Fermentacin in vitro de una Dieta y un Forraje con Altas Concentraciones de Selenio Alberto Martnez Jimnez

I.

INTRODUCCIN

El Selenio (Se) es un elemento esencial ara los rumiantes ya !ue su de"iciencia ro#oca la en"ermedad del m$sculo blanco en corderos y cabritos% atribuida a una baja acti#idad de la enzima &lutation 'ero(idasa ()amrez*+ribiesca et al,% -../), 0as bacterias ruminales in"luyen sobre la biodis onibilidad del Se consumido mediante asimilacin y re#encin de into(icacin (Stolz et al.% -..-), 'rimero% las bacterias Se inor12nico en "orma de selenometionina% la cual es de mayor absorcin intestinal (3oeni1 et al,% /445), Se1undo% las bacterias tambin reducen el Se inor12nico consumido a com uestos de menor absorcin intestinal% como Se elemental y selenuro (0an1lands et al,% /467), Esta in"luencia de las bacterias ruminales sobre la biodis onibilidad del Se tambin re ercute en la "ermentacin ruminal y la ro orcin de los roductos de la misma, En estudios in vitro se 8a obser#ado mayor roduccin de 2cidos 1rasos #ol2tiles al adicionar m1 Se 91*/ MS a artir de selenometionina en los medios de culti#o (Serra et al,% /44:b),

'or otro lado% la concentracin m2(ima tolerable de Se en dietas ara o#inos es de ; m1 91*/ MS (<)C% -..5)= sin embar1o% o#inos com lementados 8asta con :. m1 Se 91*/ MS en la dieta or m2s de un a>o% no resentaron si1nos clnicos e 8isto atol1icos de to(icidad% ero s rdida de eso su1iriendo menor de1radacin y utilizacin de los nutrientes, 'or lo !ue altas concentraciones de Se ueden a"ectar ne1ati#amente la de1radacin microbiana del alimento y la utilizacin de los nutrientes,

'or tanto% el resente estudio tiene como objeti#o determinar los cambios en #ariables de la "ermentacin anaerobia utilizando l!uido ruminal como inculo% mediante una rueba in vitro de roduccin de 1as usando al"al"a y una dieta a base de 1rano como sustratos% con altas concentraciones de Se,
?esis
/

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II. II.1

REVISIN DE LITERATURA

Funcin del Se en mamfer !

El Se "ue descubierto or el !umico sueco Jons Jacob +erzelius en /6/5 y en /4;5 reconocido como un elemento esencial ara muc8as "ormas de #ida% incluyendo al 8ombre, El Selenito y selenato de al1unos alimentos y a1ua son utilizados or las clulas de mam"eros como "uentes de Se !ue se reduce a selenuro or la 1lutatin*1lutarredo(ina y tiorredo(ina, Se 8an identi"icado seleno rotenas tales como 1lutatin ero(idasas (&'@)% tiorredo(ina reductasas (?r()) y

desyodinasas (DA) !ue est2n im licados en las reacciones redo(, 0as seleno rotenas tienen "unciones biol1icas como o(ido*reduccin% se>alizacin redo( y antio(idantes artici antes en el metabolismo de las 8ormonas tiroideas y la res uesta inmune (0u y Bolm1ren% -..6),

Cuando se descubri en /45. !ue el Se es un constituyente de la enzima &'@ se consideraba !ue la $nica "uncin del elemento era como un antio(idante, Ballaz1os osteriores 8an dejado claro !ue el Se% act$a a tra#s de la e( resin de una am lia 1ama de seleno roteinas% teniendo di#ersas "unciones en el or1anismo animal ()otruc9 et al,% /45C), ?odas las "unciones biol1icas atribuidas al Se est2n mediadas or seleno roteinas% el elemento se incor ora en la estructura rimaria de estas rotenas en "orma de selenocistena, Se 8an descubierto m2s de :.

amino2cidos di"erentes% los cuales son com onentes de di"erentes seleno roteinas identi"icadas en al1unos mam"eros (Art8ur y +ec9ett% /44:),

0as seleno roteinas de los mam"eros se ueden clasi"icar rinci almente en dos 1ru os de acuerdo con la ubicacin de la selenocistena, Dn 1ru o de seleno rotenas osee la

selenocistena en un sitio muy cercano a la terminal C de la rotena% tales como ?r() y

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seleno roteinas S% )% S% A y 3, El otro 1ru o (incluyendo &'@% DA% y seleno rotenas B% M% <% ?% E y F) tiene la selenocistena en la arte <*terminal (0u y Bolm1ren% -..6),

Actualmente% se conocen m2s de C. seleno rotenas con acti#idad cataltica (Abd El &8any y ?rtora*'rez% -./.), Se 8an identi"icado cuatro &'@, las cuales reducen er(ido de 8idr1eno y er(ido li dico, 0as DA son enzimas !ue artici an en el metabolismo de las 8ormonas tiroideas, 0as ?r() catalizan la roduccin de tiorredo(ina reducida a artir de tiorredo(ina o(idada% la cual es necesaria ara #arios sistemas de endientes de reacciones redo( ( or ejem lo% sntesis de ADN y re1ulacin redo( de "actores de transcri cin) y en la re1ulacin del crecimiento celular e in8ibicin de a o tosis, 0a seleno"os"ato sintetasa artici a en la sntesis de seleno"os"ato% donador de Se ara la sntesis de selenocistena (+e8ne y 3yria9o oulos% -../), Gtras rotenas con Se son la seleno rotena P !ue arece "uncionar como trans ortadora de Se (+ur9 et al,% -..C) y la W !ue osiblemente act$e como antio(idante en m$sculo cardiaco y es!ueltico (He8 et al,% /445),

Ti rred "ina reduc#a!a! (?r()), En clulas de mam"eros son miembros de la

iridina

nucletido*disul"uro o(idorreductasa de la "amilia ?r() y tres 8an sido identi"icadas en mam"erosI ?r()/ en el citosol yJo n$cleo% en la mitocondria ?r()- y tiorredo(ina reductasa de 1lutatin en los testculos% la $ltima tambin osee 1lutatin y acti#idad 1lutarredo(ina reductasa, ?r() es la $nica enzima ca az de reducir ?r( o(idada, 0a ?r( o"rece electrones a la ribonucletido reductasa% !ue es esencial ara la sntesis de AD< mediante la con#ersin de ribonucletidos a deso(irribonucletidos, ?ambin se sabe !ue ?r( reducida uede unirse e in8ibir AS3/ (a o tosis si1nal re1ulatin1 !uinasa /)% or lo tanto% ?r()s est2n in#olucrados en el

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control de la roli"eracin celular% la #iabilidad y la a o tosis mediante el control de la acti#idad de ?r( y estado redo( (0u y Bolm1ren% -..6),

La $lu#a#in %er "ida!a &'()* En los seres 8umanos se 8an re ortado cinco &'@ !ue contienen SeI la &'@ citoslica (&'@/)% la &'@ 1astrointestinal es ec"ica (&'@-)% la &'@ del lasma (&'@C)% el 8idro er(ido de "os"ol ido y &'@ del e itelio (&'@:)% !ue sta tambin im licado en la maduracin del es ermatozoide y "ertilidad masculina% ya !ue se 8a encontrado !ue es un im ortante com onente estructural de la c2 sula del es ermatozoide maduro como una enzima inacti#a (0u y Bolm1ren% -..6),

+ d #ir nina de!, dina!a! (DA), Se 8an identi"icado en di#ersos tejidos, 0a DA/ se encuentra rinci almente en el 81ado% ri>n y tiroides= la DA- en cerebro% ituitaria% tiroides% m$sculo es!ueltico y tejido adi oso= la DAC se encuentra en la corteza cerebral y la iel% y es e( resada a un ni#el muy alto en $tero y lacenta durante el embarazo, 0a DA/ y DA- catalizan la

deyodinacin de la tiro(ina (?:)% 8ormona tiroidea rinci al secretada or la 1l2ndula tiroides% y la con#ierten a la "orma acti#a ?ri*yodotironina (?C)= la DAC con#ierte ?: en ?C y tambin ?C en Di*yodotironina (?-), DA/ y DA- tambin uede con#ertir y re#ertir ?C en Di*yodotironina (0u y Bolm1ren% -..6),

0as seleno rotenas en bacterias &ram* ositi#as tambin se encuentran artici ando en

rocesos

tales como la de"ensa antio(idante% el ciclo redo( y la 8omeostasis redo(, 0a Formiato des8idro1enasa cataliza la o(idacin re#ersible de CG - a "ormiato y est2 im licado en el metabolismo ener1tico% la "ijacin de carbono% la 8omeostasis del B y las rotenas de de"ensa antio(idante en Clostridium ss . A menudo% contienen enzimas ara la de"ensa antio(idante% or
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ejem lo% la metionina sul"(ido reductasa (MS)) reduce y o(ida los residuos de metionina en las rotenas !ue sur1en or la accin no deseada de es ecies reacti#as del o(1eno (Stoc9 y )ot8er% -..4),

II.-

Deficiencia de Se en rumian#e!

