GENETICKI INZINJERING I

BIOTEHNOLOGIJA
Mr. sc Emina Atikovic, dipl. biolog
UVOD U GI I
BIOTEHNOLOGIJ U
Emina Atikovic
Geneticki Inzinjering

Genska modifikacija
genoma nekog organizma
uz pomoc biotehnologije
ILI
Prenos specificnih gena sa
jednog organizma na drugi



Geneticki Inzinjering
Ako je geneticki materijal prenesen iz jedne vrste u
domacina druge vrste TRANSGENETSKI
ORGANIZAM
Ako je geneticki materijal prenesen iz jedne vrste u
domacina iste vrste ili ako se te dvije vrste mogu
medusobno pariti CISGENETSKI ORGANIZAM
GI se moze koristiti za uklanjanje genetickog
materijala iz nekog organizma KNOCK-OUT
ORGANIZAM
Organizam koji je nastao procesom GI GENETICKI
MODIFIKOVANI ORGANIZAM

Emina Atikovic
Geneticki Inzinjering
PRINCIP RADA
Emina Atikovic
Ljudska celija
Nukleus
Prvo se nukleus celije rastvori
ljudska celija
Geneticki Inzinjering
PRINCIP RADA
Emina Atikovic
Fragmenti
hromozoma
Fragment koji sadrzi
gen od interesa
Hromozomi isjeceni u fragmente vrsi se
identifikacija gena od interesa
Citoplazma

Bakterijski hromozom

Celijski zid bakterije

Plazmid
Struktura bakterije
Geneticki Inzinjering
PRINCIP RADA
Prvo se nukleus ljudske celije rastvori
Geneticki Inzinjering
PRINCIP RADA
















Emina Atikovic
Plazmid
Plazmid je kruzna DNA koja je odvojena od osnovnog
hromozoma. Nose odredene gene (npr. rezistencija na
antibiotike) sto ih cini veoma pogodnim u genetickom
inzinjeringu.
Geneticki Inzinjering
PRINCIP RADA
Emina Atikovic
P
T
ZUTI gen izaziva bakterijsku rezistenciju na jedan antibiotik
(npr. Penicillin).
ZELENI gen izaziva bakterijsku rezistenciju na drugi
antibiotik (npr. Tetracycline).
Geneticki Inzinjering
PRINCIP RADA
Emina Atikovic
P
T
Ovdje presjeci
Restrikcionim enzima napraviti prijesek u sredini jednog
gena koji kodira za antibiotsku rezistenciju. U ovom
primjeru prijesek je napravljen na T genu
Geneticki Inzinjering
PRINCIP RADA
Emina Atikovic
Pripremljeni
ljudski gen
Na mjesto prijeseka dodati vec pripremljeni ljudski gen.
Ako sve bude teklo po planu onda ce se ljudski gen
smjestiti u izrezani dio plazmida tako da zeleni T gen
vise nece raditi kako treba.
Geneticki Inzinjering
PRINCIP RADA
Emina Atikovic
Nema P or
T gena
Netaknuti P i
defektni T gen
P i T geni
netaknuti
S obzirom da su plazmidi jako mali tesko je odrediti koji od njih ima
ljudski gen na pravom mjestu, tako da je potrebno inkubirati hiljade
plazmida sa stotinu bakterisjkih celija
Geneticki Inzinjering
PRINCIP RADA
Emina Atikovic
Celija od interesa Celija sa netaknutim P i T
genom
Celija bez P ili T gena
Neke celije ce uzeti rekombinantni plazmid, neke ce preuzeti orginalni
plazmid, dok neke nece uopste uzeti plazmid ili ce uzeti plazmid koji
nema niti jedan gen za rezistenciju na antibiotike.
Geneticki Inzinjering
PRINCIP RADA
Emina Atikovic
Kolonije rastu iz
jedne celije koja je
rezistentna na
penicilin.
Agar koji sadrzi
penicilin
U posudici se nalazi agar koji sadrzi penicilin - samo one celije koje
imaju odgovarajuci plazmid mogu da rastu i da se dijele. Ove celije
moraju imati rezistenciju na Penicilin.
Geneticki Inzinjering
PRINCIP RADA
Emina Atikovic
Ove kolonije su zasijane na agarni tanjiric na kojem se nalazi
tetracycline.
Samo one celije koje su rezistentne na OBA antibiotika ce rasti.
Nas interesuju celije koje NECE rasti kada je prisutan Tetracycline
Geneticki Inzinjering
PRINCIP RADA
Emina Atikovic
Celije su presijane na agar koji sadrzi samo tetracycline.
Ove celije imaju ne
promjenjen T gen
Ove celije imaju ne
promjenjen P a
defektan T gen
Emina Atikovic
Geneticki Inzinjering
PRINCIP RADA
Ova kolonija najvjerovatnije ima odgovarajuci plazmid koji moze dati proizvod
iz ljudskog gena. Celije ove kolonije ce se zasijati na vise tanjirica pod istim
uslovima kako bi se dobio odgovarajuci proizvod ljudskog gena (npr. hormon
rasta).
Geneticki Inzinjering
PRIMJENA
Primjena u medicini, istrazivanju, industriji i
agrikulturi
Medicina
1. Proizvodnja inzulina
2. Ljudski hormon rasta
3. Ljudski albumin
4. Monoklonalna antitijela
5. Vakcine
6. Razni lijekovi
Emina Atikovic
Geneticki Inzinjering
PRIMJENA
Istrazivanje
1. Geni i ostale genske informacije iz raznih
organizama su prenesene u bakterije na
cuvanje i transformaciju Geneticki
modifikovana bakterija
2. Kada se gen izoluje moze se cuvati unutar
bakterije neogranicen izvor gena potrebnih
za istrazivanje (bakterije su jeftine, lake za
uzgoj, lako se kloniraju, umnozavaju,
transformisu i mogu se cuvati neograniceno
na -80C)
Geneticki Inzinjering
PRIMJENA
Industrija
1. Modifikovanje odredene bakterije da vrsi funkcije
izvan svog prirodnog ciklusa (ciscenje naftnih
mrlja, karbona i ostalog toksicnog otpada, kao i
detekcija arsena u pitkoj vodi)
Agrikultura
1. Poboljsanje kvaliteta i kvantiteta proizvoda
(Amflora krompir kvalitetniji skrob; soja i kanola
zdravije ulje)
2. Ubrzavanje rasta i povecanje otpornosti
proizvoda na vremenske uslove
Geneticki Inzinjering
PRIMJENA

