PROSEDUR PEMERIKSAAN VIRUS IKAN KARANTINA1

Agus Sunarto2

PENDAHULUAN Indonesia sebagai bagian dari komunitas international harus mematuhi peraturan dan kesepakatan-kesepakatan regional maupun international. Ditingkat regional, ada pasar bebas ASEAN (AFTA) ang sudah dimulai tahun lalu. Di tingkat internasional ada ang menuntut diberlakukann a kesepakatan !ATT-"T#, S$S Agreement dan #IE

berbagai standar, termasuk standar pemeriksaan pen akit ikan karantina. Seiring dengan pasar bebas adalah meningkatkan %olume perdagangan termasuk di dalamn a lalu-lintas ikan hidup lintas batas. $eningkatan lalu-lintas ikan berarti peningkatan an&aman pemasukan pen akit ke dalam 'ila ah negara Indonesia. $eran karantina sebagai pen(aga pintu gerbang pemasukan dan pengeluaran ikan men(adi sangat penting. Salah satu usaha ang perlu digalakkan oleh karantina dalam menghadapi tantangan tersebut adalah peningkatan kemampuan dalam bidang diagnosa pen akit ikan dengan standar internasional, baik dengan menggunakan metode berbasis histologi, imunologi maupun biologi molekuler. Teknik diagnosa berbasis imunologi ang biasa dipakai untuk pemeriksaan pen akit %irus ikan karantina antara lain tes netralisasi (neutralisation test), imunohistokimia (immunohisto&hemistr ), FAT (Fluorescent Antobody Test), IFAT (Indirect Fluorescent Antobody Test) dan E)ISA (enzyme-linked immunosorbent assay). *eberapa teknik diagnosa berbasis biologi molekuler ang telah dipakai untuk pemeriksaan pen akit %irus ikan karantina antara lain $+, (Polymerase Chain Reaction) untuk pemeriksaan %irus DNA, ,T-$+, (Reverse Transcriptation Polymerase Chain Reaction) dan in situ hybridisation. -akalah ini men(elaskan prosedur pemeriksaan %irus pada ikan dengan berbagai teknik diagnosa diatas, termasuk teknik pembuatan preparat histologi ang merupakan ilmu dasar untuk diagnosa pen akit ikan. $rosedur ini sedapat mungkin dibuat dalam bentuk tahap demi tahap (step by step), sehingga mudah dipahami dan se&ara teknis mudah diker(akan.

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------.. 0.

-ateri disampaikan pada $elatihan Tenaga Terampil $etugas /arantina Ikan, +ia'i 01 -aret 0223 $eneliti di )aboratorium ,iset /esehatan Ikan, *adan ,iset /elautan dan $erikanan, 4akarta

2
Jenis Pe eri!saan Pen"a!it Virus #an $ara Pen"ia%an Sa %e& I!an Salah satu kun&i keberhasilan pemeriksaan %irus dan patogen lain pada ikan adalah penanganan sampel se&ara benar. Tabel di ba'ah ini memeperlihatkan se&ara ringkas (enis pemeriksaan dan &ara penanganan5penga'etan sampel. No . Jenis Pe eri!saan -akroskopis Jenis sa %e& ' Me#ia Penga(et Sampel hidup Keterangan $emeriksaan berdasarkan perubahan tingkah laku dan ge(ala . -ikroskopis (preparat basah5'et mount) 0 /on%ensional (isolasi dan identi6ikasi %irus) 8 9istopatologi Ikan: Formalin.2; <dang: Da%idson = 3 ? > Serologi (misaln a tes aglutinasi, E)ISA, dll.) Polymerase chain reaction ($+,) Reverse Transcriptation Polymerase chain reaction (,T-$+,) -ikroskop elektron Sampel hidup Alkohol 13; atau alkohol >2; Alkohol @2; A !l &erin 02; !lutaraldeh de Sampel hidup Sampel hidup klinis. $emeriksaan langsung dengan mikroskop &aha a (ge(ala klinis) 7irus diisolasi dan di kultur dengan kultur sel (cell culture) Identi6ikasi patogen melalui analisa kerusakan (aringan $emeriksaan berbasis reaksi antigen-antibodi, Deteksi %irus DNA Deteksi %irus ,NA -elihat ultrastruktur sel dan %irus

3
I) PROSEDUR HISTOLO*I 1) S!e a %rose#ur %e +uatan %re%arat ,isto&ogi Sampel

$enga'etan (fi ation)

$emrosesan (aringan (tissue processin!)

$enanaman dalam para6in (embeddin!)

$emotongan (sectionin!)

$e'arnaan (stainin!)

$enempelan (mountin!)

$engamatan dengan mikroskop

2) Sa %e& a. <ntuk keperluan studi pre%alensi pen akit, pengumpulan sampel (sampling) dilakukan se&ara a&ak (random) dengan (umlah sampel tergantung dari tingkat serangan pen akit. Semakin tinggi tingkat serangan suatu pen akit, semakin sedikit sampel ang dibutuhkan, sebalikn a semakin rendah tingkat serangann a, semakin ban ak sampel ang perlu diambil.

4
b. <ntuk keperluan diagnosa pen akit, sampel dipilih dari ikan5udang sakit atau ang menun(ukkan kelainan. &. Sampel untuk keperluan pemeriksaan histologi adalah sampel ang masih hidup, sekarat atau baru sa(a mati. Ikan5udang ang telah lama mati tidak dapat digunakan sebagai sampel. d. Semua organ5(aringan ikan dan udang dapat dibuat preparat histologi. $ada udang, biasan a digunakan kepala (&ephalothoraB) dan perut (abdomen segmen terakhir). $ada ikan, diambil bagian ang luka, mata, insang dan organ internal (gin(al, hati, limpa, (antung, gelembung renang, otak, usus dan saluran reproduksi). e. Sampel diberi label:
No. sampel: Tanggal : Spesies : Organ : Pemilik :

-) Penga(etan .fixation/ a. Ikan5udang ke&il dapat langsung dimasukkan dalam larutan penga'et. Ikan5udang besar harus disuntik dengan penga'et terlebih dahulu atau dipotong ke&il-ke&il (. &m8) sebelum dia'etkan. $erbandingan antara penga'et dan sampel adalah .:.2. <dang dia'etkan dalam penga'et Da%idson ("avidson#s fi ative) selama 0= (am kemudian dipindahkan ke dalam alkohol 32;. Ikan dan orgasnisme akuatik lainn a (kepiting, teripang, dll) dia'etkan dalam Neutral *u66ered Formalin .2;. b. Formula neutral bu66ered 6ormalin .2;: Formalin Sodium phosphate monobasi& Sodium phosphate dibasi& anh drous ACuades Disimpan pada suhu kamar. &. Formula Da%idsonDs 6iBati%e: Alkohol 13; Formalin !la&ial a&eti& a&id ACuades Disimpan pada suhu kamar. 0) Pe rosesan 1aringan dengan alat pemroses (aringan otomatis ( automatic tissue processor). 4enis bahan kimia ang digunakan, urutan dan laman a pemrosesan adalah seperti tertera pada Tabel .. 882 ml 002 ml ..3 ml 883 ml .222 ml .22,2 ml =,2 g ?,3 g 122,2 ml .222,2 ml

6
Ta+e& 1) Jenis +a,an !i ia #an &a a %e rosesan sa %e& No 2a,an !i ia La a %roses .1a / . Alkohol >2; . 0 Alkohol >2; . 8 Alkohol @2; . = Alkohol @2; . 3 Alkohol 12; . ? Alkohol 12; . > Alkohol .22; 0 @ Alkohol .22; 0 1 E lene 0 .2 E lene 0 .. $ara6in 0 .0 $ara6in 8 4umlah 13 4) Penana an #a&a %ara5in .embedding/

$enanaman sampel dalam para66in dilakukan dengan Tissue $mbeddin! Centre% Alat ini harus din alakan 0 (am sebelum pemrosesan sampel selesai, untuk men&airkan para66in ang ada di kontainer. Sehingga ketika pemrosesan sampel selesai, sampel dapat langsung ditanam dalam para66in. 6) Pe otongan .sectioning/ Setelah para66in dingin, sampel (blok) dipotong dengan alat microtome sbb: a. *lok diletakkan pada pemegang blok (block holder) b. *lok ditrimming sampai mengenai organ5(aringan ang dimaksud. c. /etebalan pemotongan diatur pada =-3 m d. $otongan (aringan (ribbon) diletakkan di atas penangas air (&ater bath) suhu =2o+ e. Slideglass diletakkan diba'ah potongan (aringan, ketika slideglass diangkat, potongan (aringan akan menempel pada slideglass. f. Slideglass diletakkan di atas alat pemanas (hot plates) suhu ?2+ selama .3 menit.

g. Slideglass ang sudah kering siap di'arnai. 7) Pe(arnaan .staining/ He ato!si&in Eosin8P,&o9in .H'E/) Sebelum pe'arnaan, para66in ang menempel pada slideglass dibersihkan dengan B lene dan alkohol. $rosedur pe'arnaan 9FE terlihat pada Tabel 0.

