Mikrobnecelulaze in

celulosomi ternjihov
biotehnolokipotencial
Maj2014
doc.dr.MaaVodovnik
CELULOZA
primarniproduktfotosinteze2090%rastlinskihtkiv
najboljrazirjenavrstaodpadkov,hkratitudiobnovljivivirenergije
Zakaj preuevati celulolitine sisteme?
SubstratzaproizvodnjoBIOGORIV
indrugihuporabnihproduktov
fermentacijesladkorjev(topila,)
Tekorazgradljivsubstrat($)
Biotehnolokiizziv:
IzoliratialipripravitiseveMO,ki
bodouinkovito pretvarjalicelulozo
veleneprodukte
Zgradba celuloze v rastlinskih celinih stenah
Prirejeno po: http://www.joostdevree.nl/shtmls/cellulose.shtml
Celuloznovlakno
Mikrovlakna
(3036glukanskihverig)
Celulozneverige
(100 20000DGlu)
Hidrofobne in
Van der Waalsove
interakcije
1,4glikozidnavez
Hvezi
Hvezi
Rastlinskecelinestene
hemiceluloze
pektin
lignin
Fazna sestava celuloznih vlaken
http://www.fmcbiopolymer.com/Food/Ingredients/CelluloseGe
l/Manufacturing.aspx
AMORFNE regije (A):
neurejena podroja
KRISTALININE regije (B):
podroja z visoko stopnjo
urejenosti
Omejujoi dejavnik razgradnje!
maks. t. H-vezi med
posameznimi verigami,
nedostopnost za encime
PREBAVILARASTLINOJEDIH
IVALI
SIMBIONTSKIMO:
bakterije,
arheje
glive,
praivali
TLA(movirja!)
Kje poteka najintenzivneja razgradnja celuloze?
konzorcijirazlino
specializiranihMO
sinergija
Proizvodnja PROSTIH CELULAZ
(se samostojno veejo na substrat)
Energetsko potratno
Znailno za AEROBNE
(mikro)organizme
Potrebne velike koliine za
dosego efektivnih koncentracij
Proizvodnja encimskih
kompleksov - CELULOSOMOV
Veja sinergija med encimi,
potrebne manje koliine
Znailno za nekatere ANAEROBNE
mikroorganizme
Bakterije: red Clostridiales
Vampne glive: Orpinomyces spp.,
Piromyces spp., Neocallimastix spp.
Energetsko uinkoviteje
Celulolitinestrategijemikroorganizmov
zunajceliniproteinskikompleksi(320x10
6
Da)
(vedomenske)podenote:
strukturne:SKAFOLDINI
katalitske:ENCIMI
Glikozidhidrolaze
Polisaharidliaze
OHesteraze
Proteaze,SERPINI,?
CELULOSOMI
sinergijamedencimi
kompecijazavezavnamesta
CBM1
CBM2
..solahkotuditakni(R.flavefaciens)
Encimi, ki razgrajujejo celulozo: CELULAZE
GLIKOZID HIDROLAZE (O-glikozid hidrolaze, E.C. 3.2.1.x):
encimi, ki katalizirajo hidrolizo glikozidne vezi
Delitev glede na specifinost katalitskih domen:
procesivnost
Modularna zgradba celulaz
1.Encimi,kiimajoleenodomeno(katalitsko)
redkeji
obiajnorazgrajujejotopneproduktehidrolizeceluloze
(celodekstrine)
2.Encimizdvemaalivedomenami
pogosteji
vekatalitskihd.zrazlinospecifinostjo
zavezavonasubstrat(CBD/CBM)
zavezavovcelulosome(dokerini)
Moduli vezave na ogljikove hidrate (CBM)
20 200AKdolgaohranjenazaporedjazznailnimvzorcemzvitja
naencimihaliskafoldinih(celulosomi)
naC koncu,Nkoncualicentralno
Delitevgledenasubstratnospecifinost(topologijovezavnegamesta):
tipA:kristalininipolisaharidi
tipB:amorfneregijeposameznih(sproenih)glikanskihverig
tipC:kratkiOH,konciglikanskihverig
Funkcije:
vezavaencimovaliencimskih
kompleksovnanetopnesubstrate,
amorfogenezakristalininihpodroij
CBM
KD
H
2
O
Kakopotekarazgradnjaceluloze?
