2

NI DUNG THC HNH

--------------------
Bi s 1: Cc quy tc an ton trong phng th nghim vi sinh vt
Bi s 2: Cc thit b phng th nghim vi sinh v cc phng php kh trng
Bi s 3: Thc hnh pha mi trng dinh dng
Bi s 4: Phn lp Nui cy Bo qun vi sinh vt
Bi s 5: Nghin cu mt s c im sinh hc ca vi sinh vt trn knh hin vi
3
BI S 1: CC QUY TC AN TON
TRONG PHNG TH NGHIM VI SINH VT
--------------------------------------
Thao tc an ton l yu cu cc k quan trng trong kim nghim vi sinh vt. Khi
lm vic vi vi sinh vt, chng ta thng thao tc vi s lng rt ln v m c t
bo vi sinh vt ( mc 10
9
t bo/ml). Nhiu chng vi sinh vt l tc nhn gy bnh
nn cn lun lun cn thn vi tt c cc chng ang thao tc. Mt khc, nhn vin
kim nghim cng phi s dng nhiu loi ha cht, trong c cc acid hoc nhng
ha cht c c tnh. Do vy, cn tun th mt s quy tc an ton m bo an ton
cho bn thn v cho nhng ngi khc trong phng th nghim nh sau:
- Nm vng nguyn tc, phng php lm vic vi vi sinh vt.
- Khng n ung, ht thuc trong phng kim nghim. Mang khu trang khi thao
tc vi vi sinh vt.
- Mc o blouse trong thi gian lm vic.
- Trc khi bt u lm cn st trng mt bn bng giy lau tm cn 70
0
hoc
dung dch cht dit khun khc (lysol 5%, amphyl 10%, chlorox 10%), kh.
Thc hin tng t cho hai tay. Ch cha t n cn hoc n Bunsen khi
tay cha kh cn. Lp li vic st trng ny sau khi hon thnh cng vic.
- Cn ghi ch tn chng, ngy thng th nghim ln tt c cc hp petri, ng
nghim mi trng, bnh nui cy.
- Khi l tay lm , nhim vi sinh vt ra ni lm vic, dng khn giy tm cht
dit khun lau k, sau thc hin kh trng li bn lm vic.
- Cn thn khi thao tc vi n cn hoc n Bunsen. Tt ngn la khi cha c
nhu cu s dng hoc ngay sau khi thc hin xong mi thao tc. Lu trnh
a tay, tc qua ngn la. Cn c cch bo v tc thch hp trng hp tc di.
- S dng qu bp cao su khi thao tc ng ht nh lng (pipette), khng ht
bng ming.
- Khi lm v dng c thy tinh, cn thn mang gng tay thu gom tt c mnh v
vo mt ti rc ring.
- Tch ring cht thi rn v cht thi lng.
- Tt c cht thi rn, mi trng cha hoc nhim vi sinh vt cn c hp kh
trng trc khi thi b vo cc bi rc. Cc dng c, bnh cha nhim vi sinh
4
vt cn c ngm vo dung dch cht dit khun (nc javel) trc khi ra v
ti s dng.
- Cn gi hoc rng bng bng keo khi t chng cc a petri ln nhau.
- Khng m hp petri v dng mi ngi trnh nhim vi sinh vt vo ng h
hp.
- Khi t que cy c dnh sinh khi vi sinh vt, cn t vng hoc u que cy
vo chn ngn la trnh s vng nhim vi sinh vt vo khng kh.
- St trng v ra tay sch s trc khi ri phng th nghim.
5
BI S 2: CC THIT B PHNG TH NGHIM VI SINH V
CC PHNG PHP KH TRNG
-------------------------
I. MC CH YU CU
1. Kin thc l thuyt: Cng c cc kin thc sau:
- nh hng ca cc nhn t vt l, ha hc i vi s tn ti v pht trin ca vi
sinh vt
+ Nhn t vt l bao gm: nhit , m, nh sng, pH ...
+ Nhn t ha hc bao gm: acid, base, mui kim loi, cn ...
- Nguyn nhn gy nhim cc dng c l do s tip xc vi khng kh, cc dng
c hay vt phm c vi sinh vt
2. K nng thc hnh: Hnh thnh v rn luyn cc k nng:
- Bao gi dng c v lm nt bng cho ng nghim
- Kh trng dng c v mi trng bng ni hp p sut cao v t sy
II. MT S DNG C V THIT B PHNG TH NGHIM VI SINH
1. Cc dng c thy tinh
a. ng nghim: c s dng cha mi trng nui cy vi sinh vt, c nt
bng gn khng thm nc hay bng nha chu nhit
Hnh 1: ng nghim
b. a petri: gm mt np ln v mt y nh p lng vo nhau, ng knh 8cm,
10cm, 12cm ......
Hnh 2: a petri
Nt gn
ng nghim
6
c. ng ht (pipette)
- ng ht c chia
- ng ht Pasteur
Nu khng c sn pipette Pasteur ta c th ch to t ng thy tinh ng knh
7mm, di khong 25cm vi 2 u c t trn cnh v nht gn khng thm nc.
khong gia ng thy tinh trn ngn n cn, xoay u cho n khi thy tinh chy
ra, mang khi ngn la v ko u tay nh th ta c c 2 pipette Pasteur
Hnh 3: Cch lm mt pipette Pasteur
d. Micropipettes (Pipetman)
y l pipet chnh xc, cho php ta ht c mt lng cht rt chnh xc.
Hnh 4: Micropipette
e. Cc dng c bng thy tinh khc
- Becher
- Bnh cu y bng v y trn
- Bnh tam gic (Erlen)
- Bnh Roux
2. Cc dng c thit b khc
Gn khng thm nc
n cn
ng ht Pasteur
7
a. Dy cy
- Dy cy thng: s dng cy su hay ly trch vi sinh vt trn mi trng c
- Dy cy vng: dng cy ria vi sinh vt trn trn mt thch hay phn lp vi sinh
vt trong mi trng lng hoc mi trng c
- Dy cy thc th: dng cy cc loi nm men, nm mc, x khun
Nhng loi dy cy ny thng lm bng kim loi khng b oxy ha nhit cao
b. T m: dng vi sinh vt hoc theo di s tng trng ca vi sinh vt
Hnh 5: T m
c. L Pasteur (xem phn sau)
d. Autoclave (xem phn sau)
e. Ni chng cch thy
III. BAO GI DNG C
1. Nguyn tc
- Dng c c bao gi phi m bo sch v kh.
- Bao gi phi kn v cn thn sau khi kh trng vn m bo s v trng ca
dng c trong lp giy gi v ly ra s dng d dng.
2. Phng php bao gi dng c
Vic bao gi dng c gm 2 khu:
- Lm nt bng: cho cc ng nghim, bnh tam gic, pipet, que trang
- Bao gi: cho hu ht cc dng c khc
a. Cch lm nt bng
- Vi cc ng nghim:
Ly mt t bng khng thm nc cun li
Dng que tre n vo gia cun bng
y cun bng ny gp i v t t vo ming ng nghim
Yu cu:
8
Nt c kch thc v cht va phi.
u nt trn, gn, phn ngoi ln hn phn trong.
Ly nt ra hay ng vo d dng
- Vi cc chai, l, bnh tam gic c kch thc ln: cch lm tng t nhng s
dng lng bng nhiu hn
- Vi cc pipet: dng mt si dy thp nh nht mt t bng vo u ln ca
pipet hn ch khng kh t ming ngi ht vo pipet
b. Cch bao gi dng c
Vi cc dng c sau khi lm nt bng cn bao gi phn c nt bng bng giy bo
khi kh trng nt bng khng b t v m bo iu kin v trng tt hn. Cch
lm nh sau:
- Ct cc on bng giy hnh ch nht vi kch thc ty theo dng c cn bao
gi.
