enfin, pour les ARNm bactriens et certains ARNm eucaryotiques, des extraits bruts de Escherichia coli (dbarrasss de leurs ARNm endognes, car ils en sont trs riches) sont aussi utilisables ; ces systmes sont trs efficaces en raison de la relative simplicit de la machinerie de traduction procaryotique.
Les mcanismes de la traduction

Voici quelques propositions concernant les aspects molculaires de la synthse des protines ; rpondez par vrai ou faux ces propositions.
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1. Dans la structure dun ARNr ou dun ARNt, il existe des rgions organises en double brin semblables celles de lADN. 2. Lanticodon dun ARNt se situe au niveau de son extrmit 3OH. 3. Chaque ribosome contient deux sites majeurs, lun pour la reconnaissance dun ARNt charg, lautre pour la chane polypeptidique naissante. 4. Toutes les protines eucaryotiques commencent leur synthse par une mthionine. 5. Plusieurs codons peuvent servir de codon dinitiation de la traduction, tandis quil en existe un seul pour la terminaison. 6. Le dcodage dun ARNm par un ribosome dbute toujours son extrmit 3OH.
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Solution
1. Vrai : ces deux ARN (molcules monocatnaires) ont une structure secondaire pourvue de nombreux segments forms de squences complmentaires et antiparallles, qui sont donc organiss localement en double-brins stables. 2. Faux : schmatiquement, cest en son milieu que se situe lanticodon (qui est complmentaire du codon de lARNm, en respectant lantiparalllisme). 3. Vrai : on parle de site A pour celui recevant lARNt et de site P pour celui dans lequel est loge la chane polypeptidique. 4. Vrai : le codon dinitiation AUG correspond cet acide amin ; cependant de nombreuses protines matures sont amputes de leur partie N-terminale et ne commencent donc plus par la mthionine ltat fonctionnel. 5. Faux : seul le codon AUG sert de codon dinitiation, alors que UAA, UAG et UGA sont des codons de terminaison, ou codons stop. 6. Faux : cest au niveau de son extrmit 5 phosphate que dmarre la traduction.
Mcanismes molculaires de ladressage

Il a t montr, dans la fiche prcdente, que la synthse de certaines protines ne se droule pas exactement de la mme faon dans des cellules dpourvues de RE rugueux et dans celles qui en possdent beaucoup, comme le prouve lajout de microsomes rugueux des systmes standard de traduction in vitro. Les expriences suivantes sont destines prciser le mode daction de ces derniers. LARNm de lhormone de croissance (GH, 22 kDa) a t purifi partir des cellules de lanthypophyse ; il a ensuite t test dans un systme de traduction in vitro en prsence dun acide amin radioactif, et dans des conditions varies : des microsomes rugueux sont ajouts (+) ou non au systme standard (cf. fiche 15), ces microsomes rugueux sont ajouts au dbut ou la fin de lincubation ; une enzyme protolytique est ajoute (+) ou non en fin dincubation ;
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un dtergent doux (de type Triton 100) est ajout (+) ou non en mme temps que lenzyme protolytique. la fin de lincubation (15 min), une lectrophorse classique en prsence de SDS est conduite et le gel est soumis la technique autoradiographique, afin de dtecter la protine synthtise. Les rsultats sont prsents sous la forme dun tableau qui mentionne aussi les tailles (en kDa) des protines obtenues.
Exp 1 Microsomes mis au dbut de lincubation Microsomes mis la fin de lincubation Protase ajoute en fin dincubation Dtergent doux en fin dincubation Taille de la protine ----26 Exp 2 + ---22 Exp 3 --+ -rien Exp 4 + -+ -22 Exp 5 + -+ + rien Exp 6 -+ --26
1. Sur quelle caractristique biochimique sappuie-t-on pour purifier les ARNm eucaryotiques ? 2. Quelle est laction attendue de la protase ajoute en fin dincubation ? 3. Quel est le rle attendu du dtergent doux ajout en fin dincubation ? 4. Dans quelles conditions obtient-on la forme courte (scrte) de la protine et quelle information apportent les expriences de protolyse ? 5. Quel rsultat prvoyez-vous pour lexprience 6, si on ajoute de la protase la fin ? 6. Rsumer les modalits de la synthse protique au niveau du RE rugueux.
Solution
1. Ces ARNm possdent leur extrmit 3OH une queue de poly A qui est utilise pour les sparer des autres ARN au moyen dune chromatographie daffinit (cf. fiche 22). Si on greffe en effet des molcules de poly U ou poly T sur un support inerte poreux, celui-ci fixera spcifiquement les ARNm, en raison de la complmentarit de leur poly A avec le poly U ou le poly T ; tous les autres ARN non fixs peuvent tre limins, et seuls sont gards les ARNm. 2. Lajout de la protase conduit la destruction par hydrolyse de toutes les protines de lextrait qui lui sont accessibles, y compris celles qui ont ventuellement t synthtises pendant lincubation ! 3. La cible de tous les dtergents est lipidique ; ici, seules les membranes des microsomes sont susceptibles dtre solubilises par le Triton 100. Si ce dernier dtruit leur
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membrane, leur contenu sera libr et deviendra accessible la protase ajoute simultanment dans le tube essais. Ce test permet de savoir si une protine est libre dans la solution ou bien si elle est protge dans une vsicule close. 4. La forme courte (GH scrte : 22 kDa) est obtenue uniquement lorsque des microsomes sont ajouts au milieu ractionnel (exp 2 et 4). Cette forme est protge dune protolyse (exp 4), mais ne lest plus en prsence de dtergent (exp 5), ce qui confirme quelle est enferme dans les vsicules microsomales. En labsence de microsomes (exp 1), ou lorsque ceux-ci sont mis la fin de lincubation (exp 6), on obtient la forme lourde qui est libre et dgradable par la protase (exp 3). 5. Dans ce cas, la forme lourde obtenue (forme libre) sera sans doute dgrade par la protase, et cest bien ce que confirment les expriences. 6. Le schma gnral que lon peut dduire est celui du processus dit dinsertion cotraductionelle : les protines fabriques au niveau des ribosomes lis au RER sont simultanment injectes dans sa cavit, ce qui saccompagne de leur raccourcissement, correspondant llimination de la squence-signal N terminale.
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La particule dite PRS (ou SRP )

On peut isoler, partir du cytosol des cellules pancratiques, une particule de coefficient de sdimentation de 11 S, et dont la masse molculaire est de 336 kDa (cf. fiche 15). Cette particule purifie permet, lorsquelle est ajoute un systme de traduction in vitro contenant des microsomes rugueux, daugmenter de faon considrable lefficacit dinsertion cotraductionnelle des protines dans le RER. Les expriences suivantes sont conduites : un traitement de cette particule avec de lADNase na aucune consquence ; un traitement avec de lARNase ou une protase abolit leffet sur linsertion ; ltude spectrophotomtrique (cf. fiche 21) dune solution de cette particule montre deux pics dabsorption, 260 nm et 280 nm ; une lectrophorse en gel SDS (cf. fiche 9) montre la prsence de 6 polypeptides en quantits quimolculaires, de taille : 9, 14, 19, 54, 68 et 72 kDa. Proposez un modle dorganisation molculaire de cette particule. On donne : Masse Molculaire (MM) dun nuclotide = 330 Da.
Solution
Les traitements avec lARNase et la protase montrent que la particule PRS contient la fois de lARN et des protines (une particule ribonucloprotique), ce qui est confirm par llectrophorse et par les spectres dabsorption. La masse totale des protines, si on admet un seul exemplaire de chacune delles, est de 236 kDa ; il ne peut pas y en avoir 2, car la MM dpasserait 336 kDa. Le reste (100 kDa) est donc constitu dun ARN form de 303 nuclotides.
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FICHE
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La voie de scrtion des protines
I Mise en vidence historique

La prsence de ribosomes libres dans le cytosol et de ribosomes lis au rticulum endoplasmique a intrigu ds le dpart les Biologistes Cellulaires intresss par la synthse protique. Lobservation dun rticulum endoplasmique rugueux (RER) trs dvelopp dans les cellules spcialises dans la scrtion de protines, telles que les cellules pancratiques, a conduit des recherches approfondies sur les modalits de cette synthse, au dbut des annes 1960. Les expriences de G. Palade : cet auteur a utilis comme modle le pancras de cobaye, et comme technique de dtection lautoradiographie en microscopie lectronique, dcrite dans cette fiche ; une raison majeure du choix de ces cellules est aussi leur caractre morphologiquement trs polaris, ce qui permet une analyse cytologique rigoureuse. Ces expriences reprsentent le prototype du protocole dcrit sous le nom de pulse-chasse (cf. fiche 18), qui a pendant longtemps t le seul mis en uvre pour tudier la physiologie cellulaire (voir lexercice suivant). Lidentification de la voie de scrtion des protines : la synthse des protines scrtes dbute au niveau du RER, o elles sjournent pendant un temps trs bref (1520 min.). Elles passent ensuite dans les saccules et les vsicules de lappareil de Golgi (cf. fiche 18), quelles traversent en environ une heure ; aprs cela, les protines sont accumules et concentres dans de grosses vsicules de scrtion qui seront stockes jusqu ltape finale du processus scrtoire : lexocytose (cf. fiche 5). La dure du stockage, parfois trs long, est fonction du type cellulaire. La gnralisation des rsultats : cette voie universelle chez les Eucaryotes doit tre gnralise dautres types de protines, au sein des cellules. Tout dabord, il faut noter que lexocytose apporte, par fusion des bicouches lipidiques, des lments de membrane qui sajoutent la membrane plasmique, augmentant donc sa surface ; de fait, toutes les protines intgrales de cette dernire (cf. fiche 3) ont pour origine ultime le RER. De plus, on a montr que les protines membranaires et luminales des lysosomes (cf. fiche 19) sont aussi fabriques par insertion cotraductionnelle au niveau du RER. La voie ainsi mise en vidence concerne donc la fois les protines scrtes, les protines de la membrane plasmique et celles des lysosomes.
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17
II Lautoradiographie
Cette technique est fonde sur la proprit que possdent les composs radioactifs dimpressionner les mulsions photographiques (observation qui est la base de leur dcouverte !) ; elle permet de localiser avec une grande prcision une espce molculaire radioactive situe dans un support plan. Le principe de lautoradiographie : il suffit de dposer une mulsion vierge ou une plaque photographique en contact troit avec lchantillon plan contenant des molcules radioactives et dattendre (de quelques minutes plusieurs jours) quune image latente soit forme. Le traitement qui suit cette exposition est donc exactement le mme que celui appliqu au dveloppement des films argentiques. La prsence de grains dargent visibles dans lmulsion traduit la prsence de composs radioactifs situs exactement au mme niveau, dans le support. Les applications en Biologie Cellulaire : lautoradiographie sapplique des coupes histologiques ou des coupes ultrafines (en microscopie lectronique), qui sont alors recouvertes dune mulsion sensible liquide. Le problme est que la rsolution de cette mthode est assez faible, dans la mesure o la taille des grains dargent dpasse celle de nombreuses ultrastructures cellulaires. Lapport de cette mthode a t considrable historiquement pour toutes les tudes de physiologie cellulaire qui tudiaient des phnomnes dynamiques, grce au protocole dcrit sous le nom de pulse-chasse (cf. fiche 18). Cependant, cette technique est aujourdhui abandonne, car largement dpasse par celle utilisant les protines recombines associes la GFP (cf. fiche 28). Les applications en Biochimie et en Biologie molculaire : la dtection de molcules radiomarques sur des gels dlectrophorse ou des chromatogrammes (cf. fiches 9 et 22) se fait grce lapplication de films photographiques poss directement sur les supports. De nombreuses expriences historiques (sur la photosynthse, par exemple) ont t ralises au moyen de cette mthode, et toutes les techniques de squenage des acides nucliques lont initialement utilise. Actuellement, des appareils sophistiqus de dtection point par point de la radioactivit tendent la remplacer, de mme que les traceurs radioactifs sont progressivement remplacs par des molcules fluorescentes.
Protocole dtude de la scrtion des protines

La fibrone est la protine constitutive de la soie naturelle. Cette protine fibreuse remarquable est majoritairement fabrique par les cellules des glandes sricignes de la larve du ver soie ; elle est trs riche en un acide amin, la glycine (47 % du total).
FICHE 17 La voie de scrtion des protines
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Les expriences suivantes, concernant sa synthse, sont conduites : des glandes sricignes isoles sont places dans un milieu de survie, dans lequel elles peuvent tre actives pendant au moins 2 heures ; ces glandes sont mises en prsence de glycine radioactive (3H) pendant 5 min ; la fin de lincubation (temps t0), le milieu radioactif est limin et les glandes sont remises dans un milieu normal mais fortement enrichi en glycine non marque ; diffrents temps aprs t0, des fragments de glandes de mme masse sont prlevs et analyss en ce qui concerne leur radioactivit ; le comptage radioactif (exprim en dpm : dsintgrations par minute) est fait la fois sur la glycine libre isole partir des glandes et sur celle incorpore dans leurs protines (essentiellement la fibrone). Les rsultats des mesures sont prsents dans le tableau suivant : _______________________________________________________ Temps en min glycine libre : glycine incorpore : aprs t0 dpm/mg de glande dpm/mg de glande ----------------------------------------------------------------------------------0 9 000 15 000 20 7 500 16 000 50 7 000 15 800 90 6 000 15 900 ----------------------------------------------------------------------------------1. Discutez le choix du prcurseur radioactif utilis. 2. Pourquoi le second milieu (aprs t0) est-il enrichi en glycine non radioactive ? 3. Que se passe-t-il pendant la priode dincubation en milieu radioactif ? 4. Pourquoi la radioactivit de la glycine libre diminue-t-elle lentement aprs le t0 ? 5. En quoi les valeurs de radioactivit mesures pour la glycine incorpore dans les protines permettent-elles de sassurer du bon droulement de lexprience ?
Solution
1. La glycine tant trs sur-reprsente dans la soie, le choix de ce prcurseur marqu est judicieux car cette protine pourra tre rendue fortement radioactive au cours de lexprience et ainsi plus facilement dtectable (et de faon spcifique). 2. Dans ces conditions, la glycine non radioactive rentre trs vite dans les cellules o elle se concentre fortement et ainsi dilue beaucoup celle, marque, qui tait entre pendant la priode prcdente. partir du t0, la probabilit dincorporation de la glycine 3H dans les protines devient trs faible, voire quasi nulle ; de cette faon, on est sr que les protines nont t efficacement marques que pendant les 5 minutes de la premire phase de lexprience (autrement dit, larrt du marquage est brutal).
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3. Pendant la priode dincubation en glycine 3H, toutes les protines synthtises sont radiomarques, en particulier la soie (la plus abondante), qui sera mme relativement plus marque que toutes les autres. Aprs le t0, les protines seront nouveau fabriques partir dacides amins non marqus, en particulier la glycine. 4. La radioactivit de la glycine libre (celle trouve en solution dans le cytosol) diminue au cours du temps pour deux raisons probables : une partie peut sans doute ressortir dans le milieu extracellulaire ; une autre peut encore tre incorpore dans les protines, mme si ce phnomne reste trs marginal. 5. La quantit de protines radiomarques reste peu prs invariante de t0 t90 min, ce qui montre bien quil ny a plus dincorporation de glycine 3H aprs t0, comme le prvoit le protocole ; ce dernier est nomm : pulse-chasse (cf. fiche 18).
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Trajet intracellulaire dune protine scrte

Ltude prcdente concernant la synthse de la soie est complte par une analyse autoradiographique en microscopie lectronique, aprs ralisation de coupes dans les glandes sricignes marques par la glycine 3H. Pour une plus grande prcision, cinq temps aprs le t0 font lobjet de cette nouvelle analyse. Aprs rvlation des coupes, le nombre de grains dargent observs sur les clichs est mesur dans un certain nombre de compartiments cellulaires bien identifis : le RE rugueux (RER), lappareil de Golgi, les vsicules de scrtion sous-apicales et les mitochondries. Cette rpartition, exprime en % et en nombre total de grains par 1 000 m 2 de surface cellulaire, est donne dans le tableau suivant : ______________________________________________________________ Temps en min aprs le t0 0 10 30 45 65 90 -------------------------------------------------------------------------------------------- Nombre total de 2 080 2 150 2 040 1 980 1 430 620 grains/1 000 m 2 Nombre de grains 95 % 78 % 56 % 30 % 15 % 12 % dans le RER Nombre de grains 3% 13 % 36 % 26 % 18 % 15 % dans le Golgi Nombre de grains 0% 5% 6% 40 % 65 % 69 % dans les vsicules Nombre de grains 2% 4% 2% 4% 2% 4% dans les mitochondries ---------------------------------------------------------------------------------------------
FICHE 17 La voie de scrtion des protines
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1. Dcrivez lvolution du nombre total de grains par unit de surface cellulaire, et rapprochez les rsultats de cette analyse de ceux trouvs dans lexercice prcdent. 2. Analysez lvolution du nombre de grains dans les trois compartiments du rseau endomembranaire au cours de temps ; que concluez-vous ? 3. Que pensez-vous de lvolution du nombre de grains dans les mitochondries ? Si on ajoute de la cytochalasine B (drogue connue pour inhiber la polymrisation des microfilaments dactine) au milieu de survie, le nombre total de grains ne varie pas pendant la dure de lexprience, mais les % restent en revanche inchangs. 4. Que concluez-vous en ce qui concerne le processus de scrtion ?
Solution
1. Le nombre absolu de grains dargent par unit de surface reste invariant jusqu 45 min, mais diminue rapidement par la suite. Ces grains reprsentent les protines radioactives prsentes dans les cellules, et donc essentiellement la soie marque. Cette diminution est comparer la stabilit des dpm observe pendant les 90 min de lexprience, mais au niveau de la glande entire. Cette contradiction apparente sexplique par le fait que la soie est vacue des cellules par exocytose (voir plus loin), mais reste stocke dans les cavits de la glande pendant un certain temps. 2. Le RER est le compartiment qui est marqu en premier, pendant le pulse , et cest donc celui dans lequel la synthse protique dbute ; la radioactivit diminue ensuite trs rapidement dans ce compartiment pendant toute la priode dite de chasse . Lappareil de Golgi est marqu dans un deuxime temps, le pic de marquage tant atteint au bout de 30 min : les protines radioactives sont donc passes du RER vers ce compartiment. Puis sa radioactivit diminue galement. Enfin, les vsicules de scrtion commencent se remplir de protines marques lorsque lappareil de Golgi se vide lui-mme. On notera que le nombre absolu de grains dargent diminue ce moment-l, qui correspond lexocytose (vacuation lextrieur de la cellule) des premires molcules de soie radioactive. Ce trajet intracellulaire des protines scrtes est celui dcrit par Palade sur le pancras exocrine. 3. Le marquage des mitochondries reste faible et relativement invariant tout au long de lexprience ; ceci est d au fait quil ny a pas dchanges entre ce compartiment et ceux impliqus dans le trafic des protines scrtes. Ce marquage indique cependant quelles reoivent des protines radiomarques (cf. fiche 25). 4. Cette inhibition de lexocytose montre que les microfilaments sont impliqus dans la dernire tape du processus de scrtion, savoir le guidage des vsicules de scrtion vers la membrane plasmique et lexocytose de la soie.
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FICHE
Lappareil de Golgi
I Les modifications des protines et la synthse des polysaccharides
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Cet organite prsent chez toutes les cellules eucaryotiques a depuis longtemps t mis en vidence sous la forme dun rseau serr entourant le noyau, proximit du centrosome. Les tudes fonctionnelles ont montr ses relations troites avec le RE rugueux lors du processus de scrtion des protines dans les cellules animales (cf. fiche 17), mais il ne sagit pas dun simple compartiment de transit ou de concentration de protines : de nombreuses fonctions lui sont spcifiques. Organisation de lappareil de Golgi : celui-ci est constitu de complexes de sacs unimembranaires aplatis, de forme incurve et empils les uns sur les autres : les dictyosomes, qui montrent en outre une polarit structurale et enzymatique trs marque. Dans les cellules scrtrices, ils sont en contact troit avec le RE rugueux, duquel ils reoivent du matriel via de nombreuses vsicules ; leur face tourne vers la membrane plasmique met de grosses vsicules destines lexocytose, dont le contenu sera scrt, et dont la membrane ira enrichir la membrane cytoplasmique. Les fonctions du Golgi des cellules animales : elles consistent essentiellement en des modifications post-traductionnelles des protines, qui sont de deux types : une activit de glycosylation ; la modeste glycosylation effectue dans le RER (de type N-glyc.) est poursuivie, des modifications tant apportes aux motifs sucrs ajouts aux protines dans ce compartiment ; son rle dans ladressage des protines sera trait dans la fiche suivante. En outre, on y dcrit une autre activit intense de glycosylation : O-glyc., qui conduit des molcules parfois trs riches en sucres : les glycoprotines ou les protoglycanes membranaires ou scrts (cf. fiche 27). une activit de clivage des protines ; de nombreuses protines : hormones, enzymes, neuromdiateurs, sont issues dun dcoupage en plusieurs fragments dune longue chane polypeptidique synthtise dans le RER ; ce dernier a lieu dans les saccules les plus tardifs du Golgi ou dans les vsicules de scrtion quil met. La synthse de polysaccharides chez les Vgtaux : plusieurs constituants des parois des cellules vgtales sont synthtiss dans le Golgi et exocyts (cf. fiche 27).
FICHE 18 Lappareil de Golgi
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II Les expriences de pulse-chasse