KOJE SU TRANSGENETSKE ZIVOTINJE?

1. Misevi Koriste se za proucavanje
ljudskog imunoloskog sistema

2. Kokoske Rezistentnije na infekcije

3. Krave povecanje proizvodnje mlijeka
manje masno meso

4. Koze, ovce i svinje Proizvodnja ljudskih
proteina u mlijeku



Geneticki Inzinjering
PRIMJENA
Ljudska DNA u
celijama koze
Ova koza ima gen koji kodira
zgrusavanje krvi. Agent za
zgrusavanje krvi se moze dobiti
iz kozijeg mlijeka.
.

Biotehnologija ???
Definicija
Koristenje tehnologije za poboljsanje
bioloskih organizama

Puna definicija
Koristenje tehnologije za modifikaciju
bioloskih funkcija organizma dodavanjem
gena iz drugog organizma
Zasto nam je potrebna
Biotehnologija ???
U prirodi postiji ogromna varijabilnost



Ovdje vidimo razlicite prirodne boje i oblike graha
Zasto nam je potrebna
Biotehnologija ???
Priroda ne sadrzi sve genske varijacije koje su
potrebne covjeku
Voce sa vakcinama
Zitarice sa poboljsanom
nutritivnom vrijednoscu
Biotehnologija - Primjena
4 glavne industrijske oblasti
1. Zdravstvo (medicina)
2. Agrikultura
3. Neprehrambena industrija (razgradnja
plastike, biljno ulje, biogoriva)
4. Ekologija

Reciklaza, tretiranje otpada, ciscenje kontaminacije
industrijskim otpadom (bioremedijacija), proizvodnja
bioloskog oruzja
Biotehnologija - primjena
Medicina
Proizvodnja lijekova
Farmakogenomika
Genska terapija
Genetsko testiranje (genetski skrining) - tehnike u
molekularnoj biologiji za detekciju genetskih
bolesti (za testiranje fetusa za Down-ov sindrom,
Amniocinteza i Horionske resice
Biotehnologija - primjena -
Farmaceutski Proizvodi
Molekularna biologija - koristenje GMO (E. Coli ili
gljivice) za proizvodnju substanci kao sinteticki inzulin ili
antibiotici

Nove medicinske terapije - tretiranje hepatitisa B i C,
kancera, artritisa, hemofilije, frakture kostiju, MS i
kardiovaskularnih oboljenja

