TRNG I HC K THUT CNG NGH TP.

HCM KHOA MI TRNG & CNG NGH SINH HC ------

BI GING

THC HNH

VI SINH NG DNG

TS. Nguyn Hai Hng

Dng cho sinh vin ngnh Cng ngh Sinh hc Nm xut bn: 2009

MC LC Gii thiu mn hc Bi 1
I II 1. 2. 3. III

Trang 4

Vi khu n amn ha
L thuyt Thc hnh Mi trng - ha cht Tin hnh th nghim Quan st v ghi nhn kt qu Bi np

5
5 5 5 6 7 8

Bi 2
I II 1. 2. 3. III

Vi khu n nitrate ha
L thuyt Thc hnh Mi trng - ha cht Tin hnh th nghim Quan st v ghi nhn kt qu Bi np

9
9 9 10 10 10 11

Bi 3
I II 1. 2. 3. III

Vi khu n phn nitrate ha

L thuyt Thc hnh Mi trng - ha cht Tin hnh th nghim Quan st v ghi nhn kt qu Bi np

12
12 12 12 13 13 14

Bi 4
I II 1. 2. 3. III

Vi khu n c nh nit
L thuyt Thc hnh Mi trng - ha cht Tin hnh th nghim Quan st v ghi nhn kt qu Bi np

15
15 16 16 17 17 18

Bi 5

Vi khu n phn hy cellulose

19
2

I II 1. 2. 3. III

L thuyt Thc hnh Mi trng - ha cht Tin hnh th nghim Quan st v ghi nhn kt qu Bi np

19 20 20 20 20 21

Ti liu tham kho Ph lc

22 23

GII THIU MN HC
Mn thc hnh vi sinh ng dng nhm gip sinh vin lm quen vi cc phng php phn lp, kho st cc vi sinh vt c ng dng trong x l mi trng, cng ngh ln men. Cc vi sinh ng dng thng c phn lp t mi trng t nhin, chng c kh nng s dng cc c cht khc nhau, chuyn ha vt cht trong t nhin. Ngun phn lp chng c th t t, nc, ng vt, thc vt hay thc phNm. Phn lp, xc nh chc nng, nh danh chng l bc u a chng vo ng dng. Trong khun kh bi thc hnh mn vi sinh ng dng sinh vin phn lp vi sinh vt ch yu t mi trng t. t l mt trong nhng c cht thun li nht i vi s pht trin ca cc loi vi sinh vt khc nhau. S lng vi sinh trong 1 g t c ti hng trm triu, thm ch hng t t bo. Hot ng sng ca vi sinh vt t c lin quan n nhiu qu trnh xy ra trong t, trc ht l cc vng tun hon ca vt cht trong t nhin nh chu trnh carbon, chu trnh nit, phospho v lu hunh. Cc bc chung ca bi thc hnh l 1. Pht hin cc nhm vi sinh vt trong mu t bao gm i din ca mt s nhm phn loi 2. Nghin cu mt s c im sinh trng v hnh thi t bo hc t bo ca cc i din thuc vi sinh vt phn lp c.

NI DUNG THC HNH BI 1: VI KHUN AMN HA BI 2: VI KHUN NITRATE HA BI 3: VI KHUN PHN NITRATE HA BI 4: VI KHUN C NNH NIT BI 5: VI SINH VT PHN GII CELLULOSE