Ces expriences ont t construites pour tudier lassimilation des prcurseurs radioactifs dans des cellules vivantes et leur incorporation dans des macromolcules au cours du mtabolisme. Elles ont historiquement permis de dcrire le trajet intracellulaire des protines scrtes, depuis le RE rugueux jusqu lextrieur des cellules (cf. fiche 17). Actuellement, elles sont remplaces par des expriences bases sur lutilisation de la GFP (cf. fiche 28), beaucoup plus sophistiques au plan technique, mais permettant de visualiser directement les processus cellulaires. Principe des expriences : elles sont conduites en deux temps : le pulse : des cellules vivantes sont mises en prsence dun prcurseur radioactif destin tre spcifiquement incorpor dans certaines de leurs macromolcules ; par exemple, un acide amin sera utilis pour marquer les protines, un nucloside sera utilis pour les acides nucliques Ce traitement doit tre de courte dure, par rapport la celle des processus analyss, mais suffisant pour que le marquage soit dtectable (le prcurseur sera donc fortement radioactif) ; la chasse : il sagit en fait dune priode de poursuite des macromolcules radioactives formes pendant la priode du pulse. Aprs ce dernier, les cellules sont enleves du milieu radioactif, soigneusement rinces pour liminer le maximum de prcurseur marqu, et transfres dans un nouveau milieu de survie non radioactif. Pendant cette priode, les cellules poursuivent leur mtabolisme normal, mais les nouvelles molcules synthtises ne sont plus radioactives. Les molcules marques prcdemment, qui sont engages dans des processus de transport intracellulaire et/ou de modifications chimiques divers, pourront alors tre facilement analyses. Mise en uvre du protocole : au cours de la chasse, des chantillons identiques de cellules sont prlevs intervalles rguliers puis analyss par diverses techniques cytologiques et biochimiques. Les macromolcules marques tant reprables sur des coupes par lautoradiographie (cf. fiche 17) et analysables biochimiquement partir dextraits acellulaires (cf. fiche 15), il est possible daborder les questions de physiologie cellulaire sous un angle dynamique, dans lespace et dans le temps. La lisibilit des rponses est dautant meilleure que la population de molcules marques est la plus ponctuelle qui soit ; ceci est donc li la nettet des bornes du pulse, dont larrt doit tre aussi rapide que possible. cet effet, on ajoute en gnral dans le milieu de survie de la chasse, une forte concentration de prcurseur non marqu ; son entre massive dans la cellule va abondamment diluer le traceur subsistant dans le cytoplasme et provoquer de manire artificielle une diminution brutale de son incorporation dans la macromolcule correspondante (cf. fiche 17).
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Synthse de linsuline
Linsuline est une hormone hypoglycmiante scrte par les cellules bta des lots de Langerhans du pancras. Elle est constitue de deux chanes polypeptidiques lies par des ponts disulfure : la chane A (2,3 kDa) et la chane B (3,3 kDa). Les expriences suivantes sont destines analyser les modalits de sa synthse : 1) un anticorps a t fabriqu contre chacune des deux chanes polypeptidiques : antiA et anti-B, afin dtre utiliss dans des expriences de western blot (cf. fiche 23) ; 2) lors dexpriences de fractionnement cellulaire (cf. fiche 15) des cellules bta, des fractions protiques purifies ont t obtenues partir du RE rugueux (RER), de lappareil de Golgi et des vsicules de scrtion ; 3) ces fractions sont ensuite soumises une lectrophorse en gel dnaturant SDS, en prsence de mercapto-thanol (cf. fiche 9) ; 4) un western blot a t effectu avec un mlange des deux anticorps sur les chantillons suivants, aprs lectrophorse : canal 1 : insuline plasmatique (purifie partir du sang) canal 2 : fraction obtenue partir du RER canal 3 : fraction obtenue partir du Golgi canal 4 : fraction obtenue partir des vsicules de scrtion Le schma suivant montre le rsultat obtenu :
1. partir de lanalyse du canal 1, rappeler lintrt des expriences de western blot. 2. Comment peut-on interprter le rsultat obtenu dans le canal 2 ? 3. Mme question pour le rsultat obtenu dans le canal 3. 4. Quelle conclusion tirez-vous de lanalyse du canal 4, et quelle question ce rsultat conduit-il poser concernant la synthse de linsuline ? Aprs purification de la protine de 9,5 kDa dtecte dans le RER, on a obtenu un nouvel anticorps contre cette molcule. Ce dernier a t test en western blot sur la fraction obtenue partir des vsicules de scrtion ; pour le rsultat, voir le canal 5. 5. Quelle information importante ce nouveau rsultat apporte-t-il ? 6. partir de toutes ces donnes, rsumer les modalits de synthse de linsuline.
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Solution
1. Grce lutilisation danticorps spcifiques visualisables par des enzymes qui leur sont greffes, il est possible de dtecter la prsence de protines bien particulires spares par un gel dlectrophorse (cf. fiche 23). Ici, les deux anticorps ont permis de mettre en vidence les deux chanes de linsuline, spares dans ce gel au moyen du mercapto-thanol, qui est connu pour rompre les ponts disulfure. En son absence, on naurait donc observ quune seule bande de 5,6 kDa. 2. On nobserve quune seule bande, dont la taille est voisine de 9,5 kDa ; cette chane polypeptidique unique est apparente linsuline puisquelle est reconnue par les anticorps. Les deux petites bandes typiques de linsuline active nexistent pas dans cet organite, qui est le point de dpart de la synthse des protines scrtes. On peut mettre lhypothse que cette forme longue contenue dans le RER est un prcurseur qui contient les deux segments de petite taille. 3. Le rsultat observ pour le Golgi montre que cet organite est un simple lieu de transit pour la forme longue de 9,5 kDa, qui ny subit aucune modification. 4. Au sein des vsicules de scrtion, on trouve les chanes de 2,3 et de 3,3 kDa typiques de linsuline, qui seront exocytes. La question pose est celle du mcanisme molculaire faisant passer de la forme longue unique ces deux petits fragments associs par des ponts disulfure (phnomne de maturation). 5. Ce nouvel anticorps reconnat dans les vsicules de scrtion un polypeptide de 4 kDa environ, diffrent de ceux de 2,3 et de 3,3 kDa, car il ne les reconnat pas. Si lon additionne les masses molculaires des 3 chanes contenues dans ces vsicules, on tombe sur une valeur proche de 9,5 kDa (valeur attribue au prcurseur de grande taille voqu dans la rponse 2). 6. La synthse de linsuline dbute dans le RER, o une chane de 9,5 kDa est fabrique par insertion cotraductionnelle. Aprs stabilisation de sa structure tridimensionnelle grce aux ponts disulfure, elle passe dans lappareil de Golgi, puis est envoye dans les vsicules de scrtion o cette chane est dcoupe en 3 fragments ; deux seulement sont conservs dans la molcule qui subira lexocytose.
Glycosylation dune protine membranaire

Le rcepteur des LDL (low density lipoproteins) est une glycoprotine membranaire rencontre dans la plupart des cellules, chez lHomme. Sa masse molculaire (MM) est de 160 kDa et sa chane polypeptidique unique comporte 839 acides amins. 1. Calculer la proportion de sucres dans la masse finale de la molcule, sachant que la MM moyenne dun acide amin est de 110 Da.
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La synthse de ce rcepteur est effectue, partir de son ARNm purifi, dans un systme de traduction in vitro auquel on ajoute des microsomes issus du RER, ainsi quun mlange de trois sucres simples : glucose, mannose et galactose. Dans trois expriences spares, le marquage de la protine nosynthtise est ralis avec trois prcurseurs radioactifs diffrents : la leucine 3H, le mannose 3H et le galactose 3H. Avec les deux premiers marqueurs, on obtient bien une chane radioactive, dont la MM est estime 120 kDa ; avec le galactose, la molcule obtenue a la mme MM, mais elle nest pas radioactive. Lorsque cette molcule est traite avec une glycosidase, enzyme qui dcroche les chanes sucres, sa MM est alors de 92,3 kDa. 2. Quelles conclusions tirez-vous de ces diffrentes expriences ? Grce un fractionnement cellulaire de cellules hpatiques, il est possible de purifier des vsicules dorigine golgienne, dont les protines membranaires peuvent tre analyses : on y retrouve le rcepteur des LDL, et sa MM est alors de 160 kDa. 3. Quelle information complmentaire apportent ces expriences en ce qui concerne les mcanismes de glycosylation du rcepteur des LDL ?
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Solution
1. La chane polypeptidique a une MM de : 839 110 = 92 300 Da = 92,3 kDa. Par rapport la masse totale, ceci reprsente la proportion suivante, : 92,3/160 = 57,7 %. La masse relative de sucres est donc de 100 57,7 = 42,3 %. 2. En prsence de microsomes et de sucres simples, prcurseurs des polysaccharides, on obtient une chane de 120 kDa, ce qui suggre un phnomne de glycosylation de la protine. Ceci est confirm par les expriences de marquage qui montrent une incorporation de mannose 3H lors de la synthse. En revanche, le galactose 3H nest pas incorpor, ce qui montre quil nentre pas dans la constitution des chanes sucres ajoutes la protine. La glycosidase dcroche tous les sucres. 3. Dans lappareil de Golgi, le rcepteur existe sous la mme forme (160 kDa) que dans la membrane plasmique. Cest lors du passage dans cet organite, spcialis dans la glycosylation des protines, quil acquiert sa composition et sa taille dfinitives. On rappelle que la nature de la glycosylation nest pas la mme dans le RER (N-glyc.) et dans le Golgi (O-glyc.).
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FICHE
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Les lysosomes ; les vacuoles vgtales
I Des organites fonction de digestion et de stockage

Ils appartiennent au rseau endomembranaire tudi prcdemment et constituent un compartiment terminal pour de nombreuses protines dorigine golgienne. Les lysosomes renferment un nombre lev denzymes susceptibles dhydrolyser la plupart des macromolcules connues. Les vacuoles ont une origine et des fonctions voisines, mais leur grand dveloppement et leur capacit de stockage dimportants volumes deau leur confrent des proprits originales et capitales chez les plantes. Les lysosomes, un compartiment trs htrogne : on rassemble sous ce nom des organites unimembranaires trs polymorphes, dont la taille peut aller de 0,1 plusieurs m, et dont le contenu est extrmement variable et htrogne. Leur point commun est la cinquantaine dhydrolases acides (concentres dans des vsicules mises partir du Golgi), ce qui permet de les mettre en vidence sans ambigut grce des tests cytoenzymologiques (cf. fiche 20). Leur lumire est acidifie grce lintervention, aprs fusion membranaire, dune pompe protons provenant du compartiment endosomal. partir de ce moment, les enzymes peuvent digrer le contenu organique qui y a t accumul. La fonction lytique des lysosomes : leur rle consiste digrer des substances exognes absorbes par endocytose : htrophagie, ou des territoires cellulaires qui ont t squestrs par des membranes : autophagie. Toutes les cellules qui se nourrissent par phagocytose, quil sagisse dtres unicellulaires (Protistes), ou bien quelles appartiennent des tres multicellulaires (cellules dfensives), mettent en uvre ces organites. Ces derniers assurent aussi le renouvellement cellulaire et le modelage de certains organes, chez lembryon et chez ladulte. Les vacuoles : elles occupent un volume important dans les cellules diffrencies, telles que celles des parenchymes ; chez les cellules mristmatiques, leur origine peut tre trace dans lappareil de Golgi. Leur lumire est riche en hydrolases, mais elles ont aussi une activit de stockage de mtabolites secondaires et de diverses macromolcules. Elles jouent en outre un rle dans le maintien et la croissance cellulaires.
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II Les sondes fluorescentes

Depuis peu, les Biologistes disposent dun grand nombre de composs fluorescents leur permettant de visualiser et quantifier non seulement des activits enzymatiques au sein des cellules vivantes, mais galement de dtecter des ions particuliers au sein du cytoplasme ou de mesurer le pH dans la lumire de tel ou tel organite. Grce ces sondes fluorescentes dactivits mtaboliques, il est dsormais possible de suivre des phnomnes physiologiques parfois trs rapides, et en temps rel, au microscope fluorescence (cf. fiches 4 et 8). Un exemple historique : le diactate de fluorescine est un compos de ce type utilis depuis longtemps comme test de viabilit des grains de pollen. Ce compos hydrophobe traverse la membrane plasmique et pntre donc aisment dans les cellules vivantes ; au sein du cytoplasme, des estrases varies le dcomposent et en librent la fluorescine, qui fluoresce en vert. Cette dernire est hydrophile et ne peut franchir les membranes, de sorte que la grande vacuole centrale dune des cellules du grain de pollen nest pas colore alors que le cytoplasme lest. Sur le mme principe, on connat dautres molcules permettant de visualiser de manire trs spcifique certains organites des cellules animales. Ainsi, la cathepsine, une protase caractristique des lysosomes, clive un substrat organique librant une molcule fluorescente, ce qui fait apparatre ces organites comme des points brillants. Dans ces deux exemples, on parle de substrats fluorogniques. Autres sondes fluorescentes : elles ont t dveloppes pour fonctionner dans un contexte physicochimique bien particulier, ce qui permet de reprer soit les organites dans lesquels celui-ci est ralis en permanence, soit didentifier des conditions transitoires pendant lesquelles tel ou tel territoire cellulaire le ralise, sous laction dun stimulus externe, par exemple. Les mitochondries accumulent spcifiquement des composs tels que le DASPMI ou la rhodamine 123, sous laction du gradient transmembranaire de protons, ce qui les rend intensment fluorescentes. Des indicateurs sensibles aux ions ne fluorescent quen leur prsence, et de manire quantitative ; le pH intracellulaire (concentration en H+), ou la concentration en ions Ca2+ libres, trs impliqus dans divers phnomnes de signalisation (cf. fiche 28) peuvent tre mesurs, et leurs variations suivies seconde aprs seconde. La difficult est que certains de ces indicateurs ne peuvent rentrer spontanment dans les cellules par diffusion, et bien souvent il est ncessaire de les injecter, de les faire entrer par lectroporation ou en utilisant des liposomes (cf. fiche 26).
FICHE 19 Les lysosomes ; les vacuoles vgtales
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Les lysosomes : des organites digestifs originaux

La fonction premire des lysosomes est la dgradation de molcules prleves dans le milieu extrieur ou dans le cytoplasme ; la prsence dans leur lumire denzymes caractristiques a t la base de leur dcouverte. Rpondre par Vrai ou Faux aux propositions suivantes qui illustrent cette fonction de digestion. 1. Le pH de la cavit des lysosomes (5-6) est maintenu grce une pompe protons membranaire qui chasse en permanence les H+ de cette cavit vers le cytosol. 2. La membrane des lysosomes possde une bicouche lipidique exceptionnellement permable aux petites molcules charges issues de lhydrolyse des macromolcules. 3. Chez les Animaux, les enzymes lysosomales sont gnralement confines ces organites et ne font pas lobjet dune exocytose. 4. On appelle corps rsiduels des vsicules contenant des enzymes lysosomales inactives et nayant jamais t en contact avec leurs substrats normaux. 5. Lensemble des hydrolases contenues dans les lysosomes est capable de digrer pratiquement toutes les macromolcules connues chez les tres vivants. 6. Certains Protistes et certains Animaux infrieurs ont un besoin absolu en lysosomes pour assurer la digestion de leurs proies ou particules alimentaires. 7. Aprs leur phagocytose, toutes les bactries sont dtruites dans les lysosomes des cellules assurant la dfense de notre organisme : leucocytes et macrophages. 8. Il existe de nombreuses maladies gntiques lies des anomalies des lysosomes.
Solution
1. Faux : pour maintenir le pH acide de leur lumire, cette pompe concentre au contraire les protons dans les lysosomes. 2. Faux : en revanche, la membrane des lysosomes est trs riche en transporteurs protiques (cf. fiche 4) permettant aux petites molcules (charges ou pas) de gagner le cytosol pour y tre utilises comme mtabolites. 3. Vrai : cette exocytose na normalement pas lieu, car elle aurait des consquences fatales pour lorganisme (en particulier, destruction des matrices extracellulaires). 4. Faux : il sagit au contraire de vsicules contenant des molcules nayant pas pu tre digres par les enzymes lysosomales. 5. Vrai : pratiquement toutes les macromolcules organiques peuvent tre digres, mais il existe cependant des exceptions, qui sont lorigine des corps rsiduels. 6. Vrai : les Cilis, les amibes, se nourrissent par phagotrophie et utilisent ces organites pour leur nutrition ; cest galement vrai pour les ponges, les Cnidaires 7. Faux : certaines espces de bactries : Listeria, Mycobacterium tuberculosis (agent de la tuberculose), Legionella pneumophila rsistent cette destruction.
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8. Vrai : si les enzymes lysosomales sont mutes , elles peuvent tre incapables de remplir leur fonction de digestion : on parle alors de maladies de surcharge .
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Synthse des hormones thyrodiennes

Chez les Vertbrs, les hormones thyrodiennes T3 et T4 (tri- et ttra-iodothyronine) sont fabriques au niveau de la thyrode, une glande forme de petites structures pithliales creuses appeles follicules. Ces follicules contiennent une glycoprotine nomme thyroglobuline (660 kDa), qui est fabrique par les cellules pithliales, scrte, iode et enfin provisoirement stocke dans leur cavit (la collode). Cette protine est lorigine de la production des hormones T3 et T4 aprs la mise en uvre de mcanismes cellulaires originaux. Ceux-ci sont analyss dans cet exercice, travers les expriences suivantes : 1) des follicules thyrodiens sont dissqus et incubs pendant 1 h dans un milieu de survie contenant de liode radioactif (131I). la suite de cette incubation, on peut vrifier que la thyroglobuline contenue dans la cavit est devenue radioactive. 2) on peut stimuler in vitro la scrtion des hormones T3/T4 par les follicules, au moyen dune hormone hypophysaire, la TSH. Une tude autoradiographique et biochimique est ensuite conduite sur les follicules partir du temps t0 o la scrtion est provoque (priode de chasse de 6 h) : 3) cinq compartiments sont tudis en autoradiographie lectronique (cf. fiche 17) : la cavit des follicules (1), les vsicules dendocytose (2), les lysosomes (3), lappareil de Golgi (4) et le cytosol (5). Paralllement, la radioactivit est mesure dans le milieu de survie (6) pendant toute la chasse. 4) les protines de certains de ces compartiments sont purifies par fractionnement cellulaire, et analyses par lectrophorse en SDS et autoradiographie des gels. La figure suivante montre les rsultats de ces deux expriences :
FICHE 19 Les lysosomes ; les vacuoles vgtales
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1. Dcrivez le trajet cellulaire des molcules radiomarques au cours de la chasse. 2. Quadvient-il de la thyroglobuline tout au long de ce trajet, en particulier dans les lysosomes, et quel produit trouve-t-on dans le milieu extrieur la fin de la chasse ? 3. En quoi le mcanisme de synthse de ces hormones est-il trs original ?
Solution
1. Le premier compartiment marqu est videmment la cavit des follicules, dans lesquels la thyroglobuline marque par liode au cours du pulse a t accumule. En mme temps que ce compartiment se vide de sa radioactivit, on observe que les vsicules dendocytose se marquent rapidement et brivement leur tour. Ensuite, selon les mmes modalits, on voit les lysosomes se charger, mais plus lentement ; puis la radioactivit y diminue alors que le milieu de survie commence devenir radioactif. Les lysosomes sont visiblement les organites dans lesquels les molcules marques sjournent le plus longtemps. 2. Les lectrophorses en SDS montrent que le compos radioactif contenu dans les follicules a une masse molculaire voisine de 330 kDa, ce qui suggre dabord que la thyroglobuline est forme de 2 sous-units de taille identique. On la retrouve telle quelle, au bout d1 heure, dans les vsicules dendocytose qui ont captur cette molcule dans la cavit folliculaire, au niveau de la membrane plasmique apicale des cellules pithliales (les thyrocytes). En revanche, dans les lysosomes, on observe au cours du temps (points 2, 3 et 4 h) une diminution progressive de la taille des molcules qui y atteignent 1 kDa seulement ; ceci prouve quune digestion de la thyroglobuline en peptides de plus en plus courts a eu lieu dans ces organites, ce qui est cohrent avec le fait quils contiennent des hydrolases, et en particulier des protases. Au bout de 6 h, le milieu contient un compos renfermant de liode radioactif, dont la masse molculaire est de lordre de 0,8 kDa : il sagit des hormones T3 et T4, qui ont t scrtes par exocytose sur la face oppose celle de la cavit folliculaire. 3. Ce mcanisme de synthse des hormones thyrodiennes est original, car il se ralise en deux tapes trs diffrentes se droulant dans les mmes cellules : les thyrocytes. Tout dabord, la thyroglobuline est synthtise et scrte dans la cavit folliculaire, selon la voie classique de scrtion (cf. fiche 17) : RER, Golgi, vsicules et exocytose. Ensuite, sous laction dun stimulus (la TSH), les cellules reprennent la tyroglobuline par endocytose, la dgradent dans les lysosomes en la dcoupant en fragments do proviennent les hormones T3 et T4, qui sont des dipeptides constitus de 2 tyrosines iodes (avec 3 ou 4 atomes dIode).
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FICHE
Les mitochondries : morphologie et organisation