7
Ta+e& 2) Jenis +a,an !i ia #an &a a %e rosesan sa %e& No 2a,an !i ia La a %roses . enit/ . E lene 3 0 E lene 3 8 Alkohol .22; .2 &elupan = Alkohol .22; .2 &elupan 3 Alkohol 13; .2 &elupan ? Alkohol 13; .2 &elupan > Alkohol @2; .2 &elupan @ Alkohol @2; .2 &elupan 1 Alkohol 32; .2 &elupan .2 ACuades .2 &elupan .. ACuades .2 &elupan .0 ACuades .2 &elupan .8 ACuades .2 &elupan .= ACuades .2 &elupan .3 ACuades .2 &elupan .? 9ematoksilin 3 menit .> Air mengalir 3 menit .@ Eosin5$hloBin 0 menit .1 Alkohol 13; .2 &elupan 02 Alkohol 13; .2 &elupan 0. Alkohol .22; .2 &elupan 00 Alkohol .22; .2 &elupan 08 E lene .2 &elupan 0= E lene .2 &elupan 03 E lene .2 &elupan 0? E lene .2 &elupan 0> Slideglass ditutup dengan &o%erglass memakai D$E atau kanada balsam sebagai perekat. Formula pe'arna -a erDs 9ematoksilin dan Eosin adalah sebagai berikut: a. Formula pe'arna -a erDs 9ematoksilin: 9ematoB lin &r stals Sodium Iodate $otassium Alum +itri& A&id +hloral 9idrate ACuades .,2 g 2,0 g 32,2 g .,2 g 32,2 g .222,2 ml

Alum dilarutkan dengan aCuades kemudian hematoB lin dilarutkan dengan larutan alum. Sodium iodate, &itri& a&id dan &hloral hidrate ditambahkan ke dalam alrutan hematoksilin. )arutan dipanaskan hingga berubah 'arna men(adi purple. )arutan disaring dengan 6ilter (kertas "hatman No. .).

8
b. Formula pe'arna Eosin: Sto&k Eosin Eosin G ACuades Sto&k $hloBine $hloBine ACuades )arutan Eosin-$hloBine: Sto&k Eosin Sto&k $hloBine 13; Ethanol !la&ial A&eti& A&id .g .22 ml .g .22 ml .22 ml .2 ml >@2 ml = ml

Setelah D$E atau balsam kanada mengering, slideglass siap diamati dengan mikroskop. II) IMUNOHISTOKIMIA .IMMUNOHISTOCHEMISTRY/ .. Sampel ikan ang telah di6iksasi dalam 6ormalin .2;, dilakukan de-para6inasi dan rehidrasi (aringan. 0. $rosedur berikutn a dilakukan di dalam ruang lembab (humid chamber). 8. Endogenous peroBidase diblok dengan aCuades teroksigen (oB genated 'ater) 8;. =. $reparat sa atan di&u&i dalam $*S selama 3 menit. 3. Di&u&i 0B dalam $*S-T'een 02 masing-masing selama 8 menit ?. Di&u&i .B dalam $*S selama 8 menit >. Diinkubasi selama 02 menit, agar anti-rabbit Ig goat antibod berikatan dengan biotin. @. Di&u&i dalam $*S. 1. Ditambahkan peroksidase reakti6 (kon(ugat a%idin - peroksidase) dan diinkubasikan selama 02 menit. .2. Di&u&i dalam $*S. ... Ditambahkan khromogen selama .2 menit, ang disiapkan sebagai berikut: aCuades (= ml)H bu66er asetat (0 tetes)H khromogen AE+ (. tetes)H o y!enated &ater 8; (. tetes) .0. Dibilas dengan aCuades selama 3 menit. .8. Di'arnai dengan haematoksilin selama 0 menit. .=. Dibilas dengan air. .3. Dimounting dengan air misaln a !lycerined !elatin, setelah kering siap diamati di ba'ah mikroskop.

9
III) :AT .FLUORESCENT ANTIBO Y TECHNI!UE/ .. Sampel ikan ang telah di6iksasi dalam bu66er 6ormalin .2;, didehidrasi lalu ditanam dalam para6in. 0. $reparat direndam tripsin 2,.; dalam 2,2. - $*S pada suhu 8>I+ selama 82 menit. 8. Setelah di&u&i dengan $*S dingin, sampel diinkubasi dengan serum kelin&i antinoda%irus pada 8>I+ selama 82 menit, =. Di&u&i dengan $*S 3. Direaksikan dengan FIT+ (fluorescein isothiocyanate) ang telah dilabel anti-rabbit I! !oat antibody pada 8>I+ selama 82 menit. ?. Siap diamati dengan mikroskop. IV) I:AT .IN IRECT FLUORESCENT ANTIBO Y TEST/. .. Sel monola er pada &a'an kultur plastik ukuran 0 &m0 atau ka&a penutup (cover-slip) disiapkan agar men&apai kon6luensi @2;, ang biasan a dapat ter&apai dalam selang 'aktu = (am setelah inkubasi pada 82o+. Setiap %irus ang akan diidenti6ikasi, diinokulasi ke ? sel monola er ditambah 0 untuk kontrol positi6 dan 0 untuk kontrol negati6 (untuk satu sampel %irus perlu .2 sel monola er). 0. Suspensi %irus diinokulasikan dengan membuat pengen&eran .2B se&ara langsung di dalam &a'an kultur (serial tenfold dilution). 8. Suspensi %irus kontrol dien&erkan dengan &ara ang sama, agar diperoleh titer %irus sekitar 3222-.2222 pla'ue-formin! units ($F<)5ml dalam medium kultur sel. =. Diinkubasi pada 03o+ selama .@ (am 3. -edium kultur dibuang, kemudian di&u&i sekali dengan $*S 2,2. -, p9 >,0H kemudian di&u&i 8B dengan aseton dingin (suhu 02o+) untuk ka&a penutup atau &ampuran aseton 82; A ethanol >2; (suhu 02o+) untuk &a'an plastik. ?. Fiksati6 dibiarkan beraksi selama .3 menit. Fiksati6 seban ak 2,3 ml &ukup untuk sel monola er seluas 0 &m0 >. Sel monola er dibiarkan mengering selama 82 menit dan segera proses atau bekukan pada 02o+ @. $ersiapkan larutan antibodi atau serum di dalam 2,2. - $*S p9 >,0 ang mengandung 2,23; T'een @2 ($*ST). 1. Sel monola er ang telah kering direhidrasi dengan &ara di&u&i dengan larutan $*ST seban ak =B. Setelah pen&u&ian terakhir, bu66er ini dibuang. .2. Ditambahkan larutan antibodi seban ak 2,03 ml50 &m0 sel monola er selama . (am pada 8>o+ ... Di&u&i =B dengan $*ST seperti diatas.

1
.0. Ditambahkan larutan antibodi terkon(ugat FIT+ terhadap imunoglobulin selama . (am pada 8>o+ (sesuai dengan manual produk FIT+). .8. Di&u&i =B dengan $*ST .=. Sel monola er pada &a'an plastik dapat langsung diamati, sedangkan ka&a penutup dimounting dengan gliserol saline p9 @,3 sebelum diamati diba'ah miroskop. .3. $engamatan dilakukan dengan mikroskop sinar <7 dengan pembesaran okuler .2B dan ob ekti6 02-=2B dengan angka aperture tinggi. <(i ini %alid bila kontrol negati6 dan kontrol positi6 harus memberikan hasil ang benar. V) ELISA "EN#YME$LIN%E IMMUNOSORBENT ASSAY&

.. Sumur mikroplat untuk u(i enzyme-linked immunosorbent assay (E)ISA) dilapisi dengan imunoglobulin (Ig) murni atau serum spesi6ik untuk %irus dalam 2,2. - $*SH p9 >,0 seban ak 022 Jl5sumur. Ig dapat berupa pol klonal atau monoklonal ang masing-masing berasal dari kelin&i atau tikus. 0. Inkubasi satu malam pada suhu =o+. 8. Di&u&i =B dengan 2,2. - $*S ang mengandung 2,23; T'een 02 ($*ST). =. Diblok dengan skim milk (3; dalam $*ST) atau larutan bloking lainn a selama . (am pada 8>o+ (022 Jl5sumur). 3. Di&u&i = kali dengan $*ST ?. Ditambahkan Triton E-.22 0; pada suspensi %irus ang akan diidenti6ikasi >. Ditambahkan .22 Jl5sumur dari pengen&eran dua atau empat tahap dari %irus ang akan diidenti6ikasi dan dari %irus kontrol, dan dibiarkan bereaksi dengan antibodi anti %irus selama . (am pada suhu 02o+. @. Di&u&i = kali dengan $*ST 1. Ditambahkan antibod poliklonal %irus kedalam sumur .2. Inkubasi selama . (am pada 8>o+ ... Di&u&i = kali dengan $*ST .0. Ditambahkan streptavidin-con(u!ated horseradish pero idase pada sumur-sumur ang telah diberi biotin-&on(ugated antibod dan inkubasikan selama . (am pada 02o+ .8. Di&u&i = kali dengan $*ST .=. Ditambahkan substrat dan Kat pe'arna (chromo!en). Tes dihentikan (ika telah terlihat reaksi pada kontrol positi6.

