COMPUESTOS AROMTICOS

BIBLIOGRAFA RECOMENDADA Trease y Evans (1989) Farmacognosia, 13 edicin, Interamericana-McGraw Hill. Deanna Marcano, Marahisa Hosegawa (1991) Fitoqumica Orgnica, Universidad Central de Venezuela, Caracas. Mabry, T.J. ; Markham, K.R.y Thomas, M.B. (1970) The Systematic Identification of Flavonoids, Springer-Verlag, New York. Harborne, J.B. ; Mabry, T.J. ; Mabry, H. (1975) The Flavonoids, Chapman and Hall, London. Samuelson, Gunnar (1992) Drugs of Natural Origin, Swedish Pharmaceutical Press, Stockholm. Bruneton, Jean (191993 Pharmacognosy, Phytochemistry, Medicinal Plants, Lavoisier, France.

Los compuestos aromticos naturales incluyen derivados simples de benceno, anillos bencnicos condensados, monmeros, dmeros o polmeros de alto peso molecular, como lo son la lignina y los taninos. Generalmente presentan grupos oxigendos, mayormente fenoles. Biogeneticamente derivan de la va del c. shikmico, y varios tienen origen mixto vas acetato-shikmico. Como ejemplo en el reino animal podemos citar el p-cresol, una secrecin de defensa de algunos insectos; la luciferina, responsable de la bioluminiscencia de las lucirnagas. Es un compuesto fenlico azufrado, que debe oxidarse enzimticamente para su luminiscencia. Un ejemplo de la vida real lo describe Mark J. Plotkin en su libro Aprendiz de Chamn (Emec Editores SA, 1997, Buenos Aires, traduccin del ingls Tales of a Shamans Aprentice, Mark J. Plotkin, 1993, Penguin Books USA Inc.). En l describe cmo los indios de la selva amaznica salen de pesca. Primero salen en busca de la liana ay-ah-e-yah, un tipo de liana amarilla, la cual cortan en tramos de treinta centmetros. Al cortarla la madera despide un olor semejante al del pepino. Luego con dos hojas de la palmera wah-pu y tiras largas de corteza de los rboles me-de-bono trenzan y arman las mochilas para transportar a la aldea los trozos de liana. En la aldea los indios se turnan para machacarla con garrotes de madera. Cargan la pila de pulpa amarilla en las canoas y se van a pescar lejos de la aldea. Las mujeres, paradas en las aguas fras del ro, amasan la pulpa amarilla del ay-ah-e-yeh soltando una sustancia blancuzca y espumosa que es llevada corriente abajo por el ro. El compuesto que la madera libera se llama rotenona (un rotenoide). Es un vasoconstrictor que penetra en las branquias de los peces y cierra los capilares responsables de la toma de oxgeno. En otras palabras, el pez se asfixia. Los hombres esperan en las canoas con arcos y flechas ro abajo. Cuando la rotenona comienza a hacer efecto, la superficie del ro comienza a hervir y se agita con los peces que salen en busca de aire. Todos los peces son alcanzados por una certera flecha hueca que vuelve a la superficie arrastrando con ella a la infeliz presa. Adems los indios usan la pulpa amarilla de la liana ay-ah-e-yah para tratar por ejemplo heridas profundas. La rotenona es hoy da uno de los pesticidas biodegradables ms importantes. Tiene poco efecto en animales de sangre caliente, efectos limitados en peces, pero es devastadora para muchos insectos. La rotenona es ingrediente de insecticidas, pulverizadores hortcolas, polvos pulguicidas y para baos de animales. Glicsidos fenlicos La mayora de los compuestos fenlicos de bajo PM se presentan en las clulas vivas en forma combinada, generalmente como O-glicsidos. El azcar unido puede ser un mono-, di-, o menos frecuentemente un polisacrido y estar conformado por unidades de hexosas y pentosas. La

glicosidacin aumenta la solubilidad de las agliconas en agua, aumentando as su movilidad y facilidad de transporte dentro de la planta. Ejemplos :
O

glucosil C HO
O Me O

OH

OH

glucovainillina

Vitexina

En el aislamiento y caracterizacin de los glicsidos hay que considerar la posibilidad de que el enlace O-glicsido se hidrolice, sea por va cida o va enzimtica. Existen tambin en la naturaleza la glicosidacin sobre tomos de carbono, llamados C-glicsidos, los cuales son resistentes a la hidrlisis cida. Las uniones C-glicosdicas siempre se encuentran adyacentes a un OH fenlico, por lo que se supone que en su bioformacin interviene el precursor O-glicosidado. Entre las agliconas, el grupo de los flavonoides son los ms glicosidados. La glicosidacin es menos frecuente en cumarinas, chalconas, y es escasa en isoflavonoides. Ciertos derivados forman un ster en la porcin del cido. Estos steres glicosdicos son llamados cidos clorognicos, compuestos asociados con la resistencia de las plantas a ciertas enfermedades. Son steres del c. qumico y del c. 3,4-dihidroxicinmico.
HO O HO HO O OH CO 2H OH

Ej. c. clorognico (c. 3,4-cafeoilqumico)

