Cultivoaditivos

Precultivo

Medio
Cultivo

Clulas

400xg, 10

BAL

48000xg, 2h

HSS

116000xg, 2h, in NaBr gradient

Lavage (Ca++-free)

Mincing

Digestion

Purification (differential adherence)

Alveolar MF

Interstitial MF

Cultivoaditivos

Precultivo

DETERMINACIONES

Medio

Cultivo

Clulas

TECNICAS BIOQUMICAS
Centrifugacin Cromatografia Electroforesis Tcnicas inmunoqumicas

CENTRIFUGACIN
Sedimentacin Ultracentrifugacin preparativa

CENTRIFUGACIN
Sedimentacin
F=mw2r-Vprw2r

mw2r

Fuerza centrfuga sobre la partcula

Vprw2r

Fuerza de flotacin ejercida por la disolucin

CENTRIFUGACIN
Ultracentrifugacin preparativa

GRADIENTE
Sacarosa Cloruro de Cesio

GRADIENTE DE DENSIDAD
Ultracentrifugacin de zona
Ultracentrifugacin con gradiente de densidad en equilibrio (isopicnica)

CROMATOGRAFIA
Fase mvil Fase estacionaria Intercambio inico Sobre papel Filtracin por gel Afinidad

Otras tcnicas cromatogrficas

Adsorcin para sustancias no polares C. con hidroxiapatito Fase reversa (RPC) Gas-lquido (GLC) Interaccin hidrofbica C. lquida de resolucin elevada (HPLC) C. en capa fina (TLC)

 Cromatografa en columna

 Filtracin por exclusin): Las

gel

(cromatografa

de

molculas con masa moleculares comprendidas dentro de los lmites de exclusin, eluyen segn su Pm, siendo las de mayor Pm las que eluyen en primer lugar.

 Intercambio inico: Los iones que estn unidos

electrostticamente a una matriz insoluble e inerte quimicamente son sustitudos de modo reversible por los iones en disolucin

 Afinidad: Las molcula deseada se une a un ligando

inmovilizado, mientras que las dems sustancias son eliminadas con el tampn. La proteina purificada puede liberarse variando las condiciones de elucin de modo que se libere de la matriz cromatogrfica

 Inmunoafinidad: Unin a anticuerpos monoclonales

Otras tcnicas cromatogrficas

C. en capa fina (TLC): (molculas orgnicas)

CROMATOGRAFIA
Sobre papel : Las molculas se separan de
acuerdo con sus polaridades, siendo las molculas no polares las que se mueven con mayor rapidez.

Visualizacin
Radiactividad UV Color

Otras tcnicas cromatogrficas

Adsorcin para sustancias no polares C. con hidroxiapatito Fase reversa (RPC) Gas-lquido (GLC) Interaccin hidrofbica

Otras tcnicas cromatogrficas

C. lquida de resolucin elevada (HPLC)

VENTAJAS
Alta resolucin Velocidad Sensibilidad Automatizacin

Bomba
Presin constante Flujo constante

Inyector
Vlvula de inyeccin Muestreador automtico Microprocesadores

Detector
UV (190-600 nm) Indice de refraccin Fluorescencia Espectrofotometria de masas Electrnico Almacenar datos

Fase estacionaria
Tamao de partcula 3-10 mm Tamao de poro:70-300A

Tipo de ligando
Fase normal OH, -NH2 Fase reversa C8, C18, Phenyl Intercambiador aninico NH4+ Intercambiador catinico COO-

Fase mvil
Pureza Compatibilidad con el detector Solubilidad de la muestra Baja viscosidad Precio razonable

Electroforesis

Electroforesis

Electroforesis
Papel

Electroforesis
Gel:
Las separaciones moleculares se basan tanto sobre la filtracin en gel como en la movilidad electrofortica

Agarosa Poliacrilamida

Electroforesis de zona

Electroforesis en gel de poliacrilamida

Electroforesis en geles de gradientes

Electroforesis capilar

Isoelectroenfoque

Electroforesis bidimensional

TECNICAS INMUNOQUMICAS
RIA ELISA

Thermocycling profile conditions

50C, 2 min-activation

95C, 10 min-initial denaturation

40 cycles of 95C, 15 s-denaturation

60C, 1 min-annealing