11
VI) TES NETRALISASI .. -edia kultur dari sel monola er ang menghasilkan +$E dikumpulkan dan disentri6ugasi pada 0222 g selama .3 menit pada suhu =o+ untuk memisahkan massa sel. 0. Supernatan ang mengandung %irus dien&erkan dari .2-0 sampai .2-= 8. Dibuat aliCuot, misaln a 022 Jl, dari masing-masing pengen&eran. AliCuot ini digunakan untuk tes antibodi spesi6ik dan inokulasi ke kultur sel baru. Titer antibodi dari tes netralisasi (neutralisin! antibody, NAb) harus sekitar .50222 dalam pla'ue reduction assay 32;. =. Se&ara bersamaan, tes netralisasi (uga harus dilakukan terhadap: ! ! %irus ang homolog (tes netralisasi positi6) %irus ang heterolog (tes netralisasi negati6)

3. Semua tes diinkubasi pada 03o+ selama . (am. ?. -asing-masing &ampuran tersebut diinokulasi ke dalam &a'an berisi kultur sel monola er (masing-masing 0 sel kultur per pengen&eran) dan dibiarkan terserap selama 2,3-. (am pada suhu 03o+. $ada &a'an kultur 0= atau .0-'ell digunakan inokulum seban ak 32 Jl. >. Setelah proses pen erapan selesai, ke dalam setiap sumur ditambahkan medium kultur sel ang mengandung F+S 0; (bu66er p9 >,8->,?) dan diinkubasi pada suhu 03-82o+. @. "aktu ter(adin a +$E di&atat. +$E bisa diamati dengan mikroskop (lebih baik dengan mikroskop 6ase-kontras) atau setelah pe'arnaan kultur sel dengan larutan crystal violet .; di dalam etanol 02;. 1. $emba&aan hasil: hasil din atakan positi6 bila +$E ter(adi pada semua kultur sel, dan tidak ter(adi atau ter(adi penundaan mun&uln a +$E dalam kultur sel ang diinokulasi dengan %irus ang telah di&ampur dengan antibodi spesi6ik ++7. VII) PROSEDUR ISOLASI DAN IDENTI:IKASI VIRUS DEN*AN KULTUR SEL 1) Pe +e#a,an i!an: a. b. tisu. &. 2) $erut ikan dibuka dengan &ara mengunting dari anus ke arah depan dan dari anus ke arah punggung. Penga +i&an sa %e&; Ikan pembiusan dengan -S00. Air dan lendir pada kulit ikan dilap bersih dengan kertas dibunuh dengan &ara langsung atau melalui

12
a. Seban ak . gram sampel diambil dari organ target (organ ang menun(ukkan kelainan karena serangan pen akit %iral) dan dari organ internal seperti: gin(al, limpa, hati, pan&reas, usus, dll. b. langsung diambil. &. dipool sebagai . sampel. 3. Penga(etan sa %e&: sampel dapat disimpan selama =@ (am di dalam media trans6er (transport media) ang terdiri dari: 9*SS (9ankDs *alan&e Salt Solution) suhu =o+, Foetal +al6 Serum (F+S) 0; dan antibiotika: $eni&illin 322 I<5ml dan Amphoteri&idin * (FungiKone) .2 g5ml. Selan(utn a sampel dikirim ke lab %irologi pada suhu =o+. =. a. b. membentuk sema&am pasta. &. d. e. mengandung F+S 0;. f. dengan 6ilter 2,=3 m. g. kultur sel (fish cell lines). 3. Iso&asi Virus dilakukan dengan kultur sel (SSN-., *F-0, E+$, dll): .. $ersiapan kultur sel lapis tunggal (monolayer) pada plate 0= lubang. a. Setiap lubang diinokulasi dengan .,3 ml kultur sel. /ultur sel biasan a tumbuh di dalam media )-.3 ang mengandung F+S 0; dan antibiotika ($eni&illin .22 I<5ml dan Streptom &in .2 g5ml). Filtrate atau ekstrak (aringan ini siap diinokulasikan ke )arutan sampel ang telah dien&erkan .:32 ini disaring Sampel dien&erkan .:.2 dengan &ara menambahkan 1 ml 9*SS ang mengandung F+S 0;. Sampel dipindahkan ke dalam tabung steril dan disentri6use pada .222Bg =o+ selama .3 menit. Supernatan diambil dengan alat suntik (s ringe) steril seban ak . ml dan dien&erkan .:3 dengan &ara menambahkan = ml 9*SS ang Pe rosesan sa %e&: 9omogenisasi: sampel dikeluarkan dari larutan penga'et dan diletakkan di dalam mortar steril ang telah didinginkan pada suhu =o+. Dengan bantuan pasir steril, sampel digerus halus Sampel dari .-3 ekor ikan (tergantung besarn a) dapat *ila ikan sangat ke&il, seluruh organ internal dapat

13
b. Setelah . hari, biasan a kepadatan sel telah men&apai kon6luensi @2-12;. Sehingga kultur sel siap diinokluasi dengan ekstrak (aringan disiapkan. 0. Inokulasi kultur sel dengan ekstrak (aringan: a. Dua lubang kultur sel masing-masing diinokulasi dengan 022 l ekstrak (aringan b. /ultur sel diinkubasi pada suhu 08-0>o+. &. $engamatan Cytopathic $ffect (+$E) dilakukan setiap hari selama .= hari. +$E atau kerusakan kultur sel dapat berupa disintegrasi sel, sel terlepas dari dasar plate, sel l sis. 3. $asase: bila terlihat +$E, 022 l supernatan kultur sel dipindahkan ke dalam kultur sel ang baru dan diamati adan a +$E selama .= hari. $asase dilakukan seban ak 8 kali. *ila pada pasase ke-8, masih ter(adi +$E seperti pada pasase-pasase sebelumn a, berarti sampel positi6 %irus. ?. a. Per+an"a!an Virus; %irus 022 l supernatan kultur sel dengan kon6luensi @2-12;. b. Diinkubasi selama . (am untuk memberi kesempatan %irus mengin6eksi sel. &. Sel di&u&i dengan 3 ml $*S, kemudian ditambahkan > ml medium pemeliharaan berupa )-.3 plus +FS 0;. d. Flask diinkubasi pada suhu 08-0>o+. e. *ila sel menun(ukkan +$E, sel dipindahkan ke tabung steril dan disenti6use pada .222Bg =o+ selama .3 menit. 6. Supernatan dikumpulkan dan dibagi ke dalam tabung ke&il . ml. disimpan pada suhu -02o+ dan -@2o+ sebagai sto&k %irus untuk karakterisasi lan(ut. 7) I#enti!asi Virus; Identi6ikasi a'al terhadap %irus ang telah berhasil diisolasi dapat dilakukan berdasarkan (enis +$E ang dihasilkan, suhu optimal pertumbuhan, dll. Identi6ikasi lan(ut dilakukan dengan menggunakan berbagai teknik identi6ikasi berbasis imunologi (antara lain tes netralisasi, imunohistokimia, FAT, IFAT, E)ISA) dan berbasis molekuler ($+,, ,T-$+,, in situ hybridisation). g. Sebagian tabung disimpan pada =o+ untuk proses identi6ikasi dan sebagian lagi ang telah berhasil diisolasi harus ang telah

diperban ak untuk keperluan identi6ikasi dan karakterisasi. ang memperlihatkan +$E pada pasase keL8, diinokulasikan ke dalam 6lasks 03 &m0 ang telah ditumbuhi kultur sel lapis tunggal