Celuloznovlakno
(kristalininopodroje)
1. stopnja:AMORFOGENEZA
rahljanjenekovalentnih vezimed
posameznimiglukanskimi verigami,
sprostitev(CBM,ekspanzini)
poasi
poasi
2. stopnja:HIDROLIZA
NETOPNIHceluloznihverig
(SP>6)
3. stopnja:HIDROLIZATOPNIH
CELODEKSTRINOV
(celooligosaharidovincelobioze)
*Anaerobi:fosforolitinacepitev
(celodekstrin/celobioza
fosforilaza)
hitro
CBM
Eksoglukanaza
Endoglukanaza
glukozidaza
hitro
Glc
Celulazeincelulosomivbiotehnologiji
potencialcelulazzauporabovrazlinihindustrijskihpanogah
prepoznanev50.letihprejnjegastoletja
danes2.najvejaskupinaindustrijskihhidrolaz
IVILSKAin
KRMILNA
industrija
TEKSTILNA
industrija
PAPIRNIKA
industrija
BIOENERGETIKA
KEMINA
industrija
BIOENERGETIKA
KEMINA
industrija
Ligno/hemi/celulozniodpadki
Sladkorji
hidroliza
fermentacija
etanol
acetat,
CO
2
, H
2
CH
4
propanol
aceton
metanogeneza
butanol
Reitve?
NATIVNECELULOLITINESTRATEGIJE:
spreminjanjemetabolizmainlastnostianaerobnihcelulolitinihMO,
takodadoseemovejiizplenelenihproduktov(etanol)
celulolitiniklostridiji(C.thermocellum,C.cellulolyticum,..)
REKOMBINANTNECELULOLITINESTRATEGIJE:
vnosheterolognihcelulolitinihsistemovvindustrijskeMO,ki
uinkovitofermentirajosladkorjeveleneprodukte(topila)
kvasovke,Z.mobilis,solventogeniklostridiji(C.acetobutylicum)
Teava:
NismoeizoliraliMO,kibineposrednoindovoljuinkovitopretvarjal
celuloznesubstratevproizvodezdodanovrednostjo.
Nativne celulolitine strategije
Metabolnoinenirstvoanaerobnihcelulolitinihmikroorganizmov
1 laktatDH
5 fosfotransacetilaza
6acetatkinaza
Spreminjanjemetabolnihtokov
veljenosmerz:
1)Blokadoalternativnihpoti
utianjem/inaktivacijogenov,
katerihproduktisodelujejov
alternativnihpoteh
2)Prekomernimizraanjem
genov,katerihproduktisodelujejov
elenihpoteh
7 acetaldehidDH
8 etanolDH
Lyndinsod.,Microbiol.Mol.Biol.Rev.66(2002)
Glc
Metabolnoinenirstvoanaerobnihcelulolitinihmikroorganizmov
Teave Potencialnereitve
Pomanjkanjeznanja,kibiomogoilo
genskospreminjanjeACM
Intenzivnejepreuevanjegenetike
ACMinrazvojsistemovzauinkovit
vnosinizraanjeheterologneDNA
Poruenjeravnotejaorganskih
metabolitovalielektronskih
prenaalcevzaradipreusmeritve
metabolnihtokov
Sekundarno(nadomestno)
spreminjanjemetabolnihpoti
Inhibicijaskonnimiprodukti
fermentacije(EtOH encimi
glikolize,membrana)
Razvojodpornejihsevov
(pospeenaevolucija+selekcija),
tarnospreminjanjegenov,ki
sodelujejopriodpornosti
Rekombinantne celulolitine strategije
elenelastnostiREKOMBINANTNIHCELULOLITINIHMO:
enostavnogenskospreminjanje
sposobnostizraanja vejegatevilaaktivnih heterolognih(hemi)celulaz
/celulosomskihpodenotvvelikihkoliinah
sposobnostprenosa heterolognihencimovnazunanjostrancelinestene,
vsidranja/pripenjanja
sposobnostvnosain fermentacijeimiregaspektrasladkorjev(C5,C6)
neobutljivostza:
a.)visokekoncentracijeproduktovfermentacije,
b.)snovi,prisotnevnaravnihsubstratihali
vindustrijskihpostopkih(lignin,kisline..)
