BIOLOGIA VIRUSURILOR. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL VIROZELOR. 4. Reprezint& structuri acelulare cu potential infectios 2, Dimensiuni de rangul nm (20-400 nm) 3. Genomul viral este constituit dintr-un singur tip de AN (ADN sau ARN) 4 Sunt lipsite de metabolism propriu,fiind pareziti ‘obligatiintracelulari ©. Nu crese gi nu se divi, se reproduc in celule vit ©. Nupot fi cultivate pe medi artifciale 7. Rezistent& naturalé la antibiotice CLASIFICAREA VIRUSURILOR Dupa tipul AN (cu genom ARN/ADN) © Dupa dimensiuni (mici - 20-50 nm, medi - 50-150 nm, mari - peste 150 nm) Dupa tipul de simetrie a capsidei (helicoidala, cubicd, mixta) © Dupa compozitia chimied (simple, complexe) © Dupa gazda (om, animal, insectd, bacterie) « Dupa sensibilitateain mediul extern, substante chimice, ete e Ordin (-virales) Familie (-viridae) e Subfamilie (-virinae) e Gen (-virus) e Specie (Virusul gripal, poliomielitic, al hepatitei B, etc) n ~ unitate structurala infectioasa a virusului Viroid - ARNm.c., circular, asociat cu boli la plante Prion - proteind termostabild infectioasa, cauzeaza la om boala Kuru, Creutzfeldt- Jacob, sindromul Gerstmann-Straussler, scrapie la oi COMPOZITIA CHIMICA $I STRUCTURA VIRIONULUI Virusurile simple ~ acid nucleic (AN) si invelis proteic - capsida (ansamblu numit nucleocapsid) Virusurile complexe - nucleocapsi invelig extern, lipoglicoproteic (supercapsida, peplos) i un Acidul Nucleic - ADN sau ARN, mono- sau bicatenar, liniar, circular sau fragmentat. ARN monocatenar : ARN+ (catend cu sens, functie de ARNm) sau ARN- (catena fra sens, este necesard prezenta ‘enzimei polimeraza) Funcfia AN - asigurarea replica AN si expresia genomului pentru sinteza proteinelor virale Virusuri ADNd.c.: Hepadnaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, Poxviridae Virusuri ADNm.c.+: Parvoviridae Virusuri ARNm.c.+: Picornaviridae, Caliciviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Retroviridae Virusuri ARNm.c.-: Rhabdoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Filoviridae Virusuri ARNd.c. : Reoviridae‘+ +I: Double-stranded DNA (2.9. Ac Desviruses, Poxviruses) ‘© “Il Single-stranded (+) sense DNA (e.g voviluses) “Ill Double-stranded RNA (e.g. E¢ jenov! + IV: Single-stranded (+) sense RNA (e.g. oinavinuses, Logaviluse: + V: Single-stranded (-) sense RNA (2.4, orthomyxoviruses, Rhabdoviruses) + VE Single-stranded (+) sense RNA with DNA. intermediate in life-cycle (e.g. Rovoviruses) * + Vik Double-stranded DNA with RNA intermedi: (e.g. Hepadnaviruses) Capside - formata din unitat! proteice, capsomere, ranjate simettic. 4. Simetrie helicoidalé - capsomerele se fixeazé pe catena de AN, forma de bastonas trie cubic (icoseedrica) - capsomerele se ranjeaz& in jurul AN, formand un icosaedru (poliedru regulat cu 20 fete triunghiulere gi 12 varfuri) eikos=20 a. Simetrie mixta (bacteriofagii, powvirusurile) Funetia capsidei- protectia AN. rol antigenic, adeziune ‘Supercepsica ~ structurd glucido-lipido-proteica, derivata din membrana celulei gazdé. Lipidele provin din membrana celulara, iar gicoproteinele ‘sunt de origine virald (ex. hemaglutinine, neureminidaza) Functie - protectie, antigene de suprafaté, adeziune Unele virusuri contin enzime ~ polimeraze, transcriptaze, ete. Actiunea factorilorfizici, chimi Virusurile