Aislamiento e Identificacin Los mtodos de deteccin, aislamiento e identificacin de compuestos fenlicos se fundamentan en sus propiedades cidas y en su polaridad. La mayora de los fenoles son slidos y su color vara desde incoloro hasta fuertemente coloreado, dependiendo de la conjugacin del o de los cromforos presentes. Su solubilidad en solventes polares (metanol, butanol) permite diferenciarlos de otros pigmentos liposolubles igualmente coloreados, los carotenoides. Su acidez los hace solubles en bases. Generalmente absorben en la regin visible y ultravioleta, y sus espectros son afectados por reactivos de desplazamiento de manera caracterstica. La prueba especfica para fenoles es la produccin de un intenso color verde, marrn o azul con soluciones recin preparados de cloruro frrico 1-2 %. Tambin se utilizan reacciones de acoplamiento con sales de diazonio recin preparadas, as como oxidacin de los fenoles por reactivos oxidantes como el reactivo de Tollens. La extraccin es precedida por el desgrasamiento del material con un solvente no polar. Se purifican mediante precipitaciones sucesivas o mediante la distribucin contracorriente (DCCC). Esta ltima tcnica se emplea para purificarlos y separarlos de acuerdo a su acidez, si una de las fases se ajusta a diferentes valores de pH. Adems se utiliza tambin ampliamente la cromatografa en columna con slica, almina, celulosa, poliamida y carboximetilcelulosa. Para las TLC (cromatografa en capa fina) los reactivos de visualizacin (o reveladores) usados son una solucin al 1-5 % de una sal de aluminio (cloruro, acetato o sulfato), o una solucin 0.2% de una amina diazotada estabilizada con carbonato de sodio al 20 % (Ej: Fast Blue). Hoy da se utiliza mucho la cromatografa lquida de alta presin, HPLC y la tcnica de cromatografa a contracorriente a la gota, DCCC.

CLASIFICACIN DE LOS COMPUESTOS FENLICOS A) Compuestos Fenlicos Simples: C6C1, C6C2, C6C3. B) Flavonoides chalconas y auronas flavonoles y flavonas antocianinas flavanonas y flavononoles flavonoles C) Isoflavonoides isoflavonas isoflavanonas rotenoides isoflavanos e isoflavenos D) Quinonas benzoquinona naftoquinona antraquinona bis-antraquinona E) -Pironas cumarinas isocumarinas aflatoxinas F) -Pironas cromanos y cromonas canabinoides G) Xantonas H) Lignoides I) Dpsidos J) Otros polictidos aromticos

A) COMPUESTOS FENLICOS SENCILLOS Los compuestos fenlicos sencillos pueden considerarse derivados de fenoles simples (C6), del c. benzoico (C6C1), de la acetofenona (C6C2) y del c. cinmico (fenilpropano) (C6C3). Biosinteticamente derivan de la va del c. shikmico. Las acetofenonas (C6C2) provenientes de un proceso de -oxidacin del precursor C6C3, aparecen como glicsidos, por ejemplo pungenina, aislada de Picea pungens. Por repeticin de las unidades C6C1 y C6C3 se forman las estructuras polimricas (taninos, melanina, ligninas). La formacin de hetersidos es comn, veamos algunos ejemplos: nombre Salicsido Propulsido (benzoilxalicosido) Arbutsido Florizsido Conifersido Glucovanillsido Gesido ejemplos y fuentes1 Salix y Populus spp Viburnum prumifolum Populus tremula Productos de hidrlisis Alcohol saliclico, glucosa Alcohol saliclico, c. benzoico y glucosa fHidroquinona, glucosa Floretina, glucosa Alcohol coniferlico, glucosa Vanillina, glucosa Eugenol, vicianosa (glucosa + arabinosa)

Ericaceae y Rosaceae Malus (Rosaceae) Coniferae Vanilla spp y algunas Graminaceae Geum spp

R1 COR5 R4 R1 R2 R3 H H H OH OMe H H H

R2 H OH OH OH OH OH OH OH

R3 H H

R4 OH H

R5

compuesto

OMe H OH OMe OH OMe OGlu H H H H H

OMe salicilato de metilo OH c. phidroxibenzico OH c. vanlico => C6C1 OH c. glico OH c. sirngico OH c. protocateico H vanillina Me pungenina => C6C2 siendo Glu = glucosa

R1 R2 H OH OCH2 O
R1 R2 OMe

Eugenol Miristicina

R1

R2 OH H OH OH OH OGlu OH OCH2 O

R3 H H OH OMe OMe OMe OMe OMe

R4 H OH H H H H H H

R5 CO2H CO2H CO2H CO2H CO2H CH2O H CH2O H CH3

compuestos c. p-cumrico c. o-cumrico c. cafico c. ferlico c. sinpico coniferina alcohol coniferlico isomiristicina

R5

R4 R1 R2 R3

H H H H OMe H H

siendo Glu = glucosa

Biosntesis La biosntesis de compuestos fenlicos sencillos comienza a travs de un precursor comn, el c. shikmico. ste se forma por una condensacin aldlica entre fosfoenolpiruvato y el azcar 4-fosfoD-eritrosa, ambos metabolitos de la glucosa. Al pH presente en la planta los cidos involucrados estn ionizados.
BIOSINTESIS DE COMPUESTOS FENLICOS SENCILLOS

O O O OH HO O P O 4-fosfo-D-eritrosa fosfoenolpiruvato (PEP) O O P O O HO OH P O OH 3-dehidroquinato OH OH HO O O

7-fosfo-3-deoxi-Darabino-heptulosato

O PEP

O O

O O O O O OH

O O

O OH

OH

HO OH

OH OH

3-dehidroshikimato

shikimato

chorismate

prefenato

COOH H NH2

O O demas fenilpropanos...

