KRONİK HEPATİT C’li HASTALARDA

HEPATOSELLÜLER KARSİNOGENEZİSTE SİKLİN D1

GEN POLİMORFİZMİNİN ROLÜ

Akkız H1, Çolakoğlu S1, Sandıkçı M1, Bekar A1, Bayram S1, Akgöllü E1, Gümürdülü Y1,
Özdil B1, Kara B1, Sümbül T1, Doran F2

1
Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Gastroenteroloji Bilim Dalı
2
Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji A.B.D

IV. Hepato-Gastroenteroloji Kongresi 1-5 Eylül 2007 Antalya

 Hücre Döngüsünde Siklin D1’in Rolü
P18ink4C
P21WAF1 P21WAF1
P27KIP1 P27KIP1

G0 Siklin D-CDK 4/6 Siklin A-CDK 1/2 Siklin A/B-CDK 1

G1 S G2 M

İnkomplet DNA replikasyonu

Siklin E-CDK 2/3
DNA hasarı
Büyüme faktörü yetmezliği P21WAF1 G2/M-kontrol
P27KIP1 noktası
Kromozomal yanlış eşleşme
Restriksiyon- Spindel-kontrol
kontrol noktası noktası
Rb Yolağı İnhibisyon
Cyclin D1
Mitojenik
Sinyal
cdk4
cdk6

Fosforilasyon

Ayrışma

E2F E2F aktif

inaktif

Transkripsiyonunun Represyonu
E2F ilgili DNA Transkripsiyonunun
Aktivasyonu
G1 Fazı
S Fazı
Wong et al Nat
Hücre Döngüsü Progresyonu Genet 2000
 Kanserde Siklin D1 Alterasyonları
• Siklin D1 alterasyonları tümör spesifiktir
– Kromozomal translokasyon
– Gen amplifikasyonu
– Proteinin aşırı birikimi
• Siklin D1 kromozomal translokasyonu
– B hücre malignensilerde
– Multiple myelomada
– Kronik lösemilerde
• Gen amplifikasyonu ve protein overekspresyonu
– Hepatosellüler karsinomada sıktır

Knudson et al Oncogene 2006, Zhang et al Molecular Carcinogensis 2002

 Siklin D1 Polimorfizmi ve Kanser Riski

• Siklin D1 lokusunda 100’den fazla SNP tanımlandı

• Missense polimorfizm sıklığı düşüktür
• Kodon 242 ekzon 4 A870G polimorfizmi yoğun olarak
çalışılmıştır
• A870G polimorfizm sıklığı %44-%56 oranlarında
bildirilmektedir
• A allel pozitifliği kanser riskini artırır ve genellikle kötü
prognozla birliktedir
Knudsen et al Oncogene 2006, Knudsen K E Cell Division 2006, Pakakasama et al Oncogene 2004
 Amaç
• Hepatosellüler karsinoma histolojik tanılı
hastalarda Siklin D1 geni A870G
polimorfizminin sıklığını ve hepatosellüler
karsinogeneziste yerini araştırmayı
amaçladık
 Metod
Hepatoselüler Kanser Dokusu

Fenol/kloroform

Genomik DNA ekstraksiyonu

Forward: (5’ GTG AAG TTC ATT

TCA TCC AAT CCG C 3’)
Konvansiyonal PCR
Reverse: (5’ GGG ACA TCA CCC
Scrf I Enzimi TCA CTT AC 3’)

Restriction Fragment Length Polimorfizm

(Siklin D1 Polimorfizmi)
Siklin D1 A870G Polimorfizmi
Marker

500 bp

Genotipi

Genotipi
Genotipi
400 bp

300 bp

200 bp AA GA GG
167 bp
147 bp

100 bp
 Siklin D1 A870G Polimorfizmi Sıklığı
Faktörler HCC (80) Kontrol (43) p Değeri

Yaş 58 ± 1,1 51± 1,7 0.009

Cinsiyet (E/K) 67/13 (%84) 36/36 (%50) <0.000
Allel sıklığı 0.004
A 86 (%54) 53(%37)
G 74 (%46) 91 (%63) (1,50)

Genotip frekansı 0.013

A/A 27 (%34) 10 (%14)
A/G 32 (%40) 33 (%46)
G/G 21 (%26) 29 (%40)
Siklin D1 A870G Polimorfizminin Genotipik Sıklığı

100
HCC grubu
Kontrol grubu
80
p=0.013

60
%46 %40
40 %40
%34
%26
20 %14

0
A/A Genotipi A/G Genotipi G/G Genotipi
Siklin D1 A870G Polimorfizminin Allel Sıklığı

100 HCC grubu

Kontrol grubu
80 p= 0.004
%63
60
%54
%46
40 %37

20

0
A Allel G Allel
 YORUM
• Hepatosellüler karsinogeneziste Retinoblastoma
yolağı aktif bir rol oynayabilir
• Siklin D1geni kodon 242 ekzon 4 A870G
polimorfizmi siklin D1 proteininin eksperesyonunu
artırarak hepatosellüler karsinogenezise katkıda
bulunabilir
• Araştırmaların tamamında hepatosellüler kanserli
olgularda bu polimorfizmin kontrol grubuna kıyasla
belirgin yüksek bulunması bu tezi desteklemektedir
 Sporadik Kolorektal Kanserlerde CCND1
Genotipleri
Hasta Kontrol
(160) (102)