HERCEPTIN - prvi odobreni lijek, uz odgovarajucu
dijagnostiku, za tretiranje karcinoma dojke kod zena cije
tumorske celije eksprimiraju protein HER2
Genska Terapija
Genetski
inzinjering ljudi
zamjena
defektnog gena
sa funkcionalnom
kopijom
Genska Terapija
Koristenje DNA molekule kao farmaceutskog agenta
za lijecenje bolesti
Naziv GT proizilazi iz ideje da se DNA koristi kao
terapija u svrhu tretiranja neke bolesti tako sto ce
zamjeniti ili izmjeniti gene unutar celije osobe
U GT, DNA koja kodira za tarapeutski protein je
spakovana unutar vektora koji se koristi kako bi
ubacio DNA u tijelo
Unutar vektora DNA je izrazena zahvaljujuci samoj
celiji u koju je ubacena dolazi do sinteze
terapeutskog proteina koji tretira pacijenta
Genska Terapija
PROCES
Pokusaj ubacivanja gena direktno u ljudsku celiju
fokus na bolest koja je izazvana greskom u jednom
genu (cisticna fibroza, hemofilija, MD, talasemia i
srpasta anemia)
PROBLEM: morao se unijeti veliki dio DNA na tacno
mjesto gena
RJESENJE: geneticki modifikovana bakterija Laksi
nacin GT uz pomoc GI
1. Funkcionalni gen se ubacuje na ne specificnu
lokaciju u genom domacina
2. Geni koji ciljaju i odbacuju (knock-out) specificne
gene sa GM nukleazama
Genska Terapija
PROCES
Primjer knock-out genske terapije je knocking out
ljudskog CCR5 gena kod T celija koje kontrolisu HIV

Ovaj pristup se trenutno koristi u nekoliko ljudskih
studija
Genska Terapija
Dvije kategorije GT:

1. GT somatskih celija
2. GT spolnih celija
Genska Terapija
GT SOMATSKIH CELIJA
Terapeutski geni preneseni u somatske celije
pacijenta tako da se bilo koja modifikacija desava u
samom tijelu domacina i ne prenose se na potomstvo
GT SPOLNIH CELIJA
Spolne celije modifikovane unosenjem funkcionalnih
gena koji su integrisani u njihov genom, tako da se
bilo koja unesena promjena prenosi na potomstvo
U teoriji jako efikasno u borbi protiv nasljednih
bolesti mnoge zemlje zabranile ljudske studije zbog
raznih etickih problema
Nacin Primjene GT-a
1. Ex vivo GT (van tjelesna GT)

Izdvajanje celija iz pacijentove krvi ili kostane srzi i
uzgajanje istih u laboratoriji
Izlaganje istih celija virusu koji nosi odredeni gen od
interesa - virus ulazi u celiju i gen od interesa postaje
sastavni dio celijske DNA
Celije se uzgajaju u laboratorijskim uslovima prije
nego se steknu uslovi za njihovo ubrizgavanje u
pacijenta (intavenozno)
Nacin Primjene GT-a
2. In vivo GT (unutar organizma)

Celije se ne izdvajaju iz pacijentovog organizma -
koristi se vektor za dostavljanje gena od interesa u
celije pacijenta
Genska Terapija
ZNACAJNA DOSTIGNUCA
1990 2000
Prvi odobreni slucaj GT 14.09.1990, SAD, NIH 4 god
djevojcica Ashanti DeSilva terapija za genetski defekt ADA-
SCID (severe combined immunodeficiency) efekat je bio
trenutan ali uspjesan
Ciklicna anemija uspjesno tretirana kod miseva
1992 Dr. Claudio Bordignon Vita-Salute San Raffaele
Univerzitet, Milan, Italija Prva procedura GT koristeci
hematopoetske maticne celije kao vektore za prenosenje gena
koji su odgovorni za korigovanje nasljednih bolesti 2002 prvi
uspjesni tretman GT za ADA-SCID
1999 Jesse Gelsinger deficijencija enzima jetre prvi
dokumentovan pacijent koi je umro usljed GT suspenzija
klinickih studija GT u SAD
Projekat Humanog Genoma
Emina Atikovic
Do 1970, DNA -
najkomplikovanija celijska
molekula za analizu
Danas DNA -
najjednostavnija molekula za
analizu preko noci
izolacija specificne regije
genoma, napraviti
neogranicen broj kopija, i
odrediti niz nukleotida
Sekvencione fabrike
proizvode DNA sekvence
brzinom od 1000
nukleotida/sekundi 24/7.
Sta je Projekat Humanog
Genoma?