BI 1: VI KHUN AMN HA
I. L thuyt Qu trnh amn ha l qu trnh phn gii protein v cc hp cht hu c khc c cha nit to thnh amoniac. Cc vi sinh vt c kh nng amn ha bao gm nhiu loi sinh bo t hoc khng sinh bo t, c kh nng s dng nhiu ngun vt cht khc nhau. Ngoi ra cn nhiu loi x khuN n v nm khuN n ty. Tuy vy, nhng vi sinh vt ch s dng ring mt loi protein th khng nhiu. Cc vi sinh vt ny c kh nng tit men phn gii protein vo mi trng, thy phn thnh cc amino acid. Khi , chng s dng cc amino acid ny trong qu trnh d ha v ng ha. Cc sn phN m c trng ca qu trnh phn gii protein l NH3 v H2S. Qu trnh phn gii protein c th xy ra trong cc iu kin hiu kh v k kh. Trong iu kin hiu kh, cc hp cht hu c c cha nit c phn gii bi cc loi trong ging Bacillus v Pseudomonas, cc i din trong h Enterobacteriaceae, cc x khuN n v nm khuN n ty. Trong , vai tr quan trng v ch yu nht l ging Bacillus. Trong iu kin k kh th cc loi trong ging Clostridium tham gia qu trnh chuyn ha ny. Cn trong iu kin thng kh hn ch, qu trnh amn ha c thc hin bi cc loi vi khuN n v trc khuN n k kh ty nghi. II. Thc hnh Vic pht hin v xc nh s lng cc vi sinh vt amn ha c thc hin bng cch cy cc mu phn tch vo mi trng lng v rn canh tht-peptone. Vic cy ln mi trng thch c tin hnh bng dch huyn ph thanh trng Pasteur nhm tiu dit cc t bo sinh dng v ch cn gi li bo t ca cc i din thuc ging Bacillus ging c trng nht cho qu trnh amn ha. Ngoi ra, vic cy ln mi trng thch cho php nhn nh c cc c tnh khc nhau ca khuN n lc cc vi khuN n khc nhau ny. 1. Mi trng - ha cht - Mi trng canh tht- peptone: Cao tht Peptone Nc 5g 10g 1000ml
5

- Mi trng thch: Trn vo mi trng lng 2% thch. - Dung dch pha long mu: dung dch nc mui sinh l tit trng. Giy lc loi thm acetate ch - Giy qu - Cc loi thuc nhum quan st vi sinh vt: thuc nhum Gram v thuc nhum bo t - Thuc th Nessler: Ha tan 50 g KI trong 35 ml nc ct khng m. Thm dung dch HgCl2 bo ha cho n khi xut hin kt ta. Thm 400 ml KOH 50% pha lang n 1 l, lng, s dng dch trong. 2. Tin hnh th nghim Chu n b mi trng: - Mi trng canh tht-peptone c phn vo khong 1/3 chiu cao ng nghim, kh trng 1 atm, 15 pht. - Cc di giy qu v giy lc thm acetat ch c cho vo a petri, hp kh trng 0,5 atm. - Mi trng thch canh tht-peptone: sau khi hp kh trng c phn vo cc a petri, gi 30OC Chu n b mu: - Mu t c pha vi nc thu dch huyn ph vi sinh vt trn mi trng lng: - Cy t cc dch pha long nng 102, 103, 104, 105, 106 - Ly 1ml dch pha long cy vo ng nghim c cha mi trng canh thtpeptone kh trng trn - Dng kp ly cc di giy qu v giy lc thm acetate ch gi vo gia nt bng v ng nghim - nhit 30OC trong 3 ngy m. Mu i chng l mi trng khng cy dch huyn ph. Cy t cc dch pha long nng 102, 103, 104, 105, 106 Ly 0,1 ml dch pha long cho vo cc a petri c cha mi trng kh trng trn Dng que trang tri u ln b mt thch
6

vi sinh vt trn mi trng thch:

nhit 30oC trong 3 ngy m. Mu i chng l mi trng khng cy dch huyn ph.

3. Quan st v ghi nhn kt qu Mi trng lng: Quan st: S c mi trng S to bng, kt cn Ni vng trn b mt. Th vi thc th Nessler: nh mt git thuc th Nessler ln a s trng, thm mt que cy y t vn trong peptone broth. Quan st mu kt ta: Mu vng nht t ammoniac Vng sm nhiu ammoniac Nu rt nhiu ammoniac Dng giy qu th s sinh NH3 (lm giy qu ha xanh). Quan st mu giy lc thm acetate ch: s sinh H2S lm giy lc thm acetate ch ha en. So snh i chng v th nghim v ghi kt qu vo bng sau: pha long c mi trng To bng T o c n Sinh NH3 Sinh H2S

Phn ng sinh ha:

Chn mt pha long c t l vi sinh vt cao nht lm tiu bn v soi knh hin vi.

Mi trng thch: Ghi nhn: S lng khuNn lc trn 1 a mi pha long Quan st hnh thi khuNn lc, m t, ghi nhn vo bng sau: pha long S khu n lc Hnh khu n lc thi Xut hin bo t

Lm tiu bn v soi knh hin vi So snh hnh thi quan st c gia tiu bn t mi trng lng v mi trng thch Chp hnh khuNn lc, t bo. Np kt qu ghi chp trong th nghim v hnh chp khuNn lc, t bo. Nu ng dng vi khuNn amn ha.

