APOPTOZS BYOKMYASI

Jacobson et al., Cell 88:347 (1997)

Nekroz ve apoptozis -Yol aan nedenler

skemi Hipertermi Hipoksi Litik viral enfeksiyon Toksik maddelerin yksek konsantrasyonlar iddetli oksidatif stress

Nekroz

Apoptozis Byme faktr eksiklii Hcre yalanmas HIV Kanser ilalar Radyasyon Yksek doz glukokortikoid Fas veya TNFR-1 res. akt. Sitotoksik T lenfositler ok iddetli olmayan oksidatif stress

Nekroz ve apoptozis -Morfolojik zellikler

Nekroz Hcre membran btnlnn kayb Kromatin floklasyonu Hcre imesi Organellerin disintegrasyonu Endoplazmik retikulumun dilatasyonu Byk vakuollerin oluumu Hcre lizisi

Apoptozis ntakt hcre membran fakat membranda bleb oluumu Kromatinin nkleer membran civarnda toplanmas ve younlamas Hcre klmesi Organellerde disintegrasyon yok Hcrenin intakt mitokondri, ribozom, nukleus paralar ve dier organelleri ieren membranla kapl apoptotik cisimciklere paralanmas

Nekroz ve apoptozis -Biyokimyasal zellikler

Nekroz Bozulmu iyon hemostazisi ATP gerekmez (pasif sre) +4 oCde gerekleebilir DNA rastgele paralanr (agaroz jel elektroforezinde smear grnts) Postlitik DNA fragmentasyonu (=lmn ge safhasnda) Apoptozis yi kontrollu, baz aktivasyonlarn ve enzimatik basamaklarn olmas ATP gereklidir (aktif sre) +4 oCde gereklemez. DNA internukleozomal alanlarda 180 kb iftinin katlar olacak ekilde krlr mono ve oligonukleozomlara ayrlr (agaroz jel elektroforezinde merdiven patterni=apoptozisin en nemli belirteci) Prelitik DNA fragmantasyonu (=erken evrede gerekleir)

Nekroz ve apoptozis -Dier zellikler

Nekroz Hcreler gruplar halinde lr Fizyolojik olmayan (patolojik) etkiler sonucu gerekleir Lizozomal enzimler salnr nflamasyona neden olur Apoptozis Hcreler tek tek veya birka bir arada lr Fizyolojik artlarda da gerekleebilir Komu hcreler veya makrofajlar tarafndan fagosite edilirler nflamasyon grlmez

ntiharla lm
Hcreler intihar karar ile unlara neden olur: Klme olur Sitokrom c salnm ile mitokondrileri yklr Yzeylerinde kabarck benzeri kntlar geliir Nkleuslar ykldnda kromatin (DNA ve protein) ortaya kar

 Kk, membran katlantl, fragmanlara yklr Normalde plazma membranna yerleik olan fosfolipid fosfatidilserin, yzeye kar. Bu makrofaj gibi fagositik hcreler ve dendritik hcreler zerindeki reseptrlere balanmakta ve daha sonra hcre fragmanlarn yutmaktadr. Fagositik hcreler inflamasyonu inhibe eden sitokinleri salglar.

 ntiharla lmdeki sonularn dizisi yle dzenlidir ki bu ileme programlanm hcre lm (PH) denilmektedir. Programlanm hcre lmnn hcresel mekanizmas mitozisin tersine evrilmesi gibidir. Programlanm hcre lm apoptozis olarak adlandrlmaktadr.

Apoptozisin tanm
Zararl hcrelerin kendilerini ldrdkleri bir yntem hcre intihar Kanser apoptozis aktivitesinin olmamasnn sonucudur. Tmrler kendilerini kurban etmekten saknarak kansere yol aar. Bylece zararl hcrelerin yapsnda apoptozis ortaya kmaz.

Hcre intihar nedenleri

ki farkl neden vardr: 1. Programlanm hcre lm mitozisdeki gibi normal gelime iin gereklidir. 2. Programlanm hcre lm organizmann btnlne kar bir tehdit oluturan hcreleri ykmak iin gereklidir.