I Les mitochondries, des organites prsents chez tous les Eucaryotes
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Toutes les activits cellulaires consomment de lnergie, et une seule molcule est universellement utilise comme moyen de fournir de lnergie aux ractions endergoniques du mtabolisme, aux transports actifs des ions ou des molcules organiques, aux mouvements intracellulaires et ceux des cellules elles-mmes. Il sagit de lATP (Adnosine tri-phosphate ; voir lencart suivant) dont lessentiel est fabriqu, dans des conditions darobiose, par les mitochondries. Tous les Eucaryotes ( lexception de quelques rares groupes de Protistes, qui les ont en fait perdues au cours de lvolution) possdent des mitochondries, y compris les Vgtaux verts, contrairement une ide fausse et assez couramment rpandue ! Observation en microscopie photonique : les mitochondries se prsentent comme des granules plus ou moins allongs, dont la taille est voisine de 0,5 1 m ; parfois filamenteuses, elles peuvent atteindre une dizaine de m de long ; leur forme est spcifique du type cellulaire considr. On compte environ 1 500 mitochondries globulaires dans un hpatocyte. Lutilisation de colorations physiques (cf. fiche 2) associes au microcinma ou la vidomicroscopie montre que ces organites sont dformables, anims de mouvements et capables de se dplacer au sein du cytoplasme. Certaines colorations cytochimiques, trs spcifiques, sont un moyen ais de visualiser de faon indiscutable les mitochondries, malgr leur petite taille (voir la suite). Observation en microscopie lectronique : voir lexercice propos dans cette fiche : un schma lgend de lultrastructure mitochondriale est donn. Le matriel gntique des mitochondries : ces organites se distinguent des autres (tout comme les chloroplastes, cf. fiche 22) par la prsence dune information gntique
FICHE 20 Les mitochondries : morphologie et organisation
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autonome, sous la forme dune molcule dADN circulaire. Le nombre de protines cod par ce chromosome est trs faible et ne suffit pas rendre compte de toutes les protines constitutives des mitochondries (plusieurs centaines). La mise en place des organites semi-autonomes (on parle de biogense) est un phnomne complexe, qui sera tudi dans une prochaine fiche (cf. fiche 25).
II La dtection denzymes in situ : la cytoenzymologie

La cytoenzymologie est une approche cellulaire ancienne (annes 1960), qui a pour objectif de localiser des activits enzymatiques au sein des cellules vivantes (Protistes, pithliums, tissus faciles craser), sur des coupes de cellules congeles (cryomicrotomie) ou sur des fractions cellulaires isoles par centrifugation (cf. fiche 15). Principe de la technique : cette mthode repose sur le fait que des enzymes situes dans des structures cellulaires peuvent tre rendues visibles travers les produits des ractions quelles catalysent. Deux conditions doivent donc tre ralises : les enzymes doivent tre fonctionnelles (protines non dnatures) ; le (ou un des) produit(s) de la raction doit tre insoluble (pour ne pas diffuser au cours du temps), et tre color ou opaque la lumire (ou aux lectrons pour les variantes adaptes la microscopie lectronique). La difficult, dans ces techniques, est donc de trouver des substrats hydrosolubles et si possible incolores pour ces enzymes, mais donnant des produits visualisables au microscope. De faon gnrale, ces molcules ne sont ainsi pas les substrats naturels des enzymes, mais des analogues artificiels labors par les chimistes, de faon remplir les conditions contraignantes signales plus haut. De nombreux contrles doivent tre raliss pour valider les rsultats de ces mthodes, toujours dlicates mettre en uvre. Exemples la succinate-dshydrognase catalyse la raction doxydation du succinate en fumarate, dans le cycle de Krebs, en couplant cette raction la rduction du coenzyme FAD en FADH2. On peut localiser cette enzyme en couplant la dernire raction une autre, le FADH2 rduisant spontanment un compos oxyd jaune non biologique (le Nitro Bleu de Ttrazolium : NBT) en NBTH2. Ce dernier, de couleur bleu-violet, est insoluble dans leau ; il saccumule donc sur son lieu de formation, cest--dire la matrice mitochondriale, ce qui permet de visualiser aisment cet organite. Lutilisation dun inhibiteur spcifique de lenzyme permet de valider la technique. De nombreuses autres oxydases sont dtectables in situ selon ce principe.
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les phosphatases, qui catalysent lhydrolyse de nombreux monoesters organiques de lacide phosphorique, sont visualisables grce des ractions couples formant un prcipit noir de sulfure de plomb (via la formation de phosphate de plomb). Des variantes de ces protocoles ont t mises au point pour la microscopie lectronique.
Structure des mitochondries

Schma de mitochondrie (observe en microscopie lectronique) lgender.
Voir solution en fin de fiche.
Formule dveloppe de la molcule dATP
Lhydrolyse de lATP (ADP + P ou AMP + Pi-Pi) est une raction spontane quasiment totale, et donc trs exergonique. Le couplage de cette raction la phosphorylation non spontane (endergonique) dune autre molcule (telle que le glucose, ou mme une protine) conduit la modification des proprits physicochimiques de cette dernire, et saccompagne souvent de son activation.
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Les mitochondries, des organites universels

1. Les dimensions des mitochondries sont trop faibles pour quon puisse les observer avec un microscope photonique (ou lumire). Vrai ou faux ? 2. Chez les Procaryotes, les mitochondries ont une organisation lgrement diffrente de celle dcrite chez les Eucaryotes. Vrai ou faux ? 3. Chez un organisme complexe (un animal, par exemple), les mitochondries ont la mme morphologie dans toutes les cellules. Vrai ou faux ? 4. Dans certaines cellules animales les membranes mitochondriales peuvent reprsenter la majorit de la surface membranaire de la cellule. Vrai ou faux ? 5. Au sein de certaines cellules animales, la rpartition des mitochondries nest pas homogne, mais en rapport avec des besoins nergtiques locaux. Vrai ou faux ? 6. Certaines cellules animales ne possdent pas de mitochondries, ce qui ne les empche pas davoir une dure de vie de plusieurs mois. Vrai ou faux ? 7. Les deux membranes limitant les mitochondries ont exactement la mme composition chimique (protines et lipides). Vrai ou faux ? 8. On ne rencontre jamais de granules damidon dans les mitochondries, quelle que soit leur origine, animale ou vgtale. Vrai ou faux ? 9. LADN des mitochondries diffre chimiquement de lADN nuclaire car il est form dun seul brin. Vrai ou faux ? 10. Les mitochondries sont des organites faciles purifier partir dhomognats cellulaires, dans un protocole de fractionnement cellulaire. Vrai ou faux ? 11. Les nombreuses ressemblances (morphologiques, biochimiques, gntiques) qui existent entre les mitochondries et les bactries sont purement fortuites. Vrai ou faux ?
Solution
1. Faux : ces organites sont parfaitement visibles, mais leurs faibles dimensions (de lordre de 0,5 m dpaisseur) font quil est impossible dobserver leur organisation interne (limite de rsolution du microscope photonique : 0,25 m). 2. Faux : il nexiste videmment pas de mitochondries dans les cellules procaryotes, qui ne sont pas compartimentes en organites. 3. Faux : la forme des mitochondries est spcifique des cellules ; elles sont, par exemple, arrondies dans les hpatocytes des Vertbrs et filamenteuses dans certaines cellules endothliales. 4. Vrai : dans les cellules musculaires (celles des Insectes en particulier), les crtes sont extrmement nombreuses et trs dveloppes, do une surface considrable pouvant atteindre prs de 75 % de la surface membranaire totale.
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5. Vrai : dans certaines cellules, les mitochondries se regroupent prfrentiellement dans des territoires o la demande en ATP est leve (base du flagelle des spermatozodes, domaine basal ou apical des cellules absorbantes) 6. Vrai : les hmaties (globules rouges) des Mammifres en sont dpourvues et elles vivent pourtant prs de 4 mois en ralisant la fermentation lactique du glucose. 7. Faux : ces deux membranes diffrent profondment par leur composition chimique et ont des proprits physisochimiques et enzymatiques bien distinctes (cf. fiche 21). 8. Vrai : on ne rencontre jamais damidon dans les mitochondries, mais en revanche les chloroplastes ou les amyloplastes des vgtaux en contiennent. 9. Faux : lADN mitochondrial est un ADN standard, double brin ; seuls certains virus ont un matriel gntique form dADN simple-brin (cf. fiches 25 et 30). 10. Vrai : il est trs ais de purifier des mitochondries par une simple centrifugation dun homognat cellulaire, 10 000 g, pendant 15 minutes (cf. fiche 15). 11. Faux : les mitochondries, de mme que les plastes, ont des anctres procaryotiques ; cest la thorie qui nen est plus une dite endosymbiotique de lorigine de ces organites.
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Solution
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FICHE
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Les fonctions des mitochondries
I Le rle nergtique des mitochondries

Cest au sein de ces organites que se ralise la respiration cellulaire, cest--dire loxydation complte des nutriments nergtiques grce au dioxygne (O2), pour en extraire un maximum dnergie chimique, laquelle sera convertie en une autre forme dnergie chimique : les liaisons phosphate contenues dans la molcule dATP. La glycolyse : la dgradation complte du glucose, molcule nergtique de toutes les cellules par excellence, commence dans le cytosol, au niveau de cette srie linaire de 10 ractions. Elle convertit le glucose en 2 molcules de pyruvate (molcule en C3), tout en permettant la synthse de 2 ATP par molcule de glucose. Le cycle de Krebs : le pyruvate est ensuite totalement dgrad dans la matrice des mitochondries, au niveau de cette succession de 9 ractions. Ce cycle conduit la production de CO2 et de pouvoir rducteur , ensemble de molcules fortement rductrices (des coenzymes donneurs dlectrons) qui seront finalement oxydes, dans un deuxime temps, grce lO2. Ces ractions doxydorduction spontanes et exergoniques seront lorigine de la phosphorylation de lADP en ATP (raction endergonique), grce un processus complexe qualifi de chimio-osmotique. Loxydation phosphorylante (ou phosphorylation oxydative) : les lectrons fournis par les coenzymes rduits sont pris en charge par une srie de ractions doxydorduction catalyses par de gros complexes protiques enchsss dans la membrane interne, et fonctionnant comme des couples redox organiss en srie Cette chane de transporteurs dlectrons assure le flux spontan des lectrons jusqu O2 ; lors de ce transport, trois ractions fortement exergoniques permettent le pompage (transport actif) de protons de la matrice vers lespace intermembranaire, qui devient plus acide que la matrice. Le gradient transmembranaire de protons ainsi gnr par la chane des transporteurs dlectrons est dissip au niveau de gros complexes protiques, les ATP synthtases, qui couplent le retour spontan des protons vers la matrice, travers elles, la synthse dATP.
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Les mitochondries assurent en outre diverses autres fonctions mtaboliques, en particulier la dgradation des acides gras et de nombreux acides amins.
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II Spectres dabsorption ; ltude spectroscopique des cytochromes

De nombreuses molcules biologiques en solution aqueuse ou dans des solvants organiques, sont capables dabsorber certaines radiations lectromagntiques dans la gamme de la lumire visible ou de la lumire ultraviolette (UV). Ces composs, trs souvent colors, sont qualifis de pigments ; on peut citer par exemple la chlorophylle ou lhmoglobine. Labsorption de la lumire : cette proprit est lie la prsence dans ces composs de groupements chimiques dont les lectrons de certains atomes peuvent tre excits par des photons dune longueur donde particulire, et ports un niveau dnergie suprieur leur niveau de base. Cest en particulier le cas des molcules qui possdent des cycles prsentant des double-liaisons conjugues : acides amins aromatiques, bases nucliques, groupements hminiques, ou de longues chanes avec une alternance de double-liaisons et de liaisons simples : carotnodes. Les lectrons de ces structures sont dits dlocaliss car ils forment une sorte de nuage (autour de la molcule de ttrapyrrole dun hme, par exemple) favorisant la capture des photons. Lnergie capture est restitue sous forme de chaleur ou dune lumire de longueur donde plus grande (fluorescence ; cf. fiches 4 et 8). La mesure de labsorption : labsorption de photons de certaines longueurs donde lumineuses est rendue visible grce un spectrophotomtre. Cet appareil produit toutes les longueurs donde (spectre visible et UV) et est capable de mesurer lintensit dun faisceau lumineux dune longueur donde donne ayant travers une solution de la molcule considre. La mesure de la quantit de lumire absorbe pour chaque longueur donde est trace en fonction de ces dernires pour toute la gamme UV-visible (240-800 nm) ; on obtient un spectre dabsorption dont le profil est caractristique de la molcule tudie. Les spectres des chlorophylles et des pigments photosynthtiques en gnral sont un exemple classique (cf. fiche 23). Les cytochromes : cest grce ces mthodes quils ont t identifis depuis fort longtemps (D. Keilin, 1925). En utilisant des fragments de muscles dinsectes, cet auteur a mis en vidence trois bandes dabsorption caractristiques, situes dans la gamme 540-610 nm. Ces bandes ne sont visibles quen conditions danarobiose (elles disparaissent en prsence de O2) ou en prsence dun poison violent tel que le cyanure ;
FICHE 21 Les fonctions des mitochondries
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lutilisation de diverses drogues ainsi que lobservation de stabilits diffrentes en fonction de la chaleur, ont conduit Keilin conclure lexistence de trois types de molcules, connues actuellement sous le nom de cytochromes b, c et a/a3. Lordre de fonctionnement de ces molcules dans une chane doxydorduction a pu aussi tre tabli grce cette approche.
Activit respiratoire des mitochondries

Lors dun effort violent et soutenu (du type course de 400 mtres), un athlte est parfois confront un problme de crampes, qui sont dues laccumulation dacide lactique dans les muscles. Cette molcule, qui passe ensuite dans le sang, drive directement de lacide pyruvique (acide trois atomes de C) issu de la glycolyse, aprs fixation de deux atomes dhydrogne apports par un coenzyme rduit. 1. Dans quel compartiment cellulaire se droulent les 10 tapes de la glycolyse ? 2. Quel est le devenir de lacide pyruvique dans les conditions normales de vie des cellules (en arobiose) ? 3. Dans quel compartiment de la mitochondrie le cycle de Krebs se droule-t-il ? 4. Quelles sont les molcules produites lors dun tour de cycle de Krebs ? 5. Quel est le compartiment le plus acide dans une mitochondrie, et pourquoi ? 6. Quelle est la molcule produite la fin de la chane respiratoire, rsultant de loxydation des coenzymes rduits ? 7. Comment interprtez-vous biochimiquement le fait que les cellules musculaires ne puissent plus dgrader de faon complte lacide pyruvique, lors dun effort intense et de longue dure ? 8. Comment appelle-t-on le processus biochimique conduisant la formation dacide lactique dans ces cellules ? 9. Pourquoi parle-t-on de couplage chimio-osmotique pour dcrire le mode de fonctionnement des mitochondries et de synthse de lATP ?
Solution
1. Ces 10 tapes se droulent au sein du cytosol, en phase soluble, chacune delles tant catalyse par une enzyme spcifique. 2. Dans les conditions normales darobiose, lacide pyruvique pntre dans les mitochondries et donne de lactyl-coenzyme A (actyl-CoA) dont le groupement actyle (CH3CO) entre dans le cycle de Krebs. Cette raction produit galement une molcule de CO2 et une molcule de NADH + H+. Dans le cycle de Krebs, le groupement actyle de lactyl-CoA est entirement dgrad en CO2 et pouvoir rducteur (sous forme de coenzymes rduits).
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3. Le cycle de Krebs se droule pour lessentiel dans la matrice mitochondriale (enzymes solubles), mais une de ses tapes est catalyse par une enzyme de la membrane interne : la succinate dshydrognase. 4. Au cours dun tour de cycle, on obtient 3 molcules de NADH + H+, 1 molcule de FADH2, 1 molcule de GTP et 2 molcules de CO2. 5. Il sagit de lespace intermembranaire, qui est un lieu daccumulation de protons pomps partir de la matrice grce certains complexes enzymatiques de la membrane interne (les complexes I, III et IV, qui sont des transporteurs dlectrons). 6. La molcule finale qui rsulte de loxydation des coenzymes rduits est H2O. Cette molcule provient de la rencontre de O2, des lectrons fournis par la cytochrome oxydase (dernier complexe membranaire de la chane des transporteurs dlectrons) et de protons issus de la matrice mitochondriale (librs par le premier complexe de la chane lors de ltape initiale doxydation des coenzymes rduits). 7. Lors dun effort intense, la fourniture dO2 par les poumons est insuffisante et les cellules musculaires entrent en anarobiose. En absence dO2, les coenzymes rduits ne peuvent plus tre roxyds par la chane respiratoire et le cycle de Krebs ne fonctionne donc plus ; la respiration cellulaire est alors bloque. La glycolyse continue cependant fournir du pyruvate qui est rduit en lactate grce au NADH + H+ quelle produit aussi, ce qui permet de recycler ce transporteur et de continuer faire fonctionner cette voie mtabolique (mais tout en produisant un peu dATP). 8. Il sagit de la fermentation lactique ; de la mme faon, nos hmaties, qui sont dpourvues de mitochondries, ralisent ce mtabolisme de manire constitutive . Certaines bactries anarobies ralisent aussi la fermentation lactique, ce qui permet ainsi dobtenir le yaourt et la choucroute, mais cest une autre histoire ! 9. On utilise cette expression car lensemble des processus mis en uvre dans ce mtabolisme nergtique permet la ralisation dune liaison covalente (la phosphorylation de lADP en ATP) grce des phnomnes de transports ioniques travers des membranes. Le pompage des protons lors du transfert des lectrons conduit la cration dun gradient lectrochimique transmembranaire de protons qui est ensuite dissip au niveau des molcules dATP synthtase : une raction spontane est thermodynamiquement exergonique.
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FICHE 21 Les fonctions des mitochondries
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Fonctionnement dune mitochondrie

Schma fonctionnel dune mitochondrie lgender.
Solution
1 : membrane mitochondriale interne 2 : membrane mitochondriale externe 3 : acide pyruvique (ou pyruvate) provenant de la glycolyse 4 : acides gras provenant du cytosol 5 : actyl coenzyme A, plaque tournante du catabolisme 6 : CO2, issu de ractions de dcarboxylation 7 : pouvoir rducteur : NADH + H+, FADH2 8 : ADP (associ au phosphate inorganique : Pi) 9 : O2, laccepteur final dlectrons dans la respiration cellulaire 10 : H2O, le dchet de la respiration cellulaire 11 : protons (H+) impliqus dans le gradient chimiosmotique 12 : ATP, fabriqu au niveau des ATP synthtases
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FICHE
Les plastes : organisation et diversit

