KAJIAN KOMPARATIF AKTIVITAS ANTIOKSIDAN FORMULA PENGAWET ALAMI EKSTRAK KECOMBRANG (Nicolaia speciosa Horan) DAN POLA PEMISAHAN

KROMATOGRAFIS EKSTRAK BAGIAN-BAGIAN TANAMAN KECOMBRANG Oleh : Pristiadi Program Pascasarjana, Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto Abstract Kecombrang (Nicolaia speciosa Horan) contains alkaloid compounds, saponin, tannin, phenolic, flavonoid,triterpenoid, steroid and glycoside which act as antimicrobial and antioxidant. Utilization kecombrang in the form of fresh or extract is easy to loss of volatile components, so that need to be formulated with the addition of fillers, stabilizers, NaCl and pH treatment. Formula that has antimicrobial activity investigated as total phenolic content and antioxidant activities. Tests performed on thin-layer chromatography of fruit extracts, rhizome extracts, stem extracts and flower extracts to get the chromatography pattern and Rf values. Experiment of eight formulas of kecombrang extracts have the highest measurement results obtaining on the formula F1 (15% fillers, 1% stabilizers,2.5% NaCl and pH 4) with total phenolic content of 323.25 mg/100 g and 58.49% antioxidant activity. The relationship between total phenolic content with antioxidant activity of formulas of kecombrang extracts obtained correlation value r = 0.92 this shows that 92% of the total phenolic effect on antioxidant activity. It shown the result of thin layer chromatography tests with GF254 stationary phase and ethyl acetate - formic acid - glacialacetic acid - water eluent (100:11:11:26) on stem and flower extracts (Rf 0.15; 0.54; 0.94), fruit extracts (Rf 0.09; 0.94) and rhizome extracts (Rf 0.15). The similarity of Rf values on kecombrang extracts shown similar compounds contained in it. Keywords : total phenolic, antioxidant activity Pendahuluan Pangan merupakan bahan kebutuhan pokok manusia yang mudah mengalami kerusakan secara fisik, mekanis, mikrobiologis, biologis dan kimia. Komposisi pangan yang berupa karbohidrat, protein, lemak, air, vitamin dan mineral menyebabkan pangan mudah mengalami kerusakan tersebut. Oleh karena itu, upaya pengawetan pangan perlu dilakukan untuk mempertahankan sifat fisik dan kimia pangan serta meningkatkan daya simpan agar lebih lama. Cara pengawetan pangan berlemak yang lazim digunakan adalah pemberian senyawa antioksidan. Antioksidan merupakan senyawa atau substansi yang mampu mencegah atau memperlambat kerusakan lemak atau bahan pangan berlemak akibat reaksi autooksidasi radikal bebas yang berperan dalam proses oksidasi (Afrianti, 2008). Menurut Fardiaz (1996) antioksidan adalah senyawa yang dapat melindungi suatu produk, khususnya produk pangan berlemak dari reaksi oksidasi seperti ketengikan oksidastif. Lebih lanjut Kochar dan Rossel (1990) mengemukakan bahwa antioksidan adalah zat yang dapat menunda atau mencegah terjadinya reaksi auto-oksidasi radikal bebas dalam oksidasi lipid. Senyawa antioksidan yang sering digunakan dalam industri pengolahan pangan adalah senyawa antioksidan sintetis seperti butylated hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluene (BHT), propil galat (PG), dan tert-butyl hydroquinone (TBHQ). Penggunaan antioksidan sintetis dinilai masih aman selama penerapannya sesuai dengan cara produksi pangan yang baik (CPPB). Meskipun akhir-akhir ini para peneliti menemukan bahwa penggunaan antioksidan sintetis diduga dapat menjadi agen karsinogenik penyebab penyakit kanker (Hernani dan Mono Raharjo, 2005) dan mempunyai efek toksik (Kikuzaki dan Nakatani, 1993). Kondisi demikian mendorong penggunaan kembali antioksidan alami yang aman dikonsumsi bagi manusia. Beberapa jenis bahan pangan yang dapat menjadi sumber antioksidan alami, misalnya rempah-rempah, teh, kokoa, biji-bijian misalnya biji atung (Sarastani et al., 2002), serealia, umbiumbian seperti umbi akar ginseng (Estiasih dan Kurniawan, 2006), sayur-sayuran dan daundaunan seperti daun suji (Prangdimurti et al., 2006). Menurut Pratt dan Hudson (1990), antioksidan alami banyak terdapat dalam tanaman dan komponen tersebut terkandung pada seluruh

