Professional Documents
Culture Documents
Abstrak
Identifikasi dan analisis asam nukleat merupakan hal yang sangat penting dalam bidang ilmu biologi (biokimia khususnya) yang masih sangat berkembang saat ini. Hal tersebut dapat dikatakan penting karena semua inovasi maupun penemuan dalam biologi mengenai gen atau DNA pastinya diawali dengan proses identifikasi dan analisis asam nukleat. Analisis dan proses identifikasi/deteksi asam nukleat sendiri terdiri dari analisis kualitatif dan analisis kuantitatif. Analisis kualitatif bericara mengenai metode untuk mengetahui keberadaan atau eksistensi dari DNA atau RNA yang sedang diuji dan juga mengenai cara dalam memanipulasi/menggunakan DNA atau RNA dalam proses pengujian.Metode yang digunakan dalam hal tersebut diantaranya adalah staining, elektroforesis gel, hibridisasi, dan blotting. Lebih jauh lagi, analisis kualitatif juag membiarakan mengenai bagaimana proses dan mekanisme pengurutan DNA (DNA sequencing). Analisis kuantitatif membahas mengenai bagaimana menghitung kemurnian dan konsentrasi dari DNA atau RNA yang sedang diuji. Metode atau teknik yang digunakan dalam hal tersebut salah satunya adalah spektrofotometri UV-Vis. Selain itu, dibahas pula teknik RT-PCR yang mendukung analisis kuantitatif dari DNA atau RNA. Kata kunci : Staining, Elektroforesis gel, hibridisasi, blotting, DNA sequencing, RT-PCR, spektrofotometri UV-Vis
Acridine Orange
Ethidium Bromide
(a)
(b)
Gambar 1. (a) Proses elektroforesis gel (b) Contoh hasil analisis elektroforesis gel
Dari gambar di atas terlihat bahwa sampel DNA (asam nukleat) bergerak ke arah elektroda positif. Pergerakan/migrasi dari molekul-molekul asam nukleat tersebut bergantung pada berat molekul masing-masing molekul asam nukleat. Molekul yang memiliki berat lebih ringan (lebih panjang rantainya) akan bergerak lebih lambat daripada molekul yang memiliki berat molekul lebih besar. Dengan begitu, molekul asam nukleat dapat dibedakan atas berat molekulnya dengan cara membandingkannya dengan sampel standar (sudah diketahui berat molekulnya). Berat molekul asam nukleat sebanding dengan panjang rantainya sehingga asam nukleat juga dapat dibedakan berdasarkan banyaknya pasangan nukleotidnya. Semakin banyak pasangan nukleotid yang terkandung, maka akan semakin panjang pula rantainya. RNA atau DNA berukuran kecil atau memiliki nukleotida sebanyak 500 atau kurang umumnya dipisahkan oleh elektrofresis gel poliakrilamid, sedangkan molekul yang lebih besar biasanya dipisahkan dengan metode elektroforesis gel agarosa, yaitu polisakarida yang diekstraksi dari rumput laut (kemudian dilarutkan dalam cairan buffer panas, dituangkan dalam cetakan, dan menurunkan suhu hingga terbentuk menjadi gel), karena memiliki porositas yang lebih besar. Pemisahan DNA (asam nukleat) yang memiliki ukuran lebih dari 25 kb (kilo base) biasanya dapat dipenuhi dengan menggunakan teknik yang dinamakan pulsed-field electrophoresis, dimana teknik tersebut menyebabkan molekul DNA mengubah orientasi medannya selama migrasi berlangsung. Pita DNA pada gel agarosa atau poliakrilamid tidak terihat, kecuali DNA tersebut diberi tanda atau diberi label. Tanda atau label yang dimaksud disini adalah warna. Salah satu metode yang cukup sensitif dalam pewarnaan DNA (DNA staining) adalah dengan merendamnya dalam EtBr(ethidium bromida) yang akan menghasilkan pancaran warna tertentu apabila disinari sinar UV. Deteksi lain yang lebih sensitif adalah dengan
memasukkan sebuah radioisotop ke dalam DNA sebelum elektroforesis. Radioisotop yang biasa digunakan adalah 32P yang dapat mengeluarkan partikel berenergi. Hal tersebut dapat dideteksi dengan mudah oleh tenik autoradiografi. Sensitivitas teknik elektroforesis gel sangatlah baik hingga dapat membedakan molekul DNA atau RNA dengan selisih hanya satu nuleotida antara molekul satu dengan yang lainnya sehingga metode ini sangat berharga dalam proses DNA sequencing. Karena laju migrasi molekul dalam gel juga dapat dipengaruhi oleh bentuk dari molekul tersebut, elektroforesis dapat digunakan untuk memisahkan molekul-molekul dengan bentuk yang berbeda, misalnya bentuk circular dan linear atau relaxed dan supercoiled.
sedikit berbeda dengan deoxynucleotide triphosphates(dNTPs) yang memiliki gugus OH pada karbon-3 dari gula ribosa. Adanya atom H pada ddNTPs membuat rantai yang sedang tumbuh tidak dapat melangsungkan lagi pertumbuhannya. Dengan kata lain, dideoxynucleotide triphosphates berperan sebagai penghenti rantai. Dalam reaksi sintesis, jika dideoxynucleotide triphosphates ditambahkan, maka proses sintesis tersebut akan berhenti karena 3 OH yang diperlukan untuk penambahan nukleotida berikutnya tidak ada.