I Une grande famille dorganites
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Ces organites pigments, caractristiques des organismes vgtaux, possdent de nombreux points communs, structuraux et biochimiques, avec les mitochondries ; les chloroplastes, responsables de la photosynthse, sont les plus courants. Ils prsentent une grande diversit de tailles, de structures, de formes et de couleurs, en particulier chez les Protistes autotrophes. Chez les Vgtaux suprieurs, la spcialisation mtabolique des plastes accompagne la diffrenciation cellulaire. Lorganisation gnrale des plastes : ils sont bien visibles en microscopie photonique, car leur taille (5-10 m chez les Vgtaux suprieurs) est sensiblement plus grande que celles des mitochondries. Sur le plan de lultrastructure, ces deux types dorganites sont cependant trs voisins, comme le montre le schma propos dans lexercice suivant ( comparer celui prsent dans la fiche 20). Leurs ribosomes sont trs proches, en taille et en composition, de ceux dcrits chez les bactries, alors que ceux observs dans les mitochondries sont nettement plus petits ; ils sont tous deux sensibles certains antibiotiques antibactriens.
Leur diversit morphologique et structurale dans le rgne vgtal : en gnral, ils sont ovodes ou lenticulaires chez les plantes suprieures, mais chez les Algues, uniou multicellulaires, ils prennent des aspects curieux et souvent spectaculaires : en cupule, en toile, en ruban spiral, en rseau Le plus souvent uniques dans ces cellules, ils sont parfois prsents en grand nombre au sein du cytoplasme. Dans certains groupes dAlgues, ils prsentent 3 ou 4 membranes limitantes, ce qui constitue un critre phylogntique important. La diversit des pigments photosynthtiques : les chloroplastes sont le plus souvent verts, en raison de la prsence de chlorophylles, mais diffrents pigments surnumraires, lorsquils sont abondants, peuvent leur confrer dautres couleurs. Les carotnodes donnent aux plastes des couleurs jaunes ou brunes, tandis que les phycobilines des Algues rouges leur donnent une couleur rouge. Les consquences physiologiques de la prsence de ces molcules sont importantes (cf. fiche 23).
FICHE 22 Les plastes : organisation et diversit
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La diffrenciation des plastes chez les Vgtaux suprieurs : dans les cellules mristmatiques, il nexiste pas de plastes diffrencis, mais des proplastes, incolores et peu diffrents des mitochondries. Les chromoplastes, de couleur rouge, sont riches en cristaux de carotnodes, tandis que les leucoplastes, incolores, ont accumul divers mtabolites dans des cellules scrtrices. Enfin, certains sont spcialiss dans le stockage de diverses rserves, tels que les amyloplastes (amidon), les protoplastes (protines) et les oloplastes (huiles), que lon trouve en abondance dans les graines.
II La chromatographie
Il sagit dun ensemble de mthodes permettant de sparer des molcules organiques en fonction de leurs proprits physicochimiques : solubilit dans divers solvants, charge lectrique, affinit par rapport un groupement chimique donn On utilise un support poreux sur lequel le mlange tudier est dpos, et sur lequel un flux de solvant entrane plus ou moins loin les molcules en fonction de leur aptitude y tre retenues. Ce dernier est constitu dune feuille de papier filtre, dune plaque recouverte de cellulose ou de silice, dune colonne remplie de ces composants, etc. La chromatographie dadsorption : mise au point par M. Tswett (1906), pour sparer les pigments chlorophylliens, elle repose sur le principe suivant : un solut donn tend se lier par des liaisons faibles (sadsorber) sur un support qui fonctionne comme une phase stationnaire solide ; le solvant (luant) constitue une phase liquide et mobile qui migre sur ce support et tend en dcrocher le solut. Il sagit donc ici dune comptition entre deux phnomnes opposs : ladsorption et la dsorption. Les diffrents soluts dun mlange tant plus ou moins solidement retenus par la phase stationnaire et plus ou moins facilement dcrochs par la phase mobile, il sen suit une vitesse de migration diffrente et donc leur sparation progressive sur le support. Exemple de la sparation des acides amins : ces molcules sont plus ou moins hydrophiles (polaires) ; sur un support de cellulose (adsorbant hydrophile), les acides amins les plus hydrophiles sont retenus, tandis que les plus hydrophobes tendent suivre un solvant tel que le butanol ou le phnol. De manire pratique, une goutte dune solution concentre de divers acides amins est dpose lextrmit dune plaque de verre recouverte de cellulose ; celle-ci est ensuite plonge sur quelques millimtres dans un mlange aqueux de solvant qui va remonter par capillarit. Cest lors de cette migration du mlange eau/solvant que la sparation a lieu ; la rvlation des acides amins se fait au moyen de colorants.
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Les colonnes changeuses dions fonctionnent sur la base de lattraction entre les charges lectriques opposes de molcules fixes et des molcules sparer. La chromatographie daffinit est base sur un principe analogue. Une colonne de verre est remplie dun support poreux sur lequel des groupements chimiques, des petites molcules ou des macromolcules ont t greffes. Si lon fait passer sur cette colonne une solution dans laquelle une seule molcule a une forte affinit pour les molcules greffes, seule celle-ci sera spcifiquement retenue et toutes les autres traverseront la colonne et seront limines. Cest ainsi quune colonne contenant des billes portant des chanes de poly-uracile retient uniquement les ARNm porteurs dune queue de polyadnine (poly-A), parmi tous les ARN (cf. fiche 16).
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Isolement de chloroplastes fonctionnels
Dans le cadre dtudes sur la photosynthse, vous tes amen(e) isoler et purifier des chloroplastes dans le meilleur tat fonctionnel possible. Vous disposez du matriel biologique suivant : des feuilles dpinard, des jeunes racines de carotte et dune culture de cellules vgtales, sous forme de cals bien verts (cf. fiche 24). 1. Quel matriel biologique ne pouvez-vous pas utiliser, et pourquoi ? Vous connaissez un protocole de fractionnement cellulaire (cf. fiche 15) adapt aux cellules animales, que vous souhaitez transposer votre matriel. 2. Quel est le problme rencontr avec les cellules vgtales, en ce qui concerne ltape dhomognisation, par comparaison avec les cellules animales ? 3. Comment pourriez-vous vous affranchir de ce problme dans les meilleures conditions, cest--dire de faon prserver lintgrit des organites, et quel est alors le matriel le plus appropri pour ce traitement ? Vous traitez vos cellules de la manire prsente dans la rponse 3). Vous avez votre disposition un mixer destin broyer les cellules animales, et vous avez ralis une solution dilue dun dtergent doux (type Triton X-100), qui dissout les lipides sans dnaturer les protines. Vous souhaitez comparer lefficacit de ces deux mthodes dhomognisation, toujours avec lobjectif disoler des chloroplastes aussi intacts que possible. 4. Quel premier test simple pouvez-vous utiliser pour vous assurer de ceci ; quel outil plus sophistiqu devrez-vous faire appel pour vrifier ce premier rsultat ? Vous avez observ que lhomognisation laide dun mixer est une mthode plus reproductible que celle utilisant un dtergent, mais qui conduit une plus grande proportion de chloroplastes en mauvais tat apparent. Il vous est suggr de tenter de sparer ces deux populations dorganites par centrifugation sur un gradient continu de saccharose. Vous dposez donc votre homognat au sommet dun tel gradient ; le rsultat observ aprs la centrifugation est montr dans la figure de la page suivante.
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5. Sur quels critres se fait la sparation des particules sur un tel gradient ? 6. Laquelle des deux bandes de chloroplastes allez-vous rcuprer pour vos expriences, et pourquoi la plus basse se situe-t-elle cet endroit du gradient ?
Solution
1. La racine de carotte ne ralise pas la photosynthse, et ses cellules nont pas de chloroplastes ; en revanche, elles contiennent en abondance des chromoplastes qui contiennent du carotne. Les feuilles dpinard ou les cals verts peuvent tre utiliss. 2. Le problme rencontr ici tient la paroi cellulosique qui entoure chaque cellule et constitue une coque rsistante, ce qui rend lhomognisation plus difficile. 3. Il est possible de digrer la paroi de cellules vgtales vivantes au moyen dun mlange denzymes extraites de divers animaux vgtariens : cellulases, pectinases, hmicellulases (cf. fiche 27). Dans ces conditions, on obtient des cellules nues nommes protoplastes, qui doivent tre conserves dans un milieu osmotiquement quilibr, afin quelles nclatent pas spontanment. Le matriel le plus appropri est constitu par les cals verts obtenus en culture, car leurs cellules ne sont pas troitement jointives, comme dans un tissu diffrenci, et leur paroi est relativement fine. 4. Lhomognisation des protoplastes peut se faire au mixer (comme pour les cellules animales) ou avec un dtergent doux, car la membrane plasmique de ces cellules isoles est aisment accessible et y est trs sensible. Un premier test consiste regarder lchantillon trait au microscope photonique, et valuer ltat des chloroplastes, en comparaison avec celui observ sur des cellules vivantes normales. Par la suite, une observation au microscope lectronique simpose pour sassurer de lintgrit maximale des organites que lon veut purifier. 5. La sparation des organites sur un tel gradient est base sur une diffrence de vitesse de sdimentation. Celle-ci est fonction de plusieurs paramtres, tels que la masse
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(taille densit), la forme, mais aussi la densit seule, car pour certaines particules, on peut atteindre une position de stabilit (arrt de la migration) si la densit du milieu dans lequel elles se situent devient gale la leur. 6. La bande la plus basse contient des chloroplastes visiblement en trs bon tat (observation au MET), alors que celle du haut contient des organites gonfls, vsiculiss, et qui semblent mal conservs. Ils sont moins denses que les prcdents car, stant dtriors au cours de lhomognisation, ils se sont remplis du milieu (tampon dilu) dans lequel ils se trouvaient cette tape du protocole.
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Structure des chloroplastes

Schma de chloroplaste (observ en microscopie lectronique) lgender.
Solution
1) membrane interne 3) espace intermembranaire 5) stroma 7) espace intrathylakode 9) membranes des thylakodes 11) ribosomes et polyribosomes 13) lamelle granaire 2) grain damidon 4) membrane externe 6) ADN chloroplastique 8) lamelle intergranaire 10) granum 12) globule lipidique
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FICHE
23
Les fonctions des chloroplastes
I La photosynthse
Ce processus mtabolique fondamental permet la synthse de substances carbones (sucres simples et polysaccharides) partir de composs minraux : CO2 et H2O, en utilisant lnergie de la lumire solaire. Cette raction est exactement linverse de celle dcrite dans le mtabolisme de dgradation du glucose, qui est une raction doxydation spontane et exergonique (cf. fiche 21). La photosynthse est une raction endergonique de rduction de latome de C, dont la source dnergie physique est inpuisable : les photons. On y distingue deux tapes successives. Les ractions dites lumineuses : il sagit de ractions catalyses au niveau des membranes des thylakodes, et qui mettent en jeu quatre gros complexes protiques : deux photosystmes qui captent la lumire grce leurs pigments et deux complexes qui transfrent, lun des lectrons, et lautre des protons de part et dautre de la membrane. Ces derniers sont structurellement trs voisins des transporteurs dlectrons et des ATP synthtases dj vus dans les mitochondries. Cette tape conduit la dissociation de leau, pour en extraire des lectrons, des protons et de lO2 ; elle produit du pouvoir rducteur (NADPH) et de lATP et ainsi convertit lnergie lumineuse en nergie chimique, Les ractions dites sombres : ces ractions ne ncessitent pas la lumire et se droulent en phase soluble dans le stroma des plastes. Elles utilisent les deux molcules produites dans la phase prcdente (NADPH et ATP), qui interviennent dans le fonctionnement du cycle de Calvin. La RUBISCO (ribulose-1,5-bis-phosphate carboxylase-oxygnase (cf. fiche 25) fixe le CO2 atmosphrique chez les plantes vertes, et est donc lenzyme-cl de la photosynthse ; cette molcule est trs abondante et peut reprsenter jusqu 20 % des protines cellulaires solubles. Le rsultat de cette phase est la production de triosesphosphates qui sont soit exports dans le cytosol, soit provisoirement stocks dans le plaste sous forme damidon. Les autres fonctions mtaboliques des chloroplastes : cest en leur sein que se ralise la rduction des nitrates et des sulfates, tape indispensable pour la synthse des acides amins. Le mtabolisme des lipides y est aussi trs intense.
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II Lidentification des macromolcules spares par lectrophorse

Llectrophorse permet de sparer efficacement toutes les macromolcules charges : les protines (cf. fiche 9) et les acides nucliques (ADN, ARN). Cependant, la seule visualisation des bandes ou des spots sur les gels dlectrophorse, par coloration et/ou utilisation de la fluorescence, ne permet pas didentifier une espce molculaire donne parmi les centaines ou les milliers qui ont t spares. La seule manire de reconnatre une telle molcule est dutiliser une sonde , cest--dire une molcule marque capable de sassocier la cible recherche avec une grande spcificit. Nature des sondes employes : pour les protines, ce sont des anticorps marqus (qui possdent en gnral des enzymes greffes faciles visualiser), tandis que pour les acides nucliques, il sagit de fragments complmentaires dADN ou dARN capables de shybrider avec eux. Ces derniers sont alors radioactifs et dtectables par autoradiographie, ou bien porteurs de groupements chimiques susceptibles dtre reconnus par des anticorps, comme pour les protines. Ces techniques de dtection sont dcrites en dtail dans les fiches traitant de limmunodtection (cf. fiche 7) et de lhybridation in situ (cf. fiche 12), transposes la Biologie Molculaire. Le transfert : dans tous les cas, la premire tape consiste faire passer les molcules contenues dans le gel sur un support souple et rsistant ; en effet, les gels sont souvent fragiles, cassants ou trs mous, et donc difficilement manipulables. Cette tape de transfert ( blotting en anglais), se ralise en dposant sur le gel une feuille fonctionnant comme un filtre, faite de nitrocellulose ou de nylon. Le passage des molcules du gel vers la feuille pose dessus se fait par capillarit, grce au flux dune solution tampon, ou laide dun courant lectrique : lectrotransfert. On obtient donc une rplique du gel sur laquelle les molcules spares ont la mme disposition, mais plus concentres et plus accessibles des sondes de toutes natures, car en surface. La dtection des sondes : la seconde tape consiste mettre le filtre en contact avec une solution de la sonde marque : anticorps pour les protines, sonde nuclique pour lADN ou lARN. Aprs un temps dincubation suffisant pour que la sonde se soit fixe sur sa cible, et aprs divers lavages pour liminer lexcdent non fix de celle-ci, la phase de rvlation a lieu (film autoradiographique, ou mise en prsence dun substrat de lenzyme greffe lanticorps, donnant ensuite un produit color). Selon les molcules tudies, le protocole se nomme : Southern blot pour lADN, northern blot pour lARN et western blot pour les protines.
FICHE 23 Les fonctions des chloroplastes
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Spectres dabsorption et spectre daction photochimique

Les spectres dabsorption (cf. fiche 21) des diffrents pigments photosynthtiques dun vgtal vert sont prsents dans le diagramme 1. Le spectre daction photochimique consiste mesurer le dgagement dO2 obtenu lors de la photosynthse pour chaque longueur donde de la lumire visible (diagramme 2).
On observe une excellente superposition entre la somme des spectres dabsorption et le spectre daction. Ceci montre que les pigments qui captent la lumire sont principalement les chlorophylles, mais que les pigments accessoires participent activement la photosynthse en transfrant lnergie capte aux photosystmes.
Organisation de la membrane des thylakodes

Lgender et complter ce schma reprsentant lorganisation de la membrane dun sac thylakodien. Dvelopper chaque rponse en dgageant les aspects fonctionnels.
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23
Solution
1. Molcule deau (H2O) servant de donneur dlectrons pour le photosystme II. 2. Proton (H+), issu de la dissociation de leau au niveau du photosystme II. 3. Molcule de O2 provenant de la dissociation de leau. 4. Proton pomp dans le stroma par le complexe protique dit b6/f (contenant divers cytochromes), et envoy vers la cavit du thylakode. 5. Photosystme I (dit P 700), comportant une antenne et un centre ractionnel. 6. Photosystme II (dit P 680), de structure voisine de celle du P 700. 7. Complexe transporteur dlectrons, dit cyt b6/f , qui reoit des lectrons de la plastoquinone ou de la ferredoxine, et les cde la plastocyanine. Il agit comme pompe protons, la manire du complexe dit cyt b/c1 des mitochondries. 8. Complexe ATP synthtase, identique celui trouv dans les mitochondries. Cest son niveau (tte globulaire f1) que se ralise la phosphorylation de lADP en ATP. 9. Proton regagnant le stroma travers lATP synthtase ; son mouvement spontan dans le sens de son gradient lectrochimique entrane la phosphorylation de lADP. 10. Coenzyme transporteur dhydrogne (H+ et lectron), nomm plastoquinone. Cest une petite molcule hydrophobe trs voisine du coenzyme Q (ubiquinone), et qui fonctionne de la mme faon dans la membrane interne des mitochondries. 11. Ferredoxine : petite protine stromatique qui contient un centre fer/soufre et fonctionne comme un couple red-ox. Elle est capable : a) de cder des lectrons pour rduire le NADP+ en NADPH, ou : b) de les cder au complexe cyt b6/f . 12. Plastocyanine : petite protine de la lumire des thylakodes, contenant du cuivre et fonctionnant comme la ferredoxine. Elle transporte des lectrons entre le complexe cyt b6/f (donneur) et le photosystme II (accepteur). 13. NADP+ + H+ : la forme oxyde du coenzyme capte un proton du stroma et deux lectrons provenant du photosystme II pour donner du NADPH. 14. NADPH : pouvoir rducteur qui sera utilis dans le cycle de Calvin. 15. ADP + P. 16. ATP, issu de la phosphorylation de lADP au niveau de lATP synthtase. 17. Face membranaire charge positivement : la lumire du thylakode est plus acide que le stroma. 18. Face membranaire charge ngativement. Le gradient lectrochimique ainsi cr entre les deux faces de la membrane attire les protons vers le stroma. 19. Cavit du sac thylakodien. 20. Stroma du chloroplaste.
FICHE 23 Les fonctions des chloroplastes
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Les tapes de la rduction du CO2

Les propositions suivantes concernent la phase dite sombre de la photosynthse. Rpondre par vrai ou faux. 1. La molcule acceptrice du CO2 comporte deux atomes de carbone, de sorte quon obtient en une seule raction enzymatique un compos trois atomes de carbone. 2. Une partie de lATP fabriqu pendant la phase lumineuse permet de phosphoryler le premier produit obtenu par la fixation du CO2 : le 3-phosphoglycrate. 3. Le cycle de Calvin permet de rgnrer 3 molcules de ribulose-1,5-bisphosphate partir de 5 molcules de trioses, alors quun seul triose est produit, de faon nette. 4. Tout lATP produit dans le chloroplaste est consomm dans le stroma, et nest pas export dans le cytosol, la diffrence des mitochondries. 5. La photosynthse en C4 est ainsi nomme car elle a une efficacit 4 fois suprieure celle dcrite chez les plantes dites en C3. 6. La concentration actuelle du CO2 atmosphrique (0,03 %) nest pas un facteur limitant pour la photosynthse chez la plupart des vgtaux. 7. La RUBISCO est la protine la plus abondante dans la biosphre.
Solution
1. Faux : la molcule qui fixe le CO2 est un pentose, le ribulose-1,5-bisphosphate, et cest la RUBISCO qui catalyse cette raction. 2. Vrai : le phosphoglycrate est phosphoryl en bis-phosphoglycrate, compos instable qui est ensuite rduit par le NADPH en phosphoglycraldhyde (un triose). 3. Vrai : trois molcules de ribulose-1,5-bisphosphate fixent 3 molcules de CO2 qui reprsentent le bilan net de cette opration, sous la forme dune molcule de phosphoglycraldhyde. 4. Vrai : il ny a pas dexportation dATP vers le cytosol (car pas de transporteur). 5. Faux : elle doit son nom la premire molcule forme aprs fixation du CO2, savoir une molcule en C4 : loxaloactate, issu du phosphonolpyruvate (C3). 6. Faux : plus cette concentration est leve, et plus lintensit de la photosynthse est importante pour une intensit lumineuse donne. 7. Vrai : cette molcule peut reprsenter une proportion trs importante (50 %) des protines des tissus vgtaux verts, do cette affirmation.
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FICHE
Les peroxysomes et organites apparents

I Des organites trs divers fonction oxydative
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ct des mitochondries et des plastes, qui ont typiquement une activit de conversion de lnergie, il existe chez les Eucaryotes plusieurs catgories dorganites impliqus dans des ractions doxydorduction, mais ne produisant pas dATP. Les plus connus sont les peroxysomes et les glyoxysomes, mais il existe chez les Protistes plusieurs organites spcifiques, dont les activits sont trs originales. Les peroxysomes des cellules animales : ces petits organites unimembranaires (0,51 m) et universels sont trs abondants dans les cellules de certains organes tels que le foie et les reins des Mammifres. Malgr une certaine uniformit de structure, leur diversit biochimique est grande, mais leur matrice contient toujours deux types denzymes oxydatives : des flavoprotines FAD ou FMN, et des peroxydases (la catalase). Les premires consomment de lO2 et oxydent divers substrats (le plus souvent des acides organiques) en produisant H2O2 ; les secondes utilisent ce dernier compos pour oxyder leur tour dautres molcules. Les cascades de ractions ainsi obtenues ont une fonction gnrale de dgradation et de dtoxification dans les cellules. Les peroxysomes des cellules vgtales et les glyoxysomes : leur quipement enzymatique est plus diversifi que celui des peroxysomes des cellules animales. Ils interviennent de faon active dans le processus de photorespiration, qui consomme de lO2 et implique galement les chloroplastes et les mitochondries. Les glyoxysomes sont des peroxysomes spcialiss, trs abondants dans les cellules des graines olagineuses en germination ; ils y assurent la dgradation les acides gras des lipides en succinate qui, avec laide des mitochondries et des enzymes de la glycolyse, permettra de produire du glucose utilisable par les cellules en croissance.
FICHE 24 Les peroxysomes et organites apparents
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Les glycosomes de certains Protistes : ces organites unimembranaires possdent dans leur lumire toutes les enzymes de la glycolyse ; ils sont typiques des parasites responsables de la maladie du sommeil de lHomme, les Trypanosomes. Les hydrognosomes : ces petits organites double membrane (1 m) apparents aux mitochondries ne possdent gnralement pas de gnome propre. On les rencontre chez certains Protistes parasites anarobies tels que les Trichomonas ; ils sont caractriss par leur aptitude produire de lH2, du CO2, mais aussi de lATP.
II Les cultures de bactries, de cellules vgtales et de champignons

De mme que pour les cellules animales (cf. fiche 14), il est important de pouvoir disposer de cultures de cellules de nombreux autres organismes. Ces cultures tant homognes au plan gntique et plan physiologique, elles sont indispensables pour ltude de tout problme biologique. Les premires cultures clonales ont t des cultures bactriennes (XIXe sicle), car elles sont les plus faciles raliser. Les cultures bactriennes : lorsquun inoculum trs dilu est tal strilement sur une bote de milieu nutritif solide (glos, en bote de Petri), les bactries sont trs loignes les unes des autres au dpart, et elles donnent, aprs de nombreux cycles de division binaire, des colonies homognes (ou des clones, pour simplifier, issus dune seule cellule) bien spares, visibles lil nu (cf. fiche 1). Lorsque cet inoculum contient initialement diffrentes espces bactriennes en mlange, cette mthode permet disoler des colonies de souches pures (on parle de sous-clonage). Il est ensuite possible dutiliser de telles populations pures pour inoculer des milieux nutritifs liquides (en Erlen-Meyer, ou en fermenteurs), dont les volumes parfois levs permettent dobtenir des quantits de cellules identiques trs importantes ; les cellules en suspension sont spares du milieu par une simple centrifugation. Les milieux nutritifs de culture bactriens : ils se rpartissent en deux catgories - 1) les milieux synthtiques, dont la composition, souvent simple, est parfaitement connue et contrle (sels minraux, sucres et quelques vitamines), - 2) les milieux naturels, trs riches, drivs dextraits biologiques bruts (extraits de viande, de plantes, de levure), dont la composition est complexe et mal connue. Les premiers sont souvent spcifiques dune espce donne, dont les exigences nutritionnelles sont bien prcises, tandis que les seconds permettent la croissance de nombreuses espces htrotrophes diffrentes. Pour se multiplier, les Procaryotes photosynthtiques ncessitent videmment de la lumire, en plus des sels minraux. La culture des cellules vgtales : elles se multiplient in vitro, sur milieu glos nutritif, ltat de massifs cellulaires plus ou moins compacts, appels cals. On peut
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galement cultiver ces cellules en suspension dans un milieu liquide ; dans ce cas, il sagit le plus souvent dagrgats de cellules plutt que des cellules isoles. La culture des Champignons : il sagit en gnral ici de faire se dvelopper un microorganisme htrotrophe multicellulaire et filamenteux ; les cultures sur milieu solide ou milieu liquide, synthtique ou riche, sont possibles. La levure de bire, champignon unicellulaire, se cultive exactement de la mme faon que les bactries.
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Fonctions des peroxysomes
Ces organites mal connus remplissent des fonctions mtaboliques insouponnes et souvent trs importantes chez les Animaux. Les propositions suivantes illustrent quelques-unes de ces fonctions ; rpondre par Vrai ou Faux. 1. Ils sont le lieu de la synthse du cholestrol, dans le foie des Mammifres. 2. Loxydation des acides gras trs courte chane, que les mitochondries ne peuvent pas raliser, se droule uniquement dans les peroxysomes. 3. La production de lumire chez les lucioles (vers luisants) met en jeu une srie de ractions ayant lieu dans les peroxysomes. 4. On ne connat aucune maladie gntique humaine lie une dficience en protines peroxysomales, en raison du caractre fortement ltal de ces anomalies. 5. Loxydation de lalcool en actaldhyde dans le foie a lieu dans les peroxysomes.
Solution
1. Vrai : le cholestrol et le dolichol sont synthtiss aussi bien dans le RE que dans les peroxysomes des hpatocytes ; ces derniers fabriquent aussi les sels biliaires. 2. Faux : les acides gras trs longue chane (> 20 atomes de C) sont uniquement mtaboliss dans les peroxysomes ; lactyl-coA ainsi produit passe dans le cytosol. 3. Vrai : cette raction met en jeu un substrat pouvant mettre des photons : la lucifrine, et une enzyme : la lucifrase, qui est une enzyme peroxysomale. 4. Faux : on en connat actuellement 17, autosomales ou lies lX, qui se traduisent par des atteintes du systme nerveux conduisant plus ou moins rapidement la mort. 5. Vrai : environ 25 % de lalcool consomm est ainsi dgrad dans le foie.
Biogense des peroxysomes