sunt foarte aldura raze UV. Detergent virusurile cu supercapsid Pot fi conservate prin liofilizare sau la 80 C REPRODUCEREA VIRUSURILOR | ADSORBTIA Virusului la celula-gazda prin intermedi receptorilor specific (tropism) |) PENETRAREA virusulut th celul ») Pinocitozd (vropexis) ») Fuziunea membranelor 9 Translocare © Injectaree AN in citoplasma (bacteriofagii) |i DECAPSIDAREA ( cu enzime celulare). Din acest moment urmeaza faza de eclipes, |v BIOSINTEZA (sinteza proteinelor si replicarea AN) ‘Are loc In citoplasma (virusuri cu ARN) sau in nucleu celulei (virusuri cu ADN) Biosinteza virusurilor ADN ADNdc —_—transcriereaARNm ___replicaree translatia (precoce, tardiva) __ sinteza prote Biosinteza virusurilor ARN ARN+ —replicare, translatie _sinteza proteicé ARN=” transcriere | ARNm—” replicare, transle ~sinteza proteicé~ — Retrovirusuri(ARN+) —transcriere ADN- A transeriere ARNmT—~ replicare, transtat sinteza'pr. (sau integrare in cronmesom) V. MORFOGENEZA (asamblarea) si maturizares Virioniler Proteinele capsidele perticip& la tormarea nucleocapsidei (in nucleu sau citoplesma) iar glicoproteinele sunt inserate in MCP. substituind proteinele celulare. in aceasta fazé apar incluziunile Viale sau corpusculi elementari. Vi_ELIBERAREA vrionilor (liza eelulel, imugurire. ‘exocitoz8). Nr lor poate atinge 100.000 per/ceiulé ‘cateva ore pana la cateva zile (ex: 8h - poliovirus 72h = citomegalovirus). Interferenta virel& - fenomen in care, consecutiv infectiei unei celule cu 2 virusuri, multiplicerea unuia este inhibata (virus interferat / vis interferent) RELATII VIRUS-CELULA GAZDA productiva, citocida Virusul este infectios iar celula permisiva (receptiva). La nivelul ma/o corespunde infectilor acute, aparente ‘sau inaparente (grip&, rujeolé..) «© Infectiivirale persistente Celulele infectate supravietuiesc, cu producerea Permanentd sau intermitentd a virusului 41. Infectit abortive (cu virion defectiv)~ infectia nu se Virale. Ele devin finta pentru efectoriiimunitati (macrotage, T-limfocite) in cursul un (ex: Panencefelita Sclerozanta Subacuta (PESS) post rujeolica) 2. Infectil integrate (virusuri ADN sau copii de ADN. 4 Retrovirusurilor), Consecinte: - Transformatea maligna a celulei gazdé Infectii lente - manifestarea infectiei dup o perioada de incubatie indelungata cu expresia & @ genomului viral (ex: HIV-SIDA) latente-reactivari ocazionale, repetate ale ‘cu exprimarea integrala a informat genetice virale (ex. infectia herpetica) Infect cronice ~ perioade de remisie si acutizare, Virusul este prezent permanent, chiar in absenta ‘simptomelor (ex. hepatita virala B)CULTIVAREA VIRUSURILOR Virusurile sunt cultivate pentru: = Stabilirea diagnosticului etiologic Obtinera culturilor de celule primar tr ~ Prelevarea tesutului (ex.: rinichi de meimut - Testarea infectiozitatii virusurilor . Testarea preparatelor antivirale Producerea vaccinurilor SISTEME DE CULTIVARE 1 Culturi de celule 2 Qu embrionat de gaina 2. Animale de laborator Animalele de laborator se utilizeaza limitat (receptivitate selectiva, preexistenta infectiilor, cost avansat). Se recurge numai cand nu exista alte posibilitati (VHB, HIV, Coxsackie, etc). Constituie modele de cercetare sau de control al vaccinurilor. Animale utilizate curent - soriceii albi nou- nascuti, dar pot fi utilizati sobolani, cobai, maimute, etc. Regulile de lucru cu animalele de laborator Oulembrionat de + Initial se verific (selectare, inoculare, examinare) sunt identice cu cele din infectiile bacteriene. 