SINTEZA DE PEPTIDE N FAZ SOLID

La nceputul anilor 1900, Emil Fischer a introdus noiunile de peptid i polipeptid i a prezentat modul de lucru pentru sinteza acestora. A stabilit tipul legturii care ar lega aminoacizii n lan, numind-o legtur peptidic. n 1901, a sintetizat o dipeptid i anume, glicil-glicina. Munca lui a condus la o mai bun nelegere a proteinelor i peptidelor i a stat la baza studiilor ulterioare ale acestora.

R2 OH H2N O
Protejarea gruparii aminice

Sinteza n faz lichid

Sinteza de peptide n faz lichid presupune urmtoarele etape: protejarea, activarea, cuplarea i deprotejarea selectiv - se folosete pentru sinteza unor secvene mici i n sinteza pe scar larg.

R2 OH P2 N H Activare carboxil R2 L P2 N H H2 N O Cuplare R2 P2 N H O H N O O R1 P1 H2 N O

R2 OH O
Protejarea gruparii carboxil

R2 O O P1

Deprotejare slectiva a gruparii aminice

R3 L P3 N H H2N O
Cuplare

R2

O H N O O R1 P1

R3 P3 N H

H N O R2

O N H

R1 O O P1

Urmatoarea extensie

Dezavantaje: La sinteza unor secvene mai mari apar probleme legate de: - solubilitate: peptidele mai lungi nu sunt foarte solubile n solveni organici - sinteza i purificarea sunt laborioase i de lung durat.

Sinteza n faz solid, pe o rin - scurt descriere

- Pentru aceast tehnic utilizat ncepnd cu 1965, Bruce Merrifield a obinut Premiul Nobel pentru chimie n 1984.

- Aminoacizii pot fi legai ntr-o peptid n orice secven se dorete, numai dac unul din capetele lanului este fixat pe un suport solid insolubil.

Etapele sintezei de peptide n faz solid sunt : Protejarea grupei NH2 a aminoacidului N-terminal i a grupei COOH a aminoacidului C-terminal. Cuplarea celor 2 aminoacizi protejai, cu formarea unei legturi amidice. Deprotejarea grupelor terminale ale peptidei.

Avantajele sintezei n faz solid

Toate reaciile se realizeaz ntr-un singur vas, ceea ce simplific i accelereaz sinteza ;
Se evit pierderile mari de produi de reacie care, n mod normal se nregistreaz pe parcursul izolrii i purificrii intermediarilor la sinteza n faz lichid; Se pot folosi reactivii n exces pentru obinerea unor randamente mari n produs finit, fornd fiecare reacie n parte s se desfoare complet ; Favorizeaz dizolvarea i mpiedic agregarea intermediarilor. n funcie de grupele protectoare exist dou strategii de lucru: Boc i Fmoc.

Grupri aminoprotectoare
Gruparea aminic este reactiv i trebuie protejat sub form de carbamat.
1. Benziloxicarbonil, Z
O H2N O O O N O O O O R1 R O O H N R1 O R

2. ter-Butoxicarbonil, BOC
O O O O O O H2N O O R1 R O O H N O R1 R

Compuii rezultai au bazicitate redus i nu particip la reacia de cuplare.

3. Fluorenil-metil-oxicarbonil, Fmoc
O H2N O O O N O + R1 O R O O O O NH O R1 R

Sinteza de peptide n faz solid metoda Fmoc

Aminoacidul de plecare cu catena laterala protejata cu Y Fmoc NH H C R2 Y Activare O C Act H2N Deprotectie COOH + Activator Rasina preincarcata cu primul aminoacid a carui catena laterala este protejata cu X Piperidina + Fmoc NH H C R1 X O C O Rasina

Fmoc

NH

H C R2 Y

H C R1 X

O C O Rasina

Cuplare pH bazic O Fmoc NH H C R2 Y C NH H C R1 X Deprotectie finala O H2N H C R2 Y C NH H C R1 X Clivare O H2N H C Rn C H N H C R2 Peptida finala O C NH H C R1 (TFA + un reactiv de curatare) O C OH O C O Rasina (dupa ultimul ciclu) O C O Rasina Se repeta deprotectia si ciclul de cuplare Rn+1

Primul aminoacid care este legat de rin este deprotejat cu piperidin de gruparea Fmoc, iar al doilea aminoacid este activat cu PyBOP sau alt agent de cuplare cum ar fi DCCDdiciclohexilcarbodiimina sau diizopropilcarbodiimina. Ciclul de deprotejare i cuplare se repet pn se obine secvena dorit, apoi se realizeaz deprotecia final i clivarea de pe rin cu acid trifluoracetic-TFA.