La croissance des peroxysomes seffectue grce lapport constant de protines de membrane et de protines de matrice ; celles-ci sont codes dans le noyau et synthtises sur des ribosomes cytosoliques, puis intgres ces organites de faon posttraductionnelle (comme pour les mitochondries et les plastes ; cf. fiche 25).
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On se propose danalyser les mcanismes de limportation de deux protines vers la lumire des peroxysomes : la catalase et la thiolase. Les expriences suivantes ont t ralises : 1) ces deux protines sont purifies partir dune fraction cytosolique isole, par fractionnement cellulaire, aprs homognisation de cellules de foie de rat. Elles sont ensuite marques radioactivement par une technique qui ne les dnature pas ; 2) une fraction de peroxysomes purifis, issus de ces mmes cellules, est galement obtenue aprs fractionnement cellulaire ; 3) les deux protines radiomarques sont ensuite mises en prsence de peroxysomes purifis pendant 15 min, in vitro, dans un milieu ractionnel appropri. 1. Quelles techniques utiliseriez-vous pour vrifier si ces 2 protines sont entres ou non dans les peroxysomes, au bout des 15 min dincubation ? 2. Comment pouvez-vous vous assurer que les protines sont bien entres dans la lumire des microsomes, et quelles ne sont pas seulement colles leur surface ? 4) quatre conditions exprimentales diffrentes sont compares, selon que lon ajoute ou pas au milieu ractionnel un certain volume de fraction cytosolique (FCS), ou bien un peu dATP. Lefficacit relative de lentre des protines est exprime en % ; on obtient des rsultats trs voisins pour les deux protines : - FCS + ATP 0 - FCS - ATP 0 + FCS + ATP 100 + FCS - ATP 15
Efficacit :
3. Quelle conclusion tirez-vous de ces expriences, et quelles hypothses formulezvous au sujet des mcanismes dimportation mis en jeu ? 5) un lot de peroxysomes purifis est soumis laction dune protase dilue pendant un temps bref ; ces organites sont ensuite mis en prsence de chacune des deux protines marques, en prsence de FCS et dATP, comme prcdemment. On observe que les protines sont alors incapables de pntrer dans les peroxysomes. 4. Quel est le rsultat attendu de laction de la protase, et quelle nouvelle hypothse pouvez-vous formuler concernant les mcanismes mis en jeu ? 6) grce aux techniques du gnie gntique (cf. fiche 26), il est possible dobtenir des formes tronques de ces deux protines, cest--dire amputes dune dizaine dacides amins, soit du ct N-terminal, soit du ct C-terminal. Ces 4 protines sont ensuite radiomarques et utilises dans des expriences identiques celles o on a ajout au milieu des extraits cytosoliques (FCS) et de lATP. Enfin, lefficacit de lentre in vitro des protines dans les organites a t mesure : catalase tronque en N Efficacit : 100 catalase tronque en C 0 thiolase tronque en N 0 thiolase tronque en C 100
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5. Quelles informations apportent ces nouvelles expriences ? 6. Prsenter un modle rsumant lensemble des hypothses formules.
Solution
1. Il faut dabord centrifuger le contenu du tube essais, de faon rcuprer nouveau les peroxysomes sous forme dun culot (sdiment). Ensuite, il faut mesurer la radioactivit du culot ; si ce dernier est radioactif, on peut imaginer que des protines radioactives ont pntr dans les organites (on parle de cosdimentation). 2. Pour sassurer que les protines sont bien dans la lumire, on peut soumettre les peroxysomes un traitement protolytique (avec de la trypsine). En effet, si les protines sont colles dessus, elles seront accesssibles lenzyme, et seront digres. 3. Ces expriences montrent quil faut absolument ajouter des protines cytosoliques pour que la pntration de la catalase et de la thiolase ait lieu. De plus, on observe que lATP a un rle important jouer dans ce processus, qui est sans doute actif. On en conclut que des protines cytosoliques doivent interagir avec les protines importer pour que le systme fonctionne. On peut faire lhypothse que ces protines cytosoliques mises en vidence agissent comme des rcepteurs solubles intervenant comme intermdiaires. Le petit volume de FCS ajout dans la 4e exprience a apport un peu dATP, responsable de la faible valeur observe : 15. 4. La protase agit en dgradant la partie superficielle des protines intrinsques appartenant la membrane des peroxysomes. Le rsultat montre que de telles protines sont indispensables au bon fonctionnement du systme dimportation. On sait que les rcepteurs membranaires appartiennent cette catgorie de protines. 5. Ces expriences montrent que des segments N ou C-terminaux des protines importer sont indispensables pour que le processus puisse avoir lieu ; ce sont des squences-signal, localises ici en C-ter pour la catalase, et en N-ter pour la thiolase. 6. Ce systme met en uvre trois acteurs classiques importants : une squence-signal de la protine importer, un rcepteur soluble cytosolique qui la reconnat, et un rcepteur membranaire, qui reconnat ce dernier, et permettra limportation ; voir aussi ce sujet les fiches 25 et 26.
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FICHE
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La biogense des mitochondries et des plastes
I Une information gntique rduite

Linformation gntique de ces organites, que lon qualifie de semi-autonomes, est trs restreinte par rapport au nombre total de polypeptides qui les constituent. Lessentiel de ces protines, savoir plus de 95 % en nombre et en masse, est en fait cod par des gnes nuclaires, synthtis sur les ribosomes cytosoliques et enfin import dans les organites par des mcanismes spcifiques dadressage. La synthse endogne des protines : le matriel gntique des mitochondries des cellules animales est form dune petite molcule dADN circulaire de 16 103 paires de bases, codant pour un trs faible nombre de polypeptides (voir lexercice suivant). Ces derniers participent la formation des complexes protiques de la membrane interne : transporteurs dlectrons et ATP synthtase (cf. fiche 21). Le gnome circulaire des chloroplastes des cellules vgtales est bien plus long : en moyenne 160 103 paires de bases, et il contient environ 100 gnes codant pour des ARNr, des ARNt, ainsi quune soixantaine de polypeptides intervenant dans la transcription, la traduction et la photosynthse. Lexemple le plus classique est celui de lenzyme nomme RUBISCO (552 kDa ; cf. fiche 23). On a montr en effet que cette molcule est constitue de deux polypeptides de masse molculaire 55 et 14 kDa, prsents en quantits quimolculaires (8 copies de chacun deux), dont lun est cod par le gnome nuclaire, et lautre par le gnome chloroplastique. Les deux sassemblent dans lorganite ; voir lexercice suivant. Limportation des protines fabriques dans le cytosol : elle ncessite tout dabord la prsence de squences-signal, simples ou composites, toujours situes lextrmit N des protines. Celles-ci sont fabriques sur les ribosomes libres du cytosol, puis adresses de faon post-traductionnelle vers les mitochondries ou les chloroplastes, de faon trs spcifique. La machinerie dimportation vers ces organites est complexe : elle comprend des rcepteurs membranaires reconnaissant les protines importer, des tunnels qui per124
mettent le franchissement des deux membranes, et une source dnergie : lATP. Il existe diffrents mcanismes, selon le compartiment destinataire dans lorganite.
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II Ltude des processus dadressage

La question de ladressage des protines vers leur compartiment destinataire a t pose ds le dbut des annes 1960, lorsque la voie de scrtion a commenc tre analyse. Diverses techniques ont t dveloppes pour dcrire cette voie et tudier les mcanismes molculaires sous-jacents. Les expriences anciennes de pulse-chasse ont ainsi permis de localiser, grce aux techniques cytologiques associes lautoradiographie, leur lieu de synthse et leur trajet intracellulaire (cf. fiche 18). Les apports de la Biochimie : les mcanismes molculaires de ladressage vers le RE ont t dcouverts peu aprs (1975), mais avec des outils trs diffrents. Laddition de microsomes rugueux des systmes de traduction in vitro classiques (cf. fiches 16 et 17) a conduit dmontrer lintervention dune squence-signal N-terminale hydrophobe, clive ds lentre de la protine dans la cavit du RE, ainsi que le phnomne dinsertion cotraductionnelle. Pour mettre en vidence la pntration du polypeptide, il a t ncessaire dutiliser des protases et des dtergents ; ces mthodes ont aussi t employes pour tudier ladressage vers les divers compartiments des mitochondries et les plastes. Linjection de protines : cette approche a t dveloppe au dbut des annes 1980 pour tudier ladressage protique vers le noyau. Une protine spcifiquement nuclaire : la nucloplasmine, a t purifie et rendue radioactive ; son injection dans le cytoplasme de cellules gantes (ufs damphibien) a ensuite t effectue au moyen de micro-aiguilles (cf. fiche 26). Lautoradiographie a enfin permis de visualiser lentre de la protine dans cet organite et danalyser les paramtres conditionnant ce phnomne. Une conclusion importante a t que le transport vers le noyau ncessitait de lnergie (transport actif) et la prsence dune squence-signal nuclaire approprie. Les apports de la gntique et de limmunofluorescence : ces outils performants ont t mis en uvre dans la suite des tudes sur ladressage nuclaire. Des mutants de virus, dont une partie du cycle de reproduction implique des protines spcifiques transitant par le noyau (pour la rplication de lADN ; cf. fiche 30), ont t utiliss ; les mouvements de ces protines ont ainsi pu tre suivis au cours du cycle grce des anticorps spcifiques. Lidentification des mutations et la localisation au niveau protique des altrations associes ont ensuite conduit la construction de plasmides recombins portant des squences-signal putatives associes des protines-reporter (cf. fiche 18). Ces exp-
FICHE 25 La biogense des mitochondries et des plastes
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riences ont permis, en 1984, de dfinir gntiquement la premire squence-signal prcise pour ladressage dune protine vers le noyau.
Biogense des mitochondries

LADN mitochondrial des cellules animales est une molcule circulaire ferme dont la longueur est de 5,5 m environ. Cet ADN code pour un certain nombre dARN qui, limage de ce qui se passe pour les ARN nuclaires, se rpartissent en trois catgories : ARNr, ARNt et ARNm. Le squenage de cet ADN a montr quil contient deux gnes dARNr (950 et 1600 nuclotides de long) et 22 ARNt (65 nuclotides environ chacun) ; chacun de ces gnes nexiste quen une seule copie. 1. Sachant que 10 paires de nuclotides (nt) reprsentent une longueur de 3,4 nm, calculer le nombre maximum de polypeptides susceptibles dtre cods par cet ADN (nombre dacides amins dune chane polypeptidique moyenne : 300). Grce des expriences dinhibition spcifique de lactivit des ribosomes du cytosol (voir lexercice suivant), on montre par lectrophorse que seulement 13 polypeptides sont synthtiss dans les mitochondries, sur leurs propres ribosomes. 2. Que peut-on conclure au sujet de lorganisation des gnes mitochondriaux ? Llectrophorse bidimensionnelle de lensemble des protines mitochondriales fait apparatre prs de 400 chanes polypeptidiques diffrentes. 3. Commentez cette observation, en tenant compte des rsultats prcdents.
Solution
1. La longueur de lADN est de 5 500 nm ; si une paire de nt reprsente 0,34 nm, cet ADN possde donc 16 176 paires de nt (5 500/0,34). Le nombre de paires de nt utiliss par les ARN connus dans lADN = 950 + 1 600 + (22 65) = 3 980. Le reste des nt susceptibles de coder pour des protines = 16 176 3 980 = 12 196. Un acide amin tant cod par 3 nt (un codon), le nombre total maximum de codons est de 4 065 (12 196/3). Si tout lADN est codant, et avec 300 codons pour une chane polypeptidique, cela reprsente donc en thorie 13,5 chanes au maximum. 2. Lexprience montre que 13 chanes sont codes, ce qui prouve bien que toutes les squences codantes sont strictement jointives et non interrompues par des squences non codantes. On en conclut que le gnome mitochondrial, comme celui des bactries et des virus, est extrmement compact. Cette situation est donc trs diffrente de ce quon connat pour les gnes nuclaires de protines, qui contiennent des introns et des squences non traduites en amont et en aval du cadre de lecture de la traduction. Ces gnes sont en outre spars par de trs longues squences dpourvues de sens.
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3. Si seulement 13 protines sont fabriques partir du gnome des mitochondries, cela signifie que lnorme majorit des protines de ces organites est code par des gnes nuclaires, fabrique dans le cytosol et enfin importe dans ces organites.
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Synthse de la RUBISCO
Les expriences suivantes sont destines montrer la complexit de la biosynthse et de lassemblage de la RUBISCO au sein des chloroplastes. Elles ont t conduites chez un Protiste photosynthtique, lEuglne : 1) 3 cultures dEuglnes sont conduites en prsence dun acide amin radioactif : la leucine 3H, dans 3 conditions diffrentes : a) lacide amin radiomarqu seul ; b) prsence, en plus de cet acide amin dans le milieu, dun antibiotique qui inhibe spcifiquement le fonctionnement des ribosomes chez les bactries ; c) prsence, en plus de cet acide amin dans le milieu, dun antibiotique bloquant spcifiquement la synthse protique ralise sur les ribosomes cytosoliques des Eucaryotes. 2) aprs 30 min dincubation, les protines sont extraites de faon quantitative des cellules, mises en prsence dun anticorps anti-RUBISCO, et la radioactivit du complexe immun purifi (obtenu par immuno-prcipitation) est alors mesure. On obtient respectivement les valeurs suivantes, exprimes en % : 100, 3 et 4. 1. Quelle conclusion tirez-vous de cette observation et quelles hypothses pouvezvous formuler concernant la synthse de la RUBISCO ? Un lot dEuglnes est homognis dans des conditions telles que les chloroplastes que lon purifie aprs centrifugation (cf. fiche 15) sont parfaitement intacts, daprs lobservation en microscopie lectronique. Ces derniers sont ensuite incubs pendant 30 min en prsence de leucine 3H. Aprs cela, on ralise llectrophorse de leurs protines en prsence de SDS (canal 1), puis une autoradiographie partir du gel obtenu (canal 2) ; les rsultats sont donns dans la figure suivante :
FICHE 25 La biogense des mitochondries et des plastes
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2. Pourquoi certains polypeptides sont-ils visualiss par cette autoradiographie, et dautres pas ? Cette exprience permet-elle de prciser lhypothse formule en 1 ? Les ARNm cytosoliques sont extraits partir dun nouveau lot dEuglnes et utiliss dans une exprience de traduction in vitro (cf. fiche 16). Les produits de traduction sont ensuite analyss par lectrophorse en SDS et par autoradiographie (canal 3). Grce lanticorps anti-RUBISCO, un immuno-prcipit est obtenu partir de ces produits de traduction, et analys dans les mmes conditions que prcdemment, savoir lectrophorse en SDS puis autoradiographie (canal 4). 3. Dans quel territoire cellulaire les protines du canal 3 sont-elles synthtises ? 4. Quelle hypothse formulez-vous au sujet du polypeptide dtect dans le canal 4 ? Les produits de traduction in vitro radioactifs sont enfin mis en prsence de chloroplastes purifis et intacts pendant 15 min, puis les protines de ces derniers sont analyses par autoradiographie aprs lectrophorse en SDS (canal 5). 5. Quelle est la nature du polypeptide le plus abondant observ dans le canal 5 et pourquoi sa taille nest-elle pas exactement celle observe dans le canal 4 ?
Solution
1. En prsence des deux antibiotiques, il ny a pratiquement pas de RUBISCO marque ; ceci suggre que lactivit simultane de deux types de ribosomes dans la cellule est ncessaire pour sa synthse. Il a t montr que les ribosomes des chloroplastes sont sensibles lantibiotique antibactrien (ici le chloramphnicol). 2. Le canal 1 montre lensemble des protines contenues dans les plastes ; on y note la prsence de deux polypeptides abondants de 55 et 14 kDa, qui sont sans doute ceux constituant la RUBISCO. Le canal 2 montre seulement les polypeptides qui sont devenus radioactifs au cours de lincubation des chloroplastres, cest--dire ceux qui ont t synthtiss au sein mme des organites ; seul celui de 55 kDa est radioactif. On dduit de ceci quil existe une synthse endogne de protines chloroplastiques, produisant en particulier une chane trs abondante, dont la taille est de 55 kDa. 3. Elles sont fabriques grce aux ribosomes prsents dans le cytosol des cellules, partir des ARNm cytosoliques. 4. Ce petit polypeptide de 18 kDa que lanticorps reconnat, est ncessairement apparent la molcule de 14 kDa qui fait partie de la RUBISCO. 5. Des polypeptides sont entrs dans les plastes ; en particulier, on y trouve la chane de 14 kDa, qui est la petite sous-unit de la RUBISCO. La diffrence de taille avec la chane de 18 kDa observe plus haut tient la disparition de la squence-signal dadressage (4 kDa), qui est coupe aprs lentre de la protine dans lorganite. On rappelle que ce phnomne a aussi lieu lors de ladressage vers le mitochondries et le RER (cf. fiche 16).
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FICHE
Ladressage des protines vers le noyau
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I Les changes nuclo-cytoplasmiques

Le noyau, qui est le plus gros de tous les organites, est le lieu dune intense activit mtabolique concernant les acides nucliques : il sagit de la rplication de lADN pendant la phase S, et de la transcription, pendant la dure de linterphase ; on rappelle que la rparation de lADN a galement lieu pendant toute cette priode (cf. fiches 10 et 11). Ces activits impliquent des changes constants de mtabolites et de protines, dans les deux sens, travers lenveloppe nuclaire. La problmatique de ladressage des protines nuclaires : un grand nombre de protines fabriques dans le cytosol doivent tre importes dans le noyau, en permanence ou de faon localise dans le temps : protines de structure (histones), enzymes (ADN et ARN polymrases), protines rgulatrices (facteurs de transcription), tandis que dautres doivent tre exportes, le plus souvent en association avec des ARN (sousunits ribosomiques, particules RNP diverses). Ces molcules franchissent lenveloppe nuclaire, dont la particularit est de disparatre lors de la division cellulaire, conduisant au mlange transitoire du cytosol et du nucloplasme. Aprs chaque division, la cellule doit donc rimporter trs rapidement et de faon spcifique toutes ces protines qui ont quitt le noyau. Les complexes des pores nuclaires : ces structures de grande taille (120 nm de diamtre) sont ancres dans la lamina nuclaire et sont formes de prs de 100 protines distinctes. Elles ont une symtrie dordre 8 et leur organisation complexe est trs diffrente selon quon examine la face cytosolique ou la face interne du noyau. Il en existe plusieurs milliers dans un noyau de cellule banale. On a montr quils laissent rentrer passivement (par diffusion) des molcules de masse infrieure 60 kDa, ce qui correspond un diamtre efficace voisin de 9-10 nm. Les squences-signal nuclaires : toutes les protines importes dans le noyau sont munies dune courte squence-signal, localise en une rgion quelconque de la mol-
FICHE 26 Ladressage des protines vers le noyau
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cule, mais qui doit affleurer sa surface pour tre reconnue. Elle comporte en gnral plusieurs acides amins basiques encadrant une ou deux prolines. Simple ou composite, elle ne fait pas lobjet dun clivage aprs importation, comme cest le cas pour toutes les autres squences-signal (cf. fiches 16 et 24). La machinerie dadressage : il existe deux types de rcepteurs impliqus dans le processus dadressage : des rcepteurs solubles cytosoliques (appels importines), qui reconnaissent la molcule importer via sa squence-signal, et des rcepteurs fixes localiss sur les complexes des pores. Comme pour tout transport, une source dnergie est indispensable, sous la forme de molcules dATP et de GTP.
II La transformation gntique des cellules et des organismes