Normal gelimede PH

rnekler: riban bir kurbaaya metamorfozu srasnda kuyruunun rezorpsiyonu apoptozis ile oluur. Fetusun parmak ve ayak parmaklarnn biimlenmesi aralarndaki dokunun apoptozis ile ayrlmasn gerektirir. Uterusun i katnn (endometrium) menstruasyonun balangcnda dklmesi apoptozis ile oluur. Beyinde nronlar arasnda uygun balantlarn (sinapslar) biimlenmesi artakalan hcrelerin apoptozis ile eliminasyonunu gerektirir.

Tehdit oluan PH
rnekler: Virslerle enfekte hcreler: sitotoksik T-lenfositler araclyla virus ile enfekte hcrelerin ortadan kaldrlmas apoptozis ile uyarlr. mmun sistem hcreleri: DNA hasarl hcreler: p53 gl bir apoptozis uyarcsdr. Kanser hcreleri: Radyasyon ve kemoterapi tedavisi apoptozisi uyarr.

Hcrenin intihara karar vermesi

Yaam mrnn srdrlmesi iin gerekli pozitif sinyallerin azalmas, negatif sinyallerin alnmas, arasndaki dengenin bozulmas.

Pozitif sinyallerin azalmas

ok sayda hcrenin srdrlen yaam mr, dier hcrelerden srekli uyarmlar almasn gerektirir. Baz pozitif sinyal rnekleri: Nronlar iin growth (byme) faktrleri Lenfositlerin mitozu iin esansiyel faktr olan Interleukin2 (IL-2).

Negatif sinyallerin alnmas

Hcre iinde artm oksidanlarn dzeyi, Bu oksidanlar ve dier ajanlarn DNAya verdikleri hasar, Bunlar:
-

Ultraviyole k x-ray n Kemoteraptik ilalar

Molekller hcre yzeyindeki spesifik reseptrleri balar ve apoptozis programn balatmak iin hcreye sinyal verir. Bu lm aktivatrleri: Tmr nekrozis faktr - alfa ("TNF") TNF reseptrne balanr. Lenfotoksin (tmr nekrozis faktr beta olarak ta bilinir) de TNF reseptrne balanr. Fas ligand (FasL), Fas adl bir hcre-yzey reseptrne balanan bir molekldr. (CD95 olarak ta bilinir)

Apoptozis Mekanizmas
Bir hcrenin apoptozisle intihar karar vermesi iin iki mekanizma vardr. Biri hcre iinden gelen sinyallerle meydana gelme. Dieri hcre yzeyindeki reseptrlere balanan lm aktivatrleriyle balatlma. TNF Lenfotoksin Fas ligand (FasL)

Apoptozisin modlatr (mediatr) leri

Baz iyonlar (kalsiyum), Molekller (seramid), Genler (c-myc), Proteinler (p53) Organeller (mitokondri)

Apoptozis nasl alr?

Apoptozis kimyasal sinyallere kar yantta yer alr. Hcreler paralara ayrlr ve bu paralar paketlenir. Makrofajlar paketleri yutar ve onlar ykar. Aadaki proteinler apoptoziste yer almaktadr: ICE-benzeri proteinler FAS FAS ligand BCL-2 p53

ICE-benzer proteinler
ICE = Interleukin-Converting Enzyme (nterlkinDntrc Enzim) apoptozis mediatr BCL-2 ar retimi ICE-benzer proteaz aktivasyonunu inhibe eder. ntraselller asidifikasyon direk ya da indirek yolla ICEbenzer proteazlar aktive ederek apoptozisi balatr. Tm apoptotik yollar p53-aracl transkripsiyon ak ve ICE-benzer proteazlarn aktivasyonu ile ilikilidir.

FAS ve FAS ligand

FAS ve FAS ligand tmr nekrozis ailesinin transmembran proteinleridir. FAS ligand FASa balandnda hedef hcrenin lm olgusunu balatr. FAS/FAS ligand sistemi immn yantn sonlandrlmasnda da nemli bir rol oynar.