OH

OH

Ejemplos de plantas Vainilla y Vainillina La vainilla (fruto de Vainilla) est constituida por los frutos inmaduros, cuidadosamente curados y totalmente desarrollados, de Vainilla fragas (Salis.) Ames (sin. V. planifolia Andrews) (Fam. Orchidaceae) (Vainilla mexicana o Borbn) y de la V. tahitensis (vainilla de Tahiti). Es nativa del neotrpico donde se usaba extensivamente en Amrica Central en la poca precolombina. Los aztecas hacan una bebida combinando vainilla, chocolate y pimientos chile. El nombre vainilla viene de la palabra espaola vaina (debido a su forma), que deriva a su vez del trmino en latn que designa a la vagina. Los frutos se recolectan cuando la parte superior del mismo cambia su color del verde al amarillo. El color y olor caracterstico de la droga comercial se desarrollan por accin enzimtica, que se efecta a lo largo del curado, consistente en una desecacin lenta a temperatura controlada. La vainilla verde contiene glicsidos, principalmente vanillsido (glucovanillina) y alcohol glucovanllico. Durante el curado estos compuestos sufren oxidaciones e hidrlisis enzimticas. La

glucovanillina se hidroliza dando glucosa y vanillina. El alcohol glucovanllico se hidroliza dando glucosa y alcohol vanllico, el cual se transforma por oxidacin en vanillina (aldehido vanllico).
O OH hidr. OMe O glu glucovanillina O glu alcohol glucovanllico OMe OH alcohol vanllico OMe OH OH <O> OMe O

vanilli na

hidrlisis

Los frutos de la vainilla son muy utilizados en confitera y perfumera, pero han sido parcialmente desplazados por vainilla sinttica. Sin embargo la esencia sinttica no contiene el olor y el sabor de los frutos complejos. La vainilla es un componente clave de la receta secreta de la Coca-Cola. Salicina Las cortezas de sauce, especialmente de Salix fragilis y S. purpurea (Fam. Salicaceae) son una fuente de salicina (salicsido). Por maceracin en agua caliente durante varias horas se extrae el glicsido junto a taninos. El extracto acuoso se filtra, se concentra al vaco y se trata, despus, con acetato de plomo. Despus de filtrar, se elimina el exceso de plomo por tratamiento con sulfuro de hidrgeno. El lquido filtrado, que carece ya de tanino, se neutraliza con amonaco, se concentra y se deja enfriar, con lo que se separan cristales de salicina. Estos cristales pueden purificarse disolvindolos de nuevo, filtrando a travs de carbn activado y recristalizando.
OH O glu hidrol. OH OH <O> O OH OH

salicina

alcohol saliclico

c. saliclico

Cpsico (Pimiento rojo, pimiento chile) La droga est constituida por los frutos desecados y maduros del Capsicum annum, var. minimum (Miller) Heiser y variedades de frutos pequeos de C. frutescens L. (Fam. Solanaceae). Los cpsicos parecen ser de origen americano, y fueron mencionados en el segundo viaje de Coln a las Indias Occidentales. Los componentes picantes son la capsaicina y la 6,7-dihidrocapsaicina, as como en menor concentracin la nordihidrocapsaicina, la homocapsaicina (cido C11) y la homodihidrocapsaicina. Los cpsicos se utilizan como condimento. La droga se administra internamente en la dispepsia atnica y en la flatulencias. Externamente se usa como revulsivo en forma de pomada, emplasto, etc para aliviar el reumatismo, lumbago, etc
O N HO OMe (CH2)4CH=CHCH(CH3)2

Blsamo de Per Se obtiene del tronco de Myroxylon balsamum var. pereira, el cual crece en Amrica Central (El Salvador, Honduras, Guatemala). La droga exuda del tronco luego de golpearlo, de arrancar la corteza y de chamuscarlos, y es de origen puramente patolgico. El blsamo de Per, un lquido viscoso, pastoso y marrn, contiene 55%-66% de steres del c. cinmico y benzoico, en especial cinamato de bencilo (cinamena), cinamato de cinamoilo (estiracina) y benzoato de bencilo, as como aprox. un 28% de resina y restos de c. cinmico y vanillina libre, lo que le da su aroma caracterstico. Usos: se emplea en cremas antispticas, y tambin contra infecciones parasitarias de la piel. Blsamo de Tol Es un producto similar al del Blsamo de Per que se obtiene del tronco de Myroxylon balsamum var balsamum, luego de realizarle incisiones en V en el tronco. La droga (blsamo de Tol, BP1980) es una pasta viscosa que lentamente solidifica, y que contiene un 80% de resina compuesta por steres de c. cinmico y benzoico con alcoholes resnicas. El resto son c. cinmico y c. benzoico libre, y una pequea cantidad de vanillina. Usos: es un componente de mezclas para combatir la tos, as como saborizante en dulces, especialidades farmacuticas y perfumes. Cinamaldehido El cinamaldehido es el principal constituyente del aceite esencial de cinnamon, es decir de la corteza de Cinnamonum zeylanicum, un pequeo rbol cultivado en Sri Lanka, India, Islas Seycheles y Brasil. La corteza se separa y se deja secar. Durante el secado ocurre un pequeo proceso de fermentacin, el cual le da un color marrn a la droga. Por destilacin con arrastre de vapor se obtiene un 0.5%1.5% de aceite esencial, cuyo principal constituyente es el cinamaldehido (65%-75%). FLAVONOIDES Los flavonoides, que se encuentran tanto en estado libre como glicosidado, constituyen el grupo ms amplio de los fenoles naturales. Son sustancias de origen vegetal y le dan los colores (rojos, azules, amarillo) a las flores y las hojas de otoo (del latn flavus, amarillo). Son abundantes en las Polugonaceae, Rutaceae, Leguminosae, Umbelliferae y Compositae. Los flavonoides se encuentran sobre todo en los rganos areos amarillos (hojas y botones florales) localizados en tejidos superficiales. Estn disueltos como glicsidos en el jugo vacuolar, cloroplastos y membranas. La luz no es esencial para su formacin, pero incluye cuantitativamente. La intensidad de color amarillo aumenta con el aumento de pH, es decir de ser incoloros o blancos a pH cido, pasan a ser fuertemente amarillos a pH bsicos. El grupo de los flavonoides es conocido por sus efectos antiinflamatorios y antialrgicos, por sus propiedades antitrombticas y vasoprotectoras, por la inhibicin de la promocin de tumores y como protectores de la mucosa gstrica. Estos efectos se han atribuido a su influencia sobre el metabolismo del c. araquidnico. Los flavonoides tambin poseen actividad antioxidante, aplicaciones como colorantes naturales y poseen propiedades antibactarianas y antifngicas. En los vegetales intervienen en los fenmenos de oxidacin-reduccin, protegen a otros pigmentos de la luz y de la radiacin UV, presentan actividad fungicida y contra parsitos agresores, ayudan en la polinizacin, ya que por sus colores atraen a los insectos junto con los aceites esenciales. Estructura La estructura general de los flavonoides comprende un anillo A, derivado de la cadena policetdica, un anillo B, derivado del c. shikimico, tres tomos de carbono que unen los anillos A y B, correspondientes a la parte alqulica del fenilpropano. Por eso se los conoce como C6-C3-C6. La estructura puede conformar un heterociclo (pironas) que son los ms abundantes, o una cadena abierta, las chalconas. Las polimerizaciones son frecuentes, y ocurren principalmente por uniones

