La práctica de laboratorio tuvo el objetivo de reconocer y diferenciar características de proteínas y aminoácidos mediante diferentes pruebas. Se realizaron pruebas como la de ninhidrina, xantoproteica, biuret, aminoácidos azufrados, del millón y Hopkins Cole. Los resultados permitieron identificar la presencia de diferentes aminoácidos y grupos funcionales en las sustancias, dando diferentes colores según su composición.
La práctica de laboratorio tuvo el objetivo de reconocer y diferenciar características de proteínas y aminoácidos mediante diferentes pruebas. Se realizaron pruebas como la de ninhidrina, xantoproteica, biuret, aminoácidos azufrados, del millón y Hopkins Cole. Los resultados permitieron identificar la presencia de diferentes aminoácidos y grupos funcionales en las sustancias, dando diferentes colores según su composición.
La práctica de laboratorio tuvo el objetivo de reconocer y diferenciar características de proteínas y aminoácidos mediante diferentes pruebas. Se realizaron pruebas como la de ninhidrina, xantoproteica, biuret, aminoácidos azufrados, del millón y Hopkins Cole. Los resultados permitieron identificar la presencia de diferentes aminoácidos y grupos funcionales en las sustancias, dando diferentes colores según su composición.
1 Estudiante de tercer semestre del programa de ingeniera Agroindustrial de la universidad de Nario, pasto (Colombia) 2 Estudiante de quinto semestre del programa de ingeniera Agroindustrial de la universidad de Nario, pasto (Colombia)
RESUMEN: la prctica realizada en laboratorio es con el fin de reconocer y diferenciar caractersticas de protenas y aminocidos, para lo cual se llevaron a cabo diferentes pruebas. La primera reaccin fue la de la ninhidrina prueba utilizada en el reconocimiento de aminocidos y protenas, da negativa en la prolina por ser un iminoacido. Una segunda reaccin xantoproteica, ayuda a identificar las sustancias que presentan un anillo aromtico. Se realiz la reaccin de biuret llevada a cabo para identificacin de la sustancias con presencia de enlaces peptdicos, positiva para las protenas dando una coloracin violeta- rosado en la solucin. Otra de la reaccin realizada de aminocidos azufrados muy til para reconocer aminocidos y protenas que tengan azufre en su composicin, la prueba fue positiva con la presencia de un precipitado de color caf. Reaccin del milln, fue una reaccin que dio positiva para la tirosina, ya que la prueba es til para la identificacin de la presencia del grupo fenlico en la tirosina. Se llev acabo la reaccin de Hopkins Cole con la que se puede distinguir protenas donde se encuentre presente el triptfano, observndose luego de la reaccin la formacin de un anillo violeta en la interface de la solucin. Una ltima prueba fue la desnaturalizacin de protenas realizada para la protena albumina
INTRODUCCIN Todos los aminocidos comparten una estructura qumica comn. Un grupo de amino (representado qumicamente como NH2) est unido a un tomo de carbono (el carbono central o alfa) que despus se une a otro tomo de carbono. ste se encuentra en la forma de cido carboxlico (abreviatura qumica COOH). El grupo de amino y el grupo de cido carboxlico tienen una participacin crucial en los enlaces que se forman entre los aminocidos cuando se sintetizan las protenas. [1]
Las protenas estn constituidas por diferentes grupos de aminocidos con la presencia de diferentes grupos R, lo que les confiere la capacidad de reaccin con determinados agentes, esto es significativo para el reconocimiento de aminocidos presentes en las protenas de determinadas muestras a analizar, para ello se utilizan reacciones o pruebas de caracterizacin (pruebas coloreadas) como la ninhidrina ,reacciona con los aminocidos y protenas, dando la coloracin azul violeta o amarillo como es el caso de la prolina e hidroxiprolina. Otra reaccin utilizada es la Reaccin Xantoproteica, emplea el cido ntrico concentrado. La prueba da resultado positivo en aquellas protenas con aminocidos portadores de grupos aromticos, especialmente en presencia de tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un lcali, se torna color amarillo oscuro. [2]
Reaccin de Biuret reaccin coloreada para identificar enlaces tripeptidos en adelante. Las protenas por sus uniones peptdicas reaccionan con los iones cpricos del reactivo en medio alcalino formando un complejo de color violeta. Un color violeta resulta cuando los iones cpricos en medio alcalino se compleja con los electrones no saturados de los tomos de nitrgeno y oxgeno de los enlaces de todas las protenas. La cantidad de color producido es proporcional a la concentracin de protenas. Reaccin de los aminocidos azufrados: evidenciada en la formacin de un precipitado negro correspondiente al sulfuro de plomo. La reaccin del milln concerniente a la presencia de grupos fenlicos que dan lugar a una coloracin rosada. La reaccin de Hopkins Cole, para las protenas que contienen triptfano la formacin de Un anillo entre violeta y rojo indica que la reaccin es positiva. Por ltimo se analiza La desnaturalizacin de protenas o prdida de las estructuras de orden superior se debe a factores que modifican la interaccin la protena con el disolvente, disminuyendo su estabilidad en disolucin provocando la precipitacin y perdida de su funcin biolgica (cuando estn desnaturalizadas). METODOLOGIA: En el laboratorio de reconocimiento de aminocidos y protenas, todas las reacciones trabajadas se desarrollaron en tubos de ensayo. Reaccin de la ninhidrina, para dicha tare fueron utilizadas las sustancias aminocidos y protenas: glicina, metionina, prolina, albumina y muestra biolgica, que fue utiliza la leche, esta fue para todas las pruebas escogida por su alto contenido en protenas (Casena, Beta-lactoglobulina Alfa- lactoalbmina Lactoferrina, Lactoperoxidasa, Inmunoglobulinas, Lisozima [5])
El proceso de la reaccin con la ninhidrina con cada sustancia se llev acabo conforme se estipulaba en la gua de laboratorio. Finalmente se procedi a observar y detallar las coloraciones presentadas y se registraron los resultados.