La transformation gntique (ou transgnse) des cellules en culture, bactriennes, animales ou vgtales est un outil trs rpandu en recherche fondamentale, pour comprendre le fonctionnement des gnes et analyser les processus cellulaires. Les principales tapes du clonage de lADN : la premire tape consiste dcouper de faon reproductible lADN extrait dun organisme en fragments de taille plus ou moins grande, au moyen denzymes appropries (les enzymes de restriction). Aprs purification, et grce la technologie de recombinaison de lADN, ces fragments sont intgrs dans des plasmides, molcules capables dautorplication dans des celluleshtes bactriennes ou eucaryotiques, et servant de vecteurs. Ces plasmides recombins permettent la multiplication (ou amplification) des fragments dADN, et on obtient ainsi une collection de clones bactriens nomme banque gnomique dADN. Si lon part dune collection dADN complmentaires dARNm produits par un type cellulaire donn, on obtient une banque dADNc. Les diffrents types de vecteurs : on en distingue deux grandes catgories, selon quils sont destins seulement la multiplication des fragments dADN intgrs, ou bien selon quils doivent permettre lexpression de gnes contenus dans lADN clon. Chez ces derniers, il est ncessaire quexistent des signaux appropris intervenant dans la transcription (promoteur et terminateur). Dans tous les cas, les vecteurs doivent contenir une origine de rplication adapte au type de cellule-hte qui les reoit. Ils doivent possder en outre un ou deux gnes permettant la slection des clones bactriens ou eucaryotiques qui les hbergent ; en gnral, il sagit de gnes de rsistance des antibiotiques. La transfection des cellules : il existe de nombreuses techniques physiques ou chimiques pour faire pntrer un vecteur dADN dans une cellule-hte en culture : la lipo-
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fection, la mthode au phosphate de Ca2+, llectroporation ou la biolistique. Dans le cas de la ralisation dorganismes animaux gntiquement modifis (voir plus loin), cest en gnral la micro-injection dans le noyau de luf qui est pratique. Les applications pratiques : cette mthode permet de suppler un gne dficient, en le remplaant ou en le modifiant pour restaurer son activit au niveau de certaines parties dun organisme (thrapie gnique). Elle permet galement dobtenir des organismes entiers dont le matriel gntique a t modifi, ce qui est un objectif trs diffrent ; il sagit de la fabrication des OGM.
La nucloplasmine
La nucloplasmine est une grosse protine spcifiquement nuclaire, trs abondante dans le noyau des ovocytes damphibiens. Cette protine possde un rle important dans lassemblage de la chromatine, en se liant aux histones ; elle est stocke en grande quantit dans cet organite car les premires divisions trs rapides de lembryon se font sans synthses protiques. La masse molculaire de la nucloplasmine est de 175 kDa ; il sagit dun pentamre (5 sous-units identiques de 35 kDa) facilement dissociable de faon rversible in vitro, en changeant simplement les conditions physicochimiques du milieu. Les schmas suivants montrent lorganisation du pentamre (1) et dun monomre (2), qui possde une extrmit N-terminale globulaire de 12 nm de diamtre, et une longue queue C-terminale ; une protolyse mnage par la trypsine spare ces deux domaines en un point situ sur le schma par la pointe de la flche.
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Adressage de la nucloplasmine
Les ovocytes de Xnope sont des cellules gantes de 1,2 mm de diamtre, dont le noyau lui-mme est de grande taille (200-300 m de diamtre) ; ceci permet de raliser aisment des micro-injections bien cibles dans cet organite ou dans le cytoplasme. Ils constituent donc un outil de choix pour des tudes sur ladressage des protines vers le noyau. Lexemple de la nucloplasmine est tudi dans cet exercice.
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Il est facile de purifier cette protine partir des ovocytes, puis de la marquer radioactivement. Il est galement possible de la dissocier en ses monomres et, aprs sparation et purification de ces derniers sur gradient (cf. fiche 15), de les marquer de la mme manire. Enfin, les deux domaines N-terminal et C-terminal obtenus partir des monomres par voie enzymatique peuvent aussi tre purifis et radiomarqus. Afin danalyser les mcanismes prcis de ladressage de cette protine vers le noyau, les expriences suivantes ont t ralises : 1) pentamre entier radiomarqu et inject dans le cytoplasme, puis aprs 30 min, traitement histologique et autoradiographie des coupes dovocytes, 2) monomre entier radiomarqu, inject dans le cytoplasme, puis protocole identique au prcdent, 3) ttes seules radiomarques injectes (idem), 4) queues seules radiomarques injectes (idem), 5) queues non radiomarques, mais sur lesquelles des billes dor collodal de 20 nm de diamtre ont t greffes, puis observation en microscopie lectronique. 6) cinq ttes et une seule queue radiomarques (protocole idem 1). Les rsultats de ces expriences sont prsents dans les schmas suivants, o le noyau des ovocytes est reprsent par un rond lgrement excentr. La prsence de la nucloplasmine marque observe aprs les 30 min est indique par un pointill.
1. Quelles conclusions tirez-vous des rsultats des expriences 1 et 2 ? 2. Quelles hypothses formulez-vous aprs analyse des expriences 3 et 4 ? 3. Quelle rserve concernant ladressage peut-on cependant formuler aprs analyse du rsultat de lexprience 4 ? 4. Dans quel but lexprience 5 a-t-elle t construite ? 5. Quelle information dfinitive vous apporte le rsultat de lexprience 6, en ce qui concerne le mcanisme de ladressage de la nucloplasmine vers le noyau ?
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Solution
1. Ces deux expriences montrent que la nucloplasmine, aprs injection dans le cytoplasme, se retrouve rapidement dans le noyau et quil nen reste plus du tout dans le cytoplasme. Elles mettent bien en vidence le phnomne dadressage : dans lexprience 1, la taille de la molcule entire permet dj dexclure quil sagit dun simple processus de diffusion, puisque le diamtre efficace pour ce phnomne est au maximum de 9-10 nm, ce qui est trs infrieur celui attendu pour le pentamre. De plus, le fait quil nexiste pas un quilibre de concentration entre le noyau et le cytoplasme montre bien que ladressage est un processus actif. lexprience 2 montre que chaque sous-unit du pentamre possde les mmes proprits que la molcule entire. La taille de la tte (12 nm) tant suprieure au diamtre permettant la diffusion, il faut sans doute exclure une entre passive dans le noyau. Le mcanisme molculaire dadressage doit rsider au niveau du monomre. 2. Ces expriences montrent que les deux parties de la molcule nont pas les mmes proprits vis--vis de ladressage : lexprience 3 montre que les 5 ttes seules du pentamre restent dans le cytoplasme et nont donc plus la capacit tre diriges vers le noyau ; elles ne peuvent pas rentrer dans cet organite par diffusion, en raison de la taille de lassemblage. Elles ne possdent donc pas de squence-signal dadressage. daprs lexprience 4, les queues seules sont adresses vers le noyau, et y sont concentres, comme dans les expriences 1 et 2. On peut donc formuler lhypothse quelles possdent une squence-signal dadressage. 3. La rserve que lon peut formuler concernant le transport des queues vers le noyau est que, leur masse tant trs faible (< 35 kDa) et leur forme allonge, on ne peut pas exclure un simple transport par diffusion travers les pores nuclaires. Un mcanisme de diffusion/rtention dans le noyau peut amener un mme rsultat. 4. Le fait de greffer des billes dor dun diamtre de 20 nm sur les queues permet de vrifier si la taille est un facteur dterminant : comme les queues ainsi traites continuent de rentrer, cest bien quil y a un transport actif en jeu. 5. Cette exprience montre quune seule queue est capable dassurer lenvoi de la molcule presque complte dans le noyau ; cest son niveau quon devra chercher la squence dadressage. On a montr quil sagit ici dune squence en 2 fragments.
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FICHE
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Les matrices extracellulaires
I Un composant universel des organismes multicellulaires

Dans la plupart des tissus animaux ou vgtaux, les cellules ne sont pas troitement accoles les unes aux autres, mais sont en contact avec un constituant extracellulaire parfois trs abondant, form de macromolcules scrtes. La composition et lorganisation complexes de cette structure universelle nomme matrice extracellulaire (MEC), ont longtemps t mconnues. Ses fonctions sont multiples et dpassent largement, en particulier chez les animaux, le seul rle de soutien qui est lui est gnralement attribu. Nature et composition chimique des MEC animales : elles sont trs dveloppes dans les tissus conjonctifs, o elles reprsentent un volume souvent plus important que celui des cellules elles-mmes. Le derme, les os, le cartilage, les tendons, sont des exemples de tissus la MEC est trs dveloppe. On y trouve des protines fibreuses, telles que le collagne et llastine, ainsi que des glycoprotines, des protoglycanes (protines trs riches en glucides), ainsi quun polysaccharide acide : lacide hyaluronique. Ces constituants sont scrts par des cellules spcialises : les fibroblastes et leurs drivs (ostocytes, chondrocytes). Tous les pithliums reposent sur des lames basales, qui sont les MEC spcifiques de ces tissus de recouvrement. Elles contiennent un collagne particulier (collagne de type IV), ainsi que des protines nommes laminine et fibronectine. Ces dernires entrent en contact avec la membrane plasmique des cellules pithliales et permettent ainsi leur adhrence aux tissus conjonctifs sous-jacents. Nature et composition chimique des MEC vgtales : les parois des cellules vgtales reprsentent une MEC quivalente celles rencontres chez les animaux. Par leur disposition extracellulaire, leur constitution chimique, leur paisseur parfois considrable et leurs fonctions, elles en possdent toutes les caractristiques. On y trouve une molcule fibreuse, la cellulose, et des molcules de remplissage : les hmicelluloses et les pectines ; tous ces constituants sont des polysaccharides (elles contiennent aussi des glycoprotines, mais en faible quantit). Dans les tissus de soutien tels que le collenchyme et le sclrenchyme, les parois sont trs paisses.
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Larchitecture des MEC : elles possdent toutes plusieurs points communs en ce qui concerne leur organisation : on y trouve toujours des molcules fibreuses et des molcules de remplissage, formant un ciment entre les fibres. Les premires assurent une bonne rsistance la traction, tandis que les secondes permettent une grande rsistance la compression. Ces caractristiques mcaniques font que les MEC constituent, limage du bton arm, un excellent matriau de soutien. De plus, chez les animaux comme chez les vgtaux, on observe souvent une disposition entrecroise des molcules fibreuses (collagne ou cellulose) rappelant lorganisation du contre-plaqu. Les fonctions des MEC : outre une fonction universelle vidente de soutien, les MEC des organismes animaux ont un rle dans la prolifration et la diffrenciation des cellules qui leur sont associes, un dialogue constant stablissant entre la cellule et son environnement immdiat. Chez les embryons, elles jouent aussi un rle crucial dans les migrations cellulaires.
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II Le triage des cellules ; la cytomtrie en flux

Plusieurs mthodes sont utilises pour sparer des types cellulaires diffrents coexistant au sein des cultures, quil sagisse de cellules un stade diffrent de leur cycle, pour des cultures homognes (lignes cellulaires, cf. fiche 14), ou de cellules de nature diffrente, comme on peut en obtenir lors des cultures primaires. La technique de centrifugation : elle consiste sparer les cellules comme on le fait pour les organites partir dun homognat (cf. fiche 15) ; les grosses cellules peuvent ainsi tre spares des petites, et celles plus denses de celles qui sont plus lgres. Cependant, on voit bien quelles sont les limites de cette mthode, quand on a affaire des caractristiques variant de manire continue, donc peu discriminantes. Lutilisation danticorps : elle permet de reconnatre des protines spcifiques de la surface cellulaire et constitue un outil trs puissant pour slectionner un type cellulaire donn dans une bote de culture. Si le fond de la bote est tapiss dune matrice sur laquelle des anticorps ont t fixs, seules les cellules possdant lantigne de surface correspondant seront retenues. Il sera alors possible dliminer par dcantation les cellules contaminantes et de rcuprer uniquement (par agitation, par exemple) les cellules intressantes. De manire analogue, on peut fixer des anticorps spcifiques sur des microbilles magntiques et rcuprer uniquement les cellules porteuses de lantigne dintrt correspondant, qui se sont fixes dessus. Cette suspension de billes est ensuite soumise un champ magntique puissant qui les retient, ce qui permet dliminer toutes les autres cellules non fixes.
FICHE 27 Les matrices extracellulaires
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La cytomtrie en flux : la mthode de sparation la plus sophistique utilise un gros appareil complexe appel FACS (fluorescence activated cell sorter), ou trieur de cellules . Son principe est le suivant : les cellules sparer partir dun mlange sont spcifiquement reconnues par un anticorps fluorescent dirig contre un antigne de leur surface ; la suspension cellulaire est fractionne sous pression sous la forme dune file de microgouttelettes de milieu contenant (ou pas) une seule cellule ; ces dernires dfilent ensuite devant un faisceau laser qui excite le fluorochrome, ce qui permet de dtecter celles contenant les seules cellules marques ; le reprage de ces cellules est coupl ladjonction la gouttelette de charges lectriques de signe diffrent selon quelle contient ou pas une cellule intressante ; la file de gouttelettes passe entre deux plaques lectriques charges de manire oppose, de sorte quelles sont fortement dvies dans un sens ou dans lautre, dans ce champ lectrique, selon la charge qui leur a t ajoute. La dviation en question permet ainsi de rcuprer des cellules diffrentes dans des rcipients distincts.
Synthse des molcules des MEC

Les constituants spcifiques des MEC animales ou vgtales sont synthtiss selon des modalits diverses. Rpondre par Vrai ou Faux aux propositions suivantes. 1. Il existe chez les Mammifres une vingtaine de gnes qui codent des collagnes diffrents sorganisant pour donner un grand nombre de combinaisons distinctes. 2. La forme scrte du collagne est un polypeptide simple qui sorganise en hlice triple aprs quil ait t mis dans le milieu extracellulaire. 3. Les protoglycanes membranaires et des protoglycanes extracellulaires sont tous deux synthtiss dans le RER et glycosyls dans lappareil de Golgi. 4. Tous les glycosaminoglycanes sont des molcules polysaccharidiques acides que lon retrouve ltat libre dans le milieu extracellulaire. 5. Les intgrines sont des protines scrtes que lon retrouve dans les espaces extracellulaires, tout comme la laminine et la fibronectine. 6. De mme que pour la synthse de lacide hyaluronique, la polymrisation de la cellulose chez les cellules vgtales se ralise directement la surface membranaire. 7. Les pectines et les hmicelluloses sont mises via des vsicules golgiennes. 8. La lignine est un polysaccharide rencontr dans les parois vgtales secondaires.
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Solution
1. Vrai : il existe environ 10 combinaisons de ces molcules, dont 4 sont abondantes dans les tissus animaux (le collagne de type I reprsentant lui seul 90 % du total). 2. Faux : la triple hlice est la forme scrte, sous la forme de procollagne ; aprs un dcoupage terminal, les molcules de collagne sorganisent en longues fibres. 3. Vrai : toutes ces molcules suivent la voie de scrtion classique. 4. Faux : seul lacide hyaluronique est libre ; tous les autres sont lis des protines, sous la forme de protoglycanes, qui sont des molcules hautement hydrophiles. 5. Faux : il sagit de protines membranaires qui se lient aux deux autres protines. 6. Vrai : ce mode de synthse trs original est un point commun aux deux rgnes. 7. Vrai : ces composs sont fabriqus dans le Golgi et sont mis par exocytose. 8. Faux : il sagit en fait dun polymre complexe et hydrophobe form dunits phnoliques ; sa prsence impermabilise les parois et conduit la mort des cellules.
Organisation dun tissu conjonctif lche

Le schma suivant illustre la structure gnrale dun tissu conjonctif lche semblable celui trouv dans le derme. Complter les lgendes en prcisant bien la nature des molcules et des cellules rencontres dans ce tissu.
Solution
1. fibres lastiques formes dlastine, une protine hydrophobe rticule, 2. macrophage, cellule immunitaire fonction dfensive par phagocytose, 3. et 4. ciment form de glycosaminoglycanes et de protoglycanes, 5. fibroblaste scrtant toutes les molcules constitutives de la MEC,
FICHE 27 Les matrices extracellulaires
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6. pithlium unistratifi, comme on en trouve dans le tractus digestif, par exemple, 7. lame basale, MEC typique dun pithlium, faisant le lien avec le tissu conjonctif, 8. mastocyte, cellule scrtrice dhistamine implique dans les ractions allergiques, 9. fibres de collagne I entrecroises, peu abondantes et disposes de faon lche, 10. capillaire sanguin irriguant le tissu, et voie de sortie des divers leucocytes.
La culture in vitro des chondrocytes
Il est possible, par digestion enzymatique de la matrice du cartilage embryonnaire de poulet, dobtenir une population de chondrocytes que lon peut ensuite mettre en culture in vitro. Deux types de milieux sont utiliss : 1) milieu standard et botes de Petri en plastique, 2) milieu contenant des facteurs de croissance appropris et botes au fond desquelles on a pralablement dpos une couche de collagne. Aprs deux semaines de culture on observe, sur le premier milieu, que les cellules prolifrent activement mais se ddiffrencient progressivement en cellules de type fibroblaste ; sur le second milieu, en prsence dune MEC artificielle, les cellules sont moins nombreuses mais conservent leur diffrenciation et scrtent leur collagne (type II) et leur protoglycane (agrcane) spcifiques. Une des utilisations du trieur de cellules (FACS) est de cribler les cellules dune culture homogne selon le stade du cycle dans lequel elles se trouvent ; dans ce cas, on utilise un colorant fluorescent de lADN, dont la quantit est alors mesure dans chaque cellule. Il est ainsi possible de rcuprer et quantifier diverses populations de cellules synchrones (en G1, S ou G2/M), ce qui permet dtudier le cycle cellulaire et dvaluer le caractre prolifratif dune culture (cf. fiche 14). Les cellules de ces deux cultures sont rcupres et analyses avec un FACS. Les rsultats sont prsents dans les deux graphes suivants, qui donnent le nombre de cellules (ordonnes) en fonction de la quantit dADN de leur noyau (abscisses) et donc de leur place dans le cycle cellulaire : 1) premier milieu, 2) second milieu.
Ces graphes montrent bien que les deux cultures ne sont pas identiques : la 1re contient beaucoup de cellules en G2/M, qui vont se diviser ou se divisent, alors que la 2e contient essentiellement des cellules en G1, stade caractristique des cellules diffrencies et qui ne sengagent pas dans un processus de division.
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FICHE
La signalisation cellulaire
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I La communication entre les cellules au sein de lorganisme

Au sein des organismes complexes, les cellules communiquent en permanence avec les cellules voisines de faon rguler leur comportement pour rpondre aux besoins et aux exigences de lorganisme entier. Le principe est le suivant : les cellules mettrices scrtent une molcule qui est vhicule dans lorganisme, puis capte par des rcepteurs, le plus souvent membranaires (cf. fiche 5), ports par les cellules cibles. Ces dernires modulent leur activit ou leur devenir : croissance, division, diffrenciation ou mort cellulaire, en fonction du signal peru ou, le plus souvent, dune combinaison de signaux. Les diffrents modes de communication entre cellules diffrentes : on en distingue quatre grands types : 1) endocrine, via des hormones agissant parfois longue distance, 2) paracrine, entre cellules trs proches, via des mdiateurs locaux, 3) synaptique, entre un neurone et sa cellule-cible, via un neurotransmetteur, 4) de cellule cellule, via des interactions directes entre protines membranaires. Les principales molcules informatives : elles sont classes en deux catgories : 1) les molcules hydrophiles : protines, peptides, acides amins ou leurs drivs, nuclotides ; elles ne peuvent franchir la membrane plasmique et ncessitent donc des rcepteurs de surface membranaires pour tre perues ; 2) les molcules hydrophobes : acides gras ou leurs drivs, strodes, rtinodes, et mme des gaz : le NO ou lthylne (chez les vgtaux) ; elles franchissent les membranes et rencontrent des rcepteurs cytosoliques ou nuclaires. Les rcepteurs membranaires : il en existe quatre grandes familles : 1) les rcepteurs coupls aux protines G, 2) les rcepteurs catalytiques activit tyrosine kinase, 3) les rcepteurs non catalytiques activit tyrosine kinase, 4) les rcepteurs-canaux.
FICHE 28 La signalisation cellulaire
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Chaque catgorie est associe des protines intracellulaires spcifiques. On rappelle lexistence des protines G htrotrimriques, localises dans la membrane plasmique, du ct cytosolique ; elles interagissent avec leur rcepteur activ, sont modifies, puis entrent en contact avec diverses protines, membranaires ou pas, qui vont enclencher leur tour une cascade complexe de ractions. On distingue des protines G stimulatrices ou inhibitrices. Les cascades de transduction intracellulaires : sous laction des protines actives prcdentes, une longue voie de signalisation est mise en route. Deux voies majeures existent, qui ne sont pas dtailles ici : celle enclenche par les protines G, qui fait intervenir lAMP cyclique, le calcium, et les phosphoinositides, et celle dite des MAP kinases, qui contrlent par exemple la prolifration cellulaire.
II Lutilisation de la GFP
Depuis une quinzaine dannes (prix Nobel 2008), cette technique a rvolutionn la Biologie Cellulaire. Grce aux mthodes du gnie gntique (cf. fiche 26), il est en effet possible de marquer in vivo toutes les protines synthtises par les cellules, au moyen dune petite protine fluorescente : la green fluorescent protein, ou GFP. Nature de la GFP : cette protine de 238 acides amins a t dcouverte chez la mduse Aequorea victoria ; sa caractristique remarquable est de naturellement fluorescer en vert, 505 nm, sans addition de fluorochrome artificiel, aprs excitation par une lumire UV ou bleue (395 nm et 475 nm). La structure de la GFP est remarquable : il sagit dun tonneau form de 11 feuillets , au centre duquel se situe une courte hlice formant le centre actif fluorescent (chromophore). Utilisation de la GFP : le gne de la GFP a t isol et clon en 1992, puis il a t rapidement utilis pour fabriquer in vitro des constructions gntiques (plasmides) dans lesquelles la partie codante du gne est mise la suite de celle dune protine dintrt, encadres par tous les signaux appropris de transcription et de traduction. Lorsque ce type de plasmide est introduit dans une cellule vivante, il est capable de sy exprimer, cest--dire quil permet la synthse dune protine chimre (ou protine de fusion) contenant la squence de la protine dintrt fusionne celle de la GFP. Cette molcule garde ses proprits biologiques tout en tant fluorescente lorsquon claire la cellule avec une lumire excitant la GFP, qui fonctionne donc comme une protine rapporteur classique. Les applications de la GFP : grce cet artifice, on peut suivre au microscope, en temps rel et dans une cellule vivante, toutes les tapes de synthse et de circulation dune protine donne, cest--dire sa dynamique et celle des compartiments cellulaires dans lesquels elle circule de faon normale. La GFP a t fusionne avec des protines
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impliques dans tous les organites connus : RER, mitochondries, appareil de Golgi, cytosquelette, etc. Cette technique trs puissante a rendu obsoltes les mthodes anciennes de localisation des protines, telles que la cytoenzymologie (cf. fiche 20) ou les expriences de pulse-chasse suivies dautoradiographie (cf. fiche 18). Les nouvelles protines fluorescentes : plusieurs variants de la GFP ont t obtenus par modification de la squence primaire de la protine (grce au gnie gntique), de faon diversifier la longueur donde dmission : la CFP fluoresce en cyan, la YFP en jaune, etc. Leur efficacit et leurs proprits de rsistance (pH extrmes, photoblanchiment), ont galement t amliores. Dautres protines qui fluorescent en rouge ont aussi t extraites de coraux. Ceci permet lobservation simultane de plusieurs protines diffrentes marques dans une mme cellule.
Les rcepteurs activit tyrosine kinase
Ces rcepteurs membranaires activit catalytique sont les plus divers et les plus nombreux parmi les molcules intervenant dans la rception des signaux extra-cellulaires et linduction de cascades de signalisation. Leur caractristique principale est leur capacit dautophosphorylation : lorsquils fixent leur ligand (la molcule informative extracellulaire) spcifique, ils forment des dimres dont les deux monomres sont capables de se phosphoryler mutuellement sur des tyrosines de leurs domaines intracellulaires. Ces dimres activs sont ensuite capables de phosphoryler dautres protines qui enclenchent les cascades.
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La dimrisation des rcepteurs de lEGF

