MTODO DE PATCH-CLAMP

Es una tcnica electrofisiolgica para medir corriente elctrica que pasa a

travs de la membrana en un canal sencillo en clulas.
La tcnica de patch clamp (desarrollada por Nher y Sakmann) usa un
micropipeta de vidrio de dimetro suave con una abertura de aproximadamente
1um. La eficiencia de esta tcnica requiere que la membrana est libre, es decir,
separada de otras clulas, libre de tejido conjuntivo, de restos celulares, etc, para
que de esta forma, la pipeta se pueda adherir de una manera eficiente a la
membrana celular.
Las pipetas son preparadas a partir de capilares de vidrio de borosilicato y
confeccionadas a travs de un puller, el cual es programado para dividir el capilar
en dos, generando as en el sector de la divisin, finsimas puntas, las que ms
tarde sern refinadas con calor para suavizar el contorno, lo que tambin permitir
una mejor adhesin del vidrio a la membrana.
Esto contrasta con microelectrodos ntidos que se usan con frecuencia en
otras tcnicas electrofisiolgicas. La pipeta se llena con una solucin que depende
del estudio especfico o la tcnica de patch clamp usada. Un electrodo de metal en
contacto con esta solucin conduce cambios elctricos a un amplificador de
voltaje. Este est presionado contra la membrana celular y se aplica succin para
absorber la membrana dentro de la pipeta con el elctrodo para formar un sello
elctricamente apretado de giga-ohm. En el patch clamp un solo electrodo se
usa para hacer el patch clamp de la membrana celular