 Tmr hcreleri FAS ekspresyonunun azaltlmasyla ile FAS-aracl apoptozise diren kazanabilir Onkogenler ve p53 gibi tmr supresr genlerdeki mutasyonlar FAS sinyal ilemiyle de interfere olur. FAS-aracl apoptozis ICE ailesinde yer alan bir sistein proteaz snfnn aktivasyonunu gerektirir.

Bcl-2 ailesi
Bir ksmnn apoptozisi indkledii (Bax, Bad, Bid, BclXs), Bir ksmnn ise inhibe ettii (Bcl-2, Bcl-Xl) geni bir ailedir. Bu ailenin yeleri kendi aralarnda homo veya heterodimerler olutururlar. Hcrenin yaayabilirlik durumu (survival) bu ailenin pro-apoptotik ve anti-apoptotik yelerinin rlatif oranna baldr. Bu heterodimerlerden biri olan Bcl-2/Baxn (ikisinin orannn) baz hematolojik malignensilerde prognostik deer tad gsterilmitir.

An Evil Twin: BAX

BAX Activation Death

p53
p53 kromozom 17 zerinde haritalanm olan bir tmr supresr genidir, aktivitesi tmr oluumunu durdurur. Bir bireyin kansere eiliminin olmas iin ebeveynlerinden bir fonksiyonel gen kopyas kaltmna ihtiyac vardr. p53teki mutasyonlar ou tmr tipinde bulunmaktadr.

 Hcrede, p53 proteini DNAy balar. baka bir gen rn olan p21 proteinini stimule eder p21 hcre blnmesini uyaran protein, cdk2 ile etkileir p21, cdk2 ile kompleks oluturduunda hcre, hcre blnmesinin yeni basamana geemez. Mutasyona uram p53 DNAya etkin bir yolla daha uzun sre balanamaz. bylece, p21protein hcre blnmesi iin stop sinyali olarak etki yapamaz hcreler daha sonra kontrolsz olarak blnr ve tmrler oluur.

Apoptozisin internal sinyallerle balatlmas

Salkl hcrede mitokondri d zarlar yzeylerinde Bcl-2 proteini eksprese olur. Bcl-2 Apaf-1proteinin bir moleklne balanr. Hcredeki internal hasarla Bcl-2, Apaf-1 serbestlemesi, Mitokondriden dar sitokrom cnin daha uzun sre szmamasna, neden olur. Serbestleen sitokrom c ve Apaf-1 caspase 9 molekllerine balanr.

Apoptosom
Sonulanan kompleks;
sitokrom c Apaf-1 kaspaz 9 (ve ATP)

Apoptosom olarak adlandrlr. Bunlar sitozolde agrege olur.

Kaspazlar
Kaspazlar (Caspases), sistein proteazlardr ve aspartik asitten sonraki peptid ban krarlar. Hcrede inaktif (zimojen) olarak bulunurlar ve proteolitik olarak birbirlerini aktifletirirler. Bylece bir kaskad eklinde ilerler. Apoptozisde hcreyi paralayan yani apoptotik morfolojinin oluumunu salayan etkenler olarak bilinirler.

Kaspaz
Kaspaz 9 bir dzineden ok kaspaz ailesinin bir yesidir. Bunlar proteazdrlar. Adlarn proteinleri Asp rezidlerinden kesmeleri nedeniyle alrlar. Kaspaz 9 dier kaspazlar aktive eder. Bir kaspazn dierini aktive etmesi proteolitik aktivitenin geni bir kaskadn yaratr (kan phtlamas ve kompleman aktivasyonu gibi). Bu durum; Sitoplazmada yapsal proteinlerin sindirimi, Kromozomal DNAnn yklm, ve Hcrenin fagositozunu balatr.

Apoptozisin eksternal sinyallerle balatlmas

Fas ve TNF reseptr hcre yzeyinde gsterilen reseptr domainleri ile integral membran proteinleridir. Komplementer lm aktivatrlerinin (srasyla FasL ve TNF) balanmas sitoplazmaya sinyal geirir. Kaspaz 8 aktivasyonunu balatr. Kaspaz 8 (kaspaz 9 gibi) bir kaspaz aktivasyon kaskadn balatr. Bu da hcrenin fagositozuna yol aar.

rnek: Sitotoksik T hcreleri ne zaman hedeflerini tanr (balar)? Yzeylerinde ok miktarda FasL retilir. Bu hcrenin apoptozis ile lmne yol aan hedef hcrenin yzeyinde yer alan Fas ile balanr. Apoptozisin erken basamaklar en azndan C. elegans rneinde gsterilmitir ki, reversibldir. Baz olgularda, hcrenin nihai paralanmas bir fagositin hcre ierisine alnmas ile garanti edilmektedir.