CH3 H3C C O C O H H 2C O C H N CH2 C H C O N-9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc) piperidina N H O CH3

t-butil

Metoda Fmoc/tBu
Protecia Fmoc este acum n mare msur folosit, dar reactivul Fmoc este nc foarte scump n comparaie cu Boc.

TFA

pentru prevenirea formrii DKP este folosit rina ClTrt; Avantaj: este mai bun pentru peptidele sensibile la mediu acid (Trp, Met), iar oxidrile i alchilrile pot fi evitate. deoarece catena lateral protejat este perpendicular pe planul CON, se pot sintetiza secvene total protejate. Dezavantaj: deprotecia Fmoc este incomplet n cazul peptidelor care se agreg;
Rasina 2-clorotritilclorura (ClTrt)
P

Cl Cl

Metoda Boc/Bzl
Benzil CH2 HF O C CH3 H 3C C CH3 TFA O O C H N CH2 C H C O N H O

Metoda Boc a fost aproape abandonat n ultimii ani, deoarece HF este extrem de toxic i necesit echipament de laborator foarte scump, iar tratamentele repetate cu TFA pe parcursul deproteciei pot conduce la alterarea legturilor peptidice, care sunt foarte sensibile, precum i la reacii catalizate de acizi.

Avantaj: evitarea formrii de dicetopiperazine (DKP); metoda este recomandat n cazul peptidelor care se agreg uor, deoarece agregatele sunt distruse dup fiecare etap cu TFA; clivarea gruprii Boc este uoar ; rina pentru metoda Boc se poate folosi i pentru metoda Fmoc. Procedura cu 2 etape de clivare poate conduce la un produs brut mai bun. Se poate realiza n prima faz clivarea cu TFA, apoi cu HF (leg. peptid-rin). Este o metod potrivit pentru prepararea peptidelor ramificate. Dezavantaj: datorit etapei de neutralizare complet, ciclul de sintez ia mult timp.

N-t-butoxicarbonyl- (Boc)

Protejarea permanent a grupelor laterale

- este necesar pentru a preveni formarea de lanuri secundare complicate;
HN NH O S O CH3 CH3 O
N O O N H COOH

NH H3C
N

H3C O N H COOH

O CH3

Fmoc-His(Trt)-OH

Fmoc-Arg(Pbf)-OH

- gruprile blocante trebuie s rmn ataate pe tot parcursul sintezei i s poat fi nlturate dup realizarea acesteia; - cnd se alege gruparea blocant stabil, trebuie s se in seama i de labilitatea gruprilor protectoare i de procesul de clivare a acestora.

Schema de clivare Fmoc

Peptida este protejata cu gruparea Fmoc la N-terminal ? da nu nlturare Fmoc da Peptida conine Arg, Met? da Folosire amestec clivare B da Folosire amestec clivare C Peptida conine Arg, Met, Trp sau Trt? nu Folosire amestec clivare A

nu
Peptida contine Trp or Trt? nu d.i.-deionizat

A: 0.5 mL d.i. ap 9.5 mL TFA

C: 0.25 mL EDT 0.25 mL d.i. ap 9.50 mL TFA

B: 0.75 g fenol crist. 0.25 mL EDT 0.50 mL tioanisole 0.50 mL d.i. ap 10 mL TFA

Exemplu practic

S se sintetizeze i caracterizeze o secven de resturi de aminoacizi :

CHQYHHNRE

nonapeptid cu urmtoarea

Cys-His-Gln-Tyr-His-His-Asn-Arg-Glu
Peptida este util pentru investigarea capacitii de legare a ionilor de cupru a peptidelor i proteinelor ce conin histidin. Puritatea peptidei se verific cu ajutorul RP HPLC i MALDI-TOF MS. Programul GPMAW 6.11 este foarte util pentru caracterizarea peptidei.

Reactivi
Rina Fmoc-Glu(O-tBu)-NovaSyn TGA, 0,22 mmol aminoacid/g rin, (Novabiochem), PyBOP (benzotriazoliloxitripirolidinfosfiniu hexafluorofosfat).

CH2 O O

H N CH CH2

O C OH

N Fmoc-His NH

Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonil) aminoacizi (GL Biochem Ltd, Shanghai), dimetilformamid (DMF), piperidin, 4-metilmorfolin (Sigma), albastru de bromfenol, ninhidrin, acetonitril i acid trifluoracetic de la Merck.