LEGF (facteur de croissance de lpiderme) appartient la famille des rcepteurs activit tyrosine kinase. Il est capable de dimrisation et dautophosphorylation ; les expriences suivantes permettent de dmontrer ces proprits : 1) le gne de la forme normale du rcepteur lEGF a t clon, puis modifi in vitro de faon produire des formes mutantes inactives ; ces divers gnes clons sont ensuite intgrs dans des plasmides dexpression (cf. fiche 26) capables de fonctionner dans des cellules eucaryotiques ; 2) une ligne de cellules en culture normalement dpourvue de ce rcepteur est transfecte avec ces plasmides, soit sparment, soit en combinaison, deux par deux (voir plus loin). Aprs un temps suffisant pour que leur expression ait lieu et que les rcepteurs aient pu rejoindre la membrane plasmique, les cellules sont mises en prsence dEGF et charges simultanment en ATP radioactif ;
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3) cinq minutes plus tard, les cellules sont broyes, les protines sont rcupres et soumises une immunoprcipitation de faon rcuprer uniquement les rcepteurs tudis. Une lectrophorse en gel dnaturant SDS (cf. fiche 9) et une autoradiographie (cf. fiche 17) permettent ensuite de savoir si les protines attendues ont t exprimes et si elles sont radiomarques ou pas. La figure suivante montre les 3 rcepteurs tudis : 1) le rcepteur normal, 2) un rcepteur dont toute la partie C-terminale, portant les Tyr. phosphorylables a t ampute, 3) un rcepteur dont la partie catalytique (kinase) seule a t modifie.
Les 6 expriences de transfection effectues avec les 3 plasmides diffrents sont les suivantes : 1, 2, 3, 1+2, 1+3 et 2+3. Les schmas suivants montrent les rsultats de la coloration du gel obtenu ( gauche) et de son autoradiographie ( droite) ; on rappelle que le SDS spare les sous-units des protines multimriques !
1. Quel type dexprience, bas sur un autre protocole de clonage, proposez-vous pour vrifier cytologiquement que les rcepteurs ont t correctement mis en place dans la membrane plasmique des cellules transfectes ? 2. Quelle information vous apporte le gel de protines ? 3. Quels rsultats attendez-vous pour lautoradiographie, dans lhypothse o chaque rcepteur (monomrique) serait capable de se phosphoryler lui-mme ? 4. Mme question dans lhypothse o seul le dimre form aprs fixation du ligand, serait capable de sautophosphoryler. 5. Quel modle retenez-vous daprs les rsultats exprimentaux obtenus ?
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Solution
1. Il est possible dutiliser les proprits de la GFP, que lon peut alors coupler aux rcepteurs tudis. On pourra visualiser, au microscope fluorescence, le trajet intracellulaire de la protine, depuis le RER, qui est son lieu de synthse, jusqu la membrane plasmique, qui est son lieu de destination finale (voie de scrtion). 2. Ce gel permet de bien vrifier, pour chaque exprience, la prsence du ou des rcepteurs produits dans les cellules, aprs leur transfection par des plasmides. 3. Compte tenu de leur structure, on peut prvoir les rsultats suivants, pour chaque monomre fonctionnant de faon indpendante : le monomre 1, qui possde un domaine catalytique actif et des tyr. accessibles, pourrait thoriquement sautophosphoryler ; les monomres muts 2 et 3, dficients dans le domaine porteur de tyr. ou dans le domaine catalytique, ne peuvent pas en thorie sautophosphoryler. 4. On attend, du point de vue de la phosphorylation, que les dimres 1+1, 2+2 et 3+3 aient le mme comportement que leurs monomres spars. De mme, dans le dimre 1+2, on prvoit que seul le monomre 1 sera phosphoryl, le 2 ne pouvant pas ltre. En revanche, dans le dimre 1+3, les deux monomres pourront tre phosphoryls par le 1. Enfin, dans le dimre 2+3, le monomre 2 ayant un domaine catalytique actif peut phosphoryler le 3, mais lui-mme ne pourra pas ltre. 5. Daprs les rsultats de lautoradiographie pour les deux dernires situations, qui correspondent exactement aux prvisions nonces dans la rponse 4, on conclut que la formation du dimre est une tape pralable indispensable la phosphorylation, qui peut affecter alors les deux partenaires. Le schma prsent dans lencart suivant illustre ce phnomne.
Lautophosphorylation des rcepteurs dimriss
Daprs Alberts et al. (Garland Science editors)
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FICHE
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La diffrenciation cellulaire
I De multiples dfinitions
Les animaux et les vgtaux pluricellulaires sont forms dorganes spcialiss dans la ralisation de fonctions intgres au sein de lindividu ; ces derniers sont constitus densembles cellulaires homognes nomms tissus. Comme toutes les cellules dun mme organisme contiennent la mme information gntique, la diffrenciation cellulaire rsulte de lexpression contrle des gnes ; celle-ci se traduit donc tous les niveaux, depuis les molcules informationnelles synthtises par la cellule jusqu sa forme caractristique, reconnaissable au microscope. La diffrenciation morphologique : ltude anatomique et histologique permet de reconnatre plus de 200 types cellulaires distincts chez un animal suprieur, et prs de 30 chez un vgtal suprieur. La taille de la cellule, sa forme, limportance inhabituelle de telle ou telle structure ou organite, sont des critres didentification rapides : on reconnat immdiatement au microscope (cf. fiches 1, 2, 6 et 8) une hmatie, une cellule de foie, de muscle, de cerveau, de pancras exocrine, etc. La diffrenciation biochimique et physiologique : lhypertrophie dun organite ou dune structure se traduit par une abondance caractristique de molcules spcifiques. Llectrophorse et la chromatographie (cf. fiches 9 et 22), sont les techniques privilgies pour lanalyse de ce type de diffrenciation. Lhmoglobine des hmaties, le glycogne des myocytes ou des hpatocytes, les triglycrides des adipocytes, la chlorophylle des cellules vgtales sont des exemples classiques de ces molcules. Les voies de biosynthse de tous ces composs sont videmment spcifiques, et donc les enzymes qui y interviennent ; la RUBISCO, prsente dans les cellules photosynthtiques o elle fixe le CO2 (cf. fiche 23), est un bon exemple dune enzyme particulirement abondante. Le contrle de lexpression des gnes : le premier niveau de rgulation de lexpression du gnome est celui de la production dARNm spcifiques, ou en quantit trs abondante, dans certains types cellulaires. La quantification de ces ARNm ncessite en gnral lemploi de sondes nucliques (cf. fiche 12), utilises dans des approches de
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Biologie Cellulaire (in situ) ou Molculaire (aprs lectrophorse). Ceci ne doit pas faire oublier les nombreux autres mcanismes de contrle post-transcriptionnel intervenant dans la synthse des protines : inactivation ou stockage des ARNm, modulation de la traduction, etc.
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II Les techniques lectrophysiologiques

Ces techniques permettent dtudier les potentiels lectriques transmembranaires, les concentrations ioniques et les changes dions travers les membranes biologiques. Elles ont t dveloppes, historiquement, pour ltude des cellules animales dites lectriquement excitables : les cellules nerveuses, musculaires et sensorielles. Elles sont appliques actuellement toutes les cellules, puisque des canaux ioniques ont aussi t mis en vidence chez les bactries, les cellules vgtales et les Protistes. Leur principe : elles ncessitent lemploi de microlectrodes ultrafines qui sont implantes dans les cellules, et dont lextrmit mesure une fraction de m. Leur taille doit tre suffisamment petite pour que les cellules ne soient pas lses lors de lintroduction : la membrane plasmique se referme sur llectrode et il ny a pas de court-circuit ce niveau. Leur lumire est remplie dune solution saline (ex : KCl) permettant le passage dun courant lectrique, cest--dire un mouvement dions. Les applications : pour la mesure dun potentiel de membrane ou celle dun flux ionique (potentiel de repos ou potentiel daction des neurones), deux lectrodes sont utilises, lune situe lextrieur de la cellule et lautre situe lintrieur ; les deux sont relies un amplificateur et un voltmtre appropris ; pour la mesure des concentrations intracellulaires dions particuliers, on utilise des lectrodes fonctionnant sur le principe de celles du pH mtre ; elles sont charges avec un ion particulier, et ne sont permables qu cet ion. Plonges dans une cellule, en mme temps quune autre lectrode de rfrence, elles permettent la mesure de la concentration intracellulaire de lion considr, travers la mesure dune diffrence de potentiel impose et telle quaucun courant ne passe. Le patch clamp : depuis les annes 1980, cette technique permet ltude de canaux ioniques individuels : une microlectrode est troitement applique la surface de la membrane plasmique et est relie un amplificateur de courant capable de dtecter des courants de quelques pico-ampres (avec un voltage impos = clamp ). Le courant peut alors tre mesur dans diffrentes configurations du morceau de membrane analys (le patch ), qui contient un nombre limit de canaux : membrane en place dans la cellule, ou membrane dcroche de la cellule, dans une orientation nor-
FICHE 29 La diffrenciation cellulaire
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male ou retourne. Il est ainsi possible danalyser le fonctionnement de canaux uniques et de dcrire leur ouverture, leur fermeture, leur conductance, et galement dtudier sur eux les effets de certaines concentrations ioniques, de diffrentes drogues situes lextrieur ou lintrieur des cellules, etc.
La fibre musculaire squelettique strie

Ce clich reprsente une coupe longitudinale dun fragment de muscle squelettique observe en microscopie lectronique transmission (cf. fiche 1). Complter les lgendes et identifier les diffrents lments de structure.
Solution
1. Bande sombre en microscopie lectronique, dite A, ou anisotrope en lumire polarise au microscope photonique, 2. Bande claire, dite I, ou isotrope en lumire polarise au microscope photonique, 3. Sarcomre : unit dorganisation de la myofibrille et de contraction de la fibre musculaire, limite par les 2 disques Z, 4. Disque (strie) Z : zone dancrage des microfilaments dactine, riche en -actinine, 5. Zone mdiane claire du sarcomre (dite H), avec une ligne sombre centrale nomme M, lieu daccrochage des faisceaux de myosine entre eux, 6. Microfilaments dactine disposs symtriquement dans le sarcomre,
146
7. Filaments pais de myosine occupant la bande A, forms de deux faisceaux symtriques opposs et cheval sur les microfilaments dactine, 8. Mitochondries de grande taille situes entre les myofibrilles, 9. Granules noirs de glycogne, rserve nergtique du muscle, 10. Trave longitudinale de rticulum sarcoplasmique (lisse), rserve dions Ca2+.
29
Diffrenciation des fibres musculaires stries
Les muscles squelettiques stris des Vertbrs sont en rgle gnrale constitus dune combinaison de 3 types de cellules (fibres musculaires, ou myocytes) diffrentes ; leur proportion varie selon la nature du muscle et surtout la faon dont il est sollicit par une activit physique. Dans cet exercice, deux types de fibres musculaires bien diffrencies sont compars au plan structural et fonctionnel : les fibres rouges ou fibres I, et les fibres blanches ou fibres II. Les muscles riches en lune ou lautre catgorie se distinguent par leur couleur (on parle de viandes rouges et de viandes blanches). Les caractristiques molculaires et cytologiques de ces fibres sont les suivantes : Fibres I fin : 40 m nombreuses peu actives peu abondant trs abondants abondante Fibres II pais : 80 m peu nombreuses trs actives trs abondant peu abondants peu abondante
diamtre mitochondries enzymes de la glycolyse glycogne triglycrides myoglobine

1. Avec quelle technique peut-on mettre en vidence spcifiquement le glycogne ? 2. Quel est le rle possible du glycogne et des lipides prsents dans ces cellules ? 3. Quelles sont les diffrences de structure, de fonction et de localisation existant entre la myoglobine et la globine ? 4. Daprs lensemble de ces donnes, quel type de mtabolisme nergtique peut-on prvoir pour ces deux types de fibres musculaires ?
Solution
1. Certaines techniques de coloration, dites cytochimiques, permettent de dtecter des composs chimiques particuliers in situ, sur des coupes histologiques. La coloration de Feulgen rvle ainsi la prsence de lADN dans le noyau ; de mme, la coloration dite APS : acide periodique/schiff, permet de visualiser le glycogne, lamidon ou la cellulose (en fait tous les polysaccharides).
FICHE 29 La diffrenciation cellulaire
147
2. Ces deux composs sont des rserves nergtiques que les cellules stockent dans leur cytoplasme : le glycogne est un polymre de glucose, tandis que les acides gras des lipides servent produire de lactyl-coenzyme A, qui sera dgrad. 3. La myoglobine est une protine hminique rencontre dans le cytoplasme des cellules musculaires ; constitue dune seule sous-unit, elle fixe et stocke lO2. Forme de 4 sous-units, lhmoglobine se trouve dans le cytoplasme des hmaties, o elle fonctionne comme transporteur dO2, grce ses proprits allostriques. 4. Par leurs caractristiques biochimiques et cytologiques : abondance ou pas de myoglobine et denzymes de la glycolyse, nature des rserves nergtiques (glucose utilis dans la glycolyse, acides gras utiliss dans les mitochondries), prsence ou pas de mitochondries, on dduit que le mtabolisme des fibres I est de type arobie (respiration), tandis que celui des fibres II est de type anarobie (fermentation).
Diffrenciation fonctionnelle des fibres musculaires stries
Plusieurs espces de myosine peuvent tre purifies partir dun mme muscle de Vertbr. Il existe en effet, au sein du gnome, de multiples copies de gnes codant pour la myosine et donnant des protines lgrement diffrentes qui se distinguent en particulier par leur capacit hydrolyser plus ou moins rapidement lATP : on parle de myosines lentes et de myosines rapides. Deux anticorps (AC) spcifiques obtenus contre des formes de myosine de ce type sont tests en immunofluorescence sur deux coupes successives de muscle ; les clichs suivants montrent, en A : limage obtenue pour lAC anti-myosine lente, en B : lAC anti-myosine rapide.
Ces deux clichs parfaitement complmentaires illustrent bien lexistence des deux types de fibres. Il a t montr que les fibres myosine lente sont les fibres de type rouge (I), mtabolisme oxydatif, et que celles myosine rapide sont les fibres blanches (II), mtabolisme fermentaire. Les premires rpondent une stimulation nerveuse par une contraction lente, elles se fatiguent peu et rsistent bien un effort prolong ; les secondes rpondent par une contraction rapide, mais elles se fatiguent trs vite et sont mieux adaptes des mouvements rapides et intermittents.
148
FICHE
Les virus
I Des entits en marge du vivant
30
Les virus sont des parasites intracellulaires obligatoires : ils ne peuvent tre reproduits quau sein dune cellule vivante, qui met leur disposition tous les prcurseurs mtaboliques, la machinerie enzymatique et lnergie ncessaires. Lorganisation non cellulaire des particules virales (virions), leur absence dactivit mtabolique et leur mode de reproduction les excluent des tres vivants classiques. Lorganisation des particules virales : elles sont toujours de trs petite taille, ne dpassant gnralement pas 200 nm de long. Lorganisation de leur coque protique (capside) est simple et gomtrique : on distingue les virus dits icosadriques et ceux dits hlicodaux ; certains virus de Bactries sont en revanche trs complexes : les bactriophages (dits aussi phages). Il existe des virus nus et des virus dits envelopps, qui prsentent une membrane phospholipidique externe provenant le plus souvent de la membrane plasmique de la cellule hte (virus bourgeonnants) Linformation gntique des virus : elle est enferme dans la capside et est constitue dun ARN ou dun ADN. La forme de ce matriel gntique est trs variable, pouvant tre simple brin ou double brin, circulaire ou linaire, selon les virus. De plus, dans le cas des virus ARN simple brin, il faut considrer le cas o ce brin est porteur de sens (messager) ou pas : on parle dARN positif ou ngatif.
Les cycles viraux : ils sont de types trs diffrents, selon la nature de linformation gntique virale, et selon les consquences sur la cellule-hte, qui peut tre dtruite ou pas. Dans tous les cas, cette dernire doit produire des ARNm qui permettront la synthse des protines virales ; ceci implique souvent que le virion emporte ses propres enzymes, car la cellule infecte ne peut pas dcoder son matriel gntique.
II Les virus utiliss comme modles