0a de"iciencia de Se es un serio roblema a ni#el mundial y se 8a dia1nosticado en #arios ases de Amrica 0atina (McDoKell et al,% /445) y en ases de otros continentes (Finlandia% <ue#a Lelanda% C8ina% Estados Dnidos y Ja n= Benry y Ammerman% /44;), En M(ico% se 8an encontrado suelos% "orrajes y animales con de"iciencia de Se en los estados de Eeracruz% Bidal1o% Estado de M(ico% ?la(cala y 'uebla ()amrez*+riebiesca et al,% -..:),

0a artici acin de las seleno rotenas en di#ersos rocesos metablicos uede e( licar los trastornos clnicos relacionados con la de"iciencia de Se, En rumiantes j#enes la de"iciencia de Se causa de1eneracin de los m$sculos estriados conocida como en"ermedad del m$sculo blanco y es atribuida a una baja acti#idad de la GPX, En corderos y cabritos esta de1eneracin se considera la rinci al causa de muerte en los rimeros -. das de edad en 2reas del centro de M(ico con de"iciencia de Se ()amrez*+ribiesca et al,% -../), En becerros la de1eneracin tambin a"ecta m$sculo cardiaco% ocurriendo la muerte or insu"iciencia cardiaca (De Aluja y Adame% /455),

0a biodis onibilidad del Se ara las lantas est2 determinada or las caractersticas del suelo ( B% te(tura% contenido de materia or12nica y condiciones redo()% "orma !umica del elemento y la resencia de otros iones com etidores (Fordyce% -..5), 0a mayora de los suelos en re1iones

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tro icales son 2cidos% lo cual reduce la absorcin de Se or las lantas al "ormarse com lejos entre el 8ierro "rrico y el selenito (McDoKell et al,% /445),

0a de"iciencia de Se conduce a una rdida de acti#idad de las seleno rotenas% incluyendo ?r()% &'@ y DA, 0a im ortancia de las seleno rotenas es ec"icas en los tejidos es ec"icos uede determinar la rioridad de los ni#eles de A)<m y e( resin de rotenas% 'or ejem lo% bajo condiciones de de"iciencia de Se% las acti#idades disminuyen en la mayora de las seleno rotenas en 81ado% ri>n y ulmn% mientras las acti#idades de las seleno rotenas en cerebro se

mantienen a un ni#el similar durante la su lementacin de Se normal, Considerando !ue la de"iciencia de Se conduce a una r2 ida disminucin de A)<m y &'@/% los ni#eles de rotena en 81ado% &'@ "os"ol ido e 8idro er(ido A)<m ?r() se mantienen en ni#eles m2s altos (0u y Bolm1ren% -..6),

Dn ejem lo de 1ra#e de"iciencia de Se ro#oca en el ser 8umano la en"ermedad de 3es8an% una "orma otencialmente mortal de la miocardio ata !ue rimero "ue encontrado en el noreste de C8ina, 0a en"ermedad se roduce tras la de"iciencia de Se en combinacin con in"eccin or #irus Coxsackie +% e#it2ndose a tra#s de la su lementacin de Se (0u y Bolm1ren% -..6),

Dna cardiomio ata !ue se asemeja a la en"ermedad de 3es8an ocurre cuando &'@/ en ratones est2n in"ectados con una en"ermedad beni1na del #irus Coxsackie% lo !ue su1iere !ue &'@/ est2 estrec8amente asociada con la roteccin contra la in"eccin or el #irus,

Al menos tres seleno rotenas% ?r()/% ?r()- y &'(:% est2n im licados en la embrio1nesis ya !ue deleciones de los 1enes ara estas rotenas en ratones resultan en la muerte embrionaria,
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?odas las &'@/% DA/ y DA- en ratones crecen% se desarrollan y se re roducen normalmente en condiciones de laboratorio, Sin embar1o% &'@/ de ratones son m2s sensibles a ara!uat y B -Ginducida or el estrs o(idati#o, DA- de ratones 8an deteriorado la "uncin auditi#a y

termo1nesis as como de"ectos de la "uncin cerebral le#e y tem oral% retraso en el crecimiento, Estos estudios re#elan !ue las seleno rotenas jue1an un a el crtico en la de"ensa antio(idante% la "ertilidad% "uncin tiroidea% metabolismo de las 8ormonas% las res uestas inmunes y el desarrollo muscular (0u y Bolm1ren% -..6),

II..

/e#a0 li!m di$e!#i1 del Se en rumian#e!

0as bacterias ruminales incor oran Se inor12nico en su rotena rinci almente en "orma de selenometionina (Serra et al,% /44:a= 3im et al,% /445= 3oeni1 et al,% /445)% ero se 8a

encontrado selenocistena y seleno8omocisteina en culti#os de Selenomonas ruminantium y Butyrivibrio ibrisolvens (Budman y &lenn% /46:= Budman y &len% /46;), Dic8a incor oracin es mayor cuando las dietas son de"icientes en Se (Bidiro1lou et al,% /476), El Se incor orado en rotena bacteriana uede estar dis onible ara ser absorbido al lle1ar al intestino del1ado

(Bidiro1lou et al,% /476), Serra et al, (/445)% lo1raron incrementar la concentracin de Se en san1re (/;M)% corazn (-5M)% ri>ones (--M)% cerebro (//M)% ulmones y bazo (/.M) y m$sculo (4M) en ratones% res ecto a los testi1o% a artir de masa bacteriana del rumen enri!uecida con Se, 0a incor oracin de Se en bacterias es menor en dietas a base de "orraje y mayor en dietas a base de 1ranos (3oeni1 et al,% /445) lo cual uede deberse a la ca acidad de las di"erentes es ecies bacterianas redominantes en cada caso ara incor orar Se, Prevotella ruminicola% redominante en dietas a base de "orraje% no incor ora Se en selenoamino2cidos= mientras !ue S. ruminantium y B. ibrisolvens redominan en dietas a base de 1rano ueden incor orarlo (Budman y &lenn% /46:= Budman y &len% /46;),
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0as bacterias ruminales tambin reducen el Se inor12nico consumido a com uestos de menor biodis onibilidad ara el animal (0an1lands et al,% /467), Se 8a calculado !ue se utilizan dos moles de !" or mol de selenito reducido a Se elemental% y un mol de !" ara reducir Se elemental a selenuro (3im et al,% /445), 0a cantidad de Se reducido aumenta con el consumo de materia or12nica (0an1lands et al,% /467),

A arentemente% la incor oracin y reduccin de Se es di"erente de endiendo de la es ecie bacteriana resente en el rumen, Se 8a demostrado !ue S. ruminantium y B. ibrisolvens

incor oran Se en "orma de selenoamino2cidos% ero no as ara el caso de P. ruminicola= sin embar1o% las tres es ecies redujeron selenito a Se elemental (Budman y &lenn% /46:= Budman y &len% /46;), Se 8a ro uesto !ue las bacterias anaerobias utilizan Se inor12nico como ace tor "inal de electrones durante su res iracin% obtenindose Se elemental insoluble no t(ico (Se.) en "orma de artculas es"ricas #isibles al microsco io de barrido de electrones (Gremland et al,% /464= Siddi!ue et al,% -..5),

II.2

A0! rcin3 #ran!% r#e , e"crecin de Se

0a absorcin de Se se roduce rinci almente en el e(tremo osterior del intestino del1ado% la absorcin total de Se en animales e( erimentales y el 8umano es del 6.M% los com uestos or12nicos% tales como selenometionina% son absorbidos m2s e"icientemente !ue las "ormas inor12nicas como selenito% con la ca tacin en el tracto 1astrointestinal del 4.M de selenometionina en com aracin con a ro(imadamente 7.M de selenito (SteKart et al,% /465),

0a absorcin de Se

uede #erse a"ectada or numerosos "actores en la dieta% adem2s de la

"orma !umica del elemento% se mejora la absorcin or la resencia de rotena% #itamina E y

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#itamina A% sin embar1o se reduce con sul"uro% arsnico% mercurio y #itamina C (FairKeat8er* ?ait% /445),

El Se absorbido es trans ortado en la san1re desde el intestino 8asta el 81ado% all se reduce a selenuro antes de ser trans ortado en la san1re unido a N y O*1lobulinas a di#ersos r1anos y tejidos, El Se se incor ora entonces en seleno rotenas es ec"icas como selenocistena y no es ec"icas como selenometionina% los ni#eles m2s altos de Se se de ositan en los 1lbulos rojos% 81ado% bazo% corazn% u>as y dientes (esmalte), 0a e(crecin de Se es rinci almente a tra#s de la orina% con al1una rdida en sudor% adem2s en e!ue>as cantidades se ierden a tra#s de la bilis% 2ncreas y secreciones intestinales en las 8eces (0inder% /466),

II.4

C n!um de Se c m%lemen#ari , u#ili5acin de nu#rien#e! en rumian#e!