- Qun quanh phn u c nt bng.
- Ct li tht cht
Yu cu:
- Phn giy bao bn ngoi phi cht v kn
- Bao bng giy du vi dng c hp t
- Bao bng giy bo vi dng c sy kh khi kh trng t.
Vi cc dng c nh pipet, que trang phi dng giy bao kn ton b. C th dng
hp nhm ng cc dng c trn kh trng.
IV. CC PHNG PHP KH TRNG DNG C
1. Nguyn tc
- Sau khi kh trng cn m bo:
S v trng tuyt i cho dng c v vt phm
Khng lm thay i cht lng mu vt
- Bo m an ton tuyt i cho con ngi
2. Cc phng php kh trng
Khi kh trng bng nhit, cc t bo sinh dng ca VSV b tiu dit d dng
trong khi cc bo t vn cn tn ti ngay nhit
Kh nng chu nhit ca vi sinh vt ph thuc vo:
- Tnh cht mi trng
9
- S lng t bo
- pH ca vt cn kh trng
Do vy kh trng bng nhit hiu qu cn xc nh ngng nhit thp nht
v khong thi gian ngn nht cn thit tiu dit ton b VSV v bo t ca chng
c trong dng c cn kh trng
C th kh trng bng phng php nhit kh hay nhit t
a. Phng php nhit kh
Kh trng bng t sy
- c thc hin trong t sy
- Cch tin hnh:
t cc dng c c bao gi vo t sy
Bt cng tc t hot ng
iu chnh thi gian v nhit thch hp (160
0
C trong 2h hoc 180
0
C
trong 30 pht)
Tt t sy, ngui ti 60
0
C ri m t ly dng c ra. Trnh m t ly dng
c khi nhit t cn cao s lm dng c thy tinh d v
Cc dng c sau khi sy m giy bao c mu hi vng l t yu cu. Nu
giy bao c mu nu chng t nhit kh trng cao lm bng v giy bin thnh
gondron (hp cht c tnh st trng) th khng th s dng dng ny nui cy VSV
c.
Kh trng bng cch t que la nng :
- Phng php ny dng kh trng que cy, ng ht, u ng nghim, ming
bnh tam gic sau khi ly nt bng ra.
- Cch kh trng:
H dng c trn ngn la n cn, a qua a li n 3 4 ln. Vi cc
dy mayxo u que cy phi nung cho tht ht chiu di dy cy.
i dng c ngui mi c s dng trnh v v vi khun khng b tiu
dit khi ly ging.
b. Kh trng bng sc nngt
un si trong nc
Phng php ny c s dng khi cn kh trng nhanh cc dng c: kim tim,
dao, ko, kp, cc ....
10
Cch tin hnh:
- Dng nc sch ngp dng c
- un si t 10 pht n 1h
un cch thy nhit thp (phng php kh trng Pasteur)
Phng php ny c dng kh trng nhanh cc thc phm d bin tnh
nhit cao
Cch tin hnh:
- un nng mi trng ln 65 70
0
C trong 15 30 pht
Phng php ny ch c tc dng c ch VSV khng c bo t
Hp cch qung 100
0
C (phng php Tyndal)
Phng php ny dng kh trng mt s loi mi trng nui cy men bnh
m, men gia sc, mc lm nc chm....
Cch kh trng:
- Hp trong trng 100
0
C t 30 40 pht.
- Ly ra t m 24 gi cho bo t vi khun pht trin
- Hp mi trng ln th hai 100
0
C trong 30 40 pht tiu dit cc bo t va
ny mm.
- Lp li qu trnh ny 3 4 ln
Kt qu: mi trng va c kh trng va c m bo khng thay i cht
lng.
Kh trng bng hi nc bo ha p sut cao (Autoclave)
Phng php ny c thc hin trong ni hp v
trng p sut cao. l thit b lm bng kim loi c tnh
chu nhit cao c kh nng t ng iu chnh nhit v
thi gian
Nguyn tc hot ng
- Lm tng nhit kh trng cc vt bng hi nc
di p sut ln hn p sut kh quyn. Khi p sut tng lm
nhit tng nh h thng van rt cht ch
Hnh 6: Autoclave
11
- Mi quan h gia p sut v nhit ca ni c biu hin qua bng sau:
p sut (atm) Nhit (
0
C)
0
0,5
1,0
1,5
2,0
100
112
121
128
134
Cch s dng:
- Chun b cc dng c cha mi trng cn kh trng
- Cho 3l nc ct vo ni hp ri kim tra mc nc cho ph hp.
- Ln lt a cc dng c, mi trng cn hp vo bn trong ni.
- ng cht ni hp.
- iu chnh kim ng h thi gian v p sut v v tr mong mun.
- Cm phch in
- Bt cng tc kh trng ni hp tin hnh hp.
- Khi kt thc qu trnh hp, ni s bo hiu bng ci.
- Gt cng tc kh trng v v tr dry
- Ch kim ch p sut tr v 0 mi m np ni ly dng c ra.
- Rt phch in
- Ghi nhn ngy - thng nm vo dng c sau khi kh trng.
CH : m bo an ton v hiu qu ca vic kh trng, ngi thc hin cn
phi:
- Kim tra li ni hp trc khi s dng
- Thc hin ng quy trnh hng dn
- Trnh cung cp in t ngt khng gy v dng c, nguyn liu hoc gy
n nguy him.
- Trc tip theo di qu trnh kh trng cho n khi kt thc v ngt in.
- nh k kim tra cht lng ng h p k v van an ton.
Tm li, phng php kh trng bng hi nc bo ha p sut cao l phng
php ph bin v hiu qu nht trong cc phng php kh trng nh kh nng tiu
dit cc t bo sinh dng ln bo t ca vi sinh vt.
12
c. Kh trng bng s lc
S dng cho mi trng lng, trong, c nhy yu, khng chu c nhit cao
hn 60
0
C. Cho mi trng i qua mt mng lc xp c ng knh l nh hn ng
knh ca vi khun. Khi , vi khun s b gi li trn mng lc cn dung dch i qua s
v trng. Mng lc thng l mng cellulose
d. Dit trng bng bc x
Tia t ngoi: Bc x thng dng nht l tia UV. Dng tia UV dit trng
khng kh phng bnh vin, phng v trng. Tia UV ch kh trng b mt m khng
thm su vo bn trong mu vt.
Tia m cc: Dit trng cc dng c gii phu, thuc, thc phm, tia m
cc c th tiu dit cc vt cho vo bao gi kn.
CU HI V BI TP
1. Thc hnh bao gi cc loi dng c?
2. Phn tch c s vi sinh vt hc ca cc phng php kh trng Pasteur, Tyndal?
3. Tm tt cch s dng ni hp p sut cao (autoclave)?
13
BI S 3: CHUN B MI TRNG NUI CY VI SINH VT
------------------------
I. MC CH V YU CU
1. Kin thc l thuyt: Cng c v hnh thnh mi cc kin thc sau:
- Khi nim mi trng dinh dng.
- Yu cu c bn ca mi trng dinh dng.
- C s phn loi mi trng dinh dng.
- Nguyn tc c bn ca vic ch to mi trng dinh dng
2. K nng thc hnh
- K nng s dng cc dng c: cn phn tch, ng ong, pipet, autoclave, t m.