Les Virus constituent depuis fort longtemps des outils privilgis pour ltude exprimentale de nombreux phnomnes molculaires et cellulaires, tels que les processus dautoassemblage molculaire, les mcanismes gntiques fondamentaux (rplication et expression du gnome), la biogense des membranes et le transport intracellulaire des protines.
FICHE 30 Les virus
149
Lidentification de la nature du matriel gntique : cest grce des virus que Hershey et Chase (1952), puis Fraenkel-Conrat (1956) ont dmontr que le matriel gntique tait constitu dacides nucliques (respectivement lADN pour le phage T4 et lARN pour le Virus de la mosaque du Tabac). Cest aussi grce eux que le concept dARN messager a pu tre dgag, et quon a pu bnficier de sources abondantes de ces ARNm (qui constituent en fait le matriel gntique des Virus ARN positif), pour mettre au point les systmes de traduction in vitro (cf. fiche 16). Ltude de lexpression du matriel gntique : lors dune infection virale, la synthse de la majorit des protines fabriques par la cellule-hte est commande par le matriel gntique viral qui prend le dessus et inhibe les processus endognes. Pour pouvoir tre dchiffr, ce gnome viral doit prsenter des caractristiques fonctionnelles identiques celles du gnome de la cellule infecte, quil sagisse dune cellule procaryotique ou eucaryotique. De mme, la machinerie de synthse protique doit pouvoir reconnatre et traduire le message dorigine virale. En ce qui concerne ltude de lorganisation des gnes et de leur fonctionnement, les virus ont galement t trs utiles : ils ont permis, par exemple, la dcouverte de la structure morcele (dite en mosaque) des gnes eucaryotiques. Les tudes in vitro : la connaissance des mcanismes enzymatiques de rplication a beaucoup bnfici de lutilisation des gnomes circulaires dADN double brin ou simple brin de certains Virus. Les avantages des systmes viraux : le plus souvent, et contrairement la situation habituelle, la cellule infecte ne fabrique quun nombre limit despces protiques virales (quelques units quelques dizaines), et celles-ci en quantit importante. De plus, comme cette synthse ne dmarre quaprs linfection, les processus de synthse sont parfaitement synchroniss, et si une squence prcise dvnements cellulaires existe, elle sera aisment identifiable. En effet, lexprimentateur est capable de reprer les protines virales nouvellement synthtises par marquage avec des prcurseurs radioactifs et autoradiographie, ou bien utilisation danticorps anti-protines virales. Lanalyse exprimentale des diffrentes tapes du cycle viral sen trouve extrmement simplifie par rapport ltude des processus cellulaires normaux, beaucoup plus complexes (voir lexercice suivant).
150
30
Le cycle dun virus enveloppe le VSV :
Le Virus de la stomatite vsiculeuse (VSV) est capable dinfecter in vitro des cultures de cellules animales (cf. fiche 14) et dy accomplir son cycle complet. Lorsquune culture de cellules confluentes est inocule avec une suspension trs dilue de ce virus, on observe au bout de 48 heures des plages circulaires claires correspondant des zones o les cellules sont visiblement mortes (plages de lyse). 1. Comment expliquez-vous lorigine de ces plages de lyse dans la culture ? Lorsque le milieu de culture de plusieurs botes infectes de ce type est rcupr et soumis une longue ultracentrifugation (cf. fiche 15), on rcupre une fraction qui savre elle-mme tre infectieuse. 2. Avec quelle technique cytologique simple pouvez-vous montrer que cette fraction contient des particules virales ? partir de cette fraction, on extrait une trs faible quantit de protines que lon peut analyser par lectrophorse en gel dacrylamide-SDS (cf. fiche 9). Cette technique met en vidence cinq bandes, dont la plus lente possde une masse molculaire de 69 kDa. Lorsque cette fraction est traite par une glycosidase avant llectrophorse, la seule modification observe est la diminution de la taille de cette protine, dont la masse molculaire passe 63 kDa. 3. Quelles informations sur la constitution chimique du virion cette exprience vous apporte-t-elle ? 4. Quelle est la localisation probable de la protine de 69 kDa ? 5. Quel autre constituant majeur attendez-vous dans cette fraction ? Un anticorps spcifique de la protine de 69 kDa a t obtenu et un fluorochrome lui a t greff afin quil puisse tre utilis dans des expriences dimmunofluorescence (cf. fiche 8). Une tude dtaille du cycle viral est ensuite conduite avec cet outil, et les donnes suivantes ont t obtenues : pendant les 4 premires heures suivant linfection, aucune fluorescence nest visible au sein de la cellule ; partir de la 5e heure, une fluorescence cytoplasmique commence tre visible ; partir de la 6e heure, la membrane plasmique devient son tour fluorescente ; progressivement, le cytoplasme perd sa fluorescence, puis son tour la membrane plasmique et, au bout de 8 h, toute fluorescence a disparu dans la cellule ; divers tests montrent que la cellule infecte entre ensuite dans un processus dinactivation de son mtabolisme, ce qui conduit sa mort aprs 12 heures. 6. Donner la squence possible des vnements molculaires et cellulaires qui rendent compte du cycle de ce virus.
FICHE 30 Les virus
151
Solution
1. Lorsquune particule virale infecte une cellule, elle sy reproduit et conduit la production dune descendance qui est libre dans le milieu de culture. Les cellules voisines sont alors infectes par ces nouveaux virions, et le processus se propage aux cellules les plus proches, ce qui conduit une zone circulaire de cellules infectes de plus en plus grande, se prsentant sous la forme dune aurole claire (nomme plage) car, ainsi quon le verra plus loin, linfection conduit ici la mort cellulaire (lyse). Ce phnomne ne peut pas sobserver si linoculum initial est trop dense, car toutes les cellules sont alors infectes simultanment, et on nobtient pas de plage de lyse bien individualise. 2. La technique de coloration ngative, en microscopie lectronique, est trs adapte la visualisation rapide des particules virales (cf. fiche 11). 3. Le virion contient seulement 5 protines, dont la plus grosse (et donc la plus lente dans ce type de gel) est une glycoprotine. On sait en effet que les glycosidases sont des enzymes qui dcrochent ou dgradent les chanes glucidiques ; on calcule que la masse de glucides de cette glycoprotine est de 6 kDa. 4. De faon gnrale, les glycoprotines sont des protines membranaires. Dans le cas des virus, ces protines se retrouvent dans lenveloppe virale qui est un bout de la membrane plasmique de la cellule-hte emporte lors du bourgeonnement. 5. Il sagit du matriel gntique viral, constitu par un acide nuclique ; dans le cas du VSV, on sait quil est constitu dun ARN ngatif (anti-sens). 6. La premire phase montre labsence de la protine de 69 kDa dans la cellule ; elle correspond la rplication et la transcription du matriel gntique viral, qui conduit la production dun grand nombre dARNm codant pour les 5 protines virales. Dans la phase suivante, la protine est visible dans le cytoplasme ; elle passe ensuite dans la membrane plasmique, ce qui suggre quelle suit la voie de scrtion et quelle y est apporte par exocytose de vsicules golgiennes, partir de 6 heures. Enfin, toutes les protines ayant t adresses la membrane font lobjet dun bourgeonnement pour former les virions qui seront librs (ils emportent galement les 4 autres protines). La cellule ne survit pas cette infection ; voir la suite.
Synthse dune protine membranaire du VSV

Une culture de cellules pithliales est infecte par une suspension de virions de VSV puis, 2 heures plus tard, de la leucine 3H est ajoute au milieu. Sept heures aprs le dbut de linfection, on recueille sparment le milieu de culture et les cellules pithliales. Les protines des virions rcolts par centrifugation du milieu sont analyses par lectrophorse (voir plus haut) et par autoradiographie : les 5 bandes observes dans le gel sont radioactives.
152
Lorsque les protines totales extraites des cellules sont soumises llectrophorse, on observe plusieurs centaines de bandes sur le gel, aprs coloration ; en revanche, lautoradiographie ne rvle que 5 bandes, de mme taille que celles des virions. Afin de prciser les lieux de synthse des diffrentes protines virales, un protocole de fractionnement cellulaire (cf. fiche 15) est conduit au temps 5 heures sur des cellules marques comme prcdemment. Deux fractions sont obtenues : a) les microsomes rugueux et, b) les protines solubles du cytosol. Aprs lectrophorse et autoradiographie des protines de ces fractions, on obtient les rsultats suivants : a) une bande de 63 kDa ; b) 4 bandes, identiques celles observes pour les virions. 1. Quelle conclusion importante tirez-vous de cette premire srie dexpriences ? 2. Sur quels types de ribosomes ces 5 protines virales sont-elles synthtises, et quel est le devenir de la protine de 63 kDa ? 3. Pourquoi sa masse molculaire au niveau des microsomes rugueux nest-elle pas sa masse dfinitive (69 kDa), et quel processus devra encore tre mis en uvre ? On a constat que, lors de la phase prcdant le bourgeonnement, la protine virale de 69 kDa est mise en place uniquement dans la membrane de la face baso-latrale de lpithlium constitu in vitro par les cellules en culture. 4. Avec quels outils pourriez-vous montrer cette localisation prfrentielle ?
30
Solution
1. Les 5 protines virales sont devenues radioactives, ce qui est attendu, car elles ont t fabriques par les cellules-htes, en prsence de leucine marque ; ceci est bien confirm par ltude des protines totales extraites des cellules. En revanche, aucune protine cellulaire nest marque, ce qui montre que la traduction est totalement bloque pour les protines endognes. Cet arrt complet est contrl par le virus, et ceci conduit fatalement la mort de la cellule, dont toute lactivit a t dtourne par son parasite, son seul profit ; la lyse de la cellule marque la fin du processus, 12 heures aprs linfection. 2. La protine de 63 kDa est synthtise sur les ribosomes lis au rticulum endoplasmique rugueux, point de dpart de la voie de scrtion qui, via lappareil de Golgi, apporte aussi des protines intrinsques la membrane plasmique. Les 4 autres protines sont fabriques grce aux ribosomes libres du cytosol. 3. Cette protine est ensuite glycosyle lors de son passage dans lappareil de Golgi. 4. On peut utiliser le microscope lectronique (coupes ultrafines conventionnelles) ou bien les microscopes photoniques dits confocal, ou dconvolution (cf. fiche 13), qui permettent de raliser des coupes optiques travers cet pithlium.
FICHE 30 Les virus
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Liste des exercices

Fiche 1 Cellules procaryotiques et eucaryotiques Volumes cellulaires compars Combien de cellules dans une colonie bactrienne ? Organisation des cellules animales Organisation des cellules bactriennes Mtabolismes bactriens Organisation gnrale dune membrane plasmique Constitution de la membrane de lhmatie Architecture de la membrane de lhmatie Permabilit des hmaties de Mammifre Pntration du glucose dans les entrocytes Mcanismes de lendocytose du fer changes entre cellules confluentes Calcium et jonctions intercellulaires Structures cytosquelettiques stables Polymrisation in vitro de la tubuline Les microtubules dynamiques en interphase Les moteurs lis aux microtubules Organisation de la chromatine Organisation des nuclosomes Images des complexes de transcription Synthse et maturation des ARN ribosomiques Rplication de lADN Fonctionnement des yeux de rplication Rles des divisions chez les Eucaryotes Le brassage interchromosomique chez lHomme Organisation des chromosomes
Fiche 2
Fiche 3
Fiche 4 Fiche 5 Fiche 6 Fiche 7 Fiche 8 Fiche 9 Fiche 10 Fiche 11 Fiche 12
154
Fiche 13 Fiche 14 Fiche 15 Fiche 16
Fiche 17 Fiche 18 Fiche 19 Fiche 20 Fiche 21 Fiche 22 Fiche 23 Fiche 24

Fiche 25 Fiche 26 Fiche 27 Fiche 28 Fiche 29 Fiche 30
Cytodirse et surface de membrane plasmique Les poisons de lappareil mitotique Dures des phases du cycle cellulaire et de la mitose Le cycle des cellules animales en culture Organisation du rticulum endoplasmique Comparaison de la synthse de deux protines Les mcanismes de la traduction Mcanismes molculaires de ladressage La particule dite PRS (ou SRP) Protocole dtude de la scrtion des protines Trajet intracellulaire dune protine scrte Synthse de linsuline Glycosylation dune protine membranaire Les lysosomes : des organites digestifs originaux Synthse des hormones thyrodiennes Structure des mitochondries Les mitochondries, des organites universels Activit respiratoire des mitochondries Fonctionnement dune mitochondrie Isolement de plastes fonctionnels Structure des chloroplastes Organisation de la membrane des thylakodes Les tapes de la rduction du CO2 Fonctions des peroxysomes Biogense des peroxysomes Biogense des mitochondries Synthse de la RUBISCO Adressage de la nucloplasmine Synthse des molcules des matrices extracellulaires Organisation dun tissu conjonctif lche La dimrisation des rcepteurs de lEGF La fibre musculaire squelettique strie Diffrenciation des fibres musculaires stries Le cycle dun virus enveloppe : le VSV Synthse dune protine membranaire du VSV
FICHE
Liste des exercices
155
Liste des techniques dcrites

Fiche 1 Fiche 2 Fiche 3 Fiche 4 Fiche 5 Fiche 6 Fiche 7 Fiche 8 Fiche 9 Fiche 10 Fiche 11 Fiche 12 Fiche 13 Fiche 14 Fiche 15 Fiche 16 Fiche 17 Fiche 18 Fiche 19 Fiche 20 Fiche 21 Fiche 22 Fiche 23 Fiche 24 Fiche 25 Fiche 26 Fiche 27 Fiche 28 Fiche 29 Fiche 30
156
Outils et mthodes de la cytologie Lobservation des cellules vivantes au microscope photonique Les techniques dtude de la structure des membranes Lutilisation de la fluorescence pour ltude des membranes Le microscope lectronique balayage Cryofracture et cryodcapage Les techniques de dtection immunocytochimiques Limmunofluorescence ; le microscope pifluorescence Llectrophorse des protines Lutilisation des radioisotopes Les techniques microscopiques danalyse des formes et des surfaces La dtection dARN et dADN spcifiques par hybridation in situ Le microscope confocal ; le microscope dconvolution Les cultures de cellules animales Les techniques de fractionnement cellulaire Les systmes de traduction in vitro Lautoradiographie Les expriences de pulse-chasse Les sondes fluorescentes La dtection denzymes in situ : la cytoenzymologie Spectres dabsorption ; ltude spectroscopique des cytochromes La chromatographie Lidentification des macromolcules spares par lectrophorse Les cultures de bactries, de cellules vgtales et de champignons Ltude des processus dadressage La transformation gntique des cellules et des organismes Le triage des cellules ; la cytomtrie en flux Lutilisation de la GFP Les techniques lectrophysiologiques ; le patch-clamp Les virus utiliss comme modles
Bibliographie
AIME-GENTY N., BUSSEREAU-PLUNIAN F., DUBERTRET G., Problmes corrigs de Biologie Cellulaire, Dunod, Paris, 2002. ALBERTS B., JOHNSON A., LEWIS J., RAFF M., ROBERTS K., WALTER P., Molecular Biology of the Cell, 4 e d., Garland Science, 2002. CALLEN J-C., Biologie cellulaire ; des molcules aux organismes, Dunod, 2005. CALLEN J-C., CHARRET R., CLEROT J-C., QCM et QROC de Biologie Cellulaire, 2e d., EdiScience, 2006. COOPER G.M., The Cell , 2e d., ASM Press - Sinauer Associates, 2000. KARP G., Cell and Molecular Biology, 4e d., John Wiley and Sons, 2005. LODISH H., BERK A., MATSUDAIRA P., KAISER C.A., KRIEGER M., SCOTT M.P., ZIPURSKY S.L., DARNELL J.E., Molecular Cell Biology, 5e d., W.H. Freeman and Co, New-York, 2004. ROLAND J-C., CALLEN J-C., Atlas de Biologie cellulaire, 6e d., Dunod, 2007.
Illustrations
Tous les clichs prsents dans cet ouvrage sont originaux ou ont t extraits des ouvrages suivants : Biologie cellulaire : des molcules aux organismes, 2e d., Dunod, Paris, 2005 ; QCM et QROC de Biologie Cellulaire, 2e d., EdiScience, Paris, 2006 ; Atlas de Biologie cellulaire, 6e d., Dunod, Paris, 2007.
Remerciements
loccasion de la parution de cet ouvrage, fruit dune longue exprience denseignement, je souhaite remercier sincrement toute lquipe des enseignants du Service de Biologie Cellulaire du L1 SV du Centre dOrsay. Si tous les exercices prsents dans ces pages sont bien de mon cru, certains doivent beaucoup au travail dquipe qui y a t effectu. Je ddie donc ce volume tous mes collgues, ceux de la premire heure comme ceux qui ont rejoint plus rcemment ce groupe : Bussereau F., Charret R., Clrot J.-C., Deneubourg AM., Dupr S., Dutuit P., Grisvard J., Lemullois M., Orcival J., Thomas M., ainsi qu tous les ATER et moniteurs qui nous ont aids.
FICHE
Bibliographie
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Index
A
actine 34, 36, 43, 64 ADN 9, 13, 44, 46-49, 51, 52, 54-58,
60, 63, 66, 69, 70, 73, 100, 103, 113, 115, 124, 126, 129, 130, 138, 149, 150 amidon 102, 110, 113, 114 anticorps 11, 20, 35, 42, 60, 78, 91, 92, 125, 127, 135, 148, 150 appareil de Golgi 24, 76, 84, 87-89, 91, 97, 136, 153 appareil mitotique 39, 64, 68 ARN 10, 13, 49, 52, 53, 55, 56, 60, 61, 77, 78, 80, 81-83, 111, 115, 126, 129, 149, 150, 152 ATP 19, 20, 43, 99, 101, 103, 104, 106108, 114, 117-119, 123, 125, 130, 141 axonme 36, 40, 43
glycogne 144, 147 glycolipide 14, 16 glycoprotine 14, 16, 24, 89, 92, 97,
134, 152
O
organites 4, 6, 11, 31, 39, 44, 55, 75,
95, 102, 109, 112, 113, 124
glycosaminoglycanes 137 glycosidase 16, 18 glyoxysomes 119 granule 13
P
paroi 6, 13, 112, 134, 136 pectines 134, 136 peptidases 16 peptidoglycane 13 peroxysomes 119, 121 phosphatase 35 phospholipides 14, 16, 17 photosystmes 114, 116, 117 phragmoplaste 65 plasmodesmes 30 plastes 109, 121 polysaccharides 13, 24, 89, 114, 134 pores nuclaires 44 protines 13, 14, 16-18, 24, 26, 27,
29, 31, 38, 44, 45, 55, 60, 76, 77, 80-92, 97, 100, 110, 115, 121, 124, 125, 129, 131, 134, 139, 152 protoglycanes 89, 134, 137
H
hmicelluloses 134, 136 htrochromatine 44, 50 histones 44, 48, 129
J
jonctions 29, 32, 33
K
kratine 34
B
bicouche 14-17, 19, 31, 33 bicouches lipidiques 84
L
lame basale 134, 138 lamina 36, 44, 129 lipides 14, 33, 114, 119 lysosomes 24, 84, 94-98
C
cellulose 134, 136 centrioles 36, 41, 42 centrosome 34, 36, 41, 64, 89 chlorophylle 105, 109, 144 chloroplastes 6, 10, 109, 111, 113,
114, 117, 119, 124, 127
M
matrice extracellulaire 134 membrane 13, 14, 17, 18, 24, 27, 29,
30, 44, 67, 74, 76, 82, 84, 89, 104, 107-109, 113, 114, 117, 121, 141 membrane cytoplasmique 13, 19 microlaments dactine 29, 34, 36, 39, 55, 64 microsomes 76, 78, 81-83, 93, 125 microtubules 34, 36-43, 55, 64, 68 microvillosits 36 mitochondries 4, 10, 39, 75, 87, 88, 95, 99, 102, 104, 106, 109, 117119, 121, 124, 126, 147, 148 moteurs microtubulaires 43 moteurs molculaires 36, 39, 64 myosine 36, 43, 64
R
radio-isotopes 15, 50 rcepteurs 27, 79, 123, 124, 130, 139,
141
rticulum endoplasmique (RE, RER) 4, 24, 39, 74, 75, 79, 84, 91,
98, 121, 125, 136, 143, 153
cholestrol 14, 17 chromatine 44, 46-48, 51, 59 chromosomes 13, 39, 50, 59, 61, 63,
64, 66, 68, 69, 100 cils 36, 40 corpuscules basaux 36 cytochromes 105, 106, 117 cytosol 87, 97, 106, 118, 121, 129 cytosquelette 29, 34, 36, 39, 43
ribosomes 13, 49, 53, 74-76, 79, 83,

84, 109, 113, 121, 126, 127, 153
RUBISCO 114, 118, 124, 127, 144
S
sondes 11, 40, 60, 95 stroma 114, 117
T
thylakode 114, 117 traceurs 50, 51 transporteur 19, 20, 22, 23, 96, 104,
107, 118
E
euchromatine 44, 50
F
laments intermdiaires 29, 34 agelles 13, 36, 40 uorochromes 20, 31, 35, 40
N
noyau 4, 6, 41, 44, 46, 54, 59, 64, 66,
69, 73, 75, 89, 121, 125, 129, 131, 133 nucloles 44, 49, 51-53 nucloplasme 44 nuclosomes 44, 47, 48, 51, 63
tubuline 34, 37, 41, 42
V
vacuoles 6, 11, 94, 95 vsicules 15, 18, 24, 39, 68, 76, 83, 84,
87-89, 91, 92, 96-98
G
GFP 11, 40, 85, 90, 140, 143 glucides 14 glucose 21-23, 103, 104, 114, 148
EXPReSS SCIeNCeS
Jean-Claude CALLEN
Biologie cellulaire
en 30 ches
Des principes aux applications Comment aller lessentiel, comprendre les mthodes et les dmarches avant de les mettre en application ? Conue pour faciliter aussi bien lapprentissage que la rvision, la collection EXPRESS vous propose une prsentation simple et concise en 30 ches pdagogiques des notions de biologie cellulaire. Chaque che comporte : les ides cls connatre, la mthode mettre en uvre, les applications sous forme dexercices corrigs.
Jean-Claude Callen Matre de confrences luniversit Paris Sud-Orsay.
L1/L2 Sciences de la Vie et de la Terre PCEM 1 PH1
ISBN 978-2-10-054193-5
www.dunod.com

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Jean-Claude CALLEN

re d n e r p Com traner et sen ent facilem

Biologie cellulaire en 30 fiches

Dunod, Paris, 2009 ISBN 978-2-10-054193-5

Dunod La photocopie non autorise est un dlit.

Table des matires

Partie 1 : Les cellules ; le monde vivant

Partie 2 : Structure et fonctions des membranes

Partie 3 : Structure et fonctions du cytosquelette

Partie 4 : Structure et fonctions du noyau

Partie 5 : Les divisions et le cycle cellulaire

Biologie cellulaire en 30 fiches

Partie 6 : La voie de scrtion des protines

Partie 7 : Les organites convertisseurs dnergie

Partie 8 : La biognse des organites

Partie 9 : Les cellules dans leur environnement

Fiche 28 La signalisation cellulaire Fiche 29 La diffrenciation cellulaire

Partie 10 : Les virus

Table des matires

Les plans dorganisation cellulaire

I La cellule, unit structurale et fonctionnelle du vivant

II Outils et mthodes de la cytologie

Dunod La photocopie non autorise est un dlit.

FICHE 1 Les plans dorganisation cellulaire

Cellules procaryotiques et eucaryotiques

Volumes cellulaires compars

Biologie cellulaire en 30 fiches

Dunod La photocopie non autorise est un dlit.

Combien de cellules dans une colonie bactrienne ?

FICHE 1 Les plans dorganisation cellulaire

Biologie cellulaire en 30 fiches

La diversit du monde vivant

I La diversit du vivant ; larbre du vivant

Dunod La photocopie non autorise est un dlit.

FICHE 2 La diversit du monde vivant

II Lobservation des cellules vivantes au microscope photonique

Biologie cellulaire en 30 fiches

Organisation des cellules animales

Dunod La photocopie non autorise est un dlit.

FICHE 2 La diversit du monde vivant

Organisation des cellules bactriennes

Biologie cellulaire en 30 fiches

FICHE 2 La diversit du monde vivant

Les membranes biologiques

I Composition chimique et architecture des membranes

Biologie cellulaire en 30 fiches

II Les techniques dtude de la structure des membranes

Dunod La photocopie non autorise est un dlit.

FICHE 3 Les membranes biologiques

Organisation gnrale dune membrane plasmique

Biologie cellulaire en 30 fiches

Dunod La photocopie non autorise est un dlit.

FICHE 3 Les membranes biologiques

Architecture de la membrane dhmatie

Les masses molculaires des protines sont exprimes en kDaltons.

Biologie cellulaire en 30 fiches

Les transports membranaires

Dunod La photocopie non autorise est un dlit.

FICHE 4 Les transports membranaires

II Lutilisation de la fluorescence pour ltude des membranes

Biologie cellulaire en 30 fiches

Dunod La photocopie non autorise est un dlit.

FICHE 4 Les transports membranaires

Pntration du glucose dans les entrocytes