Medunarodni naucni
poduhvat odredivanja
slijeda nukleotida
ljudskog genoma i
identifikacija gena koje
on sadrzi
Emina Atikovic
Projekat Humanog Genoma
1990: Projekat zapocet i finansiran od strane
Nacionalnog Instituta za Zdravlje (NIH) i Americkog
Ministarstva za energiju
Jun 2000: Zavrsen radni nacrt citavog humanog
genoma (pokriva >90% genoma sve do 3-4x
ponavljajucih sekvenci)
Februar 2001: Objavljena analiza radnog nacrta
April 2003: Sekvencioniranje PHG zavrseno i
projekat je zvanicno zavrsen (2 godine prije
predvidenog roka)

Emina Atikovic
Projekat Humanog Genoma - CILJ
Predstaviti kompletan i tacan slijed nukleotida DNA
molekule sacinjenog od 3 biliona baznih parova koji
sacinjavaju kompletan ljudski genom
Identifikovati oko 30,000 gena ljudske DNA
Pohraniti ove informacije u bazu podataka
Poboljsati tehnike za analizu ovih podataka
Sekvencionirati genome nekih drugih organizama
(vinske musice, gljivica kvasca, misa), koja su bitna
za daljna medicinska istrazivanja
Obracanje pozornosti na eticke, legalne i socijalne
implikacije (ELSI) PHG.
Emina Atikovic
Projekat Humanog Genoma
ELSI PROGRAM
Emina Atikovic
Najveci Bioeticki program na svijetu sa misijom da identifikuje
probleme koji mogu nastati kao posljedica PHG a koji bi direktno
uticali na individue, porodice i drustvo
Fokus ELSI programa:
1. Privatnost i ravnopravnost koristenja genetickih informacija,
ukljucujuci i potencijalnu geneticku diskriminaciju
2. Integracija novih genetickih tehnologija (gensko testiranje) u
klinicku medicinu
3. Eticki problemi dizajniranja i provodenja genetickog
istrazivanja na ljudina
4. Edukacija zdravstvenih radnika, legalnh institucija, studenata
i sire javnosti o genetici i kompleksnim problemima koji
proizilaze iz genetickog inzinjeringa
Projekat Humanog Genoma
USPOREDBA ORGANIZAMA
Emina Atikovic
Organizmi Velicina genoma
(br. baza)
Procjenjen br
gena
Human (Homo sapiens) 3 biliona 30,000
Laboratory mouse (M. musculus) 2.6 biliona 30,000
Mustard weed (A. thaliana) 100 miliona 25,000
Roundworm (C. elegans) 97 miliona 19,000
Fruit fly (D. melanogaster) 137 miliona 13,000
Yeast (S. cerevisiae) 12.1 miliona 6,000
Bacterium (E. coli) 4.6 miliona 3,200
Human immunodeficiency virus (HIV) 9700 9
Projekat Humanog Genoma
BENEFICIJE
Emina Atikovic
Molekularna Medicina
1. Poboljsati dijagnostiku bolesti
2. Detekcija geneticke predispozicije za odredene bolesti
3. Pravljenje lijekova na osnovu genetickog profila osobe
(custom drugs) - FARMAKOGENOMIKA
Mikrobiologija
1. Brzo detektovanje i tretiranje patogena u medicini
2. Razvoj novih izvora energije (biofuels)
3. Pracenje zagadivaca okoline
4. Sigurno i efikasno ciscenje toksicnog otpada
Projekat Humanog Genoma
BENEFICIJE
Bioarheologija, Antropologija, Evolucija i Ljudska Migracija
1. Proucavanje evolucije kroz mutacije
2. Proucavanje migracija razlicitih populacionih grupa na osnovu nasljedivanja
preko majke (mtDNA)
3. Proucavanje mutacija na Y hromozomu kako bi se otkrilo nasljedivanje po ocu
i sama migracija muskaraca

DNA Identifikacija (Forenzika)
1. Identifikacija potencijalnih ucesnika u kriminalnoj radnji
2. Odredivanje ocinstva
3. Identifikacija ugrozenih vrsta
4. Detekcija bakterija i ostalih organizama koji zagaduju okolinu i hranu

Agrikultura i Stocarstvo (GMO)
1. Uzgoj usjeva koji su rezistentni na bolesti, insekte i susu
2. Uzgoj stoke koja ce biti zdravija, produktivnijia i rezistentnija na patogene
3. Uzgoj proizvoda koji ce imati vecu nutritivnu vrijednost


Emina Atikovic
Projekat Humanog Genoma
STA JE SLJEDECE?
Emina Atikovic
Utvrditi funkciju gena i elemenata koji
regulisu gene citavog genoma

Pronaci varijacije u DNA sekvenci
medu ljudima i utvrditi njihov znacaj

Otkriti 3D strukturu proteina i
identificirati njihovu funkciju i
interakciju sa DNA

Sekvencioniranje genoma ostalih
organizama (stakora, krave, cipanze)
kako bi se uporedili slicni geni medu
vrstama

Nastavak proucavanja ELSI
problematike koja proizilazi iz daljnjeg
genetickog istrazivanja
PITANJ A