- Cn ong, pha ch ha cht.
- Lm trong mi trng.
- iu chnh pH v kh trng mi trng.
- Kim tra kt qu kh trng.
- Bo qun mi trng
II. HA CHT NGUYN LIU DNG C
1. Ha cht nguyn liu
Ty theo yu cu v iu kin thc t ca PTN m ta chun b cc nguyn liu,
ha cht ca mt s loi mi trng SV thc hnh.
2. Dng c
- ng nghim
- Gi ng nghim
- a petri
- Bnh tam gic 250 ml
- Cc thy tinh 250 ml
- Pipet cc loi
- ng ong
- Phu thy tinh
- Giy lc, giy bao gi
- Bng khng thm nc, bng y t
- n cn
III. MI TRNG DINH DNG
14
1. Khi nim mi trng dinh dng
- Cc cht dinh dng l nhng hp cht tham gia vo qu trnh trao i cht ni
bo.
- Mi trng dinh dng l hn hp cc cht dinh dng v cc cht ny c
nhim v duy tr th oxy ha kh, p sut thm thu ca t bo v s n nh ca pH
trong mi trng.
2. Cc yu cu c bn ca mi trng dinh dng
- C y cc cht dinh dng cn thit
- C pH thch hp
- C nht nht nh
- Khng cha cc yu t c hi
- Tuyt i v trng
3. Phn loi mi trng dinh dng
Ngi ta da trn cc c s khc nhau phn loi mi trng
a. Cn c theo thnh phn v ngun gc: gm 3 loi
- Mi trng t nhin: c thnh phn l cc sn phm t nhin nh: trng, sa,
khoai ty, dch chit nm men, ng, cm. Thnh phn ha hc ca loi mi trng
khng c xc nh chnh xc do s khng n nh ca sn phm t nhin.
- Mi trng tng hp: cha cc cht ha hc m thnh phn ca chng c xc
nh v nh lng mt cch c th v chnh xc.
- Mi trng bn tng hp: cha c cc cht ha hc ln cc sn phm t nhin.
b. Cn c theo tnh cht l hc: gm 3 loi
- Mi trng lng: thnh phn mi trng ny khng cha agar v thng c
s dng nghin cu qu trnh tng hp ca vi sinh vt.
- Mi trng c: mi trng ny cha 1,5 2% agar hoc 10 20% gelatin.
Mi trng ny c s dng nghin cu cc c im hnh thi, sinh l ca vi
sinh vt.
- Mi trng bn lng: ch cha 0,3 0,7% agar
c. Cn c vo cng dng: gm cc loi sau:
- Mi trng c bn: thch hp cho nhiu loi vi sinh vt khc nhau.
- Mi trng chn lc: l mi trng m bo cho s pht trin u th ca mt
loi hay mt nhm loi vi sinh vt xc nh no .
15
- Mi trng kim nh: l mi trng cho php phn bit c mt s c im
ca mt s loi vi khun xc nh. Thng thng, ngi ta cho vo mi trng cht
ch th mu to ra nhng mu c trng.
4. Phng php pha mi trng
Pha mi trng thc hin vic phn lp, nhn ging, giu ging vi sinh vt, ng
thi nui cy v nghin cu cc c im sinh hc ca chng
a. Nguyn tc pha mi trng
- Da trn c s nhu cu v cc cht dinh dng v kh nng ng ha cc cht
dinh dng ca tng loi vi sinh vt.
- m bo s cn bng v p sut thm thu gia mi trng v vi sinh vt
nn cn iu chnh t l v nng cc cht trong thnh phn mi trng dinh dng.
- m bo cc iu kin ha, l cn thit cho cc hot ng trao i cht ca vi
sinh vt.
b. Cc bc pha mi trng dinh dng
Pha ch
Cn, ong tht chnh xc cc thnh phn mi trng v pha ch theo ng trnh
t hng dn trong ti liu.
- Mi trng lng: cn, ong cc cht ri cho vo nc
- Mi trng c:
Cn cc thnh phn ca mi trng cho vo nc ct.
Cn agar ri cho vo dung dch trn
Lm trong mi trng
Vic lm trong mi trng gip ta d dng quan st s pht trin ca vi sinh
vt.
- Vi mi trng lng: tin hnh lc bng vi tha hoc giy lc.
- Vi mi trng c: thng lc qua vi mn 2 lp hoc giy lc trong iu kin
c phu lc nng.
iu chnh pH ca mi trng
- Dng HCl 10% hoc NaOH 10% iu chnh pH.
- Mun kim tra pH, ta s dng my o pH v n nhy v cho chnh xc
cao. Nu khng c th s dng giy qu o pH nhng khng c chnh xc cao.
Phn phi mi trng vo dng c
16
Ngi ta thng phn phi mi trng vo a petri, ng nghim, bnh tam
gic. Trnh t phn phi nh sau:
- un cho mi trng ha lng.
- Mt tay gi dng c cha mi trng
- Tay cn li kp nt bng v ko ra.
- Nhanh tay mi trng vo dng c v y nt bng li.
- Ch :
i vi ng nghim: Nu mi trng lm thch nghing th lng mi
trng cn c phn phi chim 1/4 th tch ng nghim. Nu lm thch ng th
lng mi trng c phn phi chim 1/2 - 1/3 th tch ng nghim.
i vi bnh cu hay bnh tam gic : lng mi trng c phn phi
chim 1/2 - 2/3 th tch bnh.
Cc thao tc phn phi phi nhanh gn, kho lo mi trng khng
dnh vo ming dng c hoc nt bng v vic phn phi cn c thc hin xong
trc khi mi trng b ng c.
Kh trng mi trng
Ty theo tnh cht v iu kin c th ca tng loi mi trng m c ch v
phng php kh trng khc nhau.
Cc phng php kh trng thng c s dng l:
- Phng php Pasteur
- Phng php Tyndal
- Phng php lc bng dng c lc vi khun
- Phng php hp bng hi nc bo ha p sut cao
i vi cc dng c chu nhit (s, vi, thy tinh) kh trng 1,5 atm / 20
30 pht
i vi dng c cha 1l mi trng tr ln th hp 1 atm / 30 pht
Vi cc loi mi trng cha ng d bin tnh nhit cao th hp kh
trng 0,5 0,6 atm / 15 pht
Lm thch nghing, thch ng v thch vo a petri
Lm thch nghing: Cn tin hnh ngay sau khi kh trng mi trng v
mi trng cha ng c.
17
- t ng nghim c mi trng ln gi t nghing v khng c
mi trng chm vo nt bng.
- yn cho n khi mi trng ng c. Yu cu mt thch phi thng,
nhn v lin tc
Lm thch ng: t cc ng nghim c mi trng l thch ng vo gi,
yn cho mi trng ng c
mi trng vo a petri: Ton b qu trnh thch vo a petri c
thc hin trong t cy v trng v gm cc thao tc sau:
- M bao giy gi cc a petri
- Mt tay cm dng c cha mi trng
- Tay cn li m nt bng v h ming bnh trn ngn la n cn.
- M h np a petri. Nghing bnh v rt mi trng vo a petri.
- y np a li, xoay trn a mi trng c phn phi u bn trong
a.
- yn cho mi trng ng c.
- Lt ngc a li v bo qun.
CH :
- Thao tc mi trng phi nhanh v kho lo hn ch s nhim khun.
- Mt thch phi phng, nhn, c dy khong 2mm. Thng thng c khong
200 ml mi trng s phn phi c t 22 25 a.