bagian tanaman seperti akar, daun, bunga, biji, batang, kulit, ranting, dan buah. Senyawa yang umumnya terkandung dalam antioksidan alami adalah fenol, polifenol, flavonoid, turunan asam sinamat, tokoferol dan asam organik. Salah satu tanaman sumber antioksidan alami adalah tanaman kecombrang (Nicolaia speciosa Horan). Kandungan fitokimia bunga, batang, rimpang dan daun kecombrang hasil penelitian Naufalin (2005) diperoleh senyawa alkaloid, saponin, tanin, fenolik, flavonoid, triterpenoid, steroid, dan glikosida yang berperan aktif sebagai antioksidan. Menurut Antoro (1995), pada rimpang ditemukan senyawa alkaloid, flavonoid dan minyak atsiri yang bertindak sebagai antioksidan. Tampubolon et al. (1983) menyebutkan bahwa kecombrang mengandung senyawa bioaktif seperti polifenol, alkaloid, flavonoid, steroid, saponin dan minyak atsiri yang diduga memiliki potensi sebagai antioksidan. Penggunaan pengawet alami tanaman kecombrang telah lama digunakan masyarakat secara tradisional pada berbagai macam olahan pangan. Namun demikian, pada skala industri tentunya penggunaan bunga, batang dan bagian kecombrang lainnya dinilai kurang praktis. Oleh karena itu, perlu dilakukan ekstraksi tanaman kecombrang untuk mendapatkan komponen bioaktifnya. Menurut Houghton dan Raman (1998), pengawet alami dari tanaman dapat diperoleh dengan cara ekstraksi dengan pelarut yaitu dengan cara mempertemukan bahan yang akan diekstrak dengan pelarut organik selama waktu tertentu, diikuti pemisahan filtrat dari residu bahan yang diekstrak. Pemanfaatan senyawa antioksidan alami dalam bentuk ekstrak memiliki beberapa kekurangan, antara lain tingginya kemungkinan kehilangan komponen volatil dalam proses pengolahan dengan suhu tinggi, mudah teroksidasi, dan tidak mudah terdispersi dalam bahan kering dan bentuknya yang sulit ditangani (Koswara, 2007). Cara untuk mengatasi kekurangan tersebut adalah dengan mencampur ekstrak tanaman dengan bahan penstabil menjadi formula. Penelitian ini menggunakan formula ekstrak kecombrang yang merupakan campuran ekstrak buah, batang, bunga dan rimpang kecombrang dengan dekstrin, gelatin, Tween 80 dan NaCl pada perbandingan tertentu. Komposisi formula ekstrak kecombrang yang digunakan adalah formula ekstrak kecombrang yang telah lolos uji sifat antimikroba hasil penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Istiqomah (2011). Menurut Haraguchi et al. (1998) senyawa antimikroba seperti fenolik, flavonoid, minyak atsiri, terpena, asam organik tanaman, asam lemak, ester asam lemak tertentu dan alkaloid juga memilki aktivitas antioksidan. Selain itu, identifikasi senyawa-senyawa yang berperan aktif sebagai antioksidan juga perlu dilakukan. Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu cara untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponen-komponennya sehingga mem-bentuk pola kromatografis yang berbeda pada masing-masing sampel ekstrak kecombrang yang diuji. Berdasarkan uraian di atas dapat di-kemukakan rumusan masalah sebagai berikut : 1) Apakah formula ekstrak kecombrang yang telah lolos uji antimikroba juga memiliki aktivitas antioksidan? 2) Apakah aktvitas antioksidan formula ekstrak kecombrang tersebut berbanding lurus dengan kandungan total fenoliknya? 3) Apakah ekstrak batang, bunga, buah dan rimpang kecombrang menunjukkan pola pemisahan kromatografis yang berbeda satu sama lain ? Penelitian ini bertujuan untuk : 1) Mengukur total fenolik dan aktivitas antioksidan formula ekstrak kecombrang yang lolos uji antimikroba. 2) Menguji linearitas total fenolik formula ekstrak kecombrang dibandingkan dengan aktivitas anti-oksidannya. 3) Membandingkan pola pemisahan kromatografis antara ekstrak bunga dengan ekstrak buah, batang dan rimpang kecombrang dengan kromatografi lapis tipis. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memperoleh formula pengawet alami ekstrak kecombrang yang dapat menekan pertumbuhan mikroba perusak pangan sekaligus menjadi antioksidan penghambat oksidasi pangan. Metode Penelitian Bahan Ekstrak batang, buah, bunga dan rimpang kecombrang, alumunium foil, kertas saring, gas N 2, dekstrin, gelatin, emulsifier Tween 80, NaCl, NaOH, akuades, asam tanat, reagen Folin Ciocalteu (Merck), NaHCO3 (Merck), asam linoleat (Sigma Chemical, Co.), buffer phosphat 0,2 M pH 7,