III. Bi np

BI 2: VI KHUN NITRATE HA
I. L thuyt Nitrate ha l qu trnh oxi ha NH3 thnh HNO3, cung cp nng lng cho vi sinh vt hot ng. Qu trnh oxi ha ny xy ra cng vi qu trnh ng ha CO2. Hu ht cc vi sinh vt t dng ha nng v c thuc loi hiu kh bt buc u c kh nng thc hin qu trnh ny. Nitrate ha qua 2 giai on: u tin l giai on oxi ha NH3 thnh nitrite bi mt s i din thuc nhm vi khuNn nitrite ha: Nitrosomonas, Nitrosocystis, Nitrosococcus, Nitrosolobus, ...Tt c chng u ging nhau v mt sinh l, sinh ha, ch khc nhau v mt hnh thi hc v cu trc t bo. Cc i din ca ging Nitrosomonas khng sinh ni bo t, t bo nh b hnh bu dc. Trn mi trng lng, Nitrosomonas tri qua mt s pha, pht trin ty thuc mt s iu kin. Hai pha ch yu l pha di ng- t bo c 1 hay chm tin mao v pha tp on khuNn keo-cc t bo khng di ng. Giai on 2 ca qu trnh nitrate ha oxi ha nitrite thnh nitrate bi mt s vi khuNn: Nitrobacter winogradski, N. agilis, Nitrospina gracilis, Nitrococcus mobilis. T bo c trng ca Nitrobacter trong dch nui thng c dng hnh que trn, hnh ht u, hoc hnh trng, c th di ng hoc khng di ng. Khi iu kin khng thun li chng c th hnh thnh nhng tp on khuNn keo. Nitrospina gracilis l nhng trc khuNn thng, mnh d, thnh thong c dng hnh cu, khng di ng, v c c trng l hnh thnh nhng tp on khuNn keo. Nitrococcus mobilis th c dng hnh trn, c tin mao. Vi khuNn nitrate ha khng s dng cc cht hu c v chuyn ha mt cch cht ch i vi vic oxi ha c cht-NH3 v nitrite. II. Thc hnh Vic pht hin vi khuNn nitrate ha c thc hin bng cch cy dch huyn ph cn phn tch ln mi trng chn lc v c Winogradski. Ngun C duy nht trong mi trng ny l CO2 c trong khng kh v trong thnh phn ca CaCO3. Nguyn liu nng lng v ngun N cho cc vi khuNn gy ra giai on u ca qu trnh nitrate ha l NH3 v mui amn, cn i vi vi khuNn gy ra giai on hai l nitrite.
9

iu kin cn thit i vi s pht trin ca vi khuNn nitrate ha l vic thng kh y vo mi trng nui cy. 1. Mi trng - ha cht - Mi trng Winogradski phn lp Nitrosomonas spp. (NH4)2SO4 K2HPO4 MgSO4.7 H2O FeSO4 . 7H2O NaCl trng 1 atm - Mi trng phn lp Nitrobacter spp. NaNO2 MgSO4. 7H2O FeSO4. 7H2O NaCl Na2CO3 K2HPO4 Nc Chnh pH v 7,3. - Dung dch pha long mu - Tinh th diphenylamin - H2SO4 m c 2. Tin hnh th nghim - ChuNn b mi trng: Mi trng hp kh trng c phn vo cc ng nghim - Xc nh vi sinh vt trn mi trng lng: Pha long mu 102 - 105 Mi pha long ly 1ml mu cy vo ng nghim c cha mi trng kh trng trn 30OC trong 2-3 tun - Lm 1 ng nghim i chng 3. Quan st v ghi nhn kt qu: 1,0 g 0,5 g 0,03 g 0,3 g 1,0 g 1,0 1L 2 g/l 2 g/l 1 g/l 0,5 g/l 0,4 g/l