- Sau khi phn phi mi trng vo a petri, kim tra li xem mi trng c b
nhim khun sau 1 2 ngy.
- Ghi ch mi trng (tn mi trng, ngy kh trng, hn s dng)
Bo qun v kim tra mi trng
- Mi trng cha s dng c bo qun ch mt (0 5
0
C) v khng mi
trng b kh.
- Trc khi s dng, kim tra v khun ca mi trng, ngi ta thng
t vo t m 37
o
C trong mt khong thi gian nht nh. Loi b mi trng b
nhim khun v ch s dng mi trng t yu cu.
IV. CNG THC V CCH PHA MT S LOI MI TRNG THNG
DNG
1. Mi trng nui cy vi khun (mi trng cao tht pepton)
18
Cng thc:
- Cao tht: 5g
- Pepton: 10g
- Nc ct: 1000ml
Cch pha mi trng nui cy:
- Cn chnh xc v cho cc thnh phn ca mi trng vo trong cc cha sn
1 t nc
- Khuy cho tan ht v thm lng nc theo yu cu
- un ln cho tan hon ton
- ngui v lng dung dch va un
- Lc bng vi hay giy lc
- Phn phi mi trng vo cc dng c kh trng
2. Mi trng nui cy nm men (Hansen)
Cng thc:
- Saccharose hoc Maltose: 50g
- Pepton: 10g
- KH
2
PO
4
: 3g
- MgSO
4
: 3 5 g
- Agar: 20g
- Nc ct: 1000ml
Cch pha ch mi trng nui cy:
- Cn chnh xc v cho cc thnh phn ca mi trng vo trong cc cha sn
1 t nc
- Khuy cho tan ht v thm lng nc theo yu cu
- un ln cho tan hon ton
- ngui v lng dung dch va un
- Lc bng vi hay giy lc
- Phn phi mi trng vo cc dng c kh trng
3. Mi trng nui cy nm mc (mi trng Czapek)
- Saccharose: 30g
- NaNO
3
: 30g
- K
2
HPO
4
: 1g
19
- MgSO
4
: 0,5g
- FeSO
4
: 0,01g
- Agar: 20g
- Nc ct: 1000ml
pH = 6, kh trng 1atm/30 pht
4. Mi trng nui cy x khun (mi trng Gauze 1)
- Tinh bt tan: 20g
- K
2
HPO
4
: 0,5g
- MgSO
4
.7H
2
O: 0,5g
- KNO
3
: 1,0g
- NaCl: 0,5g
- FeSO
4
: 0,01g
- Agar: 20g
- Nc ct: 1000ml
pH = 7,2 7,4 kh trng 0,5 atm/30 pht
V. CC PHNG PHP KH TRNG MI TRNG DINH DNG
1. Nguyn tc kh trng
Kh trng mi trng dinh dng nhm mc ch:
- Tiu dit ton b vi sinh vt ngoi lai hin din trong mi trng
- To iu kin v trng cho mi trng kt qu phn lp, nui cy chnh xc.
Do , khi kh trng mi trng phi m bo mt s iu kin nh sau:
- Khng lm bin tnh mi trng, khng lm bin tnh mt s cht trong mi
trng
- Sau khi kh trng, trong mi trng khng sn sinh ra cc cht c gy cht vi
sinh vt nui cy
- Phi m bo iu kin v trng tuyt i sau khi kh trng
- Bo m an ton i vi ngi s dng
2. Mt s phng php kh trng mi trng dinh dng
Phng php kh trng c s dng ch yu kh trng mi trng l
autoclave. Tuy nhin, ty tng loi mi trng khc nhau s c nhng iu kin kh
trng khc nhau
a. i vi mi trng cha cc cht d bin tnh (sa, cc ng)
20
- i vi mi trng cha sa: khng c kh trng trn 100
0
C v nhit
cao sa d b bin tnh. Do , i vi loi mi trng ny, ta tch ra lm 2 phn: sa
tin hnh thanh trng Pasteur, cn cc thnh phn khc c kh trng trong
autoclave. Sau , ha trn 2 thnh phn vi nhau.
- i vi mt s mi trng cha mt s cht d b phn hy nhit cao nh
urea th nu chng ta t pha ch th chia ra 2 phn kh trng cn nu mi trng
tng hp th ta kh trng bng cch s dng mng lc c kch thc l nh (0,45 m)
lc kh trng.
b. Mi trng thng thng
Tin hnh kh trng bnh thng vi cc iu kin thi gian v nhit c
khuyn co cho tng loi mi trng
CU HI V BI TP
1. Trnh by cc nguyn tc c bn ca vic pha mi trng dinh dng?
2. Cc bc pha mi trng dinh dng?
3. Mi nhm sinh vin thc hnh 3 loi mi trng.
4. Mi nhm SV thc hnh kh trng 1 trong 3 loi va pha bng autoclave v phn
phi vo ng nghim, a Petri.
5. Kim tra kt qu kh trng bng cch mi trng vo t m 37
o
C t 2 3 ngy
xc nh c vi sinh vt khng? Nu c, hy gii thch nguyn nhn ca hin tng
ny.
21
BI S 4: PHN LP NUI CY BO QUN VI SINH VT
----------------------------------
1. MC CH V YU CU CA BI
1. Kin thc l thuyt
- ngha ca vic phn lp, nui cy v bo qun vi sinh vt trong cng tc
nghin cu vi sinh vt hc
- Cc nguyn tc c bn ca qu trnh phn lp nui cy bo qun vi sinh vt
2. K nng thc hnh
- K nng phn lp vi sinh vt hiu kh
To ra cc khun lc ring r t qun th vi sinh vt
To ra cc khun lc ring r mi trng trn a petri cy chuyn
Kim tra tinh khit ca ging mi phn lp
- K nng nui cy vi sinh vt hiu kh
Cc thao tc cy chuyn t ng ging sang cc loi mi trng: thch
nghing, thch ng, thch a
Cc kiu cy khc nhau trn cc kiu mi trng trn
- K nng bo qun cc chng vi sinh vt thun khit
Bo qun trn mi trng thch
Bo qun trn ct, trn ht
Bo qun bng phng php ng kh
2. HA CHT NGUYN LIU DNG C
1. Ha cht, nguyn liu
- Mi trng thch ng, thch a, thch nghing nui cy vi sinh vt hiu
kh
- Cc ng ging nm men, nm mc
- t vn, ct, la
2. Dng c
- Que cy u trn, u nhn, hnh thc th
- Que trang, ng ht chia 1ml
- ng nghim, gi ng nghim, a petri
- n cn, dim qut
3. CCH THC PHA LONG MU
22
1. Nguyn tc
Pha long mu l mt trong nhng cng on c bn nhng rt quan trng trong
qu trnh phn tch vi sinh vt. Vic pha long mu cc nng thch hp s gip
ch rt nhiu trong qu trnh nh lng cng nh phn tch vi sinh vt
2. Phng php
- i vi mu cht lng: dng pipet ht 1 ml mu cho vo ng nghim cha 9
ml dung dch pha long, khi ta s c nng pha long l 10
-1
. Tip tc t ng
nghim 10
-1
ht tip 1ml v cho vo ng nghim cha 9 ml dung dch pha long
pha long 10
-2
. Tip tc nh vy n nng cn thit
- i vi mu rn: cn chnh xc 10 g mu, sau cho vo 90 ml dung dch pha
long nng pha long 10
-1
. V tip tc pha long tng t nh mu nc
Hnh 7: Phng php pha long
4. PHN LP VI SINH VT
1. Nguyn tc
- Tch ri cc t bo vi sinh vt
- Nui cy cc t bo trn trong mi trng dinh dng to khun lc ring r
2. Qu trnh phn lp vi sinh vt dng thun khit: gm cc bc:
- To ra cc khun lc ring r t qun th vi sinh vt ban u
- Phn lp cc vi sinh vt thun khit
- Kim tra tinh khit ca vi sinh vt
a. To ra cc khun lc ring r trn mi trng phn lp
- Nu mu ban u dng rn th phi chuyn v dng lng bng cch:
Nghin mu
Ha tan mu vo nc ct v trng ri pha long
23
Sau thc hin nh l mu dng lng:
Tip tc pha long cc nng cn thit
Cy mu trn mi trng c trng
- Ch : nu khng c mi trng c trng c th s dng mi trng m vi
sinh vt pht trin bnh thng nhng c b sung cc cht c ch cc vi sinh vt khc
pht trin.