C-C. El estado de oxidacin del anillo central determina varios grupos estructurales, como se ve a continuacin en ambas tablas.
B A B

O A C O

O C O

OH

Flavonas O A C
A

Flavonoles
B

O C O

O Isoflavonas

B Flavanonas
B O CH O

O A C

OH O

Dihidroflavonoles
3 2 3' 4' 5' 6' 2' 4 5 6

Auronas

Chalconas La estructura base puede presentar hidroxilos, metoxilos, estar O-glicosidada o estar C-glicosidada. En general el anillo A presenta hidroxilos, y no metoxilos, los cuales se ubican mayormente en 7 y en 5. El anillo B en cambio presenta 1,2 o 3 hidroxilos o metoxilos, los cuales se ubican de la siguiente manera: si hay un solo hidroxilo/metoxilo su ubica en la posicin 4, si hay dos hidroxilos/metoxilos se ubican en las posiciones 3 y 5, y si hay tres hidroxilos/metoxilos se ubican en las posiciones 3, 4 y 5.
3' 8 7 1 2' 1' 2 3 5 4

4' 5'

A
6

O C

B
6'

Numeracin general de flavonoides. Sitios de hidroxilacin y metoxilacin.

Todos los flavonoides se numeran en sentido horario, simplemente nmeros en el anillo Ay C, y nmeros con prima en el anillo B. La excepcin son las auronas, donde la numeracin se invierte. Los azcares forman O-glicsidos en las posiciones 3, 7, 3 y 4, siendo los mas comunes diglicsidos en 3 y 7 o en 7 y 4. Ej: Negretina.
3'

8 7

2' 1' 2 3

4' 5'

A
6 5

O C
4

B
6'

sitios de O-glicosidacin. Los O-glicsidos dan hidrlisis por tratamiento con cidos. En cambio los C-glicsidos, menos abundantes, no son hidrolizados por tratamiento con cidos. La C-glicosidacin se presenta sobre C6 y C8. Ej. Vitexina (C-glucsido) y Negretina (O-glucsido).
glucosil C HO O
HO O O glu O

OH

OMe OH OMe O rha O OH

OH

glu

Los azcares que podemos encontrar pueden ser mono-, di- y polisacridos. Dentro de los monosacridos tenemos D-glucosa, D-galactosa, D-xylosa, L-rhamnosa, L-arabinosa y c. Dglucurnico. Como ejemplos de disacridos tenemos la Gentiobiosa (glu 1->6glu) y la rutinosa (rha 1 -> 6glu), y como ejemplos de trisacridos tenemos la Gentiotriosa (glu 1 -> 6glu 1 -> 6glu) y la sorborosa (glu 1 -> 6glu 1 -> 4glu). Hay que resaltar que la unin de los azcares es en general 1,2 o 1,6, y son mayormente ismeros . Adems, la unin entre el azcar y la genina es una unin . Biosntesis de Flavonoides Los flavonoides son biosintetizados por una combinacin de ambas vias biosintticas, la del c. shikmico y la del malonil-CoA. El compuesto obtenido por la va biosinttica del c. shikmico, p.ej. c. cinmico, es luego utilizado como compuesto de partida para la va del malonil-CoA, en la cual se le adicionan tres acetatos. Con la posterior ciclacin se obtiene la estructura clsica de los flavonoides, en la cual el anillo A se form por la va del malonil-CoA, mientras que el anillo B se form por la va del c. shikmico, y el puente de tres carbonos proviene de la adicin de fosfoenolpiruvato. Con sucesivas hidroxilaciones y reducciones se forman los diferentes flavonoides, con la opcin de una glicosidacin final.