alpha tocopherol (komersial), methanol, HCl, amonium thiosianat (Merck), FeCl.4H 2O 0.02 M tetrahydrat (Merck), n-heksana (Brataco Chemica), etil asetat (Brataco Chemica), etanol 96% (Brataco Chemica), pelat kromatografi lapis tipis silika gel GF254, eluen etil asetat-asam formiatasam asetat glasial-air (100:11:11:26). Alat Timbangan analitik (AND), erlenmeyer 500 ml (Pyrex), shaker, gelas pengaduk, gelas ukur (100 ml, 500ml) (Pyrex), botol gelas, corong, kain saring, vakum evaporator, rotavapor, pH meter, labu takar (10 ml, 100 ml) (Pyrex), pipet volumetrik (1 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml), pipet mikro (Gilson), pipet tetes, neraca analitik, tabung reaksi (Pyrex), rak tabung reaksi, spektrofotometer (Shimadzu, Germany), sentrifuse, inkubator 37oC, kuvet, water bath shaker, lampu UV, pensil, tabung gelas untuk kromatografi lapis tipis. Metode Pengambilan Sampel Sampel diambil dari delapan sampel formula pengawet alami ekstrak kecombrang yang memiliki sifat antimikroba pada penelitian Istiqomah (2011) dengan komposisi formula seperti pada Tabel 3.1. Selanjutnya sampel-sampel tersebut diuji total fenolik dan uji aktivitas antioksidan. Identifikasi senyawa aktif yang berpotensi sebagai antioksidan dilakukan pada ekstrak batang, ekstrak buah, ekstrak bunga dan ekstrak rimpang kecombrang dengan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Tabel 3.1. Komposisi Formula Ekstrak Kecombrang Kode formula * F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 AB1C1D1E AB1C2D2E AB1C1D2E AB1C2D1E AB2C2D1E AB2C2D2E AB2C1D1E AB2C1D2E Komposisi formula bahan pengisi 15%, penstabil 1%, NaCl 2,5% , pH 4 bahan pengisi 15%, penstabil 3%, NaCl 5,0% , pH 4 bahan pengisi 15%, penstabil 1%, NaCl 5,0% , pH 4 bahan pengisi 15%, penstabil 3%, NaCl 2,5% , pH 4 bahan pengisi 30%, penstabil 3%, NaCl 2,5% , pH 4 bahan pengisi 30%, penstabil 3%, NaCl 5,0% , pH 4 bahan pengisi 30%, penstabil 1%, NaCl 2,5% , pH 4 bahan pengisi 30%, penstabil 1%, NaCl 2,5% , pH 4

Keterangan : * Formula diurut berdasarkan aktivitas antimikroba dari yang tertinggi ke terendah (Istiqomah, 2011). Pengukuran total fenolik metode Singleton dan Rossi (1965) dalam Othman et al. (2005). Persiapan kurva standar Sebanyak 10 mg asam tanat dilarutkan ke dalam etanol 95% menjadi 100 ml sebagai larutan stok, selanjutnya dilakukan pengenceran dengan seri pengenceran 0,02 mg/ml, 0,04 mg/ml, 0,06 mg/ml, 0,08 mg/ml dan 0,1 mg/ml. Sejumlah 1 ml dari tiap seri pengenceran diambil dan ditambah 1,5 ml Folin-Ciocalteu 10% dan didiamkan selama 5 menit pada suhu ruang. Kemudian ditambahkan 1,5 ml sodium bikarbonat (NaHCO3) 0,556 M dikocok dan dibiarkan pada ruang gelap selama 90 menit, selanjutnya ditambahkan masing-masing 2 ml aquades dan dikocok sehingga diperoleh seri pengenceran 3,33 g, 6,67 g, 10 g, 13,33 g dan 16,67 g, kemudian d iukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada 725 nm untuk dibuat kurva stand ar.