b. Phn lp vi sinh vt trn mi trng thch trn a petri
i vi vi sinh vt hiu kh
- Ht 0,1 ml dch mu pha long cho vo a petri c mi trng thch hp.
- Dng que trang tri u mu khp mt thch
- Tip tc s dng que trang ny tri u khp mt thch a th 2, th 3..
- cc a trn nhit thch hp trong 1 khong thi gian nht nh ta s thu
c cc khun lc ring r
c. Kim tra tinh khit ca ging mi phn lp
Kim tra vt cy
Quan st s sinh trng ca vi sinh vt trn mi trng thch
- Nu vt cy c b mt v mu sc ng u, thun nht chng t ging mi
phn lp tinh khit th gi li
- Nu vt cy khng thun nht th loi b
Kim tra thun ca cc khun lc
- Chn cc khun lc ring r trn mi trng thch nghing
- Tch cc khun lc ny ra, ha tan v pha long nng cn thit trong nc
ct v trng.
- Nh 1 git dch trn vo a petri c mi trng.
- Dng que trang tri u dch khp mt a petri th nht, ri a th 2, th 3.
- a petri nhit v thi gian thch hp.
- Sau quan st cc khun lc ring r. S thun khit ca khun lc l biu
hin s thun khit ca ging
3. Phn lp mt s vi sinh vt trong thc t
a. Phn lp vi khun Bacillus subtilis
- C kh ct nh cho vo bnh tam gic
- B sung thm: mt t phn v nc sch cho ngp c
24
- un si 15 pht dit cc t bo sinh dng v cc t bo khng sinh bo t.
- y nt bng v t m 25 26
0
C trong vng 48 72h
- Kt qu:
Xut hin lp vng xm c nhiu vi khun B.subtilis v c kh bao gi
cng xut hin bo t ca vi khun ny
Trn knh hin vi: T bo vi khun B.subtilis c hnh que, di, bo t
hnh ovan nm xa tm hay gn tm khun lc. T bo c kch thc 3 5
x 0,6 m.
Hnh 8: T bo vi khun Bacillus subtilis quan st di knh hin vi
b. Phn lp nm mcAspergillus oryzae, Aspergillus niger v Mucor
- C th phn lp nm mc ny trn cm ngui, xi lm mc tng, bnh m
kh t ngy.
- Thng qua mu sc ca mc nhn din:
Mc c mu trng: Mucor hoc Rhizopus
Mc c mu en: Aspergillus niger
Mc c mu xanh lc: Penicillum italicum
- Dng que cy hnh thc th ly 1 t si nm cy vo mi trng thch nghing
thch hp (Czapek)
Penicillum Aspergillus niger Rhizopus
Hnh 9: Hnh dng mt s nm mc
25
c. Thu nhn nm men
- C th phn lp nm men d dng t cc mi trng nh:
B mt tri cy hoc dch p mt s tri cy nh to, l, nho, du....
Trong ru np, trong cc bnh men ru, bia, nc ma vi hm, ht
kefir....
- Di knh hin vi, nm men c dng hnh cu hay hnh trng. T bo c kch
thc ln, c kh nng ny chi. Khun lc c mu trng sa
- Chn khun lc nm men ring r v cy vo mi trng thch hp (mi trng
Hansen).
(a) (b)
Hnh 10: Nm men Saccharomyces cerevisiae di knh hin vi quang hc (a) v
knh hin vi in t (b)
d. Thu nhn x khun
- C th thu nhn x khun d dng t t, nc, trn cc c cht ng vt, thc
vt v s dng mi trng Gauze 1 phn lp
- Phn bit x khun trn mi trng Gauze 1:
Khun lc vi khun nhy, t
Khun lc vi khun bng xp, c dng si
- Sau khi cy 0,1 ml dch mu t vo mi trng, cn ch : nui trong t m
(28
0
C) t 7 15 ngy mi ly ra chn khun lc ring r cy chuyn
Hnh 11: X khun
26
5. PHNG PHP NUI CY VI SINH VT
1. Khi nim
Qu trnh nui cy vi sinh vt gm 2 khu: nui v cy
- Nui: l qu trnh m bo v duy tr nhng iu kin thun li nht cho s
hot ng v pht trin ca vi sinh vt
- Cy: l nhng thao tc chuyn vi sinh vt t mi trng ang sng sang mi
trng thun li hn cho s pht trin ca chng
Hai khu ny gn b vi nhau trong qu trnh nghin cu v ng dng vi sinh vt
2. Mc ch
- Pht hin s c mt ca vi sinh vt trong cc nguyn liu vt phm cn nghin
cu.
- Tin hnh nhn ging vi sinh vt mt cch nhanh chng
- Bo tn cc ging thun khit.
- Nghin cu cc c tnh sinh hc v h thng sinh hc ca chng.
3. Nguyn tc
- Mi thao tc nui cy u phi thc hin trong iu kin v trng trnh
nhim khun.
- Mi trng v dng c nui cy phi c kh trng
- Duy tr cc iu kin thun li vi sinh vt pht trin
4. Cc phng php cy
a. Phng php chung ca vic cy chuyn
Hnh 11: Phng php cy chuyn mi trng lng sang mi trng lng
27
- Dn nhn ghi: tn ging vi sinh vt + ngy cy
- Mt tay cm 2 ng nghim: mt ng ging v 1 ng mi truong
- Tay cn lai cm que cy v dt do dy cy trn ngon lua dn cn d khu trng
- Dng ngn t v ngn p t rt nt bng cua ng ging ra.
- Ho nong khu trng ming ng nghim
- Doi que cy ngui, dua que cy vo ng nghim ly khun lac trong ng ging.
- Rt que cy ra v tin hnh cy chuyn trong ng mi truong
- Khu trng lai phn khng khi noi ming ng nghim ri dy nut bng.
- Khu trng lai que cy sau khi su dung xong
CH :
- Nu ng ging la canh truong th dng pipet ht canh truong thay cho que cy.
- Thao tc khu trng ng hut bt du tu du nho ng hut sau khi d tho giy bao
gi.
- Sau khi su dung, cm ng hut vo cn 70 d khu trng
b/ Phng php cy trn thch nghing
Phuong phap nay d cy chuyn cac vi sinh vt hiu khi:
- Su dung que cy vng tin hnh cc thao tc theo dung trnh tu d nu trn
- Thuc hin vic cy ging vo ng thach nghing bng cac thao tc tip theo:
Ha ging o du que cy vo giot nuoc o day ng nghim
Nhe nhang luot que cy trn mt thach theo cc kiu: hnh chu chi, vng
xon, vach ngang song song
c. Phng php cy trn thch ng: dung d cy vi sinh vt ky khi
- Su dung que cy hnh kim.