En estudios in vitro se 8a obser#ado mayor roduccin de 2cidos 1rasos #ol2tiles (A&E), 8asta :5M al adicionar m de Se a artir de selenometionina en los medios de culti#o (3im et al.%

/445)% concluyendo !ue la adicin de Se uede a"ectar la "ermentacin ruminal, Sin embar1o% en corderos consumiendo .,m de Se inor12nico (selenito y selenato) no 8ubo e"ecto sobre la

roduccin total de A&E ni la di1estibilidad de nutrientes% ero se obser# una correlacin ne1ati#a entre la concentracin de Se en l!uido ruminal y la roduccin de masa bacteriana en rumen (Serra et al,% /44:b), 'ero% en otro estudio la di1estibilidad total de la "ibra deter1ente neutra increment si1ni"icati#amente (C:M res ecto al testi1o) con .,/ mientras !ue con .,m Se en la dieta%

m de Se redujo 8asta en 57M (+ra#o y +a>uelos% /44:),

0os animales !ue reciben Se inor12nico tienden a tener una mayor concentracin de Se y &'@ en san1re% mientras !ue las o#ejas alimentadas con Se or12nico tienden a mostrar mayores ni#eles de
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Se en la biomasa ruminal ('ane# et al,% -./C), Adem2s% la administracin de altas dosis de Se# en o#inos mostraron disminucin de la concentracin de cobre en la san1re% lo !ue indica la osible interaccin ne1ati#a entre el cobre y el Se ('ane# et al,% -./C),

El aumento en la su lementacin con le#adura de Se en la dieta de #acas de /;. a C.. m1 91*/ de materia seca de la dieta% aumento la concentracin de A&E en el rumen y cambi el atrn de "ermentacin ruminal en mayor roduccin de ro ionato (Fan1 et al,% -..4), 0os resultados su1ieren !ue la le#adura de Se modula los microor1anismos o enzimas di1esti#as de una manera de endiente de la dosis de le#adura de Se !ue era de a ro(imadamente C.. m1 91*/ en las condiciones e( erimentales, ?ambin se su1iere !ue los su lementos de le#adura de Se en las dietas de #acas lec8eras en lactancia odran ser una "orma e"icaz de aumentar el contenido de Se en la lec8e% ara as desarrollar roductos l2cteos es eciales% como lec8e enri!uecida con Se,

II.6

Re7uerimien# , c n!um m8"im # lera0le de Se %ara 1in ! en crecimien#

De acuerdo con el <)C (-..5)% el re!uerimiento de Se ara o#inos en crecimiento de ende del ti o de dieta% adem2s de la 1anancia diaria de eso, El coe"iciente de absorcin de Se es mayor con dietas a base de 1ranos !ue con dietas a base de "orraje (.,7 #s, .,C), As% ara un cordero de C. 91 el consumo de Se recomendado es de .,m con una dieta a base de 1rano% y de .,: m

con una dieta a base de "orraje% y disminuye al incrementar el eso del animal, De acuerdo a las re1ulaciones de la Administracin de Alimentos y Dro1as (FDA% or sus si1las en in1les) el Se su lementario uede adicionarse en dietas de o#inos a artir de selenito o selenato de sodio y le#adura enri!uecida con Se% sin a ortar m2s de .,C m en las dietas inte1rales,

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0a concentracin m2(ima tolerable de Se establecida ara las dietas de rumiantes es de ;

m%

ero se recomienda usar concentraciones m2s bajas ara e#itar acumulacin e(cesi#a del mineral en tejidos comestibles (<)C% -..;= <)C% -..5), Sin embar1o% se 8an realizado estudios en o#inos ara determinar la concentracin m2(ima tolerable (Cristaldi et al,% -..;= Da#is et al,% -..7a= Da#is et al% -..7b= Da#is et al% -..6),

En o#inos en crecimiento de un a>o de edad com lementados 8asta con /.

m durante un a>o% a

artir de selenito de sodio% no mostraron si1nos clnicos de to(icidad ni lesiones tisulares= aun!ue animales en astoreo ueden acumular m2s Se or12nico or m2s tiem o or lo !ue /. m odra

re resentar un ries1o de to(icidad or eriodos de tiem o m2s rolon1ados (Cristaldi et al,% -..;), En o#ejas com lementadas 8asta con -. m de Se en la dieta durante 5- semanas no

resentaron si1nos clnicos de to(icidad ni da>os 8isto atol1icos% aun!ue al1unas o#ejas !ue consumieron /7 y -. m Se resentaron crecimiento anormal en ezu>as y cada de lana% or lo

!ue con estos consumos de Se los animales udieron estar ya su"riendo into(icacin (Da#is et al,% -..7a), Mientras% en otro estudio se obser# !ue el calostro y lec8e de o#ejas com lementadas 8asta con -. m en la dieta% durante la 1estacin y lactacin% increment de

manera si1ni"icati#a con"orme increment la concentracin de Se en la dieta% sin embar1o% este incremento (C%;:- y -%--6 P1 Se 0*/) no "ue lo su"icientemente ele#ado ara causar si1nos de to(icidad en los corderos (Da#is et al,% -..7b),

Adicionalmente% en o#inos de dos a>os com lementados 8asta con :.

m de Se en la dieta or

m2s de un a>o% se obser# una tendencia lineal ne1ati#a del eso #i#o con"orme incrementaba la concentracin de Se en la dieta% inde endientemente de la "uente (selenito de sodio o le#adura enri!uecida con Se (Da#is et al,% -..6), 0a mayora de los animales 1anaron eso% e(ce to los
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animales con Se or12nico a concentraciones de C. y :. del estudio, 0os #alores bajos de

m% !uienes erdieron eso a lo lar1o

eso #i#o obser#ados a medida !ue incrementaba la m de Se or12nico odran atribuirse a

concentracin de Se y la rdida de eso con C. y :.

e"ectos t(icos% sin embar1o% no se obser#aron si1nos clnicos o e#idencia 8isto atol1ica de to(icidad, 'or tanto% es robable !ue con las mayores concentraciones de Se en la dieta ocurran cambios a ni#el de oblacin microbiana en el rumen% ya !ue las bacterias tambin son

susce tibles a la to(icidad causada or Se (Sunde% /445)% a"ect2ndose la "ermentacin ruminal y la e"iciencia de utilizacin de nutrientes con e"ectos directos sobre el eso #i#o de los animales,

El aumento en la su lementacin con nano$selenio con dosis de a ro(imadamente C,. 1 91*/ de materia seca de la dieta en o#ejas increment la concentracin de A&E en rumen y cambi el atrn de "ermentacin ruminal de acetato a ro ionato (S8i et al,% -.//),

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/-

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III. III.1 O0;e#i1 $eneral

O9:ETIVOS

Determinar los cambios en #ariables de la "ermentacin anaerobia utilizando l!uido ruminal como inculo% mediante una rueba in vitro de roduccin de 1as usando al"al"a y una dieta a base de 1rano como sustratos% con altas concentraciones de Se,

III.- O0;e#i1 ! e!%ecfic ! E#aluar di"erentes concentraciones de Se (:% ;% 6% /-% -.% :. y 7. m1 Se 91*/ %S) en al"al"a y una dieta a base de 1rano% a tra#s de una tcnica de di1estibilidad in vitro or roduccin de 1as, Determinar los osibles cambios en la acti#idad "ermentati#a de las bacterias ruminales% mediante la medicin de la roduccin acumulada de 1as% di1estibilidad in vitro de la materia seca y B a las 5- 8oras de incubacin% or e"ecto de la adicin de altas concentraciones de Se,

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IV.

:USTIFICACIN

El selenito de sodio es la "uente de Se inor12nico m2s utilizada en la alimentacin de rumiantes, Aun!ue la FDA 8ace la recomendacin de no e(ceder de .,C establece ; m Se en dietas inte1rales% el <)C

m como ni#el m2(imo tolerable de Se ara la dieta en o#inos, 'or otro lado% en la m de Se no se obser#an si1nos de to(icidad en o#inos%

literatura 8ay e#idencia de !ue con :. indicando !ue

robablemente el ni#el m2(imo tolerable sea su erior al establecido, En m se 8a obser#ado una disminucin del eso #i#o en mac8os de

concentraciones de C. o m2s

dos a>os de edad, Este e"ecto ne1ati#o en el eso #i#o odra estar asociado a cambios en la acti#idad "ermentati#a de las bacterias ruminales debido a !ue son susce tibles a into(icarse con concentraciones altas de Se, 'or tanto% es necesario determinar la concentracin de Se a la cual la "ermentacin ruminal se #e a"ectada,

V.