CNND1 genotipleri
GG 30 (%19) 35 (%34)
AG 103 (% 64) 53 (%52)
AA 27 (% 17) 14 (%14)
AG+AG 130 (%81) 67 (%65)
CCND1 Genotipi ve Kolorektal Kanser
 Polimorfik A alleli taşıyan hastalarda homozigot
G’li hastalara kıyasla kolorektal kanser riski artmış
bulundu
 Polimorfik A alleli taşıyan hastalar daha yaşlı
olgulardı (62 vs 52)
 Senkron tümör oranı yüksekti (%11 vs %2)
 Sağ kolona lokalizasyon daha yüksek oranda
saptandı (%66 vs %52)
 Kolorektal Karsinogenezis
 Kromozomal instabilite yolağı dominant
mekanizmadır
 Kolorektal kanserlerin %85’inde belirlenir
 Birçok tümör süpressör gen, APC,p53,Smad2/Smad4
ve onkogen, K-ras karsinogenezise katılmaktadır
 Yakın zamanda BAX,COX-2 ve Siklin D1 genlerinin
karsinogenezisteki yeri birçok çalışmada
araştırılmıştır
 Method
 Genomik DNA izolasyonu klasik fenol-klorofrom yöntemi
ile yapıldı.
 Siklin D1 geni kodon 242 ntA870G genotiplendirilmesi
PCR/RFLP ile yapıldı
 PCR’da Forward (5’ GTG AAG TTC ATT TCA TCC AAT
CCG C 3’) Reverse (5’ GGG ACA TCA CCC TCA CTT AC
3’) primerleri kullanılanılarak 167 bp uzunluğundaki bölge
amplifiye edildi. Bu bölge CCND1 genin kodon 242
(870.nükleotidi) bölgesini içermektedir.
 Method
 RFLP amplifiye edilmiş 167 bp uzunluğundaki PCR
ürününün MspI enzimiyle bir gece boyunca 37 0C
muamele edilmesiyle gerçekleştirildi
 CCND1 geninde 870. nükleotid Guanin ise MspI
enzimi 167 bp uzunluğundaki PCR ürününü 145 bp
ve 22 bp’ye bölmektedir. Eğer Adenin bulunuyorsa
MspI enzimi için tanıma bölgesi ortadan kalmakta ve
PCR ürünü 167 bp uzunluğunda kalmaktadır.
 Kolorektal Kanserin Moleküler Patogenezi
 Kolerektal kanser genomik bir hastalıktır.
 Genetik ve epigenetik değişikliklerin progresif birikmesi sonucu
gelişmektedir.
 Herediter kolorektal kanserlerde tümör süpresör genler Knudson’ın 2
hedef hipotezine göre inaktive olmaktadır.
 Sporadik kolorektal kanserlerde ise tümör süpresör genlerin her 2 alleli
somatik olarak inaktive olmaktadır.
 Epigenetik silencing Knudson’ın tümör süpressör gen inaktivasyonu
modelinin 3. yolağı olarak kabul edilmektedir

Lengauer et al. Nature 1997, Shih et al. Cancer Res 2001. Halford et al. Cancer Res 2002
 CCND1 Gen ve Siklin D1 Proteini (1)
 Siklin D1 proteini Retinoblastoma yolağının kilit proteinlarinden
biridir
 CCND1 geni Wnt yolağı (APC/β -catenin/TCF pathway) tarafından
regüle edilir
 Siklin D1 proteini hücrenin G1 fazından S fazına ilerlemesinde rol alır
 Wnt yolağında gelişen mutasyonlar Siklin D1 ekspresyonunu belirgin
olarak artırmaktadır
 Siklin D1 overekspresyonu hücre proliferasyonunu hızlandırarak
kolorektal kanserin gelişmesine katkıda bulunabilir

Lewis et al Cancer Research 2003, Bala et al Cancer Research 2003

 CCND1 Gen ve Siklin D1 Proteini (2)
 Epitelyal kanserlerde Siklin D1 ekspresyonu artmıştır
 Adenomada %30, kolorektal kanserlerde ise %40 oranında
overeksprese edilmektedir
 Kolon kanserlerinde Siklin D1 mRNA ve proteini %50
oranında yüksek seviyede saptanmıştır
 Siklin D1 overekspresyonu gen amplikasyonu sonucu
değildir
 Siklin D1 overekspresyonu MMR genlerinin fonksiyonlarını
bozmaktadır

Lewis et al Cancer Research 2003, Bala et al Cancer Research 2003, Kong et al Cancer Research 2000.
 CCND1 Gen ve Siklin D1 Proteini (3)
 CCND1 geninde germline mutasyonlar bildirilmektedir
 Siklin D1 A870G polimorfizmi exon 4’te kodon 242’de yer
almaktadır
 Polimorfizm Siklin D1’in alternatif splice kapasitesini
artırmaktadır
 İmkomplet Siklin D1 proteinin yarılanma ömrü oldukça uzun
olup hücrede birikir
 Hücre proliferasyonunu hızlandırarak kolorektal kanserin
gelişme riskini artırmaktır.

Lewis et al Cancer Research 2003, Bala et al Cancer Research 2003, Kong et al Cancer Research 2000.
 Siklin D1 A870G Polimorfizmi

Marker

200 bp
167 bp 145 bp

100 bp AA AA GA GA GG