Universidad Agraria La Molina

Facultad Ciencias
Departamento de Biologa



INFORME N 8

INTEGRANTES:
Romero Manrique, Vctor
AA
BB

MESA N: 2

GRUPO DE PRACTICA: Jueves de 11-1 pm

PROFESOR: Ramos Chaupin, Roberto Ral







2014 I





I.- INTRODUCCIN

Los microorganismos, tienen la capacidad de adecuarse al entorno en el que se
encuentran, as como tambin pueden modificarla y utilizar los compuestos qumicos de
su entorno como fuente de energa para su crecimiento y reproduccin. Estos procesos
de absorcin de nutrientes son llevados a cabo por enzimas especficas los cuales son
sintetizados segn el medio en el que se encuentren.
Los principales fuentes de energa utilizados por la mayora de microorganismos son los
carbohidratos como polisacridos, disacridos, monosacridos, de los cuales muchos
microorganismos forman compuestos como cido actico, cido lctico, piruvato, CO
2
,
etc.
Muchos microorganismos tambin son capaces de degradar las protenas y usar el
pptido resultante y aminocidos como fuente de energa o tambin para la sntesis de
sus propias protenas o en energa. Tambin son capaces de degradar lpidos como
triglicridos y los fosfolpidos.
Los microorganismos se pueden diferenciar por la capacidad de producir ciertas enzimas.
Las que se utilizan para degradar los sustratos que estn en su medio, poder ingerirlos
como molculas ms pequeas y de esta manera alimentarse.
Este tipo de enzimas son llamadas exoenzimas, es decir enzimas que son excretadas al
medio externo de la bacteria que la produce. Algunos ejemplos de este tipo de enzimas
que veremos en la prctica son: amilasa, renina (caseinasa), lipasa y gelatinasa que son
las enzimas que estudiaremos en el presente informe usando los sustratos apropiados en
un medio de cultivo que los contenga, podemos saber qu tipo de enzima secreta
cualquier bacteria. De manera que ser positiva si el sustrato se acaba, demostrndose
que se produjo la enzima que lo degrada; por el contrario si el sustrato permanece intacto
quiere decir que la bacteria no produce dicha enzima capaz de degradarlo y sera una
bacteria negativa para dicha enzima en particular.


II.- OBJETIVOS

Determinar la capacidad microbiana de utilizar diferentes sustratos tales
como almidn, gelatina, casena y grasa, para lo cual es necesaria la
induccin de hidrolasas.












III.- MARCO TERICO

ACTIVIDAD ENZIMTICA

Las enzimas son molculas de naturaleza proteica que actan como catalizadores en
todas las reacciones del metabolismo. En estas reacciones, las enzimas actan sobre
unas molculas denominadas sustratos, las cuales se convierten en molculas diferentes
denominadas productos. Casi todos los procesos en las clulas necesitan enzimas para
que ocurran a unas tasas significativas. A las reacciones mediadas por enzimas se las
denomina reacciones enzimticas, tambin las enzimas son de carcter especifico para
cada reaccin ya que de lo contrario podran ocurrir reacciones no deseables.
Las enzimas, por tanto, ademas de ser catalizadores han de ser capaces de reconocer
sobre que sustancia o sustratos han de actuar
Segn Rodrguez (2005), como todos los catalizadores, las enzimas funcionan
disminuyendo la energa de activacin (G) de una reaccin, de forma que se acelera
sustancialmente la tasa de reaccin. Las enzimas no alteran el balance energtico de las
reacciones en que intervienen, ni modifican, por lo tanto, el equilibrio de la reaccin, pero
consiguen acelerar el proceso. Una reaccin que se produce bajo el control de una
enzima, o de un catalizador en general, alcanza el equilibrio mucho ms rpido que la
correspondiente reaccin no catalizada.
La actividad de las enzimas puede ser afectada por otras molculas. Los inhibidores
enzimticos son molculas que disminuyen o impiden la actividad de las enzimas,
mientras que los activadores son molculas que incrementan dicha actividad. Asimismo,
gran cantidad de enzimas requieren de cofactores para su actividad. Igualmente, la
actividad es afectada por la temperatura, el pH, la concentracin de la propia enzima y del
sustrato, y otros factores fsico-qumicos.

