6. ANLISIS DE ADN POR ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA J. Pacheco A.

Introduccin La electroforesis se ha convertido en la tcnica ms utilizada para la separacin y caracterizacin de molculas de cidos nucleicos. Los soportes mas utilizados en este procedimiento son la agarosa y la poliacrilamida, dependiendo su eleccin del tamao de las molculas a separar. Molculas por debajo de los 500 pares de bases (pb) son generalmente resueltas con mayor claridad en geles de poliacrilamida. En agarosa pueden separarse molculas DNA de miles de pb. La agarosa es un polisacarido natural que se obtiene principalmente de algas marinas. Es capas de formar geles con rigidez suficiente para ser manipulados a partir del 0,2 % la agarosa no polimeriza al melificar si no que simplemente sufre un cambio de estado, por lo que la variabilidad de la polimerizacin de la poliacrilamida desaparece. Para formar los geles, la agarosa slida es disuelta en tampn TB 0,5X por calentamiento el punto de fusin de la agarosa ordinaria esta alrededor de los 80C . sin embargo, la agarosa no gelifica por debajo de unos 45C.

La movilidad del DNA en los geles de agarosa puede considerarse dependiente del efecto tamiz de las fibras del gel, ya que cada vez que una molcula choca con una fibra del gel es retenida. El tamao de la malla depende de la concentracin de la agarosa . En trminos generales puede decirse que a mayor concentracin mayor resistencia al avance de la muestra sin embargo la linealidad solo se mantiene en un margen estrecho de concentraciones perdindose en valores especialmente a concentraciones altas de agarosa. extremos,

La electroforesis en gel puede ser usada para determinar el tamao de las molculas del DNA debido a la variabilidad de experimento a experimento, es necesario introducir patrones de tamao conocido en cada gel que luego nos permitir determinar el tamao del DNA problema.

Objetivo: Analisis de ADN a travs de electroforesis en gel de agarosa. Reactivos: buffer TAE 50x

buffer sample Agarosa

Preparacion del gel de agarosa al 1.5 % Pesar 750 mg de agarosa y disolverlos con 50 ml de buffer TAE 1X en un

erlenmeyer de 200 ml de capacidad, calentarlo hasta una ebullicin para lograr una disolucin completa. Enfriar hasta aproximadamente 45 C, aadir 1 ul de Bromuro de etidio y vaciar sobre un vidrio (como se muestra en la figura 2) y en posicin horizontal. colocar luego una peineta para formar los pocillos y dejar enfriar durante 30 minutos. DIBUJE EL PROCEDIMIENTO DE LA PREPARACION DEL GEL

Electroforesis y visualisacion del DNA Colocar el gel dentro de la cubeta de electroforesis, y cubrir con TAE- 1X Con mucho cuidado colocar en los pocillos 20 ul de DNA mezclado previamente

con tampn de muestra (Loading Buffer ). En uno de los pocillos colocar un muestra de DNA patron. Conectar la cubeta a una fuente de poder y aplicar una potencia de 100 V

Terminada la electroforesis retirar el gel y observar en un cuarto obscuro por

transiluminacin con lampara Ultra-violeta. RESULTADOS: Esquematize las partes del gel de agarosa en donde se observan as bandas e indicar el tamao de las bandas del ADN Muestra, usando como referencia la curva de PM elaborado con el DNA marcador. Para hacer la curva de PM: plotear en un papel semi logartmico la distancia recorrida por la banda (mm) vs el, PM de dicha banda. El marcador de peso molecular es el de 100pb (100 bp DNA Ladder - Life Technologies), es decir cada banda mide 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 , etc pb

Medida de las concentracin del ADN.

La concentracin de ADN y ARN debe ser determinada midiendo la absorbancia a 260 nm (A260) en un espectrofotmetro. Para mayor precisin, las lecturas de absorbancia a 260 nm debe estar entre 0,15 y 1,0. ADN puro tiene una relacin A260/A280 de 1,8-2,0 en Tris 10 mM HCl, pH 8,5. Absorbancia a A280 fuerte que resulta en una baja relacin A260/A280 indica la presencia de contaminantes, tales como protenas. Absorbancia fuerte a 270 nm y 275 nm puede indicar la presencia de contaminacin de fenol.

La absorbancia a 325 nm sugiere la contaminacin por partculas en la solucin o cubetas sucias. Conversiones espectrofotomtricas de la absorbancia a 260 nm
A260 unit dsDNA ssDNA Oligonucleotides Concentration (g/ml)* 50 33 2030

Procedimiento: En un tubo que contiene 1 ml de agua destilada pura, colocar 10 ul de la solucin de ADN, mezclar y vaciar a una cubeta de espectrofotometra y medir su absorbancia a 260 y a 280 nm. Hacer los clculos para determinar la concentracin de ADN

CUESTIONARIO: 1. Cuantas bandas de DNA se observan en el carril del marcador?

2. Indique las diferencias de Teir el gel con Azul de metileno y teir con BrEt?

3. Que otro mtodo se utiliza para visualizar el DNA?

4. Que es DNA Genmico?

5 cual es la concentracin (ug/ul) de ADN encontrada

5.

Comente el ndice encontrado 260/280 para su muestra de ADN