14
VIII) PROSEDUR POL<MERASE $HAIN REA$TION 1) PENDAHULUAN 1)1) Dasar Perti +angan $+, sangat &o&ok untuk digunakan sebagai alat diagnosa pen akit ikan karantina karena mempun ai beberapa keunggulan komparati6 dibandingkan metode diagnosa aitu: .. S%esi5i!) -etode $+, mampu mendeteksi suatu patogen pen ebab pen akit (parasit, (amur, bakteri maupun %irus) pada tingkat DNA-n a. 9al ini akan menghindari kesalahan diagnosa karena urutan DNA setiap makhluk hidup sangat spesi6ik dan berbeda satu sama lain. 0. Sensiti5) $+, mampu mendeteksi suatu patogen 'alaupun patogen tersebut ada di dalam sel ikan dalam (umlah ang sangat ke&il, sehingga belum memperlihatkan ge(ala klinis. Dengan kata lain $+, mampu mendeteksi pen akit dalam tahap subklinis atau carrier. 9al ini dimungkinkan karena &ara ker(a $+, adalah dengan meningkatkan (umlah DNA target sampai mil aran kali, sebelum hasiln a dilihat dengan elektro6oresis. Sensiti6itas sangat penting dalam pemeriksaan ikan karantina karena ikan ang akan keluar atau masuk, biasan a ikan ang se&ara klinis terlihat sehat sehingga lolos dari u(i klinis, padahal ikan tersebut mungkin merupakan carrier suatu pen akit berbaha a. 8. $e%at) /eseluruhan proses pemeriksaan pen akit dengan metode $+, dapat diselesaikan dalam 'aktu 3 (am. Diagnosa &epat sangat diperlukan untuk pemeriksaan ikan karantina, sehingga proses lalu-lintas ikan tidak terganggu. =. E5isien) Dalam sekali (alan, $+, dapat melakukan pemeriksaan terhadap =@-1? sampel sekaligus, sehingga sangat e6isien untuk digunakan di *alai /arantina Ikan dengan lalu-lintas ikan ang padat. 3. Pra!tis) -etode ini sangat praktis karena dengan satu alat sa(a ($+,), se&ara teoritis dapat memeriksa seluruh pen akit ikan dalam da6tar 9ama $en akit Ikan /arantina, asalkan tersedia primer spesi6ik untuk setiap (enis pen akit ikan tersebut. Saat ini sudah tersedia kit $+, untuk pemeriksaan pen akit ikan utama di Indonesia (Tabel .) ang lain,

15
Ta+e& 1) Da5tar %en"a!it i!an uta a #i In#onesia #an !eterse#iaan !it P$R No . 0 = 3 Jenis %en"a!it /oi herpes%irus (/97) 7iral ner%ous ne&rosis (7NN) F Sleep grouper (Irido%irus) "hite spot s ndrome %irus ("SS7) Taura s ndrome %irus (TS7) Jenis i!an Ikan -as dan koi (Cyprinus carpio) Ikan /erapu ($pinephalus sp, Cromileptes altivelis) <dang 'indu (Penaeus monodon) <dang putih ($enaeus %annamei) P$R Single dan double step Single dan double step Single dan double step Single step

Penge +angan !e #e%an) Dari berbagai keunggulan tersebut di atas, maka diagnosa pen akit ikan karantina di masa depan sebaikn a dikembangkan ke arah diagnosa &epat dan tepat dengan menggunakan alat berbasis molekuler ( molecular-based dia!nostic tools) antara lain dengan teknik $+,. $etun(uk teknis ini men(elaskan prinsip ker(a $+, dalam mendeteksi pen akit ikan karantina se&ara terperin&i dan sistematis. )engkap dengan prosedur ker(a tahap demi tahap, da6tar kebutuhan ruang, alat dan bahan ang diperlukan serta estimasi bia an a. Diharapkan petun(uk teknis ini dapat digunakan sebagai pedoman operasional teknik pemeriksaan pen akit ikan karantina dengan metode $+,. 1)2) Prinsi% #an $ara Ker1a P$R $+, adalah reaksi berantai suatu primer dari urutan ( se'uence) DNA dengan bantuan enK m pol merase sehingga ter(adi ampli6ikasi DNA target se&ara in vitro. Dalam bahasa ang sederhana, prinsip ker(a $+, adalah memperban ak DNA suatu patogen sampai (umlah ang dapat dilihat dengan mata telan(ang. Teknik $+, ditemukan oleh Dr. /ar -ullis pada tahun .1@3 dan mendapatkan hadiah Nobel atas temuann a pada tahun .118. Teknik ini beker(a dalam siklus ang berulang-ulang seban ak 02-82 kali. Setiap siklus terdiri atas 8 tahapan reaksi ang berlangsung dalam . sampai 0 menit, aitu: .. "enaturation: %e e=a,an DNA target (dalam hal agen pen ebab pen akit ikan karantina, misan a "SS7) dari DNA untai ganda (double-stranded ")A) men(adi untai tunggal (sin!le-stranded ")A). suhu 1= +. 0. Annealin!: %ene %e&an %ri er kepada DNA untai tunggal. $ada suhu 3?o+, primer akan menempel pada pangkal dan u(ung dari masing-masing DNA untai tunggal ang komplementer sehingga mengapit suatu daerah tertentu dari se'uence DNA target. 8. $ tension: %e an1angan %ri er dengan bantuan enK m pol merase pada suhu >= o+. Sehingga pada akhir proses ini, akan terbentuk 0 buah DNA untai tunggal baru ang komplemen terhadap se'uence DNA target (!ambar .A).
o

$roses ini dilakukan dengan &ara pemanasan pada

16

/arena hasil sintesa DNA dalam satu siklus dapat berperan sebagai &etakan ( template) pada siklus berikutn a, maka (umlah DNA target men(adi berlipat dua pada setiap akhir siklus (!ambar .*). Dengan kata lain DNA target meningkat se&ara eksponensial, sehingga setelah 82 siklus akan dihasilkan mil aran (0 82) ampli6ikasi DNA target. Selan(utn a, DNA target ang telah berlipat ganda (umlahn a dapat dideteksi dengan elektro6oresis gel

agarosa. Setelah di'arnai dengan Ethidum *romida (Et*r), hasil elektro6oresis ang berupa pita DNA dapat dilihat dengan alat <7 trans-iluminator dan 6oto dengan kamera $olaroid atau sistem dokemnetasi gel ang lain.

*a +ar 1) Prinsi% Dasar #an $ara Ker1a P$R A) Ta,a%an Rea!si #a&a .. Denaturasi DNA: 1=o+ 82DD Satu Si!&us 2) Penggan#aan DNA %er Si!&us

Siklus I

0. $enempelan $rimer (

):

Siklus II

3?o+ 82DD

8. $eman(angan oleh pol merase ( >=o+ 82DD

):

Siklus III

Dari keterangan di atas terlihat bah'a ampli6ikasi DNA dengan mesin $+, han a merupakan bagian ke&il dari suatu proses pan(ang diagnosa pen akit ikan karantina dengan mendeteksi ada tidakn a suatu DNA patogen tertentu di dalam tubuh ikan tersebut. $roses ini bermula dari ekstraksi DNA sampel untuk pen ediaan &etakan, ampli6ikasi DNA dengan bantuan mesin $+, (thermocycler) dan analisa hasil ampli6ikasi dengan elektro6oresis, pe'arnaan DNA dan dokumentasi dengan kamera polaroid.

17
2) SAMPEL UNTUK PEMERIKSAAN P$R 4enis dan (umlah sampel serta &ara pengambilan dan penga'etann a sangat penting dalam pemeriksaan $+,. Sampel ang telah rusak atau (umlah ang tidak men&ukupi akan men ulitkan dalam interpretasi hasil pemeriksaan. *iasan a sampel rusak karena &ara pengambilan dan penga'etan sampel kesehatan suatu populasi. 2)1) Jenis #an Ju &a, Sa %e& $ada dasarn a semua (enis ikan dari semua umur dapat diperiksa dengan metode $+,. "alaupun hampir semua bagian tubuh ikan5udang dapat digunakan sebagai sampel, tetapi akan lebih baik bila sampel diambil dari bagian tubuh ang merupakan organ target. Setiap pen akit mempun ai organ target ang berbeda, misaln a pen akit /97 ( *oi herpesvirus) men erang insang, pen akit 7NN (+iral nervous necrosis) men erang ata #an ota!, sedangkan Irido%irus men erang organ internal (gin1a& ' &i %a). #leh karena itu, (enis organ atau (aringan ang dipakai sebagai sampel tergantung dari organ target (organ ang terserang pen akit). Ada (uga pen akit ang men erang hampir semua organ tubuh, misaln a pen akit ber&ak putih (,hite spot syndrome virus) dan TS7 (Taura syndrome virus), oleh karena itu pemeriksaan $+, dapat dilakukan dari semua bagian tubuh (biasan a digunakan insang). *agian tubuh ikan5udang ang lain seperti sirip, ekor, karapas, &angkang, karapas dan rostrum udang (arang digunakan untuk pemeriksaan $+, karena bagian tersebut sangat keras sehingga sulit dalam proses ekstraksi DNA. *agian lain ang kurang baik digunakan sebagai sampel untuk pemeriksaan $+, adalah hepatopankreas pada udang dan hati ikan karena organ ini ka a akan enK m ang dapat merusak DNA5,NA %irus pada saat proses ekstraksi. 4umlah sampel (ikan5udang), tergantung dari maksud pemeriksaan. $emeriksaan $+, dapat dilakukan untuk mendeteksi adan a suatu pen akit di dalam indi%idu ikan5udang (sampling indi%idu) dan untuk mengetahui status pen akit di suatu populasi (sampling populasi). <ntuk sampling populasi, maka (umlah sampel populasi ang akan diperiksa. ang diambil harus me'akili ang salah. 4umlah sampel untuk pemeriksaan status kesehatan indi%idu udang sangat berbeda dengan (umlah sampel untuk monitoring