Teava Potencialnereitve
Heterolognoizraeniproteini
nisopreneseninazunanjo
stranmembrane
Zamenjavasignalnihzaporedijz
gostiteljskimi
Uporabagostiteljskihsevov,kisokolikor
jemogoesorodnidonorskim(PTM)
Razgradnja heterolognih
(hemi)celulazzgostiteljskimi
proteazami
Uporabagostiteljskihsevov,kineizraajo
zunajcelinihproteaz
Toksinost heterolognih
encimovzagostitelja
GojenjepriT
(upoasnjenmetabolizem)
Premajhenizplenproduktov
hidrolizezaradidifuzijev
gojiu
Fuzijagenovzahemicelulazesproteini,ki
sovsidranivcelinestene
(S.cerevisiae aglutinin)
Rekombinantne celulolitine strategije
Iskanje in razvoj uinkovitejih celulaz
Cilj:
pridobiticelulazezizboljanimilastnostmi:
katalize(specifinost,hitrost,zmanjanaobutljivostzainhibitorje)
obstojnostvelenihobmojihT,pH
Pristopi:
1.Proteinskoinenirstvo
2.Usmerjena(pospeena)evolucija
3.Iskanjenovihcelulazve
nepregledanih(meta)genomih
Tokovnemutacije
kljunihAKostankov,
osnova:3Dzgradba
Poljubnosestavljanjeproteinskihmodulov
fuzijeCBM,katalitskihdomen
Poljubnosestavljanjeencimskihkompleksov
celulosomipomeri
1.Racionalno proteinsko inenirstvo
CELULOSOMIPOMERI(DESIGNERCELLULOSOMES)
Himerni skafoldini,veejopoljubensetencimovrazlinihMO.
TRENUTNO:tudijesinergistinih interakcijmedencimi(minicelulosomi)
CILJ:Ustvaritioptimalnodelujoikomplekszadoloennamen
Sladkorji
Butanol,
acteton
Etanol
http://www.weizmann.ac.il/Biological_Chemistry/scientist/Bayer/designer_cellulosome
+nipotrebnorazumevanjestrukturafunkcija
2.Usmerjena (pospeena) evolucija
http://www.rsc.org/chemistryworld/Issues/2004/July/rational.asp
3.Iskanje novih celulaz v e nepregledanih (meta)genomih
FUNKCIONALNA
METAGENOMIKA
2.vaja:
Proizvodnjaindetekcijacelulaz vampne
bakterijeR.flavefaciens
Simulacijapilotnega
eksperimentaznamenom
analizeizraanjacelulaz
R.flavefaciens007Cv
odvisnostiodtipain
koncentracijesubstrata.
Shemaposkusa
Pripravaanaerobnihgoji
M2sCb,Ksil,Avi,
nacepljanje R.flavefaciens
Pripravaagarskih ploz
vklopljenoCMC
Pripravaraztopinza
encimograme
Frakcionacija
Inkubacija
Supernatant
Celice
Presejalnotestiranje
celulazne aktivnosti
encimskihfrakcij
Pripravaencimogramov in
analizaencimskihfrakcij
1.teden
2.teden
Koncentriranje supernatanta:
ULTRAFILTRACIJA
Koncentratorji Amicon (Millipore)
MwCo = 10 kDa
FILTRAT: proteini < 10 kDa
RETENTAT: proteini > 10 kDa
RETENTAT
FILTRAT
DETEKCIJACELULAZNEAKTIVNOSTI
NAAGARSKIHPLOAHZVKLOPLJENIMSUBSTRATOM
inENCIMOGRAMIH
KontrasranjezpH
CMC
Vklapljanjesubstrata(CMC,ksilan,..)vmatriks:
AGARaliPAGEL
BarvanjesKongordeim
RazbarvanjezNaCl+NaOH
NaDS PAGE
RENATURACIJA
SDS PAGE
10 %
NABIJALNI
gel
LOEVALNI
gel
pH in O
2

- polimerizacijo