<I(TESIS

Concentraciones mayores a ; m1 Se 31*/ MS adicionadas a dietas ara o#inos en eta as de crecimiento a"ectan la "ermentacin in vitro de las bacterias ruminales% re"lej2ndose en la roduccin de 1as total% B y di1estibilidad de la materia seca,

?esis
/:

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VI. VI.1 L cali5acin

/ATERIAL + /=TODOS

Este trabajo de in#esti1acin se realizo en el 0aboratorio de <utricin Animal del Qrea Acadmica de Medicina Eeterinaria y Lootecnia% en el Anstituto de Ciencias A1ro ecuarias de la Dni#ersidad Autnoma del Estado de Bidal1o,

VI.- Di!e> e"%erimen#al Se realizaron dos e( erimentos !ue consistieron en una rueba de di1estibilidad in vitro cada uno% utilizando una tcnica de roduccin de 1as or des lazamiento de a1ua (Filliams% -...),

Cuadr 1. Tra#amien# ! e"%erimen#ale! en funcin de la c ncen#racin de !eleni a %ar#ir de !eleni# de ! di en la die#a. Tra#amien# / C : ; ?esti1o E"%erimen# 1 E"%erimen# */ . m1 Se 91 %S o tratamiento ?esti1o . m1 Se 91 %S o tratamiento ?esti1o
*/

ne1ati#o ne1ati#o .,C m1 Se 91*/ %S o tratamiento ?esti1o ; m1 Se 91*/ %S o tratamiento ?esti1o ositi#o : m1 Se 91*/ %S 6 m1 Se 91*/ %S /- m1 Se 91*/ %S ne1ati#oI sin selenio com lementario= ?esti1o ositi#o -. m1 Se 91*/ %S :. m1 Se 91*/ %S 7. m1 Se 91*/ %S ositi#oI selenio com lementario a la

concentracin recomendada or FED<A (.,C m1 Se 91*/ MS) o la m2(ima tolerable ara o#inos (<)C% -..5= ; m1 Se 91*/ %S), El dise>o e( erimental ero cada e( erimento "ue un Dise>o en +lo!ues Com letamente al Azar% utilizando como criterio de blo!ueo el sustratoI 8eno de al"al"a y una dieta a base de 1rano, Cada

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/;

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tratamiento recibi una concentracin di"erente de Se en los sustratos (Cuadro /)% la mayora or arriba de la concentracin m2(ima tolerable establecida ara rumiantes (<)C% -..;),

'ara el e( erimento / se utilizaron cinco re eticiones or tratamiento en cada blo!ue y nue#e blancos= mientras% ara el e( erimento - se utilizaron cuatro re eticiones or tratamiento en cada blo!ue y doce blancos, 0as unidades e( erimentales "ueron #iales de #idrio de /-. m0 los cuales se identi"icaron numricamente (Fi1ura /) y se asi1naron aleatoriamente a los tratamientos e( erimentales,

Fi$ura 1. Eial de #idrio de /-. m0 con boca de -. mm utilizado ara la incubacin de los sustratos or la tcnica de roduccin de 1as,

VI.. (rue0a de Di$e!#i0ilidad in vitro &.'.( Pre)araci*n del in*culo

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/7

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Dn da re#io al inicio de las ruebas% se re ar una solucin amorti1uadora de B% dos soluciones minerales% una solucin reductora y una solucin de rezasurina (#er Ane(o/), El inculo se re ar mezclando dic8as soluciones en un matraz de bola de "ondo lano de 7 litros de ca acidad en una arrilla de a1itacin% re1ulando la tem eratura a C4 RC (Cuadro -),

Cuadr -, C m% !icin del incul u#ili5ad %ara la incu0acin in vitro de l ! !u!#ra# ! % r la #?cnica de %r duccin de $a!. V lumen %ara 4@ mue!#ra! C m% nen#e Solucin amorti1uadora% m0 Solucin macro*mineral% m0 Solucin micro*mineral% m0 )esazurina% m0 A1ua destilada% m0 0!uido ruminal% m0 Solucin reductora% m0 ?otal% m0 &mL* CC-,67 CC-,67 .,/5 /,5/ 77;,5C 777,75 77,75 -%.77,75

Adicionalmente% se utiliz l!uido ruminal "resco e(trado de tres cabras adultas de la raza Al ina% a tra#s de c2nula ruminal% alimentadas con :.. 1 de un concentrado a base de 1rano de sor1o y 1rano seco de destilera or animal or da y 8eno de al"al"a a libre acceso, El l!uido ruminal se obtu#o a las tres 8oras ost randial utilizando una bomba de #aco (Marca Felisa)% de osit2ndolo en un termo a una tem eratura de C4 RC en el interior, En el laboratorio% el l!uido ruminal se "iltr a tra#s de cuatro ca as de manta de cielo ara eliminar las artculas de alimento, 'osteriormente% se mezcl la cantidad indicada con el resto de las soluciones bajo "lujo constante de CG- y manteniendo la tem eratura constante a C4 RC (Fi1ura -),

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/5

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Fi$ura -. 're aracin del inculo ara la incubacin de los sustratos or la tcnica de roduccin de 1as,

&.'.+ ,noculaci*n e incubaci*n Se a1re1 un #olumen de :. m0 del inoculo a cada uno de los #iales% los cuales contaban con una cantidad de .,; 1 de los sustratos (molidos a / mm de tama>o de artcula) y .,; m0 de una solucin de selenito de sodio re arada en "uncin de los tratamientos (Cuadro C),

'osteriormente% se a1re1 CG- or /. s y se coloc un ta n de 8ule slido con un aro de

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/6

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aluminio ara sellar, Con"orme se realizo la inoculacin% se a1itaron sua#emente ara mezclar el inoculo con el sustrato, Finalmente% la incubacin se realiz a C4 RC or 5- 8oras en una estu"a de culti#o celular (Marca ?8ermo Electron Cor oration),

Cuadr

.. C ncen#racin de !eleni

en la! ! luci ne! %re%arada! en funcin de l !

#ra#amien# ! e"%erimen#ale!, Tra#amien# / C : ; E"%erimen# 1 A1ua destilada .,C m1 Se 0*/ : m1 Se 0*/ 6 m1 Se 0*/ /- m1 Se 0*/ E"%erimen# A1ua destilada ; m1 Se 0*/ -. m1 Se 0*/ :. m1 Se 0*/ 7. m1 Se 0*/

&.'.' -e.istro de la )roducci*n de .as 0a roduccin de 1as se re1istr a las C% 6% -:% :6 y 5- 8oras en el rimer e( erimento% y a las ;% /.% -:% :6 y 5- 8oras en el se1undo e( erimento, El #olumen de 1as se re1istr mediante un sistema de des lazamiento de a1ua elaborado con una bureta de /.. m0 conectada en la arte in"erior a un embudo de cuello lar1o mediante man1uera de l2te(% sujetados ambos en un so orte uni#ersal= en su arte su erior de la bureta se coloc una sonda ara a licacin de suero ro#ista de una a1uja del <o, /5, Dna #ez ajustado el ni#el de a1ua a cero en la bureta% la a1uja era insertada en los #iales incubados a tra#s del ta n de 8ule% con lo cual se ermite la salida del 1as contenido en el #ial y% or tanto% el des lazamiento del a1ua contenida en la bureta (Fi1ura C),

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/4

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Fi$ura .. Sistema de medicin de 1as des lazamiento de a1ua,

or

&.'./ 0btenci*n de muestras y residuo no de.radado A las 5- 8oras de incubacin y osterior al $ltimo re1istro del #olumen de 1as% se colocaron los #iales de incubacin en re"ri1eracin a : RC or C. minutos ara detener la acti#idad microbiana, 'osteriormente% se retir el aro de aluminio y el ta n de 8ule% y se trans"iri el contenido de cada #ial a tubos Falcon de ;. m0 ( re#iamente esados en balanza analtica) y se centri"u1aron a ;%... r m or /. min a : RC (centri"u1a re"ri1erada Marca Bermle), 'osteriormente% se midi el B del sobrenadante con un otencimetro de mesa (Marca Banna), Finalmente% el sobrenadante se elimin or decantacin,

?esis
-.