- Sau khi ly sinh khi, dng que cy ny dm su vo khi thach. Dm sat day
ng nghim va dm thanh 3 duong: 1 duong giua va 2 duong sat thnh ng.
- Duong cy phai thng, nhe nhang d khng gy nut, v mi truong
d. Phng php cy trn a petri
Dng que cy vng
28
Hnh 12: Phng php cy chuyn t mi trng lng sang mi trng thch
- D dia petri ln bn
- Dng que cy ly sinh khi vi sinh vt
- Mo he np dia petri du d cho que cy vo
- Nhe nhang va nhanh chong luot que cy ln mt thach theo 1 trong cc kiu sau
Theo hnh chu chi trn ton b mt thach
Theo nhung duong song song
Theo 4 hnh chu chi 4 gc
Hnh 13: Kt qu sau khi cy
Dng pipet: dung d dinh luong vi sinh vt. Co 2 cach thuc hin:
29
- Cch 1:
Trn dich cy vo thach bng cach hut 0,1 ml dich nghin cuu cho vo
ng nghim co mi truong thach o nhit d 50
0
C
Dy nut bng lai, lc nhe cho vi sinh vt phn phi du trong mi truong
D thach nay vao dia petri d khu trng
Xoay trn dia d thach phn b du mt dia
D yn cho mi truong dng dc v u o nhit d thich hop
- Cch 2:
Ht 0,1 ml dich cn nghin cuu cho vao dia petri co mi truong dc
Dng que trang trai du khp mt dia
U o nhit d v thoi gian thich hop
e. Kt qu ca vic nui cy
Sau khi nui cy o nhit d v thoi gian thich hop cho mi loai vi sinh vt ta
thy:
- Trong mi truong long: vi khun phat trin s lam duc mi truong
- Trong mi truong rn o thach nghing:
Nm men, vi khun phat trin s tao nhung vt ni thach trong hay trng
duc
Nm mc s tao nn nhung soi manh tu vt cy
6. BO QUN CHNG VI SINH VT THUN KHIT
1. Nguyn tc
- Dam bao tt cac diu kin trong qua trnh bao quan d khng lam thay di
phm cht ban du cua ging.
- Lm chm qua trnh trao di cht v h hp o vi sinh vt dng thoi ngn can
qu trnh sinh san cua chung
2. Cc phng php bo qun
a. Phng php cy chuyn nh k trn mi trng mi
Phuong phap nay ap dung d bao quan tt ca cac loai vi sinh vt
- Voi nm men, vi khun: cy chuyn sau 1 2 thng
- Voi nm mc: cy chuyn sau 3 6 thng
Thoi gian giua 2 ln cy c th keo dai hon nu sau khi cy vi sinh vt ta bao quan o
nhit d thp (3 5
0
C)
30
- Uu dim: phuong phap nay don gian, d lm, thoi gian bao qua khng lu
- Nhuoc dim: Tn mi truong, cng suc, thoi gian. Phm cht ban du cua
ging co th bi thay di do nhiu nguyn nhn kh xac dinh cu th trong qua trnh cy
chuyn.
b. Phng php gi ging trn t, ct, ht
Trn t, ct: bao quan bo tu tim sinh (bo tu v tinh) v thoi gian bao
quan l mt hoc nhiu nm
Cch bo qun:
- Dt, cat dem ry d ly hat du v ngm trong HCl hay trong H
2
SO
4
dm dc 8
12 h d loai bo cac acid huu co trong cat
- Rua k duoi vi nuoc cho dn khi pH trung tinh
- Sy kh v giu o diu kin v trng.
- D dy cat vo ng nghim chua vi sinh vt phat trin trn mi truong thach v
lc tht du.
- Rt ton b cat v vi sinh vt vo mt ng nghim khac
- Hn kn ming ng nghim ny s giu duoc rt lu.
Trn ht: bao quan cac chung co dang soi dang sinh bo tu hoc khng.
Thoi gian bao quan co th dat 1 nm
Cch bao quan:
- Hat ngu cc duoc rua sach
- Nu cho hat vua nut, d rao nuoc
- Cho cc hat ngu cc vo cc ng nghim.
- Phu trn mt cac hat ny mt lop bng thm nuoc nu hat ngu cc
- Cy ging vi sinh vt trn lop bng cho moc tht dy
- Giu o nhit d 15 20
0
C.
c. Phng php ng kh
- Phuong phap nay lam cho t bo mt nuoc o trang thai tu do. Dng thoi lm
giam, thm chi ngung hn qua trnh phn chia cua vi sinh vt. Nho do chung
chiu duoc nhiu tac dng cua ngoai canh
- Phuong phap nay dng nhiu trong san xut, thoi gian bao quan ln toi vi chuc
nm
31
CU HI V BI TP
1. Nu tm tt cac nguyn tc va phuong phap chung d phn lp vi sinh vt dang
thun khit
2. Nu va phn tich diu kin chinh cua qua trnh nui cy vi sinh vt?
3. Thuc hnh vic cy chuyn tu cac ng ging co sn sang cac mi truong
32
BI S 5: NGHIN CU MT S C IM SINH HC CA VI
SINH VT TRN KNH HIN VI
-----------------------
I. MC CH YU CU
1. Kin thc l thuyt
- Dc dim sinh hoc cua cac nhom vi khun, xa khun, nm mc, nm men.
- nghia cua vic nghin cuu cac dc dim sinh hoc cua cac nhom vi sinh vt
- Cac dc dim sinh hoc dc trung cua mi nhom vi sinh vt
2. K nng thc hnh
- K nng su dung kinh hin vi quang hoc
- K nng lm tiu ban tam thoi, tiu ban c dinh.
- K nng nhum mu cc tiu ban
- K nng quan sat cac dc dim sinh hoc cua vi sinh vt trn knh hin vi quang
hoc
II. HA CHT NGUYN LIU DNG C
1. Khi nim thuc nhum
- Thuc nhum l hop cht hoa hoc dung d nhum mu
- Cn cu vo tnh cht hoa ly, chia lm 2 loai thuc nhum chinh:
Thuc nhum kim l thuc nhum trong do gc kim co kha nng
nhum mu, chng kt hop cht ch voi phn nhn t bo.