ENDOENZIMAS Y EXOENZIMAS
Algunos microorganismos producen una serie de enzimas constantes en tomo,
dependiendo de las condiciones fsicas y qumicas imperantes, son incapaces de activar
diferentes sistemas enzimticos, dando lugar a productos distintos.
En relacin con su localizacin las enzimas se clasifican en exoenzimas y endoenzimas;
las exoenzimas son secretadas por el microorganismo y actan fuera de ella, su funcin
principal es disminuir el tamao de las molculas complejas que existen en el medio
ambiente los que frecuentemente determina que estas pueden difundirse al interior de los
microorganismos.
Algunas bacterias producen ms protenas dainas denominadas enzimas extracelulares,
o exoenzimas que son enzimas que se encuentran al exterior de la clula, tal es el caso
de las especies de Streptococcus, Staphylococcus y Clostridium que sintetizan
numerosos tipos de enzimas extracelulares toxicas.

Estos pueden ser de 3 tipos, siendo el primero de ellos el constituido por enzimas
extracelulares que causan la lisis celular; el segundo grupo incluye las enzimas
extracelulares que provocan la ruptura de los materiales que mantienen unidades a la
clulas para formar los tejidos y el tercer tipo acta alterando el delicado equilibrio
existente entre la formacin y destruccin de los cogulos sanguneos.

Las cuales catalizan una serie de reacciones aplicables a la formacin de productos que
permiten almacenar energa o en reacciones biosinteticas para la generacin de material
celular; paralelamente pueden producirse sustancias que carecen de utilidad que se
difunden continuamente hacia el exterior, de manera inversa a como ingresan los
nutrientes.
Estas diferencias son el resultado de distintos resultados enzimticos que posee cada
microorganismo hay numerosas pruebas que pueden indicar en forma clara y precisa, la
presencia o ausencia de una enzima metablica completa en uno o ms
microorganismos.
En un medio ptimo, la clula bacteriana regula sus vas metablicas tan eficientemente
que ningn intermediario es sintetizado en exceso. Si existe una fuente de carbono en
exceso, se pone en juego toda la maquinaria enzimtica para utilizarla. En forma puesta,
si un aminocido esta en exceso, se reprime su biosntesis.
La regulacin enzimtica se realiza fundamentalmente en dos niveles: actividad
enzimtica (enzimas alostricas, fosforilacin) y sntesis enzimtica (regulacin de la
expresin gnica). En bacterias, la sntesis enzimtica est regulada a travs del sistema
de operones, los cuales corresponden a unidades regulatorias gnicas.


AGAR ALMIDN
Segn Rivera, muchas bacterias producen enzimas llamadas hidrolasas. Estas catalizan
el rompimiento de molculas orgnicas en unas ms simples en presencia de agua. El
almidn es un ejemplo de estas molculas, donde las enzimas (- Amilasa) actan en su
rompimiento.

Almidn [Amilosa + Amilopectina] Dextrina + Maltosa + Glucosa

Medio de cultivo agar-almidn: Composicin y preparacin.
Peptona.........................5-10g
NaCl................................5g
Extracto de carne............3-5g
Almidn soluble...............2g
Agar-agar......................15-20g
Agua destilada.........1000ml
Disolver los ingredientes en el agua destilada, llevar a ebullicin agitando regularmente,
calentar 3-4 minutos hasta disolver. Enfriar a 50-60 C. Esterilizar en autoclave.

La presencia de un halo transparente alrededor de la colonia indica que la prueba es
positiva, es decir que la bacteria ha hidrolizado el almidn mediante la amilasa.
Slo las bacterias del gnero Bacillus (B. thuringiensis y B. subtilis) producen amilasa.

Segn Rodrguez (2005), el almidn es un homopolisacrido de glucosa, cuyos
componentes son la amilosa y la amilopectina ramificada. Para utilizarlo, algunas
bacterias sintetizan una exoenzima llamada amilasa que hidroliza los enlaces glucosdicos
alfa1-4, liberan maltosa e isomaltosa, que ingresan a la clula y quieren metabolizarse.