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'or otro lado% se enjua1 con a1ua destilada cada #ial de incubacin ara recu erar la totalidad del material residual% trans"irindose a los tubos Falcon ara re etir el roceso de centri"u1acin, Se elimin el sobrenadante or decantacin y el resto de la 8umedad se e#a or en 8orno de secado (Marca ?erlab) a 7. RC or 5- 8oras, Se re1istr el eso del tubo con la materia seca residual en balanza analtica% ara "inalmente calcular el eso de la materia seca residual restando el eso del tubo,

VI.2 Varia0le! de re!%ue!#a 0as #ariables de res uesta "ueronI a) Eolumen acumulado de 1as or 1ramo de materia seca incubada 'rimero% se corri1i el #olumen de 1as roducido a cada tiem o de incubacin de cada muestra rest2ndoles el #olumen de 1as roducido en los "rascos blancos% mediante la si1uiente "rmulaI
1C = 1% 1B

DondeI EC S Eolumen de 1as corre1ido a cada tiem o de incubacin EM S Eolumen de 1as de cada muestra a cada tiem o de incubacin E+ S 'romedio del #olumen de 1as de los blancos a cada tiem o de incubacin

'osteriormente%

ara obtener el #olumen acumulado de 1as

roducido

or 1ramo de MS

incubado% se sum el #olumen de 1as roducido en cada tiem o de incubacin con el #olumen de 1as roducido en el tiem o de incubacin re#io y di#idiendo el resultado entre el eso seco de la muestra inicial,
1A = 1C t + 1C t / PS%
?esis
-/

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DondeI 1A S Eolumen de 1as acumulado en cada tiem o de incubacin

1C t = Eolumen de 1as corre1ido a cada tiem o de incubacin
1C t / = Eolumen de 1as corre1ido al tiem o de incubacin re#io

b) Di1estibilidad de la materia seca Esta #ariable se obtu#o restando el eso de la materia seca inicial menos el eso de la materia seca del residuo% di#idiendo el resultado entre el eso de la materia seca inicial y multi licando or /..I
%S, %S- D%S = T /.. %S,

DondeI DMS S Di1estibilidad de la Materia Seca (M) MSA S 'eso de la materia seca inicial (1) MS) S 'eso de la materia seca residual (1)

c)

B de los medios a los 5- 8, Se obtu#o midiendo el B de los medios a las 5- 8oras de incubacin,

6.4 An8li!i! e!#ad!#ic 'ara el an2lisis estadstico de los datos se utiliz el ro1rama SAS ara FindoKs #ersin 4,. (SAS% -..-), 'ara la #ariable de #olumen acumulado de 1as roducido% rimero se realiz un an2lisis de #arianza utilizando modelos mi(tos% utilizando el rocedimiento MA@ED (0ittell et al,% /447)% en el cual se consider como e"ectos "ijos la concentracin de Se com lementario% el

?esis
--

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sustrato% el tiem o de incubacin% y sus interacciones dobles y tri les= mientras !ue los e"ectos aleatorios "ueron la re eticin y el error e( erimental (Modelo /),

Dado !ue% en el e( erimento - la tri le interaccin "ue si1ni"icati#a (' U .,./)% se realiz un an2lisis de #arianza ara cada tiem o de incubacin% donde los e"ectos "ijos "ueron la

concentracin de Se com lementario% el sustrato% y su interaccin= mientras !ue los e"ectos aleatorios "ueron la re eticin y el error e( erimental (Modelo -), Este $ltimo an2lisis tambin "ue realizado ara la di1estibilidad de la materia seca y el B a las 5- 8oras de incubacin,

'ara todas las #ariables% las medias de mnimos cuadrados se obtu#ieron con el enunciado 0SMEA<S, Se utilizaron olinomios orto1onales ara determinar la res uesta lineal y cuadr2tica de las medias de los tratamientos, Se com araron las medias de los tratamientos testi1o ne1ati#o y testi1o ositi#o contra las medias de los dem2s tratamientos con el enunciado 'DAFF,

A continuacin se resentan los modelos estadsticos utilizadosI

y i2kl = + Sei + S 2 + Se T S i2 + 3k + Se T 3ik + S T 3 2k + Se T S T 3i2k + -l + ei2kl VVVVVModelo /
y i2k = + Sei + S 2 + Se T S i2 + -k + ei2k VVVVVVVVVVVVVVVVVVV,,,Modelo

DondeI

?esis
-C

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y= =
Sei =
S2 =

Se T S i2 =

Eariable de res uesta, Media 1eneral, E"ecto "ijo de la i*sima concentracin de Se com lementario (i S /% -% C% : y ;), E"ecto "ijo del 2*simo sustrato ( 2 S /% -), E"ecto "ijo de la interaccin entre la i*sima concentracin de Se com lementario y el 2*simo sustrato, E"ecto "ijo del k*simo tiem o de incubacin ( k S /% -% C% :% ;), E"ecto "ijo de la interaccin entre la i*sima concentracin de Se com lementario y el k*simo tiem o de incubacin, E"ecto "ijo de la interaccin entre el 2*simo sustrato y el k*simo tiem o de incubacin, E"ecto "ijo de la interaccin tri le entre la i*sima concentracin de Se com lementario% el 2*simo sustrato y el k*simo tiem o de incubacin, E"ecto aleatorio asociado a la k*sima re eticin, E"ecto aleatorio asociado al error e( erimental,

3k = Se T 3ik =
S T 3 2k =

Se T S T 3i2k =

-l = ei2kl =

?esis
-:

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VII. VII.1 (r duccin acumulada de $a!

RESULTADOS

En los cuadros : y ; se resentan las medias de mnimos cuadrados de la roduccin de 1as acumulada or 1ramo de MS incubada en los e( erimentos / y -% res ecti#amente, En ambos e( erimentos se obser# un e"ecto rinci al del tiem o de incubacin (' U .,./)% dado !ue se trata de roduccin acumulada en el tiem o, En el e( erimento /% la roduccin de 1as acumulada no "ue di"erente or e"ecto de la

concentracin de Se com lementario (' W .,.;)% tam oco se obser# interaccin entre tratamiento con res ecto al tiem o o con sustrato% ni interaccin tri le de estos "actores (' W .,.;), Sin embar1o% se obser# una disminucin cuadr2tica de las medias con la al"al"a a las 5- 8 cuando se us una concentracin de .,: m1 de Se com lementario (' U .,.;), En contraste% en el e( erimento - se obser# e"ecto de tratamiento sobre la roduccin de 1as acumulada (' U .,./), ?ambin% se obser# interaccin tri le de tratamientos con sustrato y tiem o (' U .,./)% lo cual indica !ue la concentracin de Se a"ect de "orma di"erente la roduccin de 1as de endiendo del tiem o y del sustrato utilizado (Cuadro :), En este e( erimento% se obser# interaccin doble de tratamiento con sustrato (' U .,./) a las /. 8oras de incubacin, De esta "orma% se encontr una disminucin lineal del #olumen de 1as roducido con 7. m1 de Se% la cual "ue m2s si1ni"icati#a con la dieta a base de 1rano (desde las /. 8oras de incubacin% ' U .,./) !ue con la al"al"a (' X .,/. a artir de las -: 8oras), Esta disminucin "ue su"iciente ara !ue las medias del #olumen de 1as roducido con al"al"a "ueran

si1ni"icati#amente menores con 7. m1 de Se !ue con . y ; m1 a las :6 y 5- 8oras (' U .,.;)% y con dieta a las /.% -:% :6 y 5- 8oras de incubacin (' U .,./)% aun!ue con este $ltimo sustrato tambin se obser# si1ni"icancia en las di"erencias . #s, -. y . #s, :. m1 a las :6 8oras (' U .,.;),
?esis
-;

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-7

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-5

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-6

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?esis
-4

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Di$e!#i0ilidad de la ma#eria !eca , %< a la! A- B ra! de incu0acin En los Cuadros 7 y 5 se resenta el orcentaje de di1estibilidad de la MS y el B a las 5- 8oras de incubacin de los dos sustratos% ara los e( erimentos / y -% res ecti#amente, En ambos e( erimentos% estas #ariables no "ueron di"erentes or e"ecto de los tratamientos (' W .,.;), ?am oco se obser# interaccin de tratamiento con sustrato (' W .,.;)% ero si se obser# e"ecto de sustrato (' U .,./)% obser#2ndose mayor di1estibilidad de la MS de la dieta en com aracin con la di1estibilidad de la MS del 8eno de al"al"a% debido al contenido de almidones de alta de1radabilidad en dietas a base de 1rano (GKens et al,% /446),

?esis
C.

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VIII.