BIOSINTESIS DE FLAVONOIDES

O PEP

COOH H NH2 O O O fenilalanina

O O

HO OH

OH OH

shikimato

chorismate

cinamato

R-CO-SCoA

CH2CO-SCoA COOH R

O COOH

acil-CoA

malonil-CoA

polictidos

HO O

O 3 acetatos HOOC

HO

OH

OH O

HO A

OH O

Aislamiento e Identificacin de Flavonoides En las plantas los flavonoides estn en general glicosidados, por lo tanto son altamente polares. Se ubican preferentemente en las vacuolas y son hidrofilicos. Debido a eso hay que extraer y solubilizarlos en solventes polares como ser agua, etanol. Las geninas en cambio son solubles en ter de petrleo, diclorometano, y no en agua. Muestra fresca o seca EtOH, calor Solucin alcohlica del glicsido

Lavado con ter

Fase etrea

- clorofilas - carotenoides - flavonoides apolares

F. alcohlica - glicsidos Separacin y purificacin

Cromatografa

Precipitacin con

Cristalizacin

* Columna con: Slica, almina, celulosa, poliamida, resinas de II * HPLC * TLC, GC (no prep.) - DCCC

* Pb(Ac)2 , redisolucin con H2 S o H2 SO4 . * C activ., redisolucin con soln fenlicas acuosas * PVP, pptan en medio H+/H2 O y son solubles en medio bsico

* Pptan en medio cido, son solubles en medio bsico

Conviene usar la muestra previamente secada, as las enzimas no tienen actividad, evitando la degradacin de los compuestos. Asimismo conviene usar etanol y no agua, porque el etanol inactiva las enzimas (rompe la estructura 3aria) y adems se puede eliminar ms fcil. Para aislar los flavonoides del extracto etanlico tenemos 3 posibilidades, que pueden usarse por combinacin. Tradicionalmente se utilizaba la cristalizacin en medio cido, redisolvindolos luego en medio bsico. La precipitacin con acetato de plomo fue muy utilizada, ya que precipitan los diy polihidroxifenoles de los monohidroxilados, que quedan en solucin. Para recuperar los flavonoides precipitados se trata el precipitado con c. sulfhdrico o con c. Sulfrico, liberando los flavonoides y precipitando entonces sulfuro de plomo o sulfato de plomo. Conviene usar sulfatos y no sulfuros, ya que el sulfuro de plomo tiene un gran poder de adsorcin, y eso no es conveniente. El PVP es muy til porque causa una buena precipitacin de compuestos fenlicos hidroxilados a pH cido en metanol. Se hace reversible por cambio de pH. En el caso del carbn activado, ste acta adsorbiendo los compuestos. Se filtra y para poder liberarlos se pone en contacto con una solucin fenlica en agua. El fenol libera los flavonoides por competencia. Actualmente en la separacin y purificacin se emplean columnas de resina de intercambio inico cidas (fase H+) que separa a los flavonoides del material soluble. El fraccionamiento se puede lograr por cromatografa de adsorcin usando como fase estacionaria slica gel, celulosa, poliamida, almina y Sephadex (polmeros de dextranos, forman poros y separan por tamao). Jugando con la polaridad de los solventes podemos hacer separaciones buenas. Primero con un solvente apolar elumos las geninas que estn bastante metoxilados, luego aumentamos la polaridad de la fase mvil

pudiendo eluir compuestos polihidroxilados y finalmente con solventes muy polares elumos los glicsidos. El problema es que quedan retenidas muchas cosas. En los ltimos aos se han desarrollado varias tcnicas cromatogrficas nuevas, entre ellas PHLC (High Performance Liquid Chromatography, Cromatografa lquida de alta presin) y DCCC (Droplet Counter Current Chromatography, cromatografa contracorriente a la gota). Para HPLC preparativa (es decir separar grandes cantidades) se utiliza en general una columna de fase reversa ODS C-18 (OctaDodecilSilano). La separacin se basa en interacciones hidrofbicas y no necesita derivados, tiene alto poder de resolucin y necesita un detector UV. Se usan solventes polares como ser mezclas de agua metanol y/o acetonitrilo. Para usar GC (gas chromatography) se requiere de compuestos termoestables, y en general es necesario derivatizarlos con agentes sililantes a fin de aumentar su volatilidad. No se hace GC preparativa, GC es con fines analticos. Se puede acoplar la GC a la espectrometria de masas, dando GC.MS. La fragmentacin principal implica la escisin del anillo. Determinacin de la estructura Si tenemos un glicsido debemos identificar la genina y tambin los azcares. Para eso se hidroliza el glicsido, pudiendo previamente metilar los hidroxilos libres. Los azcares los identificamos por TLC y por RMN, y la genina la podemos identificar por RMN y por espectrofotometra UV-VIS. Antiguamente la genina se identificaba usando una batera de reacciones (hidrlisis, etc...). Espectrofotometra UV Es ampliamente usado por requerir solo pequeas cantidades del compuesto puro, el cual no se destruye, al igual que para el NMR. El espectro UV de un flavonoide se relaciona con su estructura de la siguiente manera:
8 7

A
6 5 4 3

200

500

II benzoico En general :