Persiapan sampel Sampel sebanyak 300 mg ditambahkan 4 ml etanol 70% kemudian dikocok dengan shaker dengan kecepatan 200 rpm selama 2 jam, selanjutnya campuran disentrifus selama 15 menit dengan kecepatan 1000 rpm. Supernatan yang diperoleh merupakan ekstrak untuk penetapan sampel. Analisis sampel Sebanyak 200 l supernatan ditambah 1,5 ml Folin-Ciocalteu 10% dan didiamkan selama 5 menit pada suhu ruang. Kemudian ditambah 1,5 ml sodium bikarbonat (NaHCO 3) 0,556 M dikocok dan dibiarkan pada ruang gelap selama 90 menit, selanjutnya diukur absorbansinya meng-gunakan spektrofotometer pada 725 nm. Uji aktivitas antioksidan metode Ferric Thiocyanate termodifikasi (Yurttas et al., 2000) Pembuatan asam linoleat 2,51% Asam linoleat sebanyak 2,51 ml dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml, kemudian ditambahkan ke dalamnya etanol 96% sehingga volumenya tepat 100ml. Persiapan kontrol Sebanyak 2,8 ml asam linoleat 2,51% ditambah 10 ml larutan buffer phosphat 0,2 M pH 7 (reaction mixture: 12,8 ml), kemudian ditambahkan ke dalamnya sebanyak 0,1 ml etanol 75%. Pembuatan larutan standar alpha-tocopherol 0,1% Larutan standar yang digunakan adalah alpha-tocopherol 0,1% yang dibuat dengan cara memasukkan 0,1 ml alpha-tocopherol (komersial) ke dalam labu takar 100ml, kemudian ditambahkan ke dalamnya metanol sehingga volumenya tepat 100 ml. Persiapan standar Sebanyak 0,1 ml larutan alpha-tocopherol 0,1% ditambah 2,8 ml asam linoleat dan 10 ml larutan buffer phosphat 0,2 M pH 7. Persiapan sampel Sebanyak 0,1 ml formula ekstrak kecombrang (setara dengan 200 mg formula) ditambah 2,8 ml asam linoleat dan 10 ml larutan buffer phosphat 0,2 M pH 7. Uji lanjut aktivitas antioksidan Semua larutan sampel (0,1 ml formula ekstrak kecombrang) dan larutan standar kecuali larutan kontrol ditempatkan ke dalam shaker water bath pada suhu 40 oC selama 24 jam untuk memacu reaksi oksidasi dari asam linoleat. Sejumlah 0,1 ml larutan kontrol, standar dan sampel, masingmasing ditambah dengan 9,7 ml etanol 75% (v/v), 0,1 ml ammonium thiosianat 30% (w/v) kemudian dihomogenisasi dengan vorteks selama 3 detik. Setelah itu, ditambah 0,1 ml FeCl2.4H2O 0,02 M dalam larutan HCl 3,5% (v/v) kemudian dihomogenisasi dengan vorteks selama 3 detik. Diukur absorbansinya pada spektrofotometer pada 500 nm dengan blanko etanol 75%. Persen oksidasi dihitung dengan mem-bandingkan nilai absorbansi sampel uji dengan nilai absorbansi kontrol dikalikan 100%. Persen oksidasi = A s x 100% A ctrl

Aktivitas antioksidan = 100% - persen oksidasi

Keterangan: Watch glass 24 jam, A ctrl : nilai absorbansi pada A s : nilai absorbansi pada 500 nm untuk sampel uji pada 500 nm untuk kontrol pada 24 jam

Kromatografi lapis tipis dan penetapan nilai Rf Persiapan fase diam berupa pelat kro-matografi lapis tipis silika gel GF254 yang dipotong ukuran panjang 10 x 10 cm dan dibuat garis dengan pensil seperti Gambar 3.1.

Garis pensil 1 cm dari tepi atas Garis pensil 1 cm dari tepi bawah

Gambar 3.1. Persiapan Fase Diam Silika Gel GF254. Dibuat eluen umum untuk pengujian flavonoid dan glikosida berupa campuran etil asetat - asam formiat - asam asetat glasial - air (100:11:11:26) (Brasseur, 1986). Selanjutnya melakukan aplikasi (penotolan) empat sampel (ekstrak batang, bunga, buah dan rimpang kecombrang) pada pelat kromatografi lapis tipis silika gel GF254 tepat pada garis batas bawah pensil seperti pada Gambar 3.2. Penotolan menggunakan pipa kaca kapiler dengan volume sampel yang ditotolkan antara 0,5 1 l. Bila sampel telah ditotolkan maka tahap selanjutnya adalah mengembangkan sampel dalam bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhi dengan uap eluen tadi. Tepi bagian bawah pelat tipis yang telah ditotoli sampel dicelupkan kedalam eluen kurang lebih 0,5 cm. Tinggi eluen dalam bejana harus dibawah pelat yang telah berisi totolan sampel. Bejana kromatografi ditutup rapat dan sedapat mungkin volume eluen sedikit mungkin tetapi harus mampu mengelusi pelat sampai ketinggian pelat yang telah ditentukan.

Watch glass Bejana kromatografi

Penotolan sampel

Eluen

Gambar 3.2. Pengembangan Sampel Dalam Bejana Kromatografi. Tahap berikutnya adalah pengukuran nilai Rf yaitu jarak yang ditempuh oleh senyawa dari titik asal dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut dari titik asal. Analisis Data Data hasil pengujian total fenolik dan aktivitas antioksidan diuji dengan Uji F (Fischer) dan dilanjutkan dengan Uji BNJ (Beda Nyata Jujur).

