PrcticasdeFundamentosdeAlimentacinyNutricin.

GradodeNutricinHumanay
Diettica.Curso20122013
T.GirbsyP.Jimnez1

METODO DEL RADICAL DPPH. 2,2-DIFENIL 1-PICRYLHYDRAZYL.
DETERMINACION DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE EN EXTRACTOS
DE MANZANA, BRCOLI Y ALCACHOFA

Dra. Pilar Jimnez y Dr. Toms Girbs
Nutricin y Bromatologa; Facultad de Medicina. Universidad de Valladolid

1.- Introduccin. Artculo de referencia
Pharmacognosy Magazine. 2010 Jul-Sep; 6(23): 198203
Totalphenolic,anthocyanincontentsandantioxidantcapacityofselectedelderberry
(SambucuscanadensisL.)accessions
MustafaOzgen
1
,JosephCScheerens
2
,RNeilReese
3
,RaymondAMiller
2

1
DepartmentofHorticulture,GaziosmanpasaUniversity,Tasliciftlik,Tokat60240,Turkey
2
DepartmentofHorticultureandCropScience,TheOhioStateUniversity,OhioAgricultural
ResearchandDevelopmentCenter,1680MadisonAvenue,Wooster,OH44691,USA
3
DepartmentofBiologyandMicrobiology,NPB249B,Box2140D,SouthDakotaState
University,Brookings,SD57007,USA
Abstract
Fourteen purple-black American elderberry accessions (Sambucus canadensis L.)
obtained from various sites in midwestern USA and then grown at a single Ohio
production site in USA were analyzed for their total phenolic (TP) and total monomeric
anthocyanin (TMA) contents and for their antioxidant capacity by the ferric reducing
antioxidant power (FRAP) and DPPH radical scavenging assays. Total phenolic and
anthocyanin contents were measured using the Folin-Ciocalteu reagent and the pH
differential methods, respectively. Overall, the phytonutrient contents and antioxidant
capacity of our elderberry accessions were similar to those typically reported for black
raspberries, blackberries and other dark-fleshed small fruits. Variability among
accessions was greatest for TMA content (CV 37.5%); individuals ranged nearly
threefold from 1308 to 4004 g cy3-GE/g on a fresh weight basis. Variation among
accessions was also evident for TP, FRAP and DPPH values (CV 14.4, 21.7 and 26.8%,
respectively). TP and TMA values were very highly correlated (r = 0.93), although
individuals differed in the estimated proportion of total phenolics attributable to
anthocyanins. Both TP and TMA also highly correlated to antioxidant capacity values (r
= 0.700.85). Within this limited study of 14 accessions, variability for phytonutrient
content and antioxidant capacity suggested the employment of wild germplasm within
an elderberry improvement program to incorporate an array of superior horticultural,
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post-harvest or processing traits into new or existing cultivars with superior

phytonutrient profiles.
Keywords: DPPH, ferric reducing antioxidant power, small fruits, phytonutrient,
radical scavenging assay

2.- Materiales

Cubetas de 3 ml para espectrofotometra visible.
Puntas desechables de pipeta automtica.
Pipetas automticas de diferentes volmenes
Malla de nylon
Tubos de ensayo de plstico de 15 ml con tapn
Probeta de 500 ml
Probeta 100 ml
Tubos de 50 ml
Pipetas Pasteur
Agita-tubos (vortex)
Espectrofotmetro visible (medicin a 515 nm) Helios. Epsilon Thermo Scientif
Batidora Moulinex
Centrfuga Orto Alresa Digicen
Balanza de laboratorio
Colador
Cazuelas
Cronmetro
Embudos

3.- Muestras

Los extractos de manzana,brcoli y alcachofa deben guardarse en recipientes protegidos
de la luz, y en fro (- 20 C)


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4.- Reactivos

Solucin patrn de Trolox 1 mM en metanol. Aldrich Ref. 238813-1G
DPPH. Radical 2, 2-Difenil-1-picrylhydrazyl 0,1 mM en metanol. Aldrich. Ref. D-9132
Metanol. Ref. Panreac. 131091.1211
Agua mQ. Millipore

