18
Ta+e& 2) Jenis #an 1u &a, sa %e& i!an #an u#ang untu! %e eri!saan P$R No . 0 8 Stadia Ikan F <dang *enih5benur Ikan5udang besar Induk 4enis sampel Seluruh tubuh Sesuai dengan organ target Sesuai dengan organ target 4umlah sampel Tergantung (enis sampling: o indi%idu: . ekor o populasi: 0-.32 ekor (tergantung (umlah populasi dan pre%alensi pen akit)

0..... Sampel benih5benur diambil dari setiap batch seban ak 0-.32 ekor (tergantung (umlah populasi dan pre%alensi pen akit) se&ara a&ak dan ditempatkan dalam 'adah terpisah serta diberi label. /alau hal ini tidak memungkinkan, maka sampel dapat dipool dari semua batch. 0...0. Sampel sebaikn a dipilih ang menun(ukkan ge(ala tidak normal. <ntuk keperluan deteksi (enis pen akit (misaln a suatu indi%idu ikan mas terserang pen akit /97 atau tidak), maka dilakuan sampling indi%idu. Sedangkan untuk keperluan monitoring pen akit ditingkat populasi, maka sampel diambil se&ara a&ak dengan (umlah lebih ban ak (0-.32 ekor), tergantung pre%alensi serangan pen akit di populasi tersebut. 2)2) $ara Penga +i&an> Pen"i %anan #an Pengiri an Sa %e& Ikan ang masih hidup disimpan5dia'etkan dalam alkohol 13; dengan perbandingan ati ti#a! #a%at #iguna!an se+agai sa %e&.

%olume sampel dan alkohol adalah .:.2. *ila tidak ada alkohol 13;, sampel dapat disimpan dalam alkohol >2;. I!an "ang te&a, &a a karantina terdekat. 0.0... Sampel benih5benur dapat langsung dimasukkan ke dalam alkohol 13;. 0.0.0. Sampel benih ikan atau udang ukuran ke&il (ukuran pan(ang kurang dari 8 &m) dapat langsung dia'etkan dalam alkohol 13;. 0.0.8. <ntuk sample induk besar, kepala udang disuntik dengan alkohol 13;, sisan a dipakai sebagai penga'et. 0.0.=. +ara pengambilan dan penga'etan sampel induk ang telah dia6kir sama dengan sampel untuk udang de'asa. Sedangkan untuk induk ang baru akan dipi(ahkan, sampel &ukup diambil dari insang atau kaki renangn a. Setiap sampel diberi label dan keterangan se&ukupn a sebelum dikirim ke laboratorium

19
-) EKSTRAKSI DNA #rganisme patogen pen ebab pen akit, terutama %irus hidup di dalam sel inang. Agar proses ampli6ikasi dengan $+, dapat dilakukan, DNA atau ,NA patogen ini terlebih dahulu harus dikeluarkan dari sel inangn a. $roses ini dikenal sebagai ekstraksi DNA atau ,NA. Ekstraksi dapat dilakukan dengan berbagai &ara, antara lain Mmetode phenol-&hloro6ormD ang dikenal sebagai metode dasar ekstraksi DNA. Saat ini ekstraksi DNA5,NA sangat mudah diker(akan dengan menggunakan kit ekstraksi DNA5,NA ang telah tersedia di pasaran seperti IS#!EN (Nippon !ene, 4epang), DNAKol dan T,IKol (-,+, Amerika) atau dengan kit ekstraksi DNA5,NA manual masing-masing kit. Persia%an sa %e&. Sampel ikan seban ak 32-.22 mg dipotong ke&il-ke&il5halus dengan pisau bedah atau gunting steril. <ntuk menghindari kontaminasi, setiap sampel ,arus diproses dengan mengunakan tempat dan alat ang berbeda. Selan(utn a sampel tersebut siap diekstrak DNA5,NA-n a. -)1) Prose#ur !er1a e!stra!si DNA #engan ? eto#e %,eno&-=,&oro5or @; .. Sampel ang telah disiapkan seperti tersebut di atas, dimasukkan ke dalam tabung eppendor6 ukuran .,3 atau 0 m). Ditambahkan 822 m) aCuades steril, 82 ) $roteinase-/ (.2 mg5ml) dan 82 ) ,NAse (2,0 mg5ml), diaduk dengan pestel. Ditambahkan 82 ) SDS .; (Sodium Dode& l Sulphate), di&ampur perlahan-lahan dan diinkubasi pada suhu 8>o+ selama .3 menit. 0. Ditambahkan =22 ) TE-saturated phenol. Di&ampur homogen selama . menit. 8. Disentri6ugasi pada .0.222 g, suhu ruang (0>o+), selama 3 menit. =. Supernatan dipindahkan ke tabung eppendor6 baru, ditambahkan =22 ) TEsaturated phenol, di&ampur homogen selama . menit. 3. Disentri6ugasi pada .0.222 g, suhu ruang, selama 3 menit. ?. Supernatan dipindahkan ke tabung baru, ditambahkan =22 ) +hloro6orm-Isoam l al&ohol (0=:.), di&ampur homogen selama . menit. >. Disentri6ugasi pada .0.222 g, suhu ruang, selama 3 menit. @. Supernatan seban ak 822 ) dipindahkan ke tabung baru, ditambahkan 82 ) Sodium A&etate 8- dan >32 ) al&ohol .22;, kemudian di&ampur homogen. 1. Diinkubasi pada suhu dingin selama .3 menit atau lebih. .2. Disentri6ugasi pada .0.222 g, suhu ruang, selama 3 menit. ang sudah termasuk dalam satu paket kit $+, lengkap. $rosedur ker(a kit ekstraksi DNA5,NA dari paket kit $+, ini dapat dilihat pada

2
... Supernatan dibuang, ditambahkan .,3 m) ethanol >3;, di&ampur homogen. .0. Disentri6ugasi pada .0.222 g, suhu ruang, selama 0 menit. .8. Supernatan dibuang, pellet (DNA) dikeringkan di dalam desi&ator selama 3-.2 menit. *ila tidak ada desi&ator dapat dikering-udarakan ( air-dried) dengan &ara diinkubasi pada suhu ruang selama 3-.2 menit. .=. DNA dilarutkan dengan 32-022 ) aCuades steril atau TE bu66er (Apendiks 0). DNA terlarut dapat disimpan pada suhu =o+ atau langsung digunakan untuk ampli6ikasi DNA dengan thermal& &ler (*ab =). -)2) Prose#ur !er1a e!stra!si DNA #engan ISO*EN; .. 4enis dan (umlah sampel ang digunakan sama dengan metode phenol-&hloro6orm. /e dalam tabung eppendor6 berisi sampel, ditambahkan 2,3 m) IS#!EN, di&ampur homogen, ditambahkan 2,3 m) IS#!EN dan di&ampur homogen. 0. Disentri6ugasi pada .0,222 g, suhu ruang, selama .2 menit. 8. Supernatan dipindahkan ke tabung eppendor6 baru, ditambahkan 022 ) &hloro6orm, diinkubasi pada suhu ruang sealam 8 menit. =. Disentri6ugasi pada .0,222 g, suhu ruang, selama 3 menit. 3. Supernatan dipindahkan ke tabung baru, ditambahkan 2,3 m) Isopropanol, diinkubasi pada suhu ruang selama 3 menit. ?. Disentri6ugasi pada .0,222 rpm, suhu ruang, selama .2 menit. >. Ditambahkan . m) alkohol >3;, di&ampur homogen. @. Disentri6ugasi pada .0,222 rpm, suhu ruang, selama .2 menit. 1. Supernatan dibuang, pellet (DNA) dikeringkan, dilarutkan dan disimpan seperti pada metode phenol-&hloro6orm. -)-) Prose#ur !er1a e!stra!si DNA #engan DNAAo& atau TRIAo&; .. 4enis dan (umlah sampel ang digunakan sama dengan metode phenol-&hloro6orm. /e dalam tabung eppendor6 berisi sampel, ditambahkan . m) DNAKol atau T,IKol, di&ampur homogen dan diinkubasi pada suhu ruang selama 3 menit. 0. Disentri6ugasi pada .=,222 rpm, suhu ruang, selama .2 menit. 8. Supernatan dipindahkan ke tabung baru, ditambahkan 2,3 m) alkohol .22;, di&ampur homogen. =. Disentri6ugasi pada .2,222 rpm, suhu ruang, selama 3 menit. 3. Supernatan dibuang, pellet di&u&i dengan &ara ditambahkan . ml alkohol 12;. ?. Disentri6ugasi pada .2,222 rpm, suhu ruang, selama 3 menit. >. $en&u&ian dengan . ml alkohol 12; ini dilakukan seban ak 8 kali atau sampai 'arna pigmen kekuningan hilang.