DISCUSIN

E(iste oca literatura re"erente al e"ecto del Se sobre la roduccin de 1as en estudios in vitro% ero E2z!uez et al, (-./.) su1ieren !ue la adicin de minerales como el Cobre y Linc en la dieta de cabras +oer en crecimiento modi"ica la "ermentacin ruminal% debido a !ue aumenta el #olumen de roduccin de 1as in vitro% lo cual no ocurri en el resente e( erimento,

En el resente estudio% las concentraciones de Se utilizadas en el e( erimento / no "ueron su"icientes ara ro#ocar cambios en las #ariables de la "ermentacin estudiadas% lo cual uede si1ni"icar !ue /- m1 Se 91*/ MS no es una concentracin !ue a"ecte la "ermentacin ruminal, Estos resultados ueden relacionarse con los encontrados or Cristaldi et al, (-..;)% !uienes no obser#aron si1nos de to(icidad en o#inos en crecimiento, 0as bacterias ruminales son ca aces de reducir Se inor12nico a "ormas !umicas (selenuro y Se elemental) !ue no re resentan ries1o de to(icidad ara los rumiantes or !ue no ueden absorberse en intestino del1ado (0an1lands et al.% /467), Si las bacterias se into(ican con Se y mueren% disminuye esta reduccin% incrementando el ries1o de into(icacin ya !ue se absorber2 mayor cantidad del Se consumido or el animal, De acuerdo con los resultados obtenidos en el e( erimento -% concentraciones de Se mayores a las utilizadas en el e( erimento /% ro#ocan cambios im ortantes en la roduccin de 1as% aun!ue no en la di1estibilidad de la MS y el B, Este e"ecto udo estar in"luenciado or el ti o de sustrato% de tal manera !ue con al"al"a se obser# menor #olumen de 1as roducido con 7. m1 Se 91*/ MS% mientras !ue con la dieta la reduccin "ue lineal% siendo si1ni"icati#amente menor con :. y 7. m1 Se 91*/ MS% res ecto a los testi1os,

0os resultados del e( erimento - se

ueden relacionar con los re ortados

or otros

in#esti1adores, Da#is et al, (-..6) obser#aron en o#inos !ue el eso disminua a medida !ue se
?esis
C/

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incrementaba el consumo de Se 8asta :. m1 91*/ MS% siendo los animales m2s a"ectados a!uellos con un consumo de C. y :. m1 Se 91*/ MS, 'or tanto% es osible !ue :. o 7. m1 Se 91*/ MS sean concentraciones t(icas ara las bacterias ruminales% in8ibiendo su roli"eracin y su acti#idad "ermentadora% disminuyendo la tasa de asaje del alimento y% or tanto% el consumo de alimento% or lo !ue los animales ueden dejar de 1anar eso o incluso erderlo,

'or otro lado% e(iste e#idencia de !ue el metabolismo ruminal del Se es di"erente de endiendo del ti o de alimento consumido, 0as bacterias ruminales incor oran mayor cantidad de Se con dietas concentradas !ue con dietas a base de "orraje (3oeni1 et al., /445) y esto se asocia al ti o de bacterias !ue roli"eran en cada caso% bacterias !ue roli"eran en dietas a base de "orraje (como Prevotella ruminicola) no incor oran Se% mientras !ue bacterias !ue roli"eran con dietas

concentradas (como S. ruminantium y B. ibrisolvens) si lo 8acen (Budman y &lenn% /46:= Budman y &len% /46;), ?ambin% 3oeni1 et al, (/445) encontraron mayor di1estibilidad de Se con dietas a base de 1rano (7C,5M) !ue con dietas a base de "orraje (C7,7M)% or lo !ue las recomendaciones del <)C (-..5) indican menor re!uerimiento de Se con dietas a base de 1rano y mayor con dietas a base de "orraje, De esta manera% es osible !ue la di"erencia encontrada en el e( erimento - del resente estudio% res ecto al #olumen de 1as roducido% tambin sea debida al ti o de bacterias redominantes,

Al1unas bacterias y 8on1os ueden roducir dimetilselenuro% un com uesto de Se muy #ol2til% or metilacin de Se inor12nico (?8om son*Ea1le et al,% /464), En rumen la roduccin de dimetilselenuro es ele#ada y la cantidad de Se eliminado or esta #a uede ser su erior !ue la eliminada or 8eces y orina (0o ez et al,% /474), 'or lo tanto% es robable !ue el Se desa arecido en rumen no sea absorbido% sino !ue sea eliminado or #olatilizacin a tra#s del eructo% lo !ue
?esis
C-

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8ace su oner !ue el #olumen de 1as roducido en este estudio tambin ten1a !ue #er con la cantidad de dimetilselenuro roducido or al1unas bacterias,

)es ecto a la di1estibilidad de la MS% no e(isti res uesta en "uncin de los tratamientos% solamente se encontr e"ecto de sustrato, El "actor m2s im ortante en la di1estibilidad de los sustratos es la com osicin de cada uno de ellos debido a !ue el almidn es un olmero de molculas de D*1lucosa ordenadas como una cadena lineal con enlaces 1lucosdicos N /% : en la amilosa% o con rami"icaciones !ue se inician en uniones 1lucosdicas N /% 7 en la amilo ectina, A1ualmente todos estos enlaces en el almidn% or ser de ti o al"a% son desdoblados tanto or los microor1anismos amilolticos del rumen como or la amilasa ancre2tica del animal ()ellin1 et al,% -..C), 0a di1estibilidad ruminal del almidn de ende en 1ran medida de la "acilidad con !ue acceden a l las bacterias amilolticas% en el caso de la al"al"a redomina la "ibra% carbo8idratos estructurales (celulosa y 8emicelulosa) !ue son di"ciles de de1radar or las bacterias ruminales ()ellin1 et al,% -..C), En cuanto al B% <aziro1lu et al, (/445) obser#aron menor B ruminal en corderos alimentados con .,C m de Se res ecto al testi1o% lo cual di"iere con lo obser#ado en el resente estudio, Sin

embar1o% la dieta ro#oc menor B ruminal% lo cual se debe a !ue el B disminuye cuando el consumo de carbo8idratos de "2cil "ermentacin incrementa (GKens et al., /446), El ti o de carbo8idrado redominante en la dieta condiciona el desarrollo del ti o de "lora adecuada ara su "ermentacin y el ajuste del B a su ran1o ideal, As% una racin rica en almidn es "ermentada or una "lora amiloltica !ue desarrolla mejor a un B de ;,; a 7,. mientras !ue una racin com uesta or "orraje con alto contenido de carbo8idratos estructurales (celulosa% 8emicelulosa y ectinas) ser2 "ermentada or una "lora celuloltica !ue desarrolla mejor en un ()ellin1 et al,% -..C),
?esis
CC

B de 7,. a 7,4

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I).

CONCLUSIN

+ajo las condiciones en !ue se realiz el resente estudio y en base a los resultados obtenidos% se uede concluir !ue las concentraciones de Se utilizadas% es ec"icamente :. m1 Se 91*/ MS en dietas a base de 1rano o 7. m1 Se 91*/ MS en "orrajes% a"ectan la roduccin de 1as in vitro% aun!ue no la di1estibilidad de la MS y el B "inal,

?esis
C:

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).

9I9LIO'RAFCA

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?esis
C;

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?esis
C7

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0u% J, Bolm1ren% A, -..6, Seleno roteins, Anstituto Mdico <obel de +io!uimica% De artamento de +io!uimica Mdica y +io"isica% 3arolins9a Anstitute, SE*/5/55, Estocolmo% Suecia, McDoKell% 0,),% J, Eel2s!uez*'ereira y &, Ealle, /445, Minerales ara rumiantes en astoreo en re1iones tro icales, +oletn, CZ edicin, De artamento de Ciencia Animal, Dni#ersidad de Florida, &aines#ille% Florida, 6: , <aziro1lu% M,% A9sa9al% M,, Cay% S, and Celi9% S, /445, E""ects o" #itamin E and Selenium on some rumen arameters in lambs, Acta 1et. !un.. :;I ::5*:;7, <)C, -..;, Mineral tolerance o" animals, Second re#ised edition, <ational Academy 'ress, Fas8in1ton% D,C, ;/. , <)C, -..5, <utrient )e!uirements o" small ruminantsI s8ee % 1oats% cer#ids and neK Korld camelids, <ational Academy 'ress, Fas8in1ton% DC, C6/ , Gremland% ),S,% J,?, Bollibau18% A,S, Maest% ?,S, 'resser% 0,&, Miller% and C,F, Culbertson, /464, Selenate reduction to elemental selenium by anaerobic bacteria in sediments and cultureI bio1eoc8emical si1ni"icance o" a no#el% sul"ate*inde endent res iration, A))l. 5nviron. %icrobiol. ;;I -CCC*-C:C, GKens% F, <,= Secrist% D, S,= Bill% F, J,= &ill% D, ), /446, Acidosis in cattleI a re#ieK . 4. Anim. Sci. 57I-5;*-67, 'ane#% A, 3, Bau tmano#2% 0, 'a#lata% A, 'ec8o#2% J, Fil e9% ), D#o[29% ), -./C, E""ect o" su lementation o" #arious selenium "orms and doses on selected arameters o" ruminal

"luid and blood in s8ee , C9ec6 4. Anim. Sci, ;6I C5Y:7, )amrez*+ribiesca% J,E,% J,0, ?rtora% 0,M, Bern2ndez% and M, Buerta, -../, Main causes o" mortalities in dairy 1oat 9ids "rom t8e Me(ican 'lateau, Small -umin. -es. :/I 55*6.,