15 (5-43 zile) reprezinté un mediu de celule nediferentiate, cu muttiplicare activa, steril glipsit de mijloace de aparare ‘antiinfectioas&. Se utiizeazé in prepararea unor veceinuri virale (ex.: gripel) jabilitatea embrionului la ovoscop in camera obscura. Prelevatul se inoculeaza steril cu seringa in ‘cavitatea amniotica sau alantoideand, sau pe membrana chorioalantoideana (utilizand metoda deschis& sau inchis8). Orificiul se parafineaza gi se incubeaza la 35-37 C timp de 48-72 ore Cullurle de celule (1949- Enders, Weller, Robbins), Ccalule provenrte ain tasuturi adulte sau embrionare, normale sau ‘tumorale. Plasata intrun mediu adecvat (nutrient, pH, t) rman viabile ¢1 se mulliplic’. Pentru cultivarea virusutilor se utlizeaz4 culturile in monostrat celular. Tipurile de cutturt de celute (co): Culturi primare (primar tipsinizate). Sunt obtinute din tesuturt _adulte sau embrionare de origine animala sau umana. Suporta 4-6 pasaje (subcurtivari) Culturi diploide. Obtinute cin tecut embrionar (MRS5, fibroblasts umane). Pot fi subcultivate 40-50 general Linii continui do colule. Odtinute din tecut tumoral. Pot fi ‘subcurtivate nelimitat. HeLa - carcinom de col uterin KB - tumoaro a rinofaringolui Hop-2 - tumoare canceroasé a laringeh Fragmentarea si spdlarea cu sol. fiziologic& Dezagregarea tisulard cu enzime proteolitice (tripsina) - Separarea celulelor prin centritugare = Dozarea suspensiel - 10° - 10°celule/ml Introducerea celulelor in mediu nutritiv $i repartizarea in recipiente sterile - Incubatea pana la formarea monostratului celular (inhibitie de contact) Monostratul poate fi infectat cu virus sau serveste drept sursa de celule pentru o noua cultivare (pasaj) Mediile de culturd pentru cuituride celule (Eagle, Hanks, 199, hidrolizat de lactalbumind, etc). contin AA, Vit. factori de crestere. saruri minerale, rogu fenol pentru monitonizerea pH (vireazd in gelben in mediu acid). Verietati: 1. Mediile de cregtere (pentru cultivarea CC) sunt imbogatite cu ser sangvin (uman, animal) 2 Mediile de tntretinere se utilizeazé pentru ‘mentinerea monostratului in procesul reproduceri virale. Nu contin ser. CC reprezint& sistemul virus-gazda predile Virologia clinicd si cercetare. Inocularea CC Se aleg tuburi cu monostrat bine format - Se inlatura mediul de crestere, se spala ou sol. Hanks - Se inoculeaza 0,1 - 0,2 mi de prelevat Peste 30-60 min in tuburi se toama cate 1 ml mediu de intretinere - Se introduc in termostat la temperatura adecvata 3-4 zile DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL VIROZELOR Indicat Boli cu masuri terapeutice sau profilactice speciale (SIDA, hepatite, rubeola, etc) Elucidarea etiologiei virale a unor izbucniri epidemice (meningite, gastro-enterite, pneumoni ete) Supravegherea epidemiologic8 Prelevate: LCR, sange, exsudate, secretiinazale. rino- faringiene, mase fecale, urina, continutul veziculele si uleeratilor cuteneo-mucoase, bioptate, etc.Eficacitatea diagnosticului este conditionata de: 1 Examinarea precoce (la debutul boli) 2 Alegerea corecta a prelevatelor, calitatea lor 2. Transportarea rapida a probelor