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EXPERIMENTO 1. Curva patrn de Trolox 1 mM DPPH 0,1 mM

A.- Mtodo experimental. Espectrofotometra. Recta patrn
Importante: Al aadir el Trolox hacedlo con intervalos de 1 minuto utilizando el
cronmetro
1. Se preparan los tubos de ensayo numerados.
2. Se aaden a cada tubo la cantidad correspondiente de metanol.
3. Se aade a cada tubo la cantidad de 2900 l de DPPH 0,1 mM excepto en el
Blanco 1.
4. Se aaden a cada tubo la cantidad correspondiente de patrn de Trolox 1mM
5. Se agita cada tubo en el vortex.
6. A continuacin se mide la absorbancia de las muestras a 515 nm en el
espectrofotmetro bajo la supervisin de un monitor.
7. Representar grficamente a travs de una recta de degradacin. Se representan
las absorbancia de los 5 puntos (Blanco 2 y los patrones 1, 2, 3 y 4)


RECTA PATRN
DPPPH 0,1 mM
TROLOX 1 mM



Blanco 1


Blanco 2


Patrn 1


Patrn 2


Patrn 3


Patrn 4
Metanol 80% 3000 l 100 l 75 l 50 l 25 l 0 l
DPPH 0,1 mM - 2900 l 2900 l 2900 l 2900 l 2900 l
Trolox 1 mM - - 25 l 50 l 75 l 100 l
t = 10 minutos

Abs. 515 nm

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EXPERIMENTO 2. Medida de la capacidad antioxidante total en muestras de
alimentos.

A.- Preparacin de los diferentes extractos.

Muestra 1. Extracto de manzana. Se aaden 25 g de manzana pelada y troceada a 100
ml de agua y se pasa por la batidora. El extracto se filtra a travs de una malla de nylon.
El lquido resultante se centrfuga durante 15 minutos a 4C de temperatura y a
3.500 r.p.m (guardar en fro)

Muestra 2. Extracto de brcoli. Se parte de una pieza de brcoli de 50 g dividida en
fragmentos pequeos. Hervir durante 5 minutos en 500 ml de agua. Pasar la muestra por
un colador y recoger el extracto en una cazuela. Posteriormente el extracto se filtra a
travs de una malla de nylon. El lquido resultante se centrfuga durante 20 minutos a
4C de temperatura y a 3.500 r.p.m (guardar en fro)

Muestra 3. Extracto de alcachofa. Se parte de una pieza de alcachofa de 50 g dividida
en fragmentos pequeos. Hervir durante 5 minutos en 500 ml de agua. Pasar la muestra
por un colador y recoger el extracto en una cazuela. Posteriormente el extracto se filtra
a travs de una malla de nylon. El lquido resultante se centrfuga durante 20 minutos a
4C de temperatura y a 3.500 r.p.m (guardar en fro)

Nota importante: equilibrar los tubos en balanza antes de
meterlos a la centrfuga







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B.- Anlisis de las muestra. Espectrofotometra
Importante: Al aadir las muestras de manzana, brcoli y alcachofa hacedlo con
intervalos de 1 minuto utilizando el cronmetro.

1. Se preparan los tubos de ensayo numerados.
2. Se aaden a cada tubo la cantidad correspondiente de metanol.
3. Se aade a cada tubo la cantidad de 2900 l de DPPH 0,1 mM excepto en el
Blanco 1.
4. Se aaden a cada tubo la cantidad correspondiente de muestra
5. Se agita cada tubo en el vortex.
6. A continuacin se mide la absorbancia de las muestra a 515 nm en el
espectrofotmetro bajo la supervisin de un monitor.


METODO DPPH

Blanco 1

Blanco 2
1
Manzana
2
Brcoli
3
Alcachofa
Metanol 80% 3000 l 100 l 0 l 0 l 90 l
DPPH 0,1 mM - 2900 l 2900 l 2900 l 2900 l
Muestra - - 100 l 100 l 10 l
t = 10 minutos

Abs. 515 nm

Representaciones grficas en papel milimetrado. Clculos. Expresar los resultados
en moles equivalentes de Trolox por gr de peso fresco
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Nota importante. Tirar los residuos en los contenedores habilitados al efecto