Chia vo cc bnh thy tinh 50ml, cho vo mi bnh mt t CaCO3. Hp kh

10

- mi pha long, ghi nhn s thay i mi trng trong ng nghim - Nhng ng nghim no ghi nhn c vi khuNn pht trin, cn tin hnh th nghim nh tnh. Phn ng nh tnh nitrate: Ly vi tinh th diphenylamin ha tan trong 1 git H2SO4 m c. Sau thm 1 git dch cn kim tra. Tin hnh trn bn s trng s thy xut hin mu xanh thNm. Ghi nhn kt qu vo bng: ng nghim s 102 103 104 105 106 NO2NO3NO2- NO3- NO2- NO3- NO2- NO3- NO2- NO3 pha long

Chn ng nghim c kt qu dng tnh lm tiu bn quan st di knh hin vi. Cn lu chn c c nhng ht CaCO3, v xung quanh ht ny, t l vi khuNn l cao nht. Miu t, so snh hnh thi cc t bo vi khuNn quan st c. III. Bi np Np kt qu ghi chp trong th nghim v hnh chp khuNn lc, t bo. Nu ng dng vi khuNn nitrate ha.

11

BI 3. VI KHUN PHN NITRATE HA

I. L thuyt Phn nitrate ha l qu trnh vi sinh vt thc hin vic kh nitrate thnh nit phn t, ng thi oxi ha cc cht hu c nh ng, ru, axit hu c thnh CO2 v H2O vi cht nhn in t cui cng l NO3-. Nng lng sinh ra khi oxi ha c cht c vi sinh vt s dng trong qu trnh hot ng sng ca mnh. Qu trnh phn nitrate ha c th xy ra trong iu kin hiu kh ln k kh, nhng c bit mnh trong iu kin k kh. Cc vi sinh vt thc hin qu trnh ny phn b rt rng ri trong t nhin. Phn ln chng thuc loi d dng ha nng hu c, k kh ty nghi gm mt s ging Pseudomonas, Achromobacter, Micrococcus II. Thc hnh Vic pht hin vi khuNn phn nitrate ha c thc hin bng phng php cy mu ln mi trng cha hp cht C dng oxi ha, c nitrate v cc hp cht khc cn cho qu trnh sinh tng hp ca t bo. Cc vi khuNn ny s dng nitrate lm cht nhn electron nhng khng dng lm ngun N trong qu trnh ng a, v khng th kh NO3- thnh NH4+. V vy, trong mi trng nui cy vi khuNn phn nitrate ha, ngi ta cho thm peptone, asparagine hoc mui amn v hn ch lu kh trong qu trnh nui cy. 1. Mi trng- ha cht - Mi trng Giltay: Dung dch A: Asparagine (C4HgN2O3. H2O) KNO3 Nc my: Dung dch B: Citric acid hoc Citrate kali KH2PO4 MgSO4.7H2O 5g 8,5 g 1g 1g
12

1g 1g 0,25 l

CaCl2.6H2O: FeCl2. 4H2O Nc my: 0,25l

0,2g v t

Nu s dng acid citric cn b sung KOH 10% vi phenolphthalein lm cht ch th. Ha 0,25l dung dch A v 0,25l dung dch B, sau thm nc my n 1L dung dch mi trng Giltay hon tt. 2. Tin hnh th nghim - ChuNn b mi trng: mi trng Giltay vi thnh phn nh trn c phn vo 6 ng nghim, hp kh trng 0,5 atm. - Pha long mu 103- 107
-

Ly 1ml mu cy su vo y ng nghim c cha mi trng kh trng

trn. ng i chng khng cy mu. - 30OC trong 7 ngy m. 3. Quan st v ghi nhn kt qu Du hiu ch yu nht cho s pht trin ca vi khuNn nitrate ha l s sinh kh, lm c v gim pH ca mi trng. - Quan st cc ng nghim cc pha long khc nhau v ghi nhn vo bng. - Kim tra vic kh nitrate trong mi trng bng phn ng sinh ha vi diphenylamine pha long c trng 10
3

mi Sinh kh

pH trng

mi NO3-

104 105 106 107 - Chn 1 ng nghim cho kt qu tt nht lm tiu bn, quan st knh hin vi v ghi nhn hnh thi hc ca cc vi khuNn phn nitrate ha phn lp c. - Kim tra vic kh nitrate trong mi trng bng phn ng sinh ha vi diphenylamine: Ly vi tinh th diphenylamine ha tan vo mt git H2SO4 c, sau thm vo mt git dch nghin cu. Nu c mt nitrate s xut hin mu xanh thm.
13