sau utilizarea mediului de transport 4. Respectarea regulilor de autoprotectie si de protectie a anturajului |a recoltarea, transportarea gi examinarea probelor METODELE DE DIAGNOSTIC AL VIROZELOR METODE DIRECTE - Examenul vitusoscopie (evidentierea direct’ a Virionului sau a componentelor lui in prelevate) Examenul virusologic (izolarea gi identificarea Virusului) ~ Detectarea Agvirale tn prelevat ~ Identificarea genomului viral (hibridizarea AN, amplificatea genic& METODE INDIRECTE - Serodiagnosticul (cresterea de cel putin 4 ori a titrul ‘Ac in dinamica) EXAMENUL VIRUSOSCOPIC 4. Microscopia optica ~ depistareain prelevat a incluziunilor virale specifics (corpusculii Guarnisti in variolé, Babes-Negti in rebie) sau nespecitice citoplasmatice sau nucleare. Se prepara frotiuri ‘sau frotiuramprents colorate Romanovschi Giemsa, cu hematoxilind-eozina sau cu fluoroerom. 2, Microscopia electronic& 3. Imunoslectronomicroscopia - mai sensi 4 Imunotluorescenta (direct8 si indirect) - utilizatd in diagnosticul rapid al virozelor EXAMENUL VIRUSOLOGIC Prelucrarea prealabila a prelevatelor: Omogenizarea (dupa necesitate) ~ Inlaturarea elementelor celulare, inclusiv bacteriene (centrifugare, ultrafiltrare) - Tratarea cu antibiotice pentru prevenirea cresterii bacteriilor si fungilor contaminanti (penicilina - 500 UA/ml, streptomicina - 500 UA/ml, nistatina - 20 UA/m!) ETAPELE DIAGNOSTICULUI VIRUSOLOGIC 4 zolarea virusului 2. Evidentierea (indicarea) reproducerii virale 2. Identificarea virusului lzolarea virusului se realizeaza prin inocularea ct material de examinat a animalelor de laborator, embrionilor de gain sau a culturilor de celule. Alegerea sistemului de cultivare se efectueaza in funotie de i le biologice ale agentului etiologic probabil i posibilitatile laboratorului. Indicarea virusului { in cutturi de celule 1 ECP (efect citopatic)~ modificari degenerative gi distrugere celulara, rezultat al multiplicérii virale (rotunjire sau retractie celulara, citoliza, aparitia vacuolelor sau granulelor in citoplasma, picnoza nucleului fuziunea membranelor, etc). ECP poate fi studiat la microscopul optic pe celule necolorate sau colorate cu hematoxilin&- eozina, Giemsa, fluorocrom. 2. Formaree plajelor Reprezint& focare de celule alterate in monostratul celular acoperit cu agar. Numérarea plajelor permite cuentificarea Virusului infectant. 3. Incluziuni virale Reprezi A acumulari para virioni sau de componente virale in locul de replicare si asamblare a virusurilor (citoplasma, nucleu). Coloratia Giemsa, hem-eozina, fluorocrom. Localizarea, forma gi afinitatea tinctoriala (bazofile, acidofile) sunt particularitati diagnostice pentru unele viroze.aglutinarea (Reactia de HA) Unele virusuri posed in compenenta capsidei. in special a supercapsidei, glicoproteine care pot ader la supretata hematiilor - hemaglutinine (HA). RHA este caracteristic& pentru virusurile cu HA ‘acumulate in mediul de intret In acest caz mediul de intretinere aglutineaza eritrocitele unor specii de mamifere sau pasari. jadsorbtia (Reactia de HAd) RHAd este caracteristic’ virusurilor cu HA care se afid intraceluler. in procesul asamblarii acestor virusuri. HA lor se afia deja inserate in MCP a celuleigazda nivelul viitorului mugure. Daca la aceasta etal reeipientul cu monostrat celular se adauga suspensie de hematii i se mentine 18-20 min la temperature caracteristicé fiecarui virus, la microscop pot fi urmarite hematile fixate la suprafata celulelor Infectate (RHAd). 