Berikut adalah beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam proses DNA sequencing dengan metode Sanger : DNA utas tunggal dalam jumlah cukup sebagai template DNA Primer yang sesuai (sepotong kecil DNA yang berpasangan dengan template DNA dan berfungsi sebagai starting point untuk replikasi DNA polymerase (enzim yang mengkopi DNA, menambahkan nukleotida baru ke ujung 3 dari template Sejumlah nukeotida normal Sejumlah kecil dideoxynucleotide yang dilabel (radioaktif atau dengan pewarna fluorescent) Gambar 5 di bawah ini menjelaskan mekanisme dalam proses DNA sequencing menggunakan metode Sanger. Mekanisme yang terjadi dalam proses tersebut adalah A. Seperti yang telah dikatakan sebelumnya, DNA sequencing metode Sanger menggunakan deoxynucleotide triphosphates dan dideoxynucleotide triphosphates. B. DNA yang telah dimurnikan disintesis in vitro dalam sebuah campuran yang mengandung molekul DNA rantai tunggal yang akan diurutkan (sequenced), enzim polimerase DNA, DNA primer pendek yang memungkinkan polimerase untuk memulai sintesis DNA , dan empat dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP). Jika analog dari ddNTP muncul pada campuran nukleotid, maka ddNTP tersebut dapat masuk ke dalam rantai baru yang sedang tumbuh. Akibatnya, pertumbuhan rantai akan berhenti. Dalam ilustrasi di bawah ini, terlihat bahwa sejumlah kecil ddATP masuk ke dalam campuran nukleotida. ddATP tersebut bersaing dengan dATP yang jumlahnya berlebih sehingga ddATP sangat jarang muncul dibandingkan dATP dalam rantai yang sedang tumbuh tersebut. C. Untuk menentukan urutan lengkap dari sebuah fragmen DNA, rantai ganda DNA pertama-tama dipisahkan ke dalam bentuk rantai tunggalnya dan satu diantaranya digunakan sebagai template untuk proses sequencing. Empat ddNTP digunakan di empat reaksi sintesis DNA yang berbeda. Reaksi tersebut dilakukan terhadap sejumlah salinan dari DNA awal yang digunakan. Setiap reaksi akan menghasilkan sejumlah salinan DNA yang terhenti pada titik-titik berbeda dalam urutan. Hasil tersebut kemudaian dipisahkan oleh proses elektroforesis dalam empat jalur sejajar seperti yang terlihat dalam gambar. Setelah itu, urutan DNA dapat ditentukan dengan membaca hasil elektroforesis dari yang terbawah dan secara berturut-turut hingga yang teratas.
Pada analisa PCR konvensional deteksi keberadaan DNA dilakukan pada akhir reaksi dan pengamatan keberadaan DNA hasil amplifikasi dilakukan di gel agarose setelah dilakukan proses elektroforesi, sedangkan analisa menggunakan Real Time PCR memungkinkan untuk dilakukan pengamatan pada saat reaksi berlangsung, keberadaan DNA hasil amplifikasi dapat diamati pada grafik yang muncul sebagai hasil akumulasi fluoresensi dari probe (penanda). Pada Real Time PCR pengamatan hasil tidak lagi membutuhkan tahap elektroforesis, sehingga tidak lagi dibutuhkan gel agarose dan penggunaan Ethidium Bromide (EtBr) yang merupakan senyawa karsinogenik. Cara kerja Real Time PCR mengikuti prinsip umum reaksi PCR, yang utama adalah DNA yang telah diamplifikasi dihitung setelah diakumulasikan dalam reaksi secara real time sesudah setiap siklus amplifikasi selesai. Terdapat 2 (dua) metode kuantifikasi yang umum digunakan antara lain : a) Menggunakan zat pewarna fluoresensi yang akan terinterkalasi dengan DNA rantai ganda (dsDNA) misalnya SyBr Green, dan b) Probe (penanda) yang berasal dari hasil modifikasi DNA oligonukleotida yang akan berpendar (flourensensi) ketika terhibridisasi dengan DNA komplemen, misalnya probe FRET (Hybridisasi) dan probe TaqMan. Dalam setiap pengamatan proses PCR, sinyal fluoresensi yang dipancarkan akan meningkat secara proporsional setiap siklus PCR telah berhasil dilakukan sejalan dengan bertambahnya produk DNA (DNA hasil amplifikasi) yang dihasilkan.
Daftar Pustaka
Alberts, Bruce, 2008, Molecular Biology of The Cell,5th, Garland Science, Taylor & Francis Group, New York. D.Stainsfield, William, Jaime, S. Colome, Raul, J. Cano, 2003, Schaums Easy Outlines Molecular and Cell Biology, The McGraw-Hill Companies, Inc., USA. Karp, Gerald, 2010, Cell and Molecular Biology Concepts and Experiments, 6th, John Wiley & Sons, USA. Primrose, S. B., R. M., Twyman, R. W. Old, 2001, Principle of Gene Manipulation, 6th, Blackwell Science, Ltd., UK