V du: thuc nhum tim gentian, Iuchsin kim, saIranin
Thuc nhum acid l thuc nhum m gc kim co kha nng kt hop
cht ch voi cac thnh phn t bo cht
Trong nghin cuu vi sinh vt, nguoi ta su dung chu yu l thuc nhum kim v t
bo cua chung bt mu rt tt voi loai thuc nhum ny
2. Mt s loi thuc thum c s dng
Thuc nhum Fuchsin:
1/ Ruou ethylic 96
0
: 10 ml
Fuchsin kim: 0,3g
2/ Phenol: 5g
Nuoc ct: 95 ml
Trn dung dich 1 v dung dich 2 lai ri pha long 5 ln
33
Xanh Methylen 0,001%
Xanh methylen: 0,1g
Nuoc ct: 1000ml
Xanh Methylen Loeffler
Ruou ethylic: 300ml
Xanh methylen: 20g
Ha tan hn hop trn ri loc trong (1)
Dich loc (1) 30ml
KOH 1%: 1ml
Nuoc ct: 1000ml
Dung dch lactophenol
Phenol kt tinh: 10g
Acid lactic: 10g
Glycerin: 20g
Nuoc ct: 10ml
Tm gentian
- Cng thuc:
1/ Gentian violet: 1g
Ruou ethylic 96
0
: 10ml
2/ Phenol tinh khit 5g
Nuoc ct 100ml
- Cch pha ch:
Dung dua thuy tinh khuy cho tan ht gentian violet trong ruou
Trn 2 dung dich (1) v (2) ri loc trong
D dich loc trong lo mu
- Ghi ch: Ha mt phn cn voi thuc nhum cho tan ht ri cho acid vo, lc
du. Tip tuc thm cn cho dn khi mt ht vang kim loai trn mt
Dung dch lugol
- Cng thuc: Iod tinh th : 1g
KI: 2g
- Cch pha ch:
Nuoc ct: 300 ml
34
Ha KI vo trong 5ml nuoc ct cho tan ht ri cho iod tinh th vo
B sung du 300ml nuoc sau khi iod tan ht
Cn 95%
Aceton
3. Nguyn liu
- Ong thach nghing cy cac loi vi sinh vt sau:
Bacillus subtilis, Sarcina lutea
Penicillum italicum, Aspergillus niger
Streptomyces grisea
Saccharomyces cerevisiae
- Mi truong Hansen nui cy nm men Saccharomyces cerevisiae
- Mi truong cao thit pepton dich th cy E.Coli.
- Nuoc ct v trng
4. Dng c
- Lame, lamelle
- Que cy, dn cn
- Giy loc
- Bocan, cu thuy tinh
- Bnh tia
- Tm tre v trung
- Knh hin vi, du soi
III. LM TIU BN TM THI
1. Cc c im ca tiu bn tmthi
- Thao tc lm tiu ban don gian, tin hnh nhanh.
- Quan sat duoc cac trang thai sng cua t bao nhu: su chuyn dng cua tin mao,
su sinh san, su hnh thnh bo tu.
- Chi su dung mt ln ri bo di
2. Cch ly ging vi sinh vt lm tiu bn
- Dt dn cn ln
- Mt tay cm ng nghim chua vi sinh vt
- Tay cn lai cm que cy d khu trng
- Ko nt bng ra khoi ng nghim v khu trng ming ng nghim
35
- Dua que cy vo ly sinh khi vi sinh vt.
- Rt que cy ra, khu trng ming ng nghim
- Dua giot mi truong (hoc sinh khi) vi sinh vt o du que cy dt vo giua
lame d lm vt bi
- Khu trng lai que cy
3. Cch lm tiu bn git p
- Dng que cy ly ging vi sinh vt d lm vt bi
- Dt lamelle ln giot canh truong, tranh tao bot khi
- Quan st trn knh hin vi
- Ch :
Nu giot dich qua nhiu, trn ra ngoi lamelle th dng giy thm bot nuoc di
Nu cn quan sat lu th dng vaselin bi quanh mp lamelle d giot dich khoi
bi kh.
4. Cch lm tiu bn tm thi c nhum mu
a. Nguyn tc
Phuong phap nay su dung thuc nhum khng hoc it dc di voi vi sinh vt v
duoc pha long o nng d dam bao cho vi sinh vt vn sng v hoat dng sau khi
nhum mu
b. Cch nhum: C 2 cch nhum vi khun sng:
Cch 1:
- Nho 1 giot thuc nhum xanh methylen 0,001 ln lame
- Nho 1 giot canh truong vi sinh vt voi thuc nhum
- Dy lamelle
- Quan st tiu ban o vt kinh X10 v X40
Cch 2
- Nho 1 giot thuc nhum xanh methylen 0,001 ln lame
- Dng que cy dan du thnh 1 vng nho ri d kh tu nhin.
- Nho 1 giot dich vi khun ln vung mau d kh
- Quan st tiu ban voi vt kinh X10 v X40
IV. LM TIU BN C NH
1. Cc c im ca tiu bn c nh
36
Quan st tiu ban c dinh l mt phuong phap ph bin trong nghin cuu vi
sinh vt hoc v n c uu dim sau:
- Tuy thao tc phuc tap nhung tiu ban co mau sc dep, giu duoc lu
- Cho php ta quan st r rng hnh dang v cu tao cua t bo, d dang dm s
luong vi sinh vt.
- Khng so ly nhim khi lm vic voi vi sinh vt gy bnh.
2. Cc bc tin hnh tiu bn c nh
a. Lm vt bi
- Chon lame sach v kh
- Ly sinh khi vi sinh vt cho vo giua lame.
- D vt bi kh tu nhin trong khng kh
- Ch :
Luong vi sinh vt ly vua phai
Vt bi trn gon, tht mong
Cc t bo vi sinh vt duoc dan du d quan sat
b. C nh vt bi
- Vic c dinh vt bi nhm cac muc dich sau:
Git cht vi sinh vt d chung d bt mu v an ton khi tip xuc.
Gn cht vi sinh vt vao lame d luc rua khng bi tri mu
- Cc cch c dinh:
C dinh bng nhit
La phuong phap don gian v ph bin nht
Dng kep g hay kep st d kep lame
Ho mt duoi cua lam trn ngon lua dn cn, tranh khng d qua nong
C dinh bng hoa cht:
Cch ny tuy phuc tap nhung khng gy bin dang t bo, khng gy
bin di cu truc t bao va khng lam dut cac tin mao.
Dng cc ha cht la ruou va aceton d c dinh vt bi
Cch c dinh:
Nhng vt bi vao ruou. Voi ruou ethylic ngm 5 15 pht, cn
voi ruou methylic ngm 2 5 pht.
Ngm vt bi vo dung dich aceton trong 15 phut
37
Nho vi giot ruou 95 ln vt bi. Dt chay v dy tt ngay. Lm
nhu vy vi ln ri d kh
3. Nhum mu tiu bn c nh
a. Nguyn tc
- Su dung thuc nhum co kha nng thm thu qua mng t bo v kt hop voi
cc thnh phn khac nhau cua t bo thnh nhung hop cht mau dc trung bn
vung.
- Ty theo muc dich nghin cuu v kha nng bt mu khc nhau cua nhung thnh
phn t bo m chon loai thuc nhum v cch nhum cho ph hop.
- C 2 cch nhum chinh:
Nhum don: Chi dng mt loai thuc nhum trn 1 tiu ban
Nhum kep: Dung dng thoi 2 hay nhiu loai thuc nhum trn 1 tiu
ban
b. Cch nhum
- Dt tiu ban ln cu thuy tinh
- Nho vo vt bi vi giot Fuchsin, d yn 1 2 pht.
- Rua vt bi bng cach nghing lame, dng bnh tia xit nuoc cho chay nhe qua
vt bi cho dn khi khng cn mu nua.
- Dng giy thm kh tiu ban hoc ho nhe tiu ban trn den cn.
- Quan st tiu ban o vt kinh X40 v X100 dng du soi
V. QUAN ST C IM SINH HC CA CC NHM VI SINH VT
1. Quan st cc c im sinh hc ca vi khun (Bacteria)
a. Cc c trng sinh hc cn quan st vi khun
- Cc kiu hnh dang cua t bo
- Cc kiu lin kt giua cac t bo
- Kha nng di dng
- Kha nng hnh thnh bo tu
- Nhum Gram
b. Cch quan st
Quan st cu khun
- Lm tiu ban giot ep voi ng thach nghing cy vi khun Sarcina lutea.