La siguiente reaccin a realizar fue la de la Xantoproteica, utilizando solucin albumina, leche, glicina, triptfano, fenilalanina y tirosina; como reactivo se utiliz HNO3 concentrado, se desarroll la prctica conforme a lo dicho en la gua. Por ltimo se procedi a observar los resultados.
Para la Reaccin de Biuret se utilizaron albmina de huevo, glicina, alanina y leche como reactivo se aadi solucin de hidrxido sdico al 20%, posteriormente se aadi gotas de solucin de sulfato cprico diluida al 1%. Esperando obtener una coloracin violeta-roscea caracterstica.
Reaccin de los aminocidos azufrados los aminocidos y protenas utilizadas fueron: albmina de huevo, glicina, cistena, metionina y leche. El reactivo utilizado fue solucin de hidrxido sdico al 20%, gotas de solucin de acetato de plomo al 5%. Luego se calent el tubo hasta la ebullicin. Se esper a que se forme un precipitado de color negruzco lo que indico que se form sulfuro de plomo, utilizando el azufre de los aminocidos, lo que es til para identificar protenas que tienen en su composicin aminocidos con azufre.
En la Reaccin de Milln se trabaj con las soluciones albmina de huevo, glicina, tirosina y leche. Y se realiz los pasos descritos en la gua de laboratorio. Por ltimo se debe observar una coloracin roja lo cual indica la presencia de tirosina.
En cuanto a la Reaccin de Hopkins Cole, las sustancias utilizadas fueron: albmina, huevo, triptfano, glicina y leche. A las soluciones se adiciono el reactivo de Hopkins Cole, despus se adiciono a cada tubo por las paredes cuidadosamente, sin mezclar 1 mL de cido sulfrico concentrado. Al formarse un anillo violeta en la interfase da como resultado que es prueba positiva con presencia del triptfano en las protenas o aminoacidos.
Y finalmente el ltimo procedimiento a realizar fue la Desnaturalizacin de Protenas, para el cual se utiliz la protena albumina presente en la clara de huevo. Se desarroll lo estipulado en la gua.
ANALISIS Y RESULTADOS: 1. Reaccin ninhidrina. Esta prctica realizada es usualmente utilizada para la determinacin de la presencia de aminocidos y protenas. Se obtuvieron como resultados al adicionar ninhidrina a cinco diferentes sustancias (aminocidos y protenas) la presencia de una coloracin en las sustancias, siendo los siguientes: Albumina: color azul oscuro. Glicina: azul oscuro. Metionina: azul oscuro. Muestra orgnica (leche): azul oscuro coagulado. Prolina: amarillo. La ninhidrina reacciona con los aminocidos y protenas, dando la coloracin azul violeta; con la prolina fue diferente dando una coloracin amarilla, ya que la prolina no es un aminocido como tal sino un iminoacido. la ninhidrina es un agente oxidante poderoso y lleva acabo la deaminacion oxidativa de los grupos alfa-mino, liberando amoniaco, bixido de carbono, y el correspondiente aldehdo, as como la forma reducida de ninihdrina. El amoniaco entonces reacciona con un mol adicional de ninhidrina oxidada y un mol de ninihidrina reducida para dar una coloracin azul violeta. [3]
La reaccin general de la ninhidrina con aminocidos es la siguiente:
2. Reaccin xantoproteica. Esta prueba es utilizada para la identificacin de la presencia de grupos bencnicos, en aminocidos como en las protenas. Su presencia es identificada por que luego de llevarse a cabo la reaccin de xantoproteica se observa la solucin de color anaranjado. Los resultados obtenidos en las soluciones luego de la reaccin: Albumina: color anaranjado. Glicina: no hay coloracin es una solucin trasparente. Triptfano: color anaranjado oscuro. Fenilalanina: en el momento de realizarse la reaccin xantoproteica no hay coloracin en la solucin, se adiciono cido sulfrico con el cual si se observa un cambio de coloracin a un color amarillento-anaranjado. Tirosina: coloracin verde amarillenta Leche: color anaranjado amarillento. La prueba es positiva en la albumina, triptfano, tirosina y leche se debe a que esos aminocidos y protenas llevan en su estructura grupos bencnicos. En la fenilalanina tambin hay una prueba positiva pero en condiciones ms fuertes, con la adicin de un cido ms fuerte como el cido sulfrico.