Hasil dan Pembahasan Total Fenolik Pengukuran total fenolik metode Singleton dan Rossi (1965) didasarkan pada reaksi oksidasireduksi. Reagen Folin-Ciocalteu yang terdiri atas asam fosfotungstat (H3PW12O40) dan asam molibdat (H3PMo12O40) akan tereduksi oleh senyawa polifenol menjadi malibdenum-tungsen (The Grape Seed Method Evaluation Committee, 2001). Reaksi ini membentuk komplek warna biru. Semakin tinggi kadar fenol, semakin banyak molekul kromagen (biru) yang terbentuk sehingga nilai absorbansinya pada spektrofotometer juga meningkat. Menurut Khadambi (2007), metode ini tidak membedakan jenis komponen fenolik. Tetapi semua jenis fenol dideteksi dengan sensitivitas yang bervariasi, sehingga semakin tinggi jumlah gugus hidroksil fenolik maka semakin besar konsentrasi komponen fenolik yang terdeteksi. Pengukuran total fenolik sampel formula ekstrak kecombrang pada penelitian ini, dimulai dengan pembuatan kurva standar asam tanat. Kemudian dibuat kurva standar antara absorbansi (A) dengan konsentrasi asam tanat dan diperoleh persamaan regresi y = 0,0559x 0,0030 dengan nilai koefisien determinasi R2 = 0,99. Pengukuran total fenolik formula ekstrak kecombrang dilakukan pada delapan formula ekstrak kecombrang yang lolos uji antimikroba pada penelitian Istiqomah (2011). Berdasarkan persamaan kurva standar asam tanat y = 0,0559x 0,0030 dan nilai absorbansi dari masing-masing formula ekstrak kecombrang, diperoleh kandungan total fenolik formula ekstrak kecombrang seperti pada Tabel 4.1. Tabel 4.1. Kandungan Total Fenolik Formula Ekstrak Kecombrang Formula F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 Keterangan :
F1 (AB1C1D1E), F2 (AB1C2D2E), F3 (AB1C1D2E), F4 (AB1C2D1E), F5 (AB2C2D1E), F6 (AB2C2D2E), F7 (AB2C1D1E), F8 (AB2C1D2E).

Total Fenolik dalam 100 g formula (mg/100 g) x1 x2 rerata x 324,45 279,72 267,20 260,04 254,08 217,70 207,56 175,36 322,06 282,11 266,00 256,46 258,85 221,28 200,41 172,97 323,25 280,91 266,60 258,25 256,46 219,49 203,98 174,17

Data tersebut selanjutnya dianalisis dengan uji F dan diperoleh hasil perlakuan formula ekstrak kecombrang berpengaruh sangat nyata terhadap kandungan total fenolik formula ekstrak kecombrang. Oleh karena itu, dilanjutkan uji Beda Nyata Jujur (5%) untuk mengetahui tingkat perbedaan antar masing-masing formula ekstrak kecombrang. Hasil uji BNJ 5% me-nunjukkan adanya perbedaan yang nyata pada semua formula ekstrak kecombrang kecuali antara formula F4 (AB1C2D1E) dan F5 (AB2C2D1E) yang tidak berbeda nyata. Berikut Gambar 4.1. yang menunjukkan perbedaan kandungan total fenolik antar masing-masing formula berdasarkan uji BNJ 5 % :

Kandungan Total Fenolik (mg/100g)