III. Bi np Np kt qu ghi chp trong th nghim v hnh chp khuNn lc, t bo. Nu ng dng vi khuNn phn nitrate ha.

14

BI 4. VI SINH VT C NNH NIT

I. L thuyt C nh N l kh nng ng ha N phn t ca mt s vi sinh vt v dng lm ngun kin to t bo. Cc vi sinh vt c nh N sng t do, c nhiu trong t, hay sng cng sinh trong nt sn cy h u, hai h quan trng nht l Azotobacteraceae v Rhizobiaceae. Trong bi th nghim ny chng ta s phn lp cc vi khuNn c nh m t do thuc h Azotobacteraceae. Trong h Azotobacteraceae c hai ging vi khuNn c nh m t do trong iu kin hiu kh l Azotobacter v Azomonas. Tt c cc loi thuc ging Azotobacter v Azomonas u sng d dng, dng nhiu ngun carbon khc nhau, monosacharide, disacharide, polysacharide (dextrin, tinh bt), nhiu ru v acid hu c, cc hp cht c vng thmNgun nit c th l nit phn t, cng c th l mui amn, nitrate, nitrite, amino acid. Ty thuc nng cc hp cht c nit ny trong mi trng m qu trnh c nh nit phn t s b c ch nhiu hay t. ng thi chng c nhu cu ln i vi P v Ca, cng nh c nh nit mnh m chng cn Mo v B. Phn ln cc loi Azotobacter ch pht trin c pH ln hn 6, v vy hu nh khng gp chng t chua. Azotobacter cn Nm cao hn so vi nhiu vi khuNn khc nn cng t gp chng cc vng t kh hn. Ging Azotobacter theo Kha phn loi Bergey gm 6 lai chnh: A. chroococcum, A. vilelandii, A. beijerinckii, A. nigricans, A. armenicanus v A. paspali; trong khi ging Azomonas gm 3 lai chnh: A. agilis, A. insignis v A. macrocytpgenes. C th phn bit cc lai ny qua kh nng sinh kn, kh nng di ng, kh nng tng hp sc t, kh nng pht hynh quang (Bng 1). Bng 1. Phn bit cc lai thuc ging Azotobacter v Azomonas da vo c im hnh thi Sc t tan trong nc Ging Lai Kn Di ng Nu en Nu tm L c Vng hynh quang A A. + + 15

Lamhynh quang -

en tm

lc trng

chroococcum A. vilelandii A. beijerinckii A. nigricans A. armenicanus A. paspali A. agilis A. insignis Azomonas A. macrocytpgene s + + + + + + + + + + + +/+/+ + +/+/+ + +/+/+ + + +/+/+ +/-

Qua bng 1 ta nhn thy tt c cc Azotobacter u sinh kn, ngc li vi cc Azomonas. C ba lai thuc ging Azomonas u c hnh thi khuNn lc v t bo rt ging A. chroococcum. Hu ht chng tng hp sc t pht hynh quang (pht hin khi chiu tia cc tm = 364 nm trong bung ti). II. Thc hnh Vic pht hin Azotobacter v Azomonas c thc hin trn mi trng chn lc Thompson-Skerman khng cha nit hp cht, trong iu kin hiu kh v Nm cao. 1. Mi trng- ha cht - Mi trng Thompson-Skerman (N2-free glucose) tng sinh K2HPO4: MgSO4: FeSO4: CaCl2: Na2MoO4: Glucose: Nc my: K2HPO4: MgSO4: 0,1g 0,001g 10g 1000ml 1g 0,2g 1g 0,2g 0,2g

- Mi trng Thompson-Skerman (N2-free glucose) phn lp

16

CaCl2: Na2MoO4: Glucose: Nc my: Agar:

0,1g 0,001g 10g 1000ml 3% th tch mi trng

- ChuNn b mi trng Thompson-Skerman vi thnh phn nh trn, hp kh trng 121oC trong 15 pht 1 atm. - Bung ti c n cc tm. 2. Tin hnh th nghim - Giai on tng sinh: Cn 1g t cho vo erlen c 50 ml mi trng ThompsonSkerman tng sinh hp kh trng vi thnh phn nh trn. 4-7 ngy 30OC. - Giai an sau tng sinh: kim tra xem c vi khuNn mong mn khng: soi knh X 100 hay soi du quan st tm t bo hnh oval hay que ng ring l hay cp i. - Giai on phn lp: Cy truyn t mi trng tng sinh vo mi trng Thompson-Skerman phn lp phn vo a petri v hp kh trng. 3-5 ngy, 30oC. 3. Quan st v ghi nhn kt qu - Quan st v ghi nhn hnh thi vi khuNn c trng sau giai on tng sinh. Hnh dng t bo Lai 1 Lai 2 - Ghi nhn cc loi khuNn lc khc nhau xut hin sau giai on phn lp. M t cc khuNn lc : Khuch Khu n lc Hnh dng B mt trong Mu s c Hunh quang tn mu vo mi trng S lng khu n lc loi ny Bo t Kch thc S sp xp Hnh v t t bo bo

17

- Chn cc khuNn lc c trng nht lm tiu bn git p quan st bao nhy. Soi knh hin vi vt knh 40X kim tra hnh thi vi khuNn: kch thc ln, thng ng thnh i v c bao nhy. - Ghi nhn cc c im ny vo bng: Hnh dng t bo Lai 1 Lai 2 III. Bi np Np kt qu ghi chp trong th nghim v hnh chp khuNn lc, t bo. Nu ng dng vi khuNn c nh nit. Bo t Kch thc S sp xp Hnh v t t bo bo

18

BI 5:VI SINH VT PHN GII CELLULOSE

I. L thuyt Cellulose l thnh phn cu to c bn ca thnh t bo thc vt. Vic tng hp cellulose c quy m phc tp hn hn vic tng hp nhng hp cht khc. Do , vi sinh vt phn gii cellulose c vai tr c bit quan trng trong chu trnh tun hon Carbon. S phn gii tin hnh trong iu kin hiu kh ln k kh, mi trng kim hoc acid, Nm thp hoc cao v cc nhit khc nhau. Tt c vi sinh vt tham gia v c ha cellulose u thuc loi d dng ha nng hu c, c enzyme cellulase xc tc vic phn gii cellulose thnh cellobiose v glucose. Vi sinh vt dng cc hp cht sinh ra ny lm ngun carbon v ngun nng lng. Trong iu kin hiu kh, cc vi sinh vt tham gia vo qu trnh ny gm nim khuNn, mt s i din ca cc vi khuNn khng sinh bo t v sinh bo t, x khuNn, nm...Trong , quan trng nht l nim khuNn (Myxobacteria). Nim khuNn c t bo hnh que nh b (03-0,4 x 0,7-10m) hi un cong, thng c u nhn, thnh t bo mng v nhum mu km hn so vi cc vi khuNn khc. Trn c cht c nim khuNn c chuyn ng trt, do s tit cht nhy khng ng u trn b mt t bo. Vi loi nim khuNn c tin mao, c chu k pht trin phc tp. u tin, cc t bo hnh que t t dy ln, bin thnh nhng t bo dng ngh, hnh cu hoc bu dc, kch thc khc nhau. Nim khuNn phn gii cellulose ch yu gm cc ging Cytophaga, Sporocytophaga, Sorangium sng trong t t acid, trung tnh v t kim. Cc loi thuc ging Cytophaga c t bo u nhn, khng sinh vi kn. Cc loi trong ging Sporocytophaga c hnh thi tng t nh Cytophaga nhng khc ch c kh nng sinh vi kn. Cc loi thuc ging Sorangium l nhng trc khuNn u nhn, c kh nng hnh thnh kn. Trn b mt vt liu c cellulose, nim khuNn pht trin trong dng th nhy, khng c hnh dng xc nh, lan rng, khng mu hoc c mu vng, da cam, tng ng vi ch cellulose b phn gii nhiu hay t. Ngoi nim khuNn, trong t cn c cc loi phn gii cellulose thuc ging Cellvibrio, t bo ung cong, di ng nh 1 tin mao, khng sinh ni bo t, khuNn