Fenilalanina
Tirosina
Triptfano La reaccin con glicina no se observa el precipitado de color naranja, ya que no presenta en su estructura grupos bencnicos.
Glicina La reaccin xantoproteica cosiste en la reaccin de aminocidos o protenas, con cido ntrico concentrado para identificar que estn presenten en su estructura grupos bencnicos. El anillo es el que reacciona con el cido ntrico y produce un sedimento de color amarillo intenso, a esta reaccin se le conoce como prueba xantocromica. La adicin de base fuerte hace que el color se torne ms oscuro hacia anaranjado. La reaccin llevada a cabo es la siguiente:
La reaccin xantoproteica se puede considerar como una sustitucin electrofilia aromtica de los residuos de aminocidos de las protenas por el cido ntrico dando un compuesto coloreado amarillo a pH acido. [4]
3. Reaccin de Biuret. En esta prueba se realiz con cuatro sustancias, entre ellas aminocidos y protenas. En ella se pretenda determinar la presencia del enlace peptdico (-CO-NH-) que se destruye al liberarse los aminocidos. Da positiva esta reaccin en todos los compuestos que tengan dos o ms enlaces peptdicos consecutivos en sus molculas, que al momento de reaccin presentan una coloracin violeta, esto se da para las protenas. En los aminocidos la prueba es negativa debido a la no presencia de enlaces peptdicos, y en ellos se observa precipitado de color amarillo. Las sustancias trabajadas en laboratorio fueron: Glicina y alanina: dan prueba negativa presentando un precipitado amarillo, por lo que son aminocidos. Albumina y leche: dan la coloracin violeta indicando una prueba positiva, ya que la albumina es una protena (presente en los huevos), y la leche est compuesta de diferentes protenas (Caseina, Beta- lactoglobulina Alfa-lactoalbmina Lactoferrina, Lactoperoxidasa, Inmunoglobulinas, Lisozima [5])
En los aminocidos la prueba es negativa como en el caso de la glicina y la alanina, debido a que ellos no presentan enlaces peptdicos, mientras que las protenas son conformaciones de aminocidos o restos de ellos; que estn unidos por medio de enlaces peptdicos(albumina y leche). En soluciones alcalinas Cu +2 se compleja con las uniones de pptidos de protenas resultando en la formacin de un color morado. La intensidad del color es proporcin a la concentracin de protenas. Este mtodo es generalmente aplicable porque el nmero de enlaces peptdicos por unidad de peso para todas las protenas es casi el mismo. Las sustancias que dan el color violeta tienen dos grupos -CONH2 unidos directamente o por un carbono o nitrgeno. Los compuestos que contienen -CH2NH2, -C(NH)NH2 Y - CSNH2 en lugar de los grupos - CONHH2. Las estructuras peptdicas se encuentran en protenas y sus derivados contienen enlaces peptdicos tambin dan positivo para la prueba de Buiret. [6]
la reaccion general es:
4. Reaccin de los aminocidos azufrados En la reaccin se obtuvieron los siguientes resultados: Sustancia Precipitado de sulfato de plomo Albmina de huevo Si Cistena Si Metionina Si Muestra biolgica Si (leche) Glicina No
La reaccin de los aminocidos azufrados se evidencia en la formacin de un precipitado negro, sulfuro de plomo, correspondiente a la reaccion entre azufre de la protena (separado mediante un lcali) y la solucin de acetato de plomo.