350.00 300.00 250.00 200.00 150.00 100.00 50.00 0.00

a b c d d e f g

F1

F2

F3

F4

F5

F6

F7

F8

Jenis Formula
Gambar 4.1. Kandungan Total Fenolik (mg/100g) Formula Ekstrak Kecombrang. Keterangan : F1 (AB1C1D1E), F2 (AB1C2D2E), F3 (AB1C1D2E), F4 (AB1C2D1E), F5 (AB2C2D1E), F6 (AB2C2D2E), F7 (AB2C1D1E), F8 (AB2C1D2E) Tingginya kandungan total fenolik yang terdeteksi pada formula tersebut diduga berasal dari senyawa-senyawa fenolik pada ekstrak batang, bunga, rimpang dan buah kecombrang yang merupakan komponen utama dari formula. Hal ini seperti dinyatakan oleh Tampubolon et al. (1983), bahwa komponen kimia yang terdapat pada kecombrang merupakan senyawa-senyawa fenolik berupa alkaloid, flavonoid, polifenol, steroid, saponin, dan minyak atsiri. Aktivitas Antioksidan Pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode feritiosianat didasarkan pada terbentuknya peroksida sebagai hasil oksidasi asam linoleat. Peroksida ini akan mengoksidasi ion fero menjadi feri (Gambar 4.2.) membentuk kompleks feritiosianat karena adanya ion tiosianat, yang dapat diukur absorbansinya pada panjang gelombang 500 nm. Semakin tinggi absorbansi peroksida menunjukkan semakin tingginya jumlah peroksida, yang berarti oksidasi asam linoleat semakin tinggi (Lestario et al., 2005). ROOH + Fe2+ ROH + HO + Fe3+ Gambar 4.2. Reaksi Oksidasi Ion Fero Menjadi Feri. Menurut Kikuzaki dan Nakatani (1993), nilai absorbansi peroksida berbanding terbalik terhadap aktivitas antioksidannya yaitu semakin tinggi nilai absorbansi berarti semakin rendah aktivitas antioksidannya. Hal ini dapat dirumuskan dengan % aktivitas antioksidan = 100 - % oksidasi. Hasil pengukuran absorbansi formulasi ekstrak kecombrang, diperoleh formula ekstrak kecombrang sebagai berikut : aktivitas antioksidan

Tabel 4.2. Aktivitas Antioksidan Formula Ekstrak Kecombrang Komposisi Formula AB1C1D1E AB1C2D2E AB1C1D2E AB1C2D1E AB2C2D1E AB2C2D2E AB2C1D1E AB2C1D2E Aktivitas antioksidan (%) 58,49 33,96 28,30 26,42 20,75 11,32 11,32 9,43

Formula F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 Keterangan :

1). Volume konsentrat kecombrang sama untuk semua formula, 2). % total volume konsentrat kecombrang (b/v) Berdasarkan analisis sidik ragam, perlakuan formula ekstrak kecombrang berpengaruh sangat nyata terhadap aktivitas antioksidannya. Selanjutnya dilakukan uji BNJ 5% untuk mengetahui perbedaan antar masing-masing formula. Hasil pengukuran aktivitas antioksidan formula ekstrak kecombrang, formula F1 memiliki aktivitas antioksidan tertinggi yaitu 58,49 %. Aktivitas antioksidan formula makin menurun berturut-turut pada F2, F3, F4, F5, F6, F7 dan F8 seiring dengan makin menurunnya kandungan total fenolik pada formula tersebut (Gambar 4.3.).

70.00 Aktivitas antioksidan (%) 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00 F1 F2 F3 F4 F5 F6 Formula Ekstrak Kecombrang F7 F8 b c c d e e e a

Gambar 4.3. Aktivitas Antioksidan (%) Formula Ekstrak Kecombrang.

Aktivitas Antioksidan (%)

70.000 60.000 50.000 40.000 30.000 20.000 10.000 0.000

y = 5.6696x R = 0.8422

258.252

174.165

203.983

219.489

256.463

266.601

280.913

Total Fenol (mg/100g)

Gambar 4.4. Kurva Hubungan Antara Aktivitas Antioksidan Dengan Total Fenolik Formula Ekstrak Kecombrang Hubungan antara aktivitas antioksidan dengan total fenolik formula ekstrak kecombrang dapat diketahui dengan menggunakan persamaan regresi antara total fenolik dan aktivitas antioksidan formula ekstrak kecombrang, sehingga diperoleh persamaan y = 5,6696x dan nilai korelasi r = 0,92. Hal ini menunjukkan bahwa 92% nilai total fenolik berpengaruh terhadap aktivitas antioksidannya (Gambar 4.4.) Estiasih dan Kurniawan (2006) menyatakan bahwa aktivitas antioksidan berkaitan dengan nilai total fenolik dimana semakin tinggi nilai total fenolik maka aktivitas antioksidan semakin besar. Penghambatan reaksi radikal bebas oleh antioksidan dapat dijelaskan dengan mekanisme penghambatan pada tahapan inisiasi maupun propagasi. Menurut Gordon (1990), antioksidan fenol dapat menghentikan atau menghambat tahapan inisiasi dengan bereaksi dengan radikal asam lemak atau menghambat tahapan propagasi dengan bereaksi radikal peroksi atau radikal alkoksi dengan reaksi sebagai berikut : Inisiasi : AH + R* A* + RH Propagasi : AH + ROO* A* + ROOH AH + RO* A* +ROH Gambar 4.5. Tahapan Reaksi Inisiasi Dan Propagasi. Radikal bebas antioksidan kemudian akan menginterferensi reaksi tahapan propagasi dengan membentuk komponen antioksidan peroksida sebagai berikut : A* + ROO ROO (non radikal) A* + ROO ROA (non radikal) Gambar 4.6. Interferensi Reaksi Tahapan Propagasi. Kromatografi Lapis Tipis Uji kromatografi lapis tipis ekstrak buah, rimpang, batang dan bunga kecombrang dengan eluen etil asetat-asam formiat-asam asetat glasial-air (100:11:11:26) diperoleh pola pemisahan sebagai berikut :