19

lc khng mu hoc c mu vng lc. Chng ch dng cellulose khi cn kit cc ngun cacbon khc v kh nng phn gii khng mnh m bng nim khuNn. Trong t chua, vai tr phn gii do cc nm thuc ging Chaelomium, Trichoderma, Fusarium, Aspergillus... II. Thc hnh Hu ht tt c nhng loi phn gii cellulose thuc nhm hiu kh v a Nm. Vic pht hin v xc nh s lng cc vi sinh vt phn gii cellulose trong iu kin hiu kh c tin hnh bng cch cy dch huyn ph nghin cu ln cc a cha mi trng chn lc Hutchinson c ngun carbon duy nht l cellulose. Nui cy trong iu kin hiu kh. 1. Mi trng v ha cht - Mi trng Hutchinson (g) KNO3 K2HPO4 MgSO4 CaCl2 NaCl FeCl3 Agar Nc my 2,5 1,0 0,3 0,1 0,1 0,01 3% 1000ml

2. Tin hnh th nghim - ChuNn b cc a petri c mi trng Hutchinson vi thnh phn nh trn, hp kh trng 1 atm. - Giy lc ct thnh nhng khoanh trn kch thc tng ng a petri. Hp kh trng 1 atm. - Mu t pha vi nc my ly dch huyn ph - Cy 0,1 ml dch huyn ph t pha long 102 n 106, trang u ln b mt bng que cy trang. - Dng kp st kh trng trn ngn la gp 1 khoanh giy lc v trng t p st ln b mt. Mi pha long lp li 3 ln, y np a petri. - Nui cy 30OC trong 12-14 ngy m. 3. Quan st v ghi nhn kt qu

20

- Quan st v m s lng khuNn lc vi sinh vt mc c trn khoanh giy lc trong mi a petri. - Xc nh xem khuNn lc l ca nhm vi sinh vt no (nim khuNn, x khuNn hay nm khuNn ty) chim u th trn giy lc. phn bit cc khuNn lc nh ca x khuNn v nm, c th quan st trn knh hin vi vi vt knh 10X. Nhn xt s khc nhau gia cc loi vi sinh vt pht hin c. Khu n lc Loi 1 Loi 2 - M t khc khuNn lc khc nhau ca nim khuNn, ghi nhn cc du hiu. Chn khuNn lc c trng nht lm tiu bn cng vi cc si cellulose t nhng ch giy lc b phn gii nhiu nht. Lu hnh dng t bo sinh dng v vi kn hoc bo t nm mc. III. Bi np Np kt qu ghi chp trong th nghim v hnh chp khuNn lc, t bo. Vi sinh vt nui cy c thuc nhm vi isnh vt no? Qua quan st hnh thi, mu sc bo t v cung sinh bo t nm mc, hy th phn lai nm mc. Hnh dng Kch thc Mu s c S khu n lc cng loi ghi nhn c (khu n lc/a)

21

TI LIU THAM KHO

1. Ebgorov. Thc tp vi sinh vt hc. NXB i hc quc gia Moscow. 2. Benson: Microbiological Applications Lab Manual, Eighth Edition. The McGrawHill Companies, 2001.

22

PH LC Bi 1. Vi khu n phn gii amn

Mu t thanh trng 80oC, 10 pht pha lang ri tri a

KhuNn lc Bacillus megaterium

KhuNn lc Bacillus substilis

Bacillus substilis nhum bo t

Bacillus cereus var. Mycoides A) KhuNn lc B) T bo kt chui c bo t 23

2. Bi 2. Vi khu n nitrate ha

Nitrosomonas europea (Knh hin vi quang Nitrosomonas europea (Knh hin vi in t hc, tng phn pha X2500) X39,600.

Nitrobacter winogradskyi (Knh hin vi Nitrobacter winogradskyi (Knh hin vi in quang hc, tng phn pha X2500) Bi 3. Vi khu n phn nitrate ha t X 213000)

KhuNn lc Paracoccus denitrificans

T bo Paracoccus denitrificans 24

KhuNn lc Pseudomonas aeruginosa Bi 4. Vi khu n c nh m

T bo Pseudomonas aeruginosa

KhuNn lc Azotobacter spp.

T bo Azotobacter spp. hnh que v kn hnh cu, oval

Bi 5. Vi sinh vt phn hy cellulose

Vi khu n thy phn cellulose (nim khu n)

Cytophaga hutchinsonii, 25

KhuNn lc Sorangium cellulosum

T bo Sorangium cellulosum

Nm phn hy cellulose

Trichoderma harzianum

Trichoderma viride

Trichoderma flavofuscum

26