21
@. Supernatan dibuang, pellet DNA dikeringkan, dilarutkan dan disimpan seperti diatas.

0) AMPLI:IKASI DNA
Ampli6ikasi atau perban akan DNA target dimaksudkan untuk meningkatkan (umlah DNA target ang ada, sehingga dapat dideteksi dengan elektro6oresis. Ampli6ikasi DNA dilakukan dengan bantuan thermo& &ler atau ang lebih dikenal dengan alat $+,. $ada prinsipn a, alat ini han a sema&am inkubator ang mampu mengatur5mengubah suhu dengan sangat &epat sesuai dengan settin! atau program ang dimasukkan. Alat $+, sendiri tidak mampu melakukan ampli6ikasi DNA, tetapi settin! suhu didalamn a merupakan pras arat bagi berlangsungn a reaksi ampli6ikasi. Ampli6ikasi DNA akan ter(adi bila ada komponen: .. 0. "eo yribonucleotide triphosphate (dNT$) ang memberikan energi dan nukleosida untuk sintesis DNA. EnK m DNA pol merase ang akan meman(angkan primer ang telah menempel pada &atakan. *iasan a digunakan enK m TaC $ol merase ang tahan terhadap suhu tinggi. 8. =. 3. -agnesium +hlorida (-g+l0) ang merupakan sumber trace element $+, *u66er (Apendiks 8). Sepasang primer ang terdiri dari primer F ( for&ard) dan , (reverse) ang akan menentukan urutan (se'uence) DNA ang akan disintesa. $rimer ang digunakan bisa satu pasang ( 0 buah) atau 0 pasang (= buah). ?. Template aitu DNA target ang diekstraksi dari sampel udang sakit dan ber6ungsi sebagai bahan &etakan DNA ang diperban ak (ampli6ikasi). Standar setiap komponen dalam %olume reaksi 03 ) adalah dNT$ 022 -, Ta' pol merase 0 unit, -g+l0 0 m-, $+, bu66er .B, primer . - dan &etakan DNA .2 ng. /elima komponen (No..-3) dapat di&ampur bersama men(adi master mi ang telah di(ual komersial, sehingga tidak perlu membeli setiap komponen tersebut se&ara terpisah. Sehingga ketika ada sampel datang, tinggal mempersiapkan DNA template. Strategi ini selain e6isien dalam penggunaan reagen (uga terbukti e6ekti6 dalam menghindari kontaminasi akibat ban akn a reagen ang harus di&ampur. 0)1) Pen"ia%an Pri er $rimer adalah seCuen&e DNA kapan harus berhenti. $rimer Tabel 8. ang menentukan dimana reaksi ampli6ikasi dimulai dan ang pan(angn a sekitar 02 basa inilah ang akan

menentukan hasil ampli6ikasi DNA. +ontoh primer untuk pen akit "SS7 ter&antum pada

22

Ta+e& -) $onto, 1enis %ri er> se'(ence #an am)*icon-n"a)

Ko#e Pri er "SS7 F. "SS7 ,. "SS7 F0 "SS7 ,0 SeBuen=e Pri er 3DA+TA+TAA+TT+A!++TAT+TA!-8D 3DTAAT!+!!!T!TAAT!TT+TTA+!A-8D 3D!TAA+T!++++TT++AT+T++A-8D 3DTA+!!+A!+T!+T!+A++TT!T-8D "mplicon .+%/ F.,.: .==> )o et al., .11? F0,0: 1=0 Re5eren=e

$rimer tersebut di atas dapat dipesan (order) melalui supplier lokal dengan men ertakan se'uence primern a. $rimer ang telah dipesan tersedia5dikirim dalam bentuk serbuk sehingga harus dilarutkan terlebih dahulu dengan TE bu66er atau aCuadest bebas ,NA MR)ase free &aterD atau aCuades steril. /arena primer dibuat dalam konsentrasi sangat tinggi, pelarut ini (uga ber6ungsi sebagai pengen&er. /andungan primer dalam setiap kemasan berbeda-beda, tetapi rata-rata dari . kemasan primer dapat digunakan untuk 0222 sampel. -isalkan (umlah suatu primer 32 n- ( 32B.2-8 - per )iter) dan akan dibuat sto&k primer .22 - maka diperlukan pengen&eran sebagai berikut: /onsentrasi a'al (+.): 32B.2-8 - 7olume a'al (7.): . ) N .2? ) /onsentrasi akhir (+0): .22 7olume akhir (70): OP 7olume pelarut atau %olume akhir (70) adalah: 7. B +.5+0 N .2? B 32B.2-8 5 .22 N 322 ) 4adi dengan menambahkan 322 ) TE bu66er ke dalam kemasan primer, didapat primer sto&k .22 - seban ak 322 ). <ntuk membuat primer &orkin! solution .2 -: .2 ) primer F A .2 ) primer , A @2 ) TE bu66er. $rimer &orkin! solution .2 - seban ak .22 ) ini siap digunakan. /arena untuk setiap sampel dibutuhkan 0,3 ) primer, maka &orkin! solution ini dapat digunakan untuk =2 sampel. Sehingga seluruh sto&k primer dapat digunakan untuk 0222 sampel. 0)2) Master Mi9 Saat ini telah tersedia -aster -iB komersial ang siap pakai, baik dalam bentuk &air maupun padat5butiran (bead). Sehingga proses penger(aan sampel akan lebih mudah. Gang perlu dilakukan tinggal mengambil . butir (untuk master miB padat) atau .2 ) (untuk master miB &air), kemudian ditambahkan primer, template ")A dan aCuades se&ukupn a (Tabel =). 7olume master miB &air ang harus digunakan untuk setiap sampel berbeda

23
untuk setiap produk, lihat manual setiap masing-masing produk. $rosedur pen&ampuran reagen $+, adalah sebagai berikut: .. /e dalam tabung eppendor6 2,0 m) dimasukkan master mi , &etakan DNA dan aCuades dengan komposisi seperti Tabel =. 0. )arutan di&ampur homogen dengan &ara dipipet keluar masuk. 8. Tabung disentri6ugasi sebentar agar larutan mengumpul di dasar tabung. =. Tabung dimasukkan ke dalam thermo& &ler dan di(alankan sesuai dengan settin! suhu dan siklusn a. Ta+e& 0) Ko %osisi reagen untu! setia% sa %e& #engan No . 0 8 = Reagen -aster mi $rimer Template DNA ACuades Tota& Vo&u e .untu! MM %a#at/ . butir 0 ) . ) 00 ) 24 ) aster i9 !o ersia&

Vo&u e .untu! MM =air/ .2 ) 0 ) . ) .0 ) 24 )

0)-) Kits P$R untu! #ete!si %en"a!it i!an) *ila tidak mau repot-repot membeli master mi dan mempersiapkan primer, bisa (uga menggunakan kits $+, untuk deteksi berbagai pen akit ikan karantina ang sudah siap pakai, antara lain "SS7, TS7, 7NN, -*7, I99N7, dll. /its biasan a untuk .22-022 sampel, berisi master mi ( ang merupakan &ampuran dNT$, Ta' pol merase, -g+l0, $+,-bu66er), primer dan kontrol positi6 serta kontrol negati6. $ada dasarn a, penger(aan selan(utn a sama seperti pada Table = atau mengikuti petun(uk seperti ang tertera pada manual setiap kits. 0)0) Setting Su,u #an Si!&us Mesin P$R .ettin! suhu untuk pemeriksaan tiap (enis pen akit mungkin berbeda. Tetapi pada prinsipn a terdiri dari 3 tahap aitu pre-denaturation/ denaturation/ annealin!, e tension dan final elon!ation (Tabel 3). Ta+e& 4) $onto, setting su,u #an si!&us a %&i5i!asi %a#a No . 0 8 = 3 ,eaksi Pre-denaturation "enaturation Annealin! $ tension Final $lon!ation Suhu (o+) 1= 1= 3? >= >= )ama = menit 82 detik 82 detik 82 detik 8 menit esin P$R

4umlah Siklus . 82 82 82 .