323.255

Gambar 4.7. Pola Pemisahan Kromatografi Lapis Tipis Ekstrak Buah (bu), Rimpang (ri), Batang (ba) dan Bunga (bg) Dengan Eluen Etil Asetat - Asam Formiat - Asam Asetat Glasial Air (100:11:11:26). Berdasarkan pola kromatografis (Gambar 4.7) dan nilai Rf (Tabel 4.3.), banyaknya noda yang terlihat menunjukkan banyaknya komponen senyawa yang terdapat pada ekstrak kecombrang tersebut. Pada ekstrak batang dan bunga kecombrang terdapat masing-masing 3 komponen senyawa, sedangkan pada ekstrak buah kecombrang terdapat 2 komponen senyawa dan pada ekstrak rimpang kecombrang hanya terdapat 1 komponen senyawa. Banyaknya noda dan nilai Rf yang terbentuk dipengaruhi oleh eluen yang digunakan yaitu etil asetat-asam formiat-asam asetat glasial-air (100:11:11:26). Menurut Brasseur (1986), eluen etil asetat-asam formiat-asam asetat glasial-air (100:11:11:26) biasa digunakan untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa flavonoid dan glikosida. Kesamaan nilai Rf pada masing-masing ekstrak kecombrang menunjukkan kesamaan senyawa yang terkandung di dalamnya. Pada ekstrak rimpang, batang dan bunga kecombrang terdapat kesamaan 1 komponen senyawa dengan nilai Rf 0,15. Pada ekstrak batang dan bunga kecombrang terdapat kesamaan 3 komponen senyawa dengan nilai Rf 0,15, 0,54 dan 0,94. Pada ekstrak buah, batang dan bunga kecombrang terdapat kesamaan 1 komponen senyawa dengan nilai Rf 0,94. Oleh karena itu, campuran ekstrak buah, rimpang, batang dan bunga kecombrang pada formula ekstrak kecombrang yang diteliti, terdapat 4 komponen senyawa flavonoid dan glikosida. Tabel 4.3. Nilai Rf Hasil Kromatografi Lapis Tipis Ekstrak Buah, Rimpang, Batang dan Bunga Kecombrang Dengan Eluen Etil Asetat-Asam Formiat-Asam Asetat Glasial-Air (100 :11:11: 26) Rf Fraksi Buah Rimpang Batang Bunga Jumlah Noda 2 1 3 3 1 0,09 2 0,15 0,15 0,15 3 4 0,94 0,94 0,94

0,54 0,54

Simpulan dan Saran Simpulan 1. Salah satu formula ekstrak kecombrang yang diuji yaitu F1 dengan komposisi campuran ekstrak buah : rimpang : batang : bunga (1 : 1 : 1 : 1), konsentrasi bahan pengisi 15%, penstabil 1%, NaCl 2,5% dan pH 4 memiliki aktivitas antioksidan sebesar 58,49 %. Aktivitas antioksidan formula ekstrak kecombrang berbanding lurus dengan kandungan total fenolik dengan koefisian determinasi R2 = 0,84. Pola pemisahan kromatografis pada ekstrak rimpang, batang dan bunga kecombrang memiliki 1 kesamaan komponen senyawa dengan nilai Rf 0,15. Pada ekstrak batang dan bunga terdapat 3 kesamaan komponen senyawa dengan nilai Rf 0,15, 0,54 dan 0,94 dan pada ekstrak buah, batang dan bunga terdapat 1 kesamaan komponen senyawa dengan nilai Rf 0,94.

2. 3.