?esis
C5

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)amrez*+ribiesca% E,% E, Bern2ndez*Camac8o% 0,M, Bern2ndez*Cal#a y J,0, ?rtora*'rez, -..:, E"ecto de un su lemento arenteral con selenito de sodio en la mortalidad de corderos y los #alores 8em2ticos de selenio, A.rociencia. C6I :C*;/, )ellin1 A,E, y &,A, Mattioli, -..C, Fisiolo1a di1esti#a y metablica de los rumiantes, Editorial EDD0'% C*75,

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?esis
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Stolz J,F,% ', +asu and ),S, Gremland, -..-, Microbial trans"ormation o" elementsI t8e case o" arsenic and selenium, ,nt. %icrobiol. ;I -./Y-.5, Sunde% ),A, /445, Selenium, EnI G\Dell% +,0, and Sunde% ),A (eds,)% Bandboo9 o" nutritionally essential mineral elements, Marcel De99er% Anc, <eK Hor9% DSA, :4C*;;7,

?8om son*Ea1le% E,?,% F,?, Fran9enber1er% Jr,% and D, 3arlson, /464, Eolatilization o" selenium by Alternaria alternate, A))l. 5nviron. %icrobiol. ;;I /:.7*/:/C, E2z!uez% J,F, )ojo% ), 0 ez% D, ?inoco% J,0, Cardoso% D, y +rionez% F, -./., Fermentacin )uminal in vitro de una Dieta Ante1ral 'ara Cabras Adicionadas con Cobre y Linc, Centro Dni#ersitario DAEM% ?esmacalte ec% M(ico, Fan1% C,% ], 0iu% F,L, Han1% ], Don1% @,M, Han1% D,C, Be% ', L8an1% 3,B, Don1% H,@, Buan1, -..4, E""ects o" selenium yeast on rumen "ermentation% lactation er"ormance and "eed di1estibilities in lactatin1 dairy coKs, 8ivestock Science /-7I -C4Y-::, Filliams% +, A, -..., Cumulati#e 1as* roduction tec8ni!ues "or "ora1e e#aluation, AnI &i#ens D A% GKen E% Gmed B M and A("ord ) F E (editors), Fora1e E#aluation in )uminant <utrition, Fallin1"ord (D3), CA+ Anternational, :5; , He8% J,*H,% ],*', &u% M,A, +eilstein% <,E, Forsber1 and ',D, F8an1er, /445, Selenium in"luences tissue le#els o" Seleno rotein F in s8ee , 4. Nutr. /-5I C4:*:.-,

?esis
C4

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ANE)OS A1. SOLUCIONES (ARA LA (RE(ARACIN DEL INCULO Cuadr A1.1 S lucin am r#i$uad ra Reac#i1 +icarbonato de amonio (<B:BCGC)% 1, +icarbonato de sodio (<aBCGC)% 1, A"orar con a1ua destilada% m0, Cuadr A1.- S lucin macr mineral Reac#i1 Fos"ato de sodio dib2sico (<a-B'G:) Fos"ato de otasio monob2sico (3B-'G:) Sul"ato de ma1nesio 8e ta8idratado (M1SG:^5B-G) A"orar con a1ua destilada% m0, Cuadr A1.. S lucin micr mineral Reac#i1 Cloruro de calcio di8idratado (CaCl-^-B-G) Cloruro de man1aneso tetra8idratado (MnCl^:B-G) Cloruro de cobalto 8e(a8idratado (CoCl^7B-G) Cloruro "rrico (FeClC) A"orar con a1ua destilada% m0, Cuadr A1.2 Re!a5urina Reac#i1 )esazurina% 1 A"orar con a1ua destilada% m0, Reac#i1 Sul"ato de sodio an8idro (<a-SG:) Solucin de 8idr(ido de sodio .,/ < (: 1 <aGBJ0)% m0 A"orar con a1ua destilada% m0, 1@@ mL .,/ /.. 1 mL .,..;5 .,.: / -@@ mL .,-.. 1@@ mL .,;5 :,. /.. -@@ mL /,/: 6 -.. 1@@ mL /C,/. / 6 /.. -4@ mL CC -; -,; -. -;. 4@@ mL 77 ;. ; :. ;.. 1 mL .,..;5 .,..7.,...7 / 1L ;,5 7,.,7 /... 1 mL .,..: .,.C; / 1L :,. C;,. /...

Cuadr A1.4 S lucin reduc# ra a ra5n de - mL % r cada 6@ mL de incul &%ara 1@@ mL*

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:.

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A-. ANDLISIS ESTADCSTICO A-.1 E;em%l ! del (r cedimien# /I)ED

PROC MIXED; TITLE 'PRODUCCIN DE GAS EXPERIMENTO 1'; CLASS SUSTRATO NUMERO HORA TRAT; MODEL GASGRAM=SUSTRATO HORA TRAT SUSTRATO*HORA SUSTRATO*TRAT HORA*TRAT SUSTRATO*HORA*TRAT/DDFM=SATTERTH; RANDOM NUMERO; REPEATED/ TYPE=AR(1) SUB=NUMERO; LSMEANS SUSTRATO*TRAT*HORA; RUN; PROC MIXED; TITLE 'PRODUCCIN DE GAS EXPERIMENTO 1'; CLASS SUSTRATO NUMERO HORA TRAT; MODEL GASGRAM=HORA TRAT HORA*TRAT/DDFM=SATTERTH; RANDOM NUMERO; REPEATED/ TYPE=AR(1) SUB=NUMERO; LSMEANS HORA*TRAT/PDIFF; WHERE SUSTRATO='A !" !"';
ESTIMATE ESTIMATE ESTIMATE ESTIMATE ESTIMATE ESTIMATE ESTIMATE ESTIMATE ESTIMATE ESTIMATE 'LINEAL TRATAMIENTO# HORA $' TRAT %2 %1 0 1 2 HORA*TRAT %2 %1 0 1 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0; 'LINEAL TRATAMIENTO# HORA &' TRAT %2 %1 0 1 2 HORA*TRAT 0 0 0 0 0 %2 %1 0 1 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0; 'LINEAL TRATAMIENTO# HORA '(' TRAT %2 %1 0 1 2 HORA*TRAT 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 %2 %1 0 1 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0; 'LINEAL TRATAMIENTO# HORA (&' TRAT %2 %1 0 1 2 HORA*TRAT 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 %2 %1 0 1 2 0 0 0 0 0; 'LINEAL TRATAMIENTO# HORA )'' TRAT %2 %1 0 1 2 HORA*TRAT 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 %2 %1 0 1 2; 'CUADR*TICO TRATAMIENTO# HORA $' TRAT %1 0 2 0 %1 HORA*TRAT %1 0 2 0 %1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0; 'CUADR*TICO TRATAMIENTO# HORA &' TRAT %1 0 2 0 %1 HORA*TRAT 0 0 0 0 0 %1 0 2 0 %1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0; 'CUADR*TICO TRATAMIENTO# HORA '(' TRAT %1 0 2 0 %1 HORA*TRAT 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 %1 0 2 0 %1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0; 'CUADR*TICO TRATAMIENTO# HORA (&' TRAT %1 0 2 0 %1 HORA*TRAT 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 %1 0 2 0 %1 0 0 0 0 0; 'CUADR*TICO TRATAMIENTO# HORA )'' TRAT %1 0 2 0 %1 HORA*TRAT 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 %1 0 2 0 %1;

RUN; PROC MIXED; TITLE 'DIGESTIBILIDAD DE LOS MEDIOS $'; CLASS SUSTRATO NUMERO HORA TRAT; MODEL PH=SUSTRATO TRAT SUSTRATO*TRAT/DDFM=SATTERTH; RANDOM NUMERO/SUB=NUMERO; LSMEANS SUSTRATO*TRAT/PDIFF;
ESTIMATE ESTIMATE ESTIMATE ESTIMATE

RUN;

'LINEAL TRATAMIENTO# ALFALFA' TRAT %2 %1 0 1 2 SUSTRATO*TRAT %2 %1 0 1 2 0 0 0 0 0; 'LINEAL TRATAMIENTO# DIETA' TRAT %2 %1 0 1 2 SUSTRATO*TRAT 0 0 0 0 0 %2 %1 0 1 2; 'CUADR*TICO TRATAMIENTO# ALFALFA' TRAT %1 0 2 0 %1 SUSTRATO*TRAT %1 0 2 0 %1 0 0 0 0 0; 'CUADR*TICO TRATAMIENTO# DIETA' TRAT %1 0 2 0 %1 SUSTRATO*TRAT 0 0 0 0 0 %1 0 2 0 %1;

A-.- Re!ul#ad ! del an8li!i! e!#ad!#ic %ara el e"%erimen# 1 A2.2.1 Produccin de gas, Prueba tipo 3 de efectos fijos y sus interacciones.
Type 3 Tests of Fixed Effects Effect SUSTR T! *!R TR T SUSTR T!.*!R SUSTR T!.TR T *!R .TR T SUSTR T!.*!R .TR T Num DF " # # # # "$ "$ Den DF #$%& "+& #$%& "+& #$%& "+& "+& F-Valor '3#%#( ,$(,%,+ (%#( "$$%$& (%'# (%3(%#Pr > F )%(((" )%(((" (%-($)%(((" (%,"'3 (%,-#& (%,+'#

A2.2.2 Produccin de gas, Medias de mnimos cuadrados.