24
Sebelum memasuki reaksi utama aitu ampli6ikasi DNA (DNA diperban ak), perlu dilakukan reaksi pre-denaturation untuk meme&ah protein. Setelah siklus
o

ang terakhir, perlu

dilakukan reaksi tambahan berupa final elon!ation pada suhu >= + selama 8 menit untuk memberi kesempatan kepada enK m pol merase ang belum men elesaikan reaksin a, sehingga tidak ada sintesa DNA baru ang belum selesai. Tabel 3 diatas merupakan &ontoh settin! suhu dan siklus standar ang dapat dipakai pada hampir semua (enis primer ((enis pemeriksaan pen akit). Namun demikian setting suhu tersebut perlu dimodi6ikasi untuk mendapatkan hasil pemeriksaan ang optimal untuk masing-masing (enis pen akit ikan karantina. /it $+, komersiil sudah dilengkapi manual untuk setting suhu dan siklus ampli6ikasi untuk masing-masing (enis pen akit. 4) ANALISA HASIL P$R 9asil ampli6ikasi (produk $+, N amplikon) mengandung potongan DNA ang pan(angn a tergantung (enis primer ang dipakai, misaln a primer /97 menghasilkan potongan DNA ang pan(angn a 012 bp. Namun demikian DNA hasil diampli6ikasi ini belum bias dilihat dengan mata telan(ang. <ntuk melihatn a, produk $+, ini perlu dianalisa lebih lan(ut dengan elektro6oresis dan di'arnai dengan Et*r. *ila perlu dapat diabadikan dengan kamera $olaroid. 4)1) E&e!tro5oresis *e& Agarosa -olekul DNA, seperti protein dan sen a'a biologik ang lain, mempun ai muatan listrik negati6. Akibatn a bila molekul DNA ditempatkan pada medan listrik dalam tangki elektro6oresis, maka DNA akan bergerak ke kutub positi6. /e&epatan migrasi (per(alanan DNA mele'ati pori-pori gel) tergantung dari ukuran DNA. -akin ke&il molekul DNA makin &epat migrasin a mele'ati gel. $erbedaan ke&epatan mele'ati gel inilah menghasilkan pro6il potongan DNA ang ang berbeda-beda, sehingga berat molekul setiap

6ragmen dapat diketahui dengan membandingkann a dengan penanda berat molekuler standar (standard moleculer &ei!ht marker). $en iapan gel agarosa 0; dan prosedur elektro6oresis: .. Di dalam botol S&ott ukuran .22 ml: =22 mg serbuk agarosa dilarutkan dalam 02 ml T*E bu66er (Apendiks =) dengan &ara dididihkan di atas hotplate ma!netic stirrer. 0. )arutan didinginkan pada selama 02 menit di dalam 'aterbath suhu ?2o+. 8. Agarosa dituangkan ke dalam tangki elektro6oresis ang telah dipisang comb% Setelah 02 menit, larutan agarose akan mengeras (membentuk gel).

25
=. T*E bu66er dituangkan ke dalam tangki, selan(utn a comb diambil sehingga terbentuk sumur (&ell) seban ak @ atau .0 buah, tergantung (enis comb dipakai. )ubang inilah nanti ang akan diisi dengan produk $+,. 5. Di atas para6ilm: .2 ) produk $+, di&ampur dengan 0,3 ) loading bu66er (Apendiks 3). Selan(utn a .2 ) larutan tersebut dimasukkan ke masing-masing sumur pada gel agarose. 6. Sumur terakhir diisi dengan .2 ) penanda molekuler (marker). >. Elektro6oresis di(alankan pada %oltase .02 %olts selama 82 menit. 4)2) Penga atan #an Do!u entasi +ara paling mudah untuk melihat hasil elektro6oresis adalah melalui pe'arnaan gel dengan sen a'a Ethidium bromida (Et*r). -olekul DNA ang berikatan dengan Et*r akan berpendar (fluorescence) bila dilihat dengan lampu ultra%iolet (0+ trans-illuminator). $an(ang atau berat molekul pita DNA ang tampak berpendar dapat dihitung dengan &ara membandingkan dengan penanda (marker) ang telah diketahui berat molekuln a. $enanda ini dirun bersama-sama dengan sampel. *iasan a marker diletakkan di sumur pertama atau terakhir dari suatu gel. $ita DNA ang terbentuk kemudian diabadikan dengan kamera $olaroid. Adapun prosedurn a adalah sebagai berikut: .. !el diangkat dari tangki eletro6oresis. /edua karet pembatas gel dilepas. 0. !el direndam dalam larutan Et*r 2,23; selama = menit. Et2r a#a&a, Aat !arsinogeni!> se&a&u guna!an sarung tangan. 8. !el diamati di atas <7 trans-illuminator. Sinar UV #a%at %e&in#ung ata. =. Dokumentasi dengan kamera $olaroid. 6) KE2UTUHAN RUAN*> ALAT DAN 2AHAN <ntuk proses pemeriksaan sampel dengan $+,, idealn a diperlukan = ruangan terpisah sebagaimana terlihat pada !ambar 0, aitu: .. Ruang a# inistrasi. ,uang ini ber6ungsi untuk penerimaan sampel, recordin! (pen&atatan dan pengarsipan data sampel) dan pembuatan serti6ikat hasil pemeriksaan ang selan(utn a dapat dikirim melalui 6aB. Diruang ini tersedia me(a resepsionis dan me(a komputer lengkap dengan printer untuk membuat serti6ikat erusa! ata> guna!an ang

26
hasil, mesin 6aB untuk mengirimkan hasil pemeriksaan dan lemari arsip untuk pen impanan 6ile. ,uang ini dapat dilengkapi sepasang me(a tamu sederhana. 0. Ruang E!stra!si DNA. Selain untuk ekstraksi DNA, ruang ini (uga ber6ungsi untuk sterilisasi alat, pen iapan media dan pen impanan bahan kimia F bu66er. Di ruang ini tersedia lemari media, auto&la%e, timbangan dengan tingkat ketelitian 2,. mg (analytical balance), p9 meter, hotplate dengan magneti& stirrer, sentri6use dan tempat ekstraksi DNA lengkap dengan sarung tangann a. ,uang ini lengkapi dengan saluran air untuk men&u&i dan membersihkan alat. 8. Ruang A %&i5i!asi DNA. Fungsi utama ruang ini adalah untuk pen iapan reagen $+, dan pen&ampuran reagen tersebut dengan DNA template dari sample sehingga siap diampli6iaksi (perban ak) dalam mesin $+, ( thermocycler). Di ruang ini tersedia satu set miropipet dan area sebagai tempat ker(a pen&ampuran reagen $+, dan DNA sampel, mini spin (sentri6use ke&il dengan ke&epatan rendah), %orteB, mesin $+,, re6rigerator pintu ganda untuk pen impanan reagen $+, dan lemari untuk pen impanan alat gelas dan plastik. =. Ruang Ana&isa Hasi& P$R. ,uang ini ber6ungsi untuk analisa produk $+,, melihat hasil dan dokumentasi. Di ruang ada unit elektro6oresis, 'aterbath, timer, Kat 'arna Et*r, <7 trans-illuminator dan kamera $olaroid. Sebaikn a ruang ini dilengkapi dengan sinar <7 untuk merusak (degradasi) &emaran DNA ang mengambang di udara. +emaran DNA dalam bentuk aerosol biasan a ter(adi saat kita membuka tabung $+, ang berisi DNA hasil ampli6ikasi dengan mesin $+,. <ntuk menghindari terbentukn a &emaran DNA di ruang 8 (ruang reagen dan ampli6ikasi DNA), dilarang keras membuka tabung $+, hasil ampli6ikasi di ruang 8. 4adi, setelah proses ampli6ikasi dengan mesin $+, di ruang 8 selesai, tabung $+, dikeluarkan dari mesin dan langsung di ba'a ke ruang =. Tabung $+, ang berisi DNA terampli6ikasi ang (umlahn a mil aran ini han a boleh dibuka di ruang = (ruang analisa hasil). Setelah proses analisa hasil $+, selesai, lampu <7 di ruang = din alakan sekitar 82 menit agar sinar mendegradai &emaran DNA ang beterbangan di udara.