6. Proba culoril - Metabolismul celular neafectat - virajul culorii ‘mediului din rogu in galben (pH acid) Metabolismul celular inhibet - culoarea mediului nu se modifica 7. Interferenta Ex: V.rubeolic nu produce ECP, dar determing fenomenul de interferenta. Pentru detectarea Vrubeclei se infecteazd CC cu virus citopatogen. Lipsa multiplicarii acestui virus confirma prezenta V.rubeolic Ouale se racese 18 ore la +4 grade C pentru vazoconstrictie maxima, apoi aseptic se taie coaja, se recolteaza lichidul alantoic sau amniotic, iar MCA si embrionul se introduc in cutii Petri sterile. Se observa: 4 Moartea embrionului Apatitia modificarilor (nemoragii, pustule) pe MCA 2. Acumularea de HA in lichide Indicarea virusului pe animale de laborator 1. Boala manifesta a animalului, deces 2 Urmérirea virusului in organele-tint - Hemaglutinare - _ Infectiozitatea omogenatelor Examene histopatologice (leziuni inflamatorii, degenerare, incluzi virale specifice: corp. Babes-Negri in neuronii infectati cu V.rabic, ete) Identificarea virusurilor Determinarea genului, speci stabilirea structurii anti Se efectueazé cu ajutorul serurilor imune specifice antivirale in diferite reactil serologice: RN RA ~ RIHA/RIHAG - RFC RIF RIE (ELISA) ~ ARI ete si serotipului de virus ice. DETECTAREA AG VIRALE IN PRELEVATE Avantaje: simplitatea si rapiditatea examenulu ‘nu necesité mentinerea infectiozitati virusului Dezavantaje: sensibilitate direct proportional cu cantitatea virusulul din prelevat Se utilizeazé Ac policlonali de origine umana (seruri imune) sau Ac monocionali (de origine murina) Reactii: RHAl, RLA, RIF, RIE (ELISA), Western-blot, ARI, ete. IDENTIFICAREA GENOMULUI VIRAL (punerea in evidenta a AN virali din prelevate in cursul infectiilor virale acute sau cronice si monitorizarea tratamentului). Pot fi examinate toate fesuturile si lichidele biologice © Hibridizarea acizilor nucleici fara amplificare © Hibridizarea dupa amplificare (PCR si variantele ei) DIAGNOSTICUL SEROLOGIC Esenta: depistarea Ac sintetizati de gazda in raspuns la o infectie virala. Dupa o primo-infectie are loc inducerea formérii Ac, iar dupa o reinfectie sau reactivare titrul Ac creste in dinamica. In serodiagnosticul virozelor este obligator de a examina 2 probe de ser de la boinav (seruri- perechi): prima prelevata la debutul bolii, a doua prelevata peste 15 zile.‘Ac sunt depistati in ser, uneori in LCR, exsudate, lichid articular, ete. Pentru depistarea Ac se utilizeaza Ag virale de referinta (suspensie virala inactivata, proteine virale native sau recombinant, oligopeptide sintetice). Tehnici utilizete: RFC, RIHA, RHAI, RN, RIFI, ARI, IE (ELISA), etc. ‘Semnificatie diagnostica prezinta creceree tierulul de Ac de la O la pozitiv (seroconversie, primo-infectie) sau cresterea titrulyi Ac de ce! putin 4 or in cursul infectiei. Ambele seruri Vor fi testate in aceeasi zi, prin tehnict identice gi in acelagi laborator. TERAPIA ANTIVIRALA Dificultati Toxicitate (imposibil de a distruge virusul fara afectarea celulei!) = Aparitia mutantelor rezistente - Activitate asupra virusulut in faz de multiplicare Costul avansat