BCL-2 Inhibitor Restores Death by Displacing BH3-Only to Activate BAK

BCL-2 Occupied Small Molecule Inhibitor BH3 Only Activation BAK BCL-2

BCL-2

DEATH
tBID Active BAK

Extrinsic pathway

CD14

LPS
TLR-4

TNF

TNFR-1
Bax bad bid

?
Mitochondria Caspase 8 ?
TRADD FADD

Bcl-2 Bcl-x

Cytochrome c
APAF-1

Caspase-9

Caspase8

Caspase-3 Caspase-6 Caspase-7 Cleavage of death substrates Potential mechanisms of LPS-mediated apoptosis

Apoptoziste hcrelerde grlen morfolojik deiiklikleri

Hcre klmesi Hcre eklinde deiim Sitoplazmann younlamas Nkleer zarf deiiklikleri Nkleer fragmantasyon Hcre yzey yaplarnn kayb Apoptotik cisimcikler Hcrenin paralanmas Kalntlarn fagositozu

Biyokimyasal deiikilikler
Serbest kalsiyum iyon art bcl2/BAX etkileimi Hcrenin su kayb (dehidrasyonu) Mitokondriyal membran potansiyeli kayb Proteoliz Phosphatidylserinin dar kmas Lamin B proteolizi DNA denaturasyonu 50-300 kb yarlma Intrankleozomal yarlma Protein cross-linking

Apoptozisin zet olarak belli bal aamalar

Apoptozisin indksiyonu Hcre yzey lm reseptrlerinin uyarlmas Sitokrom cnin salverilmesi Apoptozom oluumu (sitokrom c+Apaf-1 +kaspaz-9) Mitokondriyal transmembran potansiyelin deimesi Kaspazlarn aktivasyonu Fosfatidilserinin hcre membrannn i yznden d yze transloke olmas DNazn aktivasyonu sonucu DNAnn fragmentasyonu (internukleozomal DNA fragmentasyonu) Yapsal proteinlerin yklmasna bal olarak apoptozise zg morfolojik deiikliklerin meydana gelmesi

APOPTOZSN SAPTANMASINDA KULLANILAN

YNTEMLER

1. 2. 3. 4. 5.

Morfolojik grntleme yntemleri mmunohistokimyasal yntemler Biyokimyasal yntemler mmunolojik yntemler Molekler Biyoloji yntemleri

Morfolojik grntleme yntemleri

1. Ik Mikroskobu a. Hematoksilen Boyama b. Giemsa Boyama 2. Floresan Mikroskobu / Lazerli Konfokal Mikroskop a. Propidium yodr (PI) b. Hoechst Dye 3. Elektron Mikroskobu* 4. Faz Kontrast Mikroskobu

Histokimyasal yntemler
1. 2. 3. 4. Anneksin V Yntemi TUNEL Yntemi M30 Yntemi* Kaspaz-3 Yntemi*

Biyokimyasal Yntemler
1. Agaroz Jel Elektroforezi DNA fragmentasyonu 2. Western Blotting - Substrat krlmalar - Aktif kaspaz belirlenmesi - Sitokrom c salverilmesi 3. Flow Sitometri - DNA azalmas - Annexin V

mmunolojik Yntemler: 1. ELISA - DNA Fragmentasyonu - M30 Dzeyi 2. Fluorimetrik YNTEM - Kaspaz Aktivasyonu (Hcre kltr Molekler Biyoloji Yntemleri: DNA Microarrays Gen ekspresyon dereceleri (mRNA) - Hcre lm reseptrleri - Kaspazlar

DNA merdivenlemesi ile apoptozisin gsterilmesi

5 kb 2 kb 1 kb 0.5kb