Saran Pengkajian lebih mendalam terhadap batang dan bunga kecombrang sebagai sumber antioksidan untuk formula pengawet alami. Daftar Pustaka Afrianti, L. H. 2008. Teknologi Pengawetan Pangan. Alfabeta, Bandung. Antoro, E. D. 1995. Skrining Fitokimia Rimpang Nicolaia speciosa Horan Secara Mikrokimiawi Kromatografi Lapis Tipis dan Spektrofotmetri UV. FF-UGM. Brasseur, T., dan Angenot, L. 1986. Flavonol Glycosides from Leaves of Strychnos variabilis. Phytochemistry 52(2): 563-564. Estiasih, T dan D. A. Kurniawan. 2006. Aktivitas Antioksidan Ekstrak Umbi Akar Ginseng Jawa (Talinum triangulare Wild.). Jurnal Teknologi dan Industri Pangan 17(3): 166 175. Fardiaz, S. 1996. Prinsip HACCP dalam Industri Pangan . Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi. Fakultas Teknologi Pertanian. IPB, Bogor. Gordon, M. 1990. The Mechanism of Antioxidant Action in Vitro. Di dalam: Hudson, B. J. F. (Ed.) Food Antioxidants. Elsevier Applied Science. New York. Hal: 1-18. Haraguchi, H. et al. 1998. Antifungal Activity From A. galanga and The Competition for Incorporation of Unsaturated Fatty Acid in Cell Growth . Plant Med. 62(4):308. Hernani dan M. Raharjo. 2005. Tanaman Berkhasiat Antioksidan. Penerbit Swadaya, Jakarta. Houghton, P. J. dan Raman. 1998. Laboratory Handbook for the Fractionation of Natural Extract. Chapman & Hall, London. Istiqomah, A. N. 2011. Formulasi Pengawet Alami dari Ekstrak Kecombrang (Nicolaia Speciosa Horan) Serta Penetapan Aktivitas Antibakteri dan Toksisitas Formula . Skripsi. Fakultas Pertanian, Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto. (Tidak dipublikasikan). Khadambi. 2007. Extraction of Phenolic Compounds and Quantification of The Total Phenol and Condensed Tannin Content of Bran Fraction of Condensed Tannin and Condensed Tannin Free Sorghum Varieties. Kikuzaki, H. and K. Nakatani. 1993. Antioxidant Effect of Some Ginger Constituents. Journal Food Science 58: 1407-1410.

Kochhar, S. P and J. B. Rossell. 1990. Detection, Estimation and Evaluation of Antioxidants in Food Systems. Di dalam: Hudson, B.J.F (Ed). Food Antioxidants. Elsevier Applied Science. New York. Hal: 19-64. Koswara, S. 2007. Teknologi Enkapsulasi Flavor Rempah-rempah. Lestario, L. N., S. Rahardjo dan Tranggano. 2005. Sifat Antioksidatif Ekstrak Buah Duwet (Syzygium cumini). Agritech. XXV(1): 24-31. . 2005. Perubahan Aktivitas Antioksidan, Kadar Antosianin dan Polifenol Pada Beberapa Tingkat Kemasakan Buah Duwet (Syzygium cumini). Agritech. XXV(4): 169-172. Naufalin, R., Herastuti, S. R., Tri Yanto dan Erminawati. 2009. Formulasi dan Produksi Pengawet Alami dari Kecombrang (Nicolaia speciosa Horan). Laporan Penelitian Hibah Kompetensi. Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi. Naufalin, R., B. S. L. Jenie, dan Herastuti, S. R. 2005. Kajian Sifat Antimikroba Bunga Kecombrang (Nicolaia speciosa Horan) Terhadap Berbagai Mikrobia Patogen dan Perusak Pangan. Jurnal Teknologi dan Industri Pangan XII(2): 119-125. Naufalin, R. 2005. Kajian Sifat Antimikroba Ekstrak Bunga Kecombrang (Nicolaia speciosa Horan) Terhadap Berbagai Mikroba Patogen dan Perusak Pangan . Disertasi. Sekolah Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor, Bogor. Othman, A., A. Ismail, N. A. Ghani and I. Adenan. 2005. Antioxidant Capacity and Phenolic Content of Cocoa Beans. Journal of Food Chemistry 100: 1523-1530. Prangdimurti, E., D. Muchtadi, M. Astawan dan F. R. Zakaria. 2006. Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Suji (Pleomele angustifolia). N. E. Brown. Jurnal Teknologi dan Industri Pangan XVII(2): 79 85. Sarastani, D., S. T. Soekarto, T. R. Muchtadi, D. Fardiaz dan A. Supriyantono. 2002. Aktivitas Antioksidan Ekstrak dan Fraksi Ekstrak Biji Atung. Jurnal Teknologi dan Industri Pangan. XIII(2): 149-156. Singleton, V. L., dan J. A. Rossi. 1965. Colorimetry of Total Phenolics with Phosphomolybdicphosphotungstic Acid Reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16: 144158. Tampubolon, O. T., S. Suhatsyah dan S. Sastrapradja. 1983. Penelitian Pendahuluan Kandungan Kimia Kecombrang (Nicolaia speciosa Horan) dalam Risalah Simposium Penelitian Tumbuhan Obat III. Fakultas Farmasi UGM. DIY. Hal: 451-459. Yurttas, H. C., H. W. Schafer dan J. J. Warthesen. 2000. Antioxidant Activity of Nontocopherol Hazelnut (Corylus spp.) Phenolics. Journal of Food Science. 65(2): 276-280.