I cinamoilo

Banda II

Banda I

Banda I 300 - 400 nm Banda II 240 - 285 nm Flavona y Flavonol Banda I 320-350 nm, intensa Isoflavona Banda I, hombro, banda II 245-270 nm, intensa Flavanona y Dihidroflavonol Banda I, hombro, banda II 270-295 nm, intensa Chalcona Banda I 340-380 nm, intensa Aurona Banda I 370-430 nm, intensa Antocianinas Banda I 480-550 nm, intensa El espectro en metanol de los flavonoides da informacin sobre el tipo de flavonoide y el estado de oxidacion. El mximo de absorcin de los flavonoides vara de acuerdo al estado de oxidacin del anillo central y segn el nmero y posicin de los grupos OR, como resultado de los diferentes sistemas conjugados. El empleo de reactivos de desplazamientos como etxido de sodio, cloruro frrico, acetato de sodio y c. brico produce corrimientos de los mximos de absorcin de acuerdo a la localizacin y naturaleza de las funciones oxigenadas. 1er corrimiento MeOH MeOH + NaMeOH

Obtengo el espectro del flavonoide en metanol entre 200 a 500 nm. Luego agrego en la misma cubeta metxido de sodio y obtengo un nuevo espectro. El metxido de sodio es una base fuerte y arranca todos los protones de los hidroxilos libres causando un desplazamiento batocrmico (a longitudes de onda mayores) en ambas bandas. Este es mayor en la medida que aumenta la conjugacin a travs del sistema enona. 2do corriemiento MeOH + AlCl3 MeOH + AlCl3 + HCl Se obtiene primero el espectro en metanol, luego en metanol con tricloruro de aluminio, y finalmente en metanol con tricloruro de aluminio con c. clorhdrico. El corrimiento se basa en la formacin de quelatos entre el AlCl3 y dos grupos hidroxilos en posicin orto, as como con el carbonilo en C4 y un hidroxilo libre en C5 o en C3. El quelato con los hidroxilos en orto en el anillo B no es estable en medio cido. Si los espectros realizados en MeOH + AlCl3 y en MeOH + AlCl3 + HCl coinciden, no tenemos hidroxilos en el anillo B. Si el espectro de MeOH no cambia con el agregado de MeOH + AlCl3 + HCl, no hay hidroxilos en 3 ni en 5. Si el espectro cambia mostrando un efecto batocrmico, efectivamente tenemos un hidroxilo libre en 3 y/o en 5. 3er corrimiento MeOH + AcONa MeOH + AcONa + H3 BO3 El acetato de sodio es una base dbil. Se usa para detectar especficamente el hidroxilo en 7, observndose un efecto batocrmico importante en la banda II. Adems tambin puede desprotonarse el protn en 3 y en 4, dando los corrimientos batocrmicos correspondientes en la banda I. Al agregar H3 BO3 a la cubeta, se puede observar un efecto batocrmico de la banda I si el anillo B contiene dihidrxidos. Esto se debe a que el cido brico en presencia de acetato de sodio forma un complejo con dihidrxidos, es decir forma diesteres con hidroxilos en orto, en gral con dihirxidos del anillo B. Adems el c. brico puede protonar al OH en 7 y restablecer la banda II Podemos resumir el uso de reactivos de desplazamiento en la siguiente tabla: Variacin en la absorcin UV-VIS de los flavonoides (nm) Esqueleto MeOH NaOH NaOAc Flavonas 315-350 40-60 --Flavonoles 350-385 40-60 --Flavanonas 275-295 30-40 30-40 Isoflavonas 250-270 10-15 5-15 Chalconas 370-395 40-60 --Auronas 385-415 40-60 --Antocianinas 475-545 Inest. Inest.

AlCl3 25-40 40-60 20-30 10-20 50-65 50-65 15-50

Analicemos cada grupo ahora por separado. 1) Chalconas y Auronas Las chalconas se encuentran solamente en algunas familias botnicas. Estructuralmente son ismeros de las flavanonas por apertura del ncleo central o piransico. Cabe mencionar el glucsido de la floretina : florizina, ampliamente distribudo en la corteza de los OH frutos de varias Rosceas. Produce la diabetes de la HO OH floretina que se caracteriza por un aumento de la glucosuria, es decir la excresin urinaria de glucosa, causada por interferencia en la reabsorcin de la glucosa OR O por los tbulos renales.

2) Flavonas y Flavonoles Ambos son los flavonoides naturales ms abundantes. Se han aislado tanto libres como glicsidos. Los compuestos ms frecuentes son la apigenina, la quercitina (de mayor abundancia) y el kanferol.
OH R1O O R2

OH HO O OR1 R2

OH

OH

R1 H H apiosil-glu

R2 H OH H

apigenina luteolina apina

R1 H H

R2 OH OH H

quercitina rutina kanferol

3) Antocianinas Constituyen los pigmentos principales de las flores y de las hojas de otoo, sus colores van desde el rojo hasta el azul. Son glicsidos de polihidroxiflavilio, en los cuales la unin glicosdica est principalmente en C3. Veamos algunos ejemplos : aglicona apigenidina peonidina rosinidina cianidina malvidina hirsutidina R H OH OH OH OH OH R1 OH OH OH OH OH OH R2 OH OH OMe OH OH OMe R3 OH OH OH OH OH OH R4 H OMe OMe OH OMe OMe R5 H H H H OMe Ome
R5 R3 R2 O R R1 R4

Las antocianinas de las flores se han sealado como mercadores genticos y por ello son utilizados en la manipulacin gentica para obtener nuevas variedades de petunias, rododendros, camelias, etc... Se ha encontrado que la deficiencia de fsforo en el suelo, la baja temperatura (de 0 a 5) y la exposicin a ozono, aumentan el contenido de antocianinas.