al tratamentului Primele preparate antivirale ~ anticanceroase. Preparatele antivirale contemporane: -Nu manifesta activitete virucida, doar inhib& reproducerea vil Sunt dirijate contra etay lor reproduce virale © Adeziunea virusului la cella ‘Mecanismul ~ blocarea receptorilor celulari (HIV= oligopeptidul T, care reproduce go120; CD4 solubii Dificultéti efinitate redusé, degradere rapida © Fuziunea, penetrarea Reprezinta peptide sintetice (pentafuzida-T20, T1249) blocheazé fuziunea virusului HIV cu membrana ccelulard (dificultate - injectiis/c zilnice) © Decapsidarea Amantadina, rimantadina inhibé decapsidarea virusului gripal A Utilizare limitata - dezvoltarea rezistentei © Replicarea ‘Mecanismul - blocheaz’ activitatea enzimelor virale de reproducere(transcriptaze, polimeraze, repicaze) ‘Avanta) - nu influenteaza componentele celulet-garda 4. Analogi nucleozidici Sse disting de nucleozidele naturale prin modificarea ‘componentului glucidic sau a bazei purinice sau inice. Blocheaza elongarea catene! de ADN in Antiherpetice (acielovr, gancictovr, pencictovir, idoxuriin) AntisHlV(zidovadin, didanozin, zacitabin, stavudin, amici, etc) Alnt-HBY (entecavir, LAT. LAC ~ faz de cervetare) 2. Analogi nucleotidi - Cidofovir - CMV, HSV - Adefovir - HIV, HBV, HSV, CMV - Tenofovir — HIV, HBV 3. Analog al pirofosfatului - Foscarnet - HSV, CMV (HIV, HBV -?) 4. Inhibitori nenucleozidici ai RT HIV (nevirapin, delavirin, efavirenz) Blocarea acti realizeaza prin: 1 Competitie cu substratul natural al enzimei 2 Ingramadirea steric’ a centrului activ al enzimei 2. Incorporarea in catena de ADNin curs de sinteza 4 Blocarea procesului de elongare a catenei de ADN prin incapacitatea de a fixa un alt nucleozid pe analogul sau artificial polimerazelor virale se Asamblarea, eliberarea Inhibitori ai proteazei HIV (sanquinavi ritonavir, indinavir, amprenavir, lopinavir, nelfinavir, etc) - toxicitate, rezistenta jazei virusurilor oseltamivir). Activa contra gripei A si B (efect preventiv, curativ, rezistenta rara) INTERFERONII (IFN) © IFN — ansamblu de proteine capabile sa confere celulelor o stare de rezistenta la 0 infectie virala. IEN tip 4 (clasic, antiviral): 1. IFN-alfa (leucocitar) 2 IFN-beta (fibroblastic) Inductori ai IFN 1: virusuri, LPS, ARN bicatenar IFN-gamma, tip 2, imun, produs de LT activate, NK. Manifest activitate munomodulatoareIFN actioneaza asupra ciclului de replicare viral prin intermedi eslulet: Interactiunea IFN-alfa cu rece ptargl ‘sdu incluce sau stimuleaza expresia unor gene celul rezultand 0 activitate antivirala (blocarea translatiet ‘ARNm viral, dogradaroa ARN viral). Este posibi si blocarea asamblari st inmugurirt virusulu (HIV) ~ IFN maresc expresia moleculelor clasa | a CMH, iar IFN- ‘gamma $1 celor de clasa Il = IFN maresc activitatea macrofagolor $i manifesta ‘actiitate antiproliferativa ~ IFN gamma activeaza colulele NK Utilizarea terapeuticd a IFN- hepatite B si C cronice, infecti herpetice, sarcomul Kaposi,limfome, leticemi « TERAPIA CELULARA (CMV, EBV) Fondata pe administrarea CTL (limfocite To) autologe. - Prelevarea sangelui de la bolnav - lzolarea CTL specifice - Clonarea gi proliferarea CTL in vitro - Reinjectarea la pacient VITOR: fototerapia, imunizarea intracelulara (introducerea unei gene ce codifica un anticon antiviral)