/east S0uares 1eans Effect SUSTR T! *!R TR T Estimador Error est2ndar DF Valor t Pr > 3t3

?esis
:/

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A2.2.3 Produccin de gas, stimadores para !a prueba de respuesta !inea! y cuadr"tica de !as medias.
Estimates Eti0ueta Estimador Error est2ndar DF Valor t Pr > 3t3

/4NE / TR T 14ENT!5 *!R 3 /4NE / TR T 14ENT!5 *!R /4NE / TR T 14ENT!5 *!R '# /4NE / TR T 14ENT!5 *!R #/4NE / TR T 14ENT!5 *!R &' 6U DR7T46! TR T 14ENT!5 *!R 6U DR7T46! TR T 14ENT!5 *!R 6U DR7T46! TR T 14ENT!5 *!R

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Fermentacin in vitro de una Dieta y un Forraje con Altas Concentraciones de Selenio Alberto Martnez Jimnez
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A2.2.# $igestibi!idad, Prueba tipo 3 de efectos fijos y sus interacciones.

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A2.2.% $igestibi!idad, Medias de mnimos cuadrados.

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A2.2.& $igestibi!idad, medias.

stimadores para !a prueba de respuesta !inea! y cuadr"tica de !as

Estimates

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A2.2.' p(, Prueba tipo 3 de efectos fijos y sus interacciones.

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A2.2.) p(, Medias de mnimos cuadrados.

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A2.2.* p(, stimadores para !a prueba de respuesta !inea! y cuadr"tica de !as medias.
Estimates Eti0ueta /4NE / TR T 14ENT!5 /F /F /4NE / TR T 14ENT!5 D4ET 6U DR7T46! TR T 14ENT!5 /F /F 6U DR7T46! TR T 14ENT!5 D4ET Estimador -(%("-(( -(%(#$(( (%(''(( -(%(''(( Error est2ndar (%(3+&+ (%(3+&+ (%('&$, (%('&$, DF 3,%, 3,%, 3,%, 3,%, Valor t -(%+( -"%', (%&, -(%&, Pr > 3t3 (%$"&# (%'(+$ (%#3"$ (%#3"$

A-.. Re!ul#ad ! del an8li!i! e!#ad!#ic %ara el e"%erimen# A2.3.1 Produccin de gas, Prueba tipo 3 de efectos fijos y sus interacciones.
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A2.3.2 Produccin de gas, Medias de mnimos cuadrados.

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Fermentacin in vitro de una Dieta y un Forraje con Altas Concentraciones de Selenio Alberto Martnez Jimnez
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A2.3.3 Produccin de gas, stimadores para !a prueba de respuesta !inea! y cuadr"tica de !as medias.
Estimates Eti0ueta /4NE / TR T 14ENT!5 *!R /4NE / TR T 14ENT!5 *!R /4NE / TR T 14ENT!5 *!R /4NE / TR T 14ENT!5 *!R /4NE / TR T 14ENT!5 *!R 6U DR7T46! TR T 14ENT!5 6U DR7T46! TR T 14ENT!5 6U DR7T46! TR T 14ENT!5 6U DR7T46! TR T 14ENT!5 6U DR7T46! TR T 14ENT!5 /4NE / TR T 14ENT!5 *!R /4NE / TR T 14ENT!5 *!R /4NE / TR T 14ENT!5 *!R /4NE / TR T 14ENT!5 *!R /4NE / TR T 14ENT!5 *!R 6U DR7T46! TR T 14ENT!5 6U DR7T46! TR T 14ENT!5 6U DR7T46! TR T 14ENT!5 6U DR7T46! TR T 14ENT!5 6U DR7T46! TR T 14ENT!5 + "( '# #&' *!R *!R *!R *!R *!R + "( '# #&' *!R *!R *!R *!R *!R Estimador -"%','$ -"+%-'$& -'&%",33 -'-%$-'( -3(%$#," -"%,$,+ -(%'33, -'%,'+$ -(%,$"3 "%('(Error est2ndar "+%"3++ "+%"3++ "+%"3++ "+%"3++ "+%"3++ ""%&'3, ""%&'3, ""%&'3, ""%&'3, ""%&'3, "#%("#3 "#%("#3 "#%("#3 "#%("#3 "#%("#3 "(%-++# "(%-++# "(%-++# "(%-++# "(%-++# DF "-%& "-%& "-%& "-%& "-%& "-%& "-%& "-%& "-%& "-%& '"%# '"%# '"%# '"%# '"%# '"%# '"%# '"%# '"%# '"%# Valor t -(%(, -"%(+ -"%-( -"%,( -'%(' -(%"& -(%(' -(%'+ -(%((%(, -(%(& -+%(" -3%'( -3%#( -3%(, (%3( (%$' (%"3 -(%+-(%33 Pr > 3t3 (%,3'(%3(,( (%(--+ (%(&3$ (%(+&# (%-$-# (%,-#3 (%-(+& (%,3++ (%,3"+ (%,#$# )%(((" (%((#' (%(('& (%((++ (%&$$, (%+#'" (%-,&" (%+$-& (%&#$,

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A2.3.# $iferencias entre medias de mnimos cuadrados de !os tratamientos a !as '2 +oras
Differences of /east S0uares 1eans Effect *!R *!R *!R *!R *!R *!R *!R *!R *!R *!R *!R *!R *!R *!R *!R *!R *!R *!R *!R *!R *!R *!R *!R *!R *!R *!R *!R *!R *!R *!R *!R *!R .TR .TR .TR .TR .TR .TR .TR .TR .TR .TR .TR .TR .TR .TR .TR .TR .TR .TR .TR .TR .TR .TR .TR .TR .TR .TR .TR .TR .TR .TR .TR .TR T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T *!R #######&' &' &' &' &' &' &' "( "( "( "( "( "( "( '# '# '# '# '# '# '# ####TR T ( ( ( ( + + + ( ( ( ( + + + ( ( ( ( + + + ( ( ( ( + + + ( ( ( ( *!R #######&' &' &' &' &' &' &' "( "( "( "( "( "( "( '# '# '# '# '# '# '# ####TR T + '( #( $( '( #( $( + '( #( $( '( #( $( + '( #( $( '( #( $( + '( #( $( '( #( $( + '( #( $( Estimador Error est2ndar $%&$-$%&$-$%&$-$%&$-$%&$-$%&$-$%&$-$%&$-$%&$-$%&$-$%&$-$%&$-$%&$-$%&$-$%'$&# $%'$&# $%'$&# $%'$&# $%'$&# $%'$&# $%'$&# $%'$&# $%'$&# $%'$&# $%'$&# $%'$&# $%'$&# $%'$&# $%'$&# $%'$&# $%'$&# $%'$&# DF "-%& "-%& "-%& "-%& "-%& "-%& "-%& "-%& "-%& "-%& "-%& "-%& "-%& "-%& '"%# '"%# '"%# '"%# '"%# '"%# '"%# '"%# '"%# '"%# '"%# '"%# '"%# '"%# '"%# '"%# '"%# '"%# Valor t (%3# "%', -(%', '%## (%,# -(%$3 '%(, (%3"%'# -(%3'%$# (%-& -(%&+ '%'$ (%3# "%-( '%'( #%$& "%#$ "%-& #%3# (%-+ "%#"%$" 3%'( (%$3 (%&$ '%3# (%-+ '%"" "%,, 3%'3 Pr > 3t3 (%&3## (%'"3' (%&&++ (%('+( (%3+&( (%+33, (%(+(# (%&"", (%''-& (%&""3 (%("$3 (%3,+& (%#$'" (%(3+$ (%&#(# (%(-$( (%(3-(%(((" (%"+&& (%(&+, (%(((3 (%#(33 (%"+'' (%"'"" (%((#3 (%+3#" (%#+#+ (%('-(%#($" (%(#$# (%(+,, (%((#(

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A2.3.% $igestibi!idad, Prueba tipo 3 de efectos fijos y sus interacciones.

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A2.3.& $igestibi!idad, Medias de mnimos cuadrados.

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A2.3.' $igestibi!idad, medias.

stimadores para !a prueba de respuesta !inea! y cuadr"tica de !as

Estimates

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