- Quan st cc tiu ban trn knh hin vi voi vt kinh X40
38
- Yu cu:
V hnh dang t bo, cc kiu lin kt giua cac t bo
Nhn xt v su chuyn dng cua t bo
Quan st trc khun
- Lm tiu ban giot ep voi vi khun E.Coli trong mi truong dich th (1)
- Lm tiu ban nhum don voi vi khun Bacillus subtilis nui cy trong thach
nghing (2)
- Yu cu:
Tiu ban 1: quan sat o vt kinh X40. V hnh, nhn dang su chuyn dng
cua t bo.
Tiu ban 2: quan sat o vt kinh X40 v X100 bng du soi
V hnh v nhn xet v hnh dang t bo; hnh dang, s luong v vi tri
cua bo tu trong t bo
Quan st xon khun
- Lm tiu ban c dinh nhum mu voi bua rng d quan sat vi khun Vibrio,
Spirochae, Spirillum.
- Ch : dung tm ly bua rng lm vt bi
- Ly bua rng vua phai, dan du moi quan sat duoc
- Quan st o vt kinh X40 v X100 bng du soi
- V hnh cc dang xon khac nhau cua vi khun (xon tu 1 vng dn nhiu
vng)
a) b) c)
Hnh 13: Cc hnh dng chnh ca vi khun
a) cu khun
b) truc khun
c) phy khun hay xon khun
2. Quan st c im sinh hc ca x khun(Actinomycetes)
39
a. Cc c im sinh hc c trng cn quan st
- Hnh dang bo tu
- Dc dim cung sinh bo tu
- Phuong thuc hnh thnh chui bo tu
b. Cch quan st
- Lm tiu ban giot ep voi Streptomyces grisea trn thach nghing (khi lm tiu
ban ny phai dng que cy du nhon dm khun ty xa khun trong giot nuoc v
tch roi cc soi, sau do dy lamelle ri quan sat)
- Lm tiu ban nhum don voi xa khun trn
- Yu cu: Quan sat tiu ban o vt kinh X10 v X40. V hnh v nhn xet hnh
dang chung cua xa khun.
- Lm tiu ban quan sat cung sinh bo tu:
Cy xa khun vao mi truong trn dia petri
Dng lamelle cm vo b mt thach nghing mt goc 45
0
.
Dy dia petri thich hop v u o nhit d thich hop
Sau do ly lamelle ra, dy ln lame v quan st
- Lm tiu ban quan sat bo tu
Dng lame n nhe ln mt thach d c xa khun moc
Quan st trn knh hin vi voi vt kinh X100
V hnh v nhn xet v cung sinh bo tu v bo tu xa khun
3. Quan st c im sinh hc ca nm mc (Molds)
a. Cc c im sinh hc c trng cn quan st
- Dc dim cua soi nm: mu sc, co vach ngn hay khng?
- Dc dim cua co quan sinh san: hnh dang, cach sp xp cac b phn cua co
quan sinh san.
- Hnh dang, cu tao, cch sp xp cua bo tu
b. Cch quan st
- Lm tiu ban nm mc khng nhum mu
Nho 1 giot lactophenol ln lame
Dng que cy ly khun lac nm Penicillum hoc Aspergillus niger v
dn mong
Dy lamelle v quan st o vt kinh X10 v X40
40
V hnh v nhn xet chung hnh dang cua soi nm; vi tri, hnh dang, cach sp xp
chung cua bo tu, th bnh, cung th bnh, cung bo tu dinh cua 2 loai nm mc trn
- Lm tiu ban nm mc nhum mu:
Nho 1 giot dung dich xanh cotton ln lame
Ly 1 it soi nm dan du trn lame
Dy lamelle v quan st o vt kinh X40
V hnh cu tao soi nm va co quan sinh san
4. Quan st c im sinh hc ca nm men (Yeasts)
a. Nhng c im sinh hc cn quan st
- Hnh thi, kch thuoc t bo nm men
- Su ny chi cua nm men
- Hnh dang, s luong bo tu trong 1 tui bo tu
b. Cch quan st
- Lm tiu ban nhum don nm men cy trong mi truong xanh methylen LoIIler
- Yu cu:
Quan st knh hin vi o vt kinh X40 v X100
V hnh ch thch mng t bo cht, khng bo cua t bo
VI. PHNG PHP NHUM GRAM
1. Ha cht nguyn liu - dng c
a. Ha cht Nguyn liu
Ha cht
- Cc loai thuc nhum
- Nuoc mui sinh ly: dung dich NaCl 0,85
Nguyn liu
- Cc ng thach nghing nui cy cac ging vi sinh vt: B.subtilis, E.Coli.
b. Dng c
- Ong nghim dung nuoc ct v trng
- Lame, lamelle
- Que cy, dn cn, dim quet
- Bnh dung nuoc rua tiu ban
- Chu thuy tinh
- Cc thuy tinh, cu thuy tinh
41
- Knh hin vi, du soi kinh
- Giy loc, kep st
2. Nguyn tc nhumgram
Dua trn kha nng bt mu cua t bo cht v mng t bo voi thuc nhum tim kt
tinh v iod m hnh thnh nn hai loai phuc cht khac nhau
- Loai phuc cht thu nht vn giu nguyn mu cua thuc nhum nn khng bi
rua tri khi xu ly bng cn. Vi sinh vt co phuc cht ny l vi khun gram duong.
- Loai phuc cht thu hai khng giu duoc mu cua thuc nhum nn mt mu khi
xu ly bng cn v bt mu cua thuc nhum b sung. Vi sinh vt co phuc cht ny
thuc loai gram m.
3. Cc bc tin hnh
- Lm tiu ban
Dng que cy ly nuoc v trung d lm 3 vt bi trn lame (hai du v giua
lame).
Dng que cy ly mt chut sinh khi lm vt bi theo thu tu sau:
Bn tri lame l B.subtilis
Bn phai lame l E.Coli
O giua lame l B.subtilis trn ln voi E.Coli
D kh vt bi trong khng kh hoc c dinh nhe trn den cn.
- Nhum tiu ban:
Dt 3 ming giy loc ln 3 vt bi
Nhum tiu ban bng thuc nhum tim kt tinh qua giy loc trong 1 phut.
Nhum lugol trong 1 phut
Rua nuoc
Ty cn trong 30 giy, d nghing tiu ban, nho tu tu tung giot cn cho dn
khi tan ht mu
Rua nuoc
Nhum b sung Fuchsin hoc saIranin tu 10 30 giy
Rua nuoc
Lm kh v soi tiu ban voi vt kinh du
- Kt qua:
Voi vt bi cua B.subtilis mu tm gram duong
42
Vt bi trn B.subtilis + E.Coli c mu hng ln mu tm
Vt bi cua E.Coli mu hng - gram m
Hnh 14: Cc bc nhum gram
Hnh 15: Kt qu sau khi nhum gram
CU HI V BI TP
1) Thuc hnh lm tiu ban giot ep di voi vi khun E.Coli. V hnh v ch thch cc
dc dim quan sat duoc.
2) Thuc hnh lm tiu ban nhum don voi vi khun B.subtilis, vi khun bua rng. V
hnh v ch thch cc dc dim quan sat duoc
43
3) Lm tiu ban nhum mu A.niger. V hnh v ch thch cc co quan mang bao tu
cua chung
4) Trnh by nguyn tc v nghia cua vic nhum kep.
5) Nu tn cc loai thuc nhum su dung trong nhum gram
6) Trnh by cua nguyn tc nhum gram
7) Tm tt phuong phap nhum gram. V hnh, ch thch kt qua nhum gram