Debido a las resticciones sanitarias hacia el uso de colorantes sintticos, las antocianinas presentan inters comercial pra la industris alimentaria. Las antocianinas presentan isomerizacin por cambios de pH, variando su color y estructura del anillo central.
OH HO

OH O OR OR

chalcona (amarillo)

OH HO O OH O

OR OH HO

OR OR OR

OR

sal de flavilio (rojo)

cromenol (pseudobase) (incoloro)

OH O O HO O

OR OR OR

OR

anhidrobases (azules)

Los pigmentos vegetales se pueden clasificar en cuatro grandes grupos, dos liposolubles : clorofilas y carotenoides, y dos hidrosolubles : las betalanas y los flavonoides, los cuales se encuentran principalmente en flores y frutos. La coloracin de las antocianinas vara con el cambio de pH, de rojo en medio cido, pasando por amarillo, a violeta y azul en medio alcalino. Se ha propuesto que el mecanismo de agrupacin procede : 1. Mediante puentes de hidrgeno. Esto no es tan importante, ya que las antocianinas completamente metiladas producen las mismas coloraciones que las no metiladas. 2. Mediante interaccin entre anillos bencnicos. La interaccin puede deberse al fenmeno de copigmentacin intermolecular, es decir involucra un mezcla de flavonoides. Estos complejos se estabilizan por la presencia de metales bivalentes, as como por la sustitucin con el c. cumrico y por la glicosidacin, lo que estabiliza el pigmento frente a la accin enzimtica y a la luz. Puede haber copigmentacin intramolecular, en cuyo caso la unin tiene lugar entre dos unidades de ster del tipo cinamolo, que se presentan como sustituyentes de la porcin del azcar. En este caso la adicin de metales bivalentes no incrementa la estabilidad del color. La copigmentacin intramolecular produce un desplazamiento batocrmico. 4) Flavanonas y Flavanonoles La saturacin del anillo heterocclico crea en la molcula al menos dos centros quirales C2 y C3 y un tercero : C4 en el caso de los flavanodioles. Las flavanonas de origen natural presentan casi siempre la configuracin 2S, que dispone el anillo B ecuatorial. Pueden presentarse como O- y Cglicsidos (hesperidina y aervanona), tambin pueden tener O- y C-metilaciones o alquilaciones superiores (prenilaciones). Las agliconas ms representativas son hesperetina y naringenina.

OH RO O
2s

OMe RO O OH

HO O Me

O O O OH HO OH

R=H: naringenina OH O Narirutina R=rutinsilo:

R=H: hesperetina OH O R=rutinsilo:hesperidina

HO OH Rutinsilo (6-[-L-rham]-D-glu)

Los flavanonoles, llamados tambin 3-hidroxiflavanonas o dihidroflavonoles, presentan dos carbonos asimtricos : 2 y 3. La mayora tiene configuracin 2R :3R. Los compuestos incluyen polioxigenaciones en los anillos A y B, glicosidacin, prenilacin, y tambin algunas estructuras cclicas como en el caso del flavolignano silycristina (de Silybum marianum, Compuesta).
OH O OMe HO O OH OH O OH O H CH2OH HO O OMe OH OH O

silvlycristina

sophoronol

OH OH OR1

R1 H Me Glu H

R2 H H H Me

Sustancia Taxifolina Hultenina Glucodistylina Cederodarina

HO R2 OH

Algunas flavanonas y flavanonoles inhiben el crecimiento larval de Heliothis zea, una plaga del maz, entre ellos el eriodictiol, la taxifolina (dihidroquercetina) y su 3-0-ramnsido. 5) Flavanoles El esqueleto del flavano puede estar mono- o dihidroxilado formando los flavan-3,4-dioles, flavan4-oles y flavan-3-oles, o catequinas.
R HO O OH OH OH OH

R C-2 C-3 C-4 H R S R Mollisacacidina H S R S Leucofisetidina OH R R R Melacacidina OH R R S isomelacacidina

Los flavan-3,4-dioles pueden ser facilmente convertidos en antocianinas por tratamiento con cido mineral, lo que provoca la deshidratacin seguida de oxidacin, por el oxgeno del aire, originando la sal de flavilio. Por esta razn se conocen estos flavonoides como leucoantonianidinas. Las catequinas o flavan-3-oles son las unidades monomricas de los flavonoides condensados : taninos. ISOFLAVONOIDES Estn distribuidos en pocas familias, principalmente en las Leguminosas. Estructuralmente se los puede dividir en varias clases, correspondientes stas a los flavonoides respectivos : isoflavonas, isoflavonoles, etc... Para su anlisis tambin son de capital importancia la espectrofotometra UV y la RMN. 1) Isoflavonas Dentro de los isoflavonoides son las ms abundantes. La O-glicosidacin es ms frecuente que la Cglicosidacin. Las cuatro agliconas ms comunes son:

R1 X R R1

R2

XR

R H H OH OH OH

OH OH OH OH OH

OH OMe OH OMe OH

H H H H Me2 C=CH-CH2

Daizdena Formononetina Genistena Biochanina-A wighteona

Las alquilaciones pueden presentarse sobre C2, tal es el caso de la 7-hidroxi-2-metilisoflavona que se encuentra en la raz de regaliz (Glycyrrhiza glabra ). 2) Isoflavanonas Son mucho ms escasas que las anteriores y contienen generalmente una o ms unidades de prenilo. Como ejemplo podemos mencionar al lespedeol presente en Neurautanenia amboensis, que est presente en el vegetal junto al 4-isoflavanol correspondiente ambanol.
O O

