Estrategias de Secuenciacin

de Genomas
Jos Guillermo Dvila Ramos
Centro de Ciencias Genmicas, UNAM

Secuenciacin del DNA
Principios y Mtodos ms
empleados
Genomas Secuenciados
En aos recientes, se ha logrado la secuenciacin a gran
escala del genoma de organismos eucariotes
Los 5 primeros genomas secuenciados de organismos
pluricelulares son:
1998 Caenorhabditis elegans - 8 x 10
7
pb - un nemtodo
2000 Homo sapiens - 3 x 10
9
pb - el Humano
2000 Arabidopsis thaliana - 1.15 x 10
8
pb- una planta
2000 Drosophila melanogaster - 1.65 x 10
8
pb - la mosca
de la fruta
2002 Anopheles gambiae - 2.78 x 10
8
pb - el mosquito
vector de la malaria
Secuenciacin Tipo Sanger
El mtodo de secuenciacin de Sanger aprovecha la
forma normal de la replicacin del DNA
Para extender la cadena de DNA, usando la DNA
polimerasa, deber estar presente un grupo hidroxilo
en el carbono 3 de la deoxiribosa
Los fragmentos se generan al agregar pequeas
cantidades de 2 3 dideoxinucletidos a la reaccin
lo que interrumpe la polimerizacin cada vez que son
incorporados en la cadena de DNA
La polimerasa usada deber de carecer de la actividad
de la exonucleasa de correccin 3 > 5 para que
funcione el mtodo
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH
2

NH
2

N
N
N
N
Azucar
Base
Fosfato
3
5
2
1 4
Dideoxinucletidos
La secuenciacin de DNA usando
el mtodo de Sanger emplea 23-
dideoxinucletidos trifosfatados
ademas de los normales 2-
deoxinucletido trifosfatado
Ya que los 23-dideoxinucletidos
trifosfato carecen del grupo 3
hidroxilo, y la polimerizacin del
DNA ocurre solo en la direccin 3,
cada vez que un 23-
dideoxinucletido trifosfato es
incorporado la extencin se detiene
H
23-dideoxinucletido
monofosfato
2-deoxinucletido
monofosfato
H
P
O
HO
O
O
CH
2

H OH
P
O
O
HO
O
O
CH
2

H
P
O
OH
HO
O
O
CH
2

NH
2

N
N
N
N
O
O
NH
2

N
NH
N
N
N
O
NH
2

N
Los 23
dideoxi-
nucletidos
terminan
la sntesis
del DNA

O
H
P
O
H O
O
O
CH
2

H O
H
H OH
P
O
OH
O
O
CH
2

OH
H
P
HO
O
O
CH
2

H
O
H
2
O
Secuenciacin de DNA
Plsmido con un
fragmento clonado
de DNA
Sitios de Prmeros
fragmento
Clonado
Prmero
La Reaccin con ddATP
5TTATCG
3AATAGCATGGTACTGATCTTACGCTAT5
5TTATCGTACCATGACTAGATGCGA
5TTATCGTACCA
5TTATCGTACCATGACTA
5TTATCGTA
5TTATCGTACCATGA
5TTATCGTACCATGACTAGATGCGATA
5TTATCGTACCATGACTAGA
Pol.
5TTATCGTA
Ya no
puedes!
Pol.
5TTATCGTACCATGA
Otra
vez!
Pol.
5TTATCGTACCATGACTAGA
No
De nuevo!
Pol.
5TTATCGTACCATGACTAGATGCGATA
A que la!
Separacin de los Fragmentos
Todos los mtodos actuales de
secuenciacin requieren que la
separacin de los fragmentos de
DNA detecten diferencias en longitud
de una base
Esto se logra por una electroforesis
ya sea en geles de poliacrilamida o
en capilares con polmeros lquidos
Separacin de Fragmentos (Sanger)
Los productos de las 4
reacciones, cada una
conteniendo una pequea
cantidad de uno de los
cuatro dideoxinucletidos,
son cargadas en el gel y
sometidas a electroforesis
Como la polimerizacin es
solo en direccin 5 a 3, los
fragmentos ms cortos
estarn en 5 y los ms
largos que se encontrarn
en la direccin 3
ddTTP ddCTP ddGTP ddATP
L
e
c
t
u
r
a