Aparatura Analiza MALDI-TOF MS a fost realizat cu un spectrometru de mas tip Bruker Biflex TOF liniar (Bruker Daltonik, Bremen, Germany) echipat cu un laser UV cu nitrogen (max = 337 nm) i sistem ntrziat de extracie, cu sistem video si program XMASS pentru prelucrarea spectrelor.

Un aparat pentru cromatografia de lichid de nalt performan cu faz invers BioRad HRLC System 2700. Aparatul HRLC a fost folosit pentru separarea preparativ a peptidei i a produilor de clivare, cu o coloan Vydac-C18 cu vitez de migrare de 1 ml/min.

Mod de lucru Peptida este sintetizat manual prin metoda/strategia Fmoc pe o rin NovaSyn TGA (341 mg rin, calculat pentru 75 mol de peptid) folosind metoda Fmoc. Reactivii de cuplare i aminoacizii sunt luai n exces pentru a se obine un randament maxim; excesul de reactivi i aminoacizi este ndeprtat prin splare cu DMF, iar n final, produsul este clivat/ndeprtat de pe suportul solid. Pentru sintez, se procedeaz astfel: splare cu DMF urmat de deprotecie cu 20 % piperidin n DMF, 2, 2, 5, 10, 2 i, respectiv, 2 min. Urmtorul pas este splarea rinii cu DMF i verificarea ndeprtrii totale a grupei protectoare Fmoc, cu o soluie de albastru de bromfenol 1 % n DMF. Soluia i schimb culoarea din galben n albastru n prezena gruprilor aminice libere.

Cuplarea se poate realiza ntr-o soluie ce conine un amestec de PyBOP (Benzotriazol-1-yl-N-oxy-tri-pirolidinfosfoniu-hexafuorofosfat), NMM (N-Metil-morfolin) n DMF. Dup terminarea sintezei, peptida este clivat de pe rin folosind TFA, trietilsilan i ap (4.5:0.25:0.25) timp de 2.5 ore, la temperatura camerei.
N N

P N
N

P NH
N

N N N
O RO NH OH O R1

N N N
RO NH O O R1
O N N N P(NR2)3

O O RO NH O O P(NR2)3 O
N N O N

RO

NH O R1 P(NR2)3

R1

fosfonamida OBt ester

N N N

Dup clivare, peptida brut este precipitat cu 45 mL t-butilmetileter, splat cu dietil-eter i dizolvat n acid acetic 5 % nainte de liofilizare (uscarea prin ngheare). Peptida brut este apoi purificat prin RP-HPLC folosind o coloan Vydac C18.

Faza mobil este n ambele cazuri format prin amestecarea a dou soluii: A) 1000 mL ap bidistilat cu 0,1 mL acid trifluoracetic; B) 800 mL acetonitril, 200 mL ap bidistilat i 0,1 mL acid trifluoracetic. Soluiile sunt sonicate sub vacuum pentru ndepartarea gazelor. Compoziia fazei mobile este urmtoarea: 95% A i 5% B, timp de 0-5 min, crescnd la 55% A i 45% B la min 45. Peptida este dizolvat n solventul A i introdus apoi pe coloana cromatografic.

Rezultate i discuii (exemplu)

Peptida legat de rina brut a fost splat cu DMF, DCM i etanol absolut, uscat la vacuum i cntrit (487 mg).

Folosind programul GPMAW 6.11, a fost calculat masa molecular a peptidei = 1223,2968. Prin spectrometrie de mas s-a obinut M = 1223,6308. S-a observat astfel o rezoluie foarte bun m/m = 3703,7.

HPLC preparativ arat un pic mare n cromatogram la cca. 20 min. Peptida a fost colectat, liofilizat i msurat prin spectrometrie de mas.

0,8

Absorbanta (220 nm)

1000

1200

1400

1600

1800

2000 m/z

0,6

Spectrul MALDI-TOF al peptidei

0,4

0,2

0,0

10

20

30

40

Spectrul MALDI-TOF arat c masa peptidei este 1224,6308 Da i mici cantiti de Napeptid i K-peptid.

Timp (min)

Spectrul HPLC al peptidei

Concluzii (exemplu) S-au studiat metodele de sintez a peptidelor n faz solid i s-a stabilit cel mai eficient procedeu de sintez a unor oligopeptide bazat pe tehnica Fmoc. S-a sintetizat o nonapeptid specific, capabil s fixeze ionii de cupru. Folosind programul GPMAW 6.11, a fost caracterizat peptida, iar resultatele s-au comparat cu datele experimentale. Sinteza poate fi realizat manual n laboratoare cu dotare relativ modest.

V mulumesc pentru atenie !

V mulumesc pentru atenie !