OH

OH

OH

3) Rotenoides Son una clase de isoflavonoides que contienen un anillo heterocclico adicional en su estructura. Se 7 encuentran preferencialmente en las Leguminosas. 6 8
9 10

A
11

O C O

B
1

O A
2

5 4 3

12

Como ya mencionamos, Derris ellptica (Leguminosa) rica en rotenona, es utilizada como veneno temporal en las aguas de ros del amazonas para facilitar la pesca.
5'

O
E D o C O H H B o A OM e OM e

O OMe

Rotenona (rotenoide) Derris negrensis, D. elliptica

Rotenonona (deshidrorotenoide) Neorautanenia amboensis

EJEMPLOS DE PLANTAS Ginkgo biloba Con excepcin de Ginkgo biloba L, las plantas del orden Ginkgoaceae solo se encuentran al estado de fsiles, originarios del terciario. El rbol, de ms de 30 metros de altura, produce madera utilizable y semillas comestibles que contienen aceite. Se cultiva en Corea, sureste de Francia y USA para abastecer el mercado farmacutico de hojas. Se ha demostrado que los principios activos amargos (ginkglidos) son potentes antagonistas especficos del PAF (Factor Activador de Plaquetas), as como vasodilatadores arteriales y vasoconstrictores venosos, es decir con posible accin teraputica en la inflamacin alrgica o hiperactividad bronquial. El extracto tambin mejora la irrigacin de los tejidos, activa el metabolismo celular, en particular en la corteza cerebral, incrementando la absorcin de glucosa y de oxigeno. Las hojas de Ginkgo biloba contienen aprox un 0.5%-1% de flavonoides totales, comprendiendo una mezcla de aprox 20 compuestos. Entre ellos quercetina, kaempferol, isorhamnetina, sus glicsidos, biflavonoides (bilobetin, ginkgetina, isoginkgetina, etc...), y 0.01%-0.04% gingkglidos A, B, C (diterpenos), c. ginkglico, c. shikmico, c. vanllico, c. chlorognico, catequinas, sesquiterpenos (bilobalida), etc...

OCH3 HO (CH2)7 CH=CH (CH2)5 CH3 ginkgol bilobetin HO O HO OH O OH O O OCH3

Usos: El extracto de las hojas de Ginkgo biloba que contiene por valoracin un 24% de flavonoides y un 6% de ginkgolidos, es indicado para el tratamiento de oclusiones arteriales, para la enfermedad de Raynaud, as como en la insuficiencia seil cerebral y prdida auditiva por origen isqumico. Otras formulaciones y combinacines, p.ej. con heptaminol y trihidroxyethylrutina, son indicadas para tratar sntomas relacionados con insuficiencia venosa y linftica. Passiflora incarnata La planta de Passiflora incarnata L. (flor de la pasin o passiflora), Passifloraceae, crece en forma de arbustos en el sur de USA y en Mxico. La droga incluye partes aereas secas conteniendo pedazos de troncos, zarcillos, hojas y flores. La hoja tiene un pecolo largo y es trilobulada, siendo el lbulo medio el ms desarrollado. La droga puede verse adulterada con troncos y hojas de P. edulis Sim., cuya fruta es comestible (la fruta de la pasin), y cuya hoja es dentada. Otro adulterante lo presenta P. caerules L., cuyas hojas son pentalobuladas y que se cultiva por sus flores azules ornamentales. La droga contiene c. Fenlicos, coumarinas, fitosteroles, 0.1% de aceite esencial, glicsidos cianogenticos, 0.05% maltol, menos de 0.03% de alcaloides indlicos y varios flavonoides. Los compuestos mayoritarios son flavon-di-C-glicsidos, shaftsido e inoshaftsido, y 2glicsidos de isovitexina e iso-orientina.
R4 R3 R2 O R1 OH O O OH

Vitexin Isovitexin Orientin Iso-orientin Shaftoside Isoshaftoside

R1 H glc H glc glc ara

R2 H H H H H H

R3 glc H glc H ara glc

R4 H H OH OH H H

El estudio del contenido de glicsidos flavnicos totales del extracto metanlico por TLC permite identificar las especies oficiales y rechazar las no oficiales. La farmacopea francesa (10 edicin) exige un contenido mayor o igual al 1.5% de flavonoides totales, expresados como vitexina, midiendo la absorcin luego de formar el complejo con AlCl3 . Usos: en preparaciones galnicas y en fitofarmacuticos para controlar anormalidades del ritmo cardaco, as como sedante. Citroflavonoids Citrus (Rosaceae) son rboles de origen oriental, de los que se cultivan muchas especies para consumir los frutos, y tambien para obtener los aceites esenciales, as como fuentes de pectinas y flanonoides. Estos abundan en el pericarpio principalmente como glicsidos (hesperidina o hesperetin-7-O-rutinsido, neohesperidina, naringenina, eriodyctina, eriocitrina) y flavone glycosidos (diosmina, rutina). OMe RO O OH Hesperetina 7-Rutinosil: Hesperidina

OH

Usos: se utilizan puros (diosmina), en extractos o en combinaciones (con p.ej. c. Ascrbico, rutina, papaverina, etc...) en preparaciones farmacuticas para tratar insuficiencia venosa crnica y

funcional, y para tratar dolores de piernas y calambres. La administracions de una dosis de (1 g/da) por un perodo de tiempo mediano (8 semanas) hace disminuir e incluso desaparecer los sntomas. La eficacia del tratamiento es significativamente mayor a la del placebo, pero en ste tipo de patologas el 50% de los pacientes siente alivio solamente con el placebo...y por adoptar normas higinicas generales.