5

a

3

d
e
s
d
e

l
a

b
a
s
a

a
l

t
o
p
e

Applied Biosystems
Applied Biosystems (ABI) ha desarrollado colorantes
fluorescentes ms sensibles, mejorado el mtodo de
cargado de la muestra y la electroforesis
Cuatro colorantes que fluoresen a una longitud de onda
distinta, pero con el mismo impacto en la movilidad
electrofortica, pueden ser usados para marcar ya sea
los prmeros o los nucletidos que terminan la reaccin
Si se usan los dideoxinucletidos fluorados, la reaccin
de secuenciacin completa se realiza en un solo tubo
En lugar de los geles de poliacrilamida, se emplea un
solo capilar con un polmero lquido que se remplaza al
final de cada corrida
3AATAGCATAACGTTAACGTTACGCTAT5
Pol.
Oh come
on!
5TTATCGTACCAC
Pol.
5TTATCGTACCATAATT
Not
Again!
Pol.
Agggg.
5TTATCGTACCATAATTGCA
Secuencia con Terminadores Fluorados
5TTATCG
5TTATCGTATTGCAATTGCA
5TTATCGTATTGCAATT
5TTATCGTA
5TTATCGTATTGCAAT
5TTATCGTATTGCAATTG
5TTATCGTATTGCAA
5TTATCGTATTGCAATTGC
5TTATCGTATTGCA
5TTATCGTAT
5TTATCGTATTG
5TTATCGTATT
5TTATCGTATTGC
Pol.
5TTATCGTA
Let me
Through!
Como la base al
final de cada
fragmento esta
marcada con un
fluorforo nico, la
reaccin total se
puede hacer en un
solo tubo
..
Placa caliente
Pol.
lquido
ATTGC A
Sistema Prisma 310 ABI
Laser
Prisma
Detectores
-
+
Ventana
Reaccin
Secuencia
Capilar
El ABI Prisma 3700
ABI Prism 3700
El Estado del Arte
El ABI Prisma 3730XL, representa la ltima
generacin de equipos de secuenciacin capilar
automtica
El 3730XL puede secuenciar hasta 1,500,000 de bases
diarias
Con esta capacidad el genoma de una bacteria de
5,000,000 de pares de bases, puede ser totalmente
secuenciado en un mes
El desarrollo ms reciente es la piro-secuencia, que
incrementa en un orden de magnitud el nmero de
bases obtenidas por da

Estrategias para la
Secuenciacin de Genomas
Secuenciacin al Azar y
Secuenciacin Jerrquica al
Azar
Mtodo de Secuenciacin al Azar
Fragmentacin
clonacin
Plsmido
Genoteca del genoma
Secuenciacin y alineamiento
de los insertos
ATTCGCTGGCGGT TTGCTGCAAAATTG
CGGTATTGCGCTTGCTGC
Refinamiento
ATTCGCTGGCGGTATTGCGCTTCTGCAAAATTG
Secuencia final
Genoma
Secuenciacin Jerrquica al Azar
1. Fragmentacin
2. Clonacin
BAC
Genoteca de BACs
Genoma
3. Secuencia de los bordes de los insertos
de los BACs y alineamiento para crear
un mapa de CONTIGS
4. Secuenciacin y alineamiento
de los insertos de cada BAC
ATTCGCTGGCGGT TTGCTGCAAAATTG
CGGTATTGCGCTTGCTGC
Refinamiento
ATTCGCTGGCGGTATTGCGCTTCTGCAAAATTG
Secuencia final
NH
4
+
H
2
O
CO
2
H
2
O
N
2
ndulo
O
2
O
2
Rizsfera
N
2
suelo
f
e
d

c
a
b
Cromosoma
circular
Plsmidos
= plsmido
simbitico

El Genoma de Rhizobium etli
El primer genoma completo hecho en Mxico