27
8m Sentri6use Tempat Ekstraksi DNA $ traction *its 8m

)emari !lass'are F $lasti&'are

7orteB Auto&la%e

9otplate

-esin $ipet -ini spin $+, 7orteB

Analiti&al p9 meter *alan&e

Ruang E!stra!si DNA

Ruang A %&i5i!asi DNA (dilengkapi dengan sinar <7)

8m

)emari -edia )emari Arsip

,e6rigerator

"aterbathElektro6oresisTimer

/omputer F $rinter

FaB

-e(a

Ruang Ana&isa Hasi& (dilengkapi dengan sinar <7)

8m

Ruang A# inistrasi

/ursi tamu

/amera Qat 'arna Et-*r

<7 trans
Designed by Agus Sunarto

*a +ar 2)

Tata ruang i#ea& untu! &a+oratoriu P$R alur penger(aan sampel alur pen ampaian hasil tes $+, *ila tidak tersedia = ruangan, pemeriksaan $+, dapat (uga diker(akan di laboratorium ang han a mempun ai 8 ruang terpisah. ,uang pertama merupakan ruang administrasi. ,uang kedua merupakan gabungan ruang ekstraksi DNA, ruang reagen F ampli6ikasi DNA. ,uang ketiga adalah ruang analisa hasil. *ila han a tersedia 0 ruang, maka prinsipn a ruang ampli6ikasi DNA dipisah dengan ruang analisa hasil untuk menghindari kontaminasi (!ambar 8). /eseluruhan proses $+, dapat (uga dilakukan dalam . ruang. Tetapi penanganan produk pas&a $+, (setelah ampli6ikasi dengan mesin $+,) harus dilakukan se&ara esktra hati-hati, sehingga DNA hasil ampli6ikasi tidak men&emari DNA sample dan reagen $+, (kit, master mi / dll). 8m 'ater bath $ipet, 7orteB F -inispin $+, 0m

Alat glass

Elektro6oresis

28

/ulkas )emari Auto&la%e

Ruang Ana&isa Hasi& (dilengkapi dengan sinar <7)

Analiti&al p9 meter 9otplate *alan&e

Ruang E!stra!si ' A %&i5i!asi DNA

<7 /amera Et-*r

8,3m

Ekstraksi DNA

Sentri6us
Designed by Agus Sunarto

*a +ar -) Tata ruang ini a& untu! &a+oratoriu P$R alur penger(aan sampel alur pen ampaian hasil tes $+, <ntuk men&egah kontaminasi, mikropipet dan boks mi&rotip ang digunakan untuk ker(a pre-PCR harus terpisah dengan ang dipakai untuk ker(a post-PCR. $eker(aan pre-$+, adalah seluruh proses ker(a sebelum ampli6ikasi dengan mesin $+, ang meliputi ekstraksi DNA, proses pen iapan master miB, primer dan pen&ampurann a dalam tabung $+,. Sedangkan ker(a post-$+, adalah seluruh rangkaian peker(aan setelah amplikasi DNA dengan mesin $+,. $ada prinsipn a, alat-alat untuk pemeriksaan $+, dibagi men(adi 8 bagian (Tabel ?.), aitu: .. A&at uta a terdiri dari thermal& &ler untuk ampli6ikasi DNA, unit ele&tro6oresis untuk memisahkan produk $+, dalam bentuk band DNA, <7 trans-illuminator untuk melihat band DNA dan kamera $olaroid untuk dokumentasi. 0. A&at %en#u!ung berupa alat sterilisasi (autokla%e), alat untuk pen iapan media, bu66er F gel, alat bedah, mikropipet F laminar 6lo' untuk ker(a DNA, dan 6reeKer. 8. A&at ,a+is %a!ai seperti mata pisau, tabung eppendor6, tips mikropipet, para6ilm, 6ilm dan sarung tangan.

29
*ahan utama ang diperlukan untuk pemeriksaan $+, adalah dNT$, Ta' pol merase, -g+l0, $+,-bu66er dan primer. ,eagen $+, tersebut tersedia dalam bentuk terpisah-pisah maupun paket (kits). /its, biasan a untuk .22-022 sampel, berisi master mi merupakan &ampuran dNT$, Ta' pol merase, -g+l0, $+,-bu66er dan primer. pendukung ang *ahan

ang diperlukan mulai dari penga'etan sampel, ekstraksi DNA, pembuatan

bu66er, gel serta pe'arna DNA sampai untuk dokumentasi, ter&antum lengkap di Tabel >. Ta+e& 6) Da5tar A&at> 2a,an #an Esti asi Harga P$R Satu Set Leng!a%
No

Na a A&at #an 2a,an A) A&at Uta a;

Thermo& &ler <nit ele&tro6oresis <7 Trans-illuminator /amera $olaroid atau !el Do& S stem

Kegunaan
Ampli6ikasi DNA $emisahan produk $+, $engamatan hasil $+, Dokumentasi hasil $+, Sterilisasi alat F bahan *edah sample $embuatan media $roses ekstraksi DNA $embuatan bu66er, gel, dll $engo&ok $en&ampuran reagen $+, $en&ampuran reagen $+, $en&ampuran reagen $+, $en&ampuran reagen $+, $en impanan reagen $+, -engukur p9 bu66er, dll Alarm $en iapan bu66er, gel, dll Tempat tabung $+, $engambilan sampel Ekstraksi DNA Ampli6ikasi DNA $en&ampuran reagen $+, $en&ampuran reagen $+, Ekstraksi DNA Tempat loading bu66er <ntuk dokumentasi -enghindari kontaminasi Sampling F ekstraksi DNA Ekstraksi DNA ,eagen ampli6ikasi DNA $enanda berat molekul *ahan pembuat gel $e'arna DNA *u66er elektro6oresis )arutan pemberat ke 'ell $elarut bebas ,NA $elarut dan pengen&er

Keterangan

. 0 8 = 3 ? > @ 1 .2 .. .0 .8 .= .3 .? .> .@ .1
02 0. 00 00 08 0= 03 0? 0> 0@ 01 82 8. 80 88 8= 83 8? 8>

2) A&at Pen#u!ung;
Auto&la%e (9ira ama =2 )) Disse&ting kits (0 set) Analytical 1alance (timbangan . mg) Sentri6use untuk tabung eppendor6 0 ml 9ot plate magneti& stirrer 7orteB -i&ropipette ukuran .-.2 ) -i&ropipette ukuran 0- 02 ) -i&ropipette ukuran 02-.22 ) -i&ropipette ukuran 022-.222 ) ,e6rigerator dua pintu p9 meter Timer !lass'ares (Erlenme er, botol, dll) $lasti&'ares (rak 0 F 2,0ml, pestle, &ooler)

$) A&at Ha+is Pa!ai;

*otol sampel (.22 buah) Tabung mi&rotube 0m) (.222 buah) Tabung $+, mi&rotube 2,0m) (.222 buah) -i&ropipette tip .2) (putih, .222 buah) -i&ropipette tip .22 ) (kuning, .222 buah) -i&ropipette tip .222 ) (biru, .222 buah) $ara6ilm (. pak) Film $olaroid (untuk .22 lembar) Sarung tangan (= pak)

D) 2a,an Ha+is Pa!ai;

Alkohol .22; ($A 0,3 liter) ")A $ traction kits (.22 sample) $+, detection kit ("SS7, TS7 F /97) ")A marker 233 bp ladder Agarose (.22 g) Ethidium bromide (.2 ml) *u66er T*E .2B (premiB po'der .0 )) )oading bu66er (3 ml) ,NAse 6ree 'ater (.2 m)) "ouble distilled &ater (dd90# .3 ))

31
:or u&a #an $ara Pe +uatan 2u55er; 1) TE 2u55er Tris 9+l .2 m- p9 @,2 EDTA . mDibuat dalam d90#, disimpan pada suhu =o+ 2) P$R 2u55er 1C9 .22 m- Tris-9+l p9 @,8 322 m- /+l .2 m- -g+l0 2,2.; gelatin ('5%) Disimpan pada suhu -02o+ -) T2E 2u55er 19 Tris base *ori& A&id EDTA d90# .2@ gram 33 gram 02 ml 1@2 ml

p9 @,2 Dapat disimpan pada suhu ruang, tetapi harus dibuang bila ter(adi presipitasi. 0) Loa#ing 2u55er !l &erol *romophenol *lue E lene + anol FF

82; 2,03; 2,03;

Dibuat dalam d90#, disimpan pada suhu =o+