Los resultados obtenidos para cada uno de los tubos de ensayo fue la presencia de un precipitado de sulfato de plomo lo que evidencia la presencia de protenas que contienen aminocidos con azufre en su estructura, la albumina de huevo es rica en cistena, contienen azufre en los aminocidos. Para la cistena al ser un aminocido con el grupo tiol, contiene azufre el que puede reaccionar y formar el precipitado negro de sulfuro de plomo. En la muestra biolgica se utiliz la leche la cual presenta lacto albmina. Es una protena soluble, rica en aminocidos azufrados. La metionina es un aminocido que contiene azufre en medio de la cadena carbonada Glicina no presenta una prueba positiva por lo que no tiene presencia de azufre en su estructura
5. Reactivo del milln: En la prueba realizada se obtuvieron los siguientes resultados: Sustancia Color Prueba del milln Tirosina Rojo Positivo Albumina de huevo Tono blanco con Cogulos amarillos Negativo Glicina Transparente Negativo Muestra biolgica Tono caf claro y presencia de costras Negativo
El reactivo de Milln se prepara disolviendo una parte de mercurio (Hg) en una parte de cido ntrico (HNO 3 ). De esta forma, la presencia de cantidades relativamente altas de mercurio conduce a la formacin de Nitrato de mercurio (I) Hg 2 (NO 3 ) 2 el cual en un medio fuertemente cido reacciona con el grupo -OH de la tirosina produciendo una coloracin roja caracterstica. [7]
La reaccin del milln se debe a la presencia de grupos fenlicos, la tirosina presente en algunas protenas tiene el grupo fenlico, de esta manera solo las protenas que tienen este aminocido entregan resultados positivos (un color rosado). El resultados obtenido para la albumina fue un color amarillo, el reactivo del milln no actu sobre la albumina por lo cual el resultado fue negativo. El resultado para la glicina tambin fue negativo debido a que no tiene grupos fenoles en su estructura para reaccionar. En la muestra biolgica se utiliz leche, aunque esta presenta una pequea cantidad del aminocido tirosina (143mg de tirosina por 100g de leche entera) [8] , el color obtenido en la reaccin fue caf muy claro por lo que la prueba fue negativa. De la tirosina se obtiene una prueba positiva, lo cual indica que contiene aminocidos con grupos fenoles es su estructura.
La reaccin de Hopkins Cole, es una prueba estndar para el triptfano y para las protenas que contienen triptfano. La solucin que se va a examinar se mezcla con cido glioxlico y se agrega cido sulfrico concentrado. Un anillo entre violeta y rojo en la unin de los dos lquidos indica que la reaccin es positiva. [9]
La reaccin para el triptfano exhibe la forma de un anillo violeta al fondo del tubo representando una prueba positiva, para la sustancia orgnica (leche) se observa la formacin de un anillo violeta en la parte intermedia lo que representa una prueba positiva, ocasionado por las protenas con triptfano de la leche. La prueba para la albumina tambin resulto positiva a diferencia de la glicina que arroja resultados negativos al ser un aminocido deferente al triptfano.
Luego de realizar el procedimiento de desnaturalizacin se observa la formacin de cogulos blancos El cido actico es capaz de producir la desnaturalizacin de las protenas
Las cadenas de protenas que hay en la clara de huevo se encuentran enrolladas adoptando forma esfrica, se denominan protenas globulares al agregar el cido actico las cadenas de las protenas se desenrollan y formen enlaces que unen unas cadenas con otras. El cido actico es capaz de producir la desnaturalizacin de las protenas.
Desnaturalizacin. Es la prdida o destruccin de la estructura terciaria de una protena, en la que la protena pasa de una forma plegada o enroscada a una forma desenroscada o desplegada. La hlice alfa se estira o despliega, por rompimiento de enlaces de hidrgeno. En la protena desnaturalizada ocurren cambios estructurales que afectan sus propiedades biolgicas, como la hormonal, enzimticas y la actividad inmunolgica. Se produce una prdida de solubilidad, ya que se exponen grupos hidrofbicos que hacen insoluble la protena. La desnaturalizacin es generalmente un proceso irreversible, fuertemente endotrmico, que produce un aumento de la entropa o desorden del sistema. Los principales agentes desnaturalizantes son: Altas temperaturas, provocan la coagulacin, y Cambios bruscos de pH. [10]
CONCLUCIONES - Las pruebas realizadas en el laboratorio de reconocimiento de protenas y aminocidos, permiten reconocer a los anteriores en laboratorio por pruebas que los caracterizan especficamente a ellos. Por lo cual estas pruebas ayudan en la identificacin de aminocidos o protenas con ciertas caractersticas, en muestras biolgicas.
- Las protenas son conformaciones de aminocidos unidos por enlaces peptdicos, lo que hace que entre aminocidos y protenas hallan semejanzas como diferencias, estas se pueden observar en las reacciones realizadas en laboratorio. Como en la prueba de observar la presencia de enlaces peptdicos solo es positiva en las protenas; mientras que en la prueba de detectar los grupos bencnicos se pueden encontrar pruebas positivas y negativas en protenas como en aminocidos.