Para evidenciar la presencia de amilasa, se recurre a que el almidn forma un complejo
de color azul intenso con el yodo que se evidencia cubriendo la placa con solucin de
lugol. Las cadenas de amilopectina solo dan un color caf rojizo y el almidn hidrolizado
no da ninguna coloracin. Por lo tanto la ausencia del color azul indica que el almidn ha
sido hidrolizado.
La produccin de amilasa es til para diferenciar especies de Bacillus, de Streptococcus y
de Lactobacillus. De igual forma se aplica a esquemas de diferenciacin de algunas
bacterias aerobias y anaerobias como Bacteroides, Clostridium y Fusobacterium.
Los polisacridos, como el almidn son demasiados largos para ser transportados al
interior de la clula. Los microorganismos excretan amilasas que hidrolizan esos
polmeros hasta oligo o monosacridos que pueden usarse como sustratos para crecer.
La hidrlisis de almidn es analizada en medios conteniendo almidn en placa. Despus
de incubar se inundan las placas con lugol que al unirse con el almidn intacto forma un
complejo prpura.
Las bacterias pueden usar alimentos macromoleculares; para ello, es necesaria una
hidrlisis extracelular preliminar, igual que sucede en los animales superiores. Las
distintas bacterias elaboran para este fin una cierta variedad de enzimas extracelulares
que se segregan al medio.
La solucin de lugol se le agrega para observar la reaccin de ambos microorganismos y
la capacidad que estos microorganismos tienen para producir una enzima que hidrolice al
almidn. La observacin fue que el bacilo cereus fue resistente al colorante o sustancia y
pudo hidrolizar al almidn formndose un halo transparente alrededor del almidn.

AGAR CASENA
Segn Rodrguez (2005), la casena es una protena encontrada en la leche. Como todas
las protenas est compuesta por aminocidos que son utilizados por los microorganismos
como fuente de energa y de carbono.

Peptona de carne. 5.0 g
Extracto de carne... 3.0 g
NaCl. 5.0 g
Casena 2.5 g
Ca Cl
2
. 0.05 g
Agar-agar. 13.5 g
Agua destilada 1.0 L
pH. 7.2

Suspender los ingredientes, calentar a bao mara hasta disolverse y mantener 10
minutos. Esterilizar en autoclave.
Se pueden agregar 5-10 g. de leche descremada para reforzar turbidez.
Cuando la leche es mezclada con un medio de cultivo, el medio pierde su transparencia y
se vuelve turbio debido a que la casena reacciona con los iones calcios y forma
complejos coloidales insolubles de caseinato de calcio. Cuando la enzima caseinasa
cataliza la hidrlisis de la casena, los aminocidos resultantes se disuelven y el medio se
torna de nuevo transparente alrededor de la colonia de microorganismos. Este fenmeno
permite detectar la degradacin de la protena.
El cambio que se observ en agar leche es la clarificacin del agua alrededor de las
colonias que producen caseinasa.
La hidrlisis de la casena no difiere de la de cualquier protena tpica, la molcula proteica
se desarrolla en etapas produciendo una sucesin de molculas de tamao decreciente
llamadas proteasas, peptonas, pptidos, hasta terminar en aminocidos libres, las cuales
por su tamao son ya cristaloides.











AGAR GRASA
Los lpidos son compuestos de alto peso molecular los cuales poseen grandes cantidades
de energa almacenada La lipasa es una enzima que hidroliza los lpidos en molculas
ms simples como glicerol y cidos grasos. Cuando los lpidos son aadidos al agar
solidificado los microorganismos pueden hidrolizar el mismo en el laboratorio. La hidrlisis
se puede detectar aadiendo indicadores de pH al medio de cultivo.

Peptona . 5.0 g
Extracto de levadura... 3.0 g
Agar-agar. 15 g
Agua destilada 1.0 L
Emulsin de grasa
Grasa de manteca . 20.0 g
Goma arabiga ....... 2,.5 g
Agua destilada 1.0 L

Fundir manteca no salada en bao de agua a 50C, separar la grasa pipeteando
cuidadosamente. Esterilizar en autoclave.
En el momento de preparar las placas, la solucin de goma arbiga y la grasa se
mezclan y emulsionan en un homogeneizador estril.

AGAR GELATINA
La gelatina es una protena que se obtiene por hidrlisis parcial del colgeno y
proporciona un sustrato til para determinar la accin de las enzimas proteolticas de los
microorganismos. Tambin se puede emplear en la identificacin de cultivos puros de
bacterias que son en realidad delicadas en relacin con sus necesidades nutritivas.
La hidrlisis de la protena es importante porque se obtienen aminocidos y producen
amonaco, fosfatos tiles para el suelo.

Peptona . 10.0 g
NaCl . 5.0 g
Extracto de carne... 5.0 g
Gelatina 4.8 g
Agar-agar. 15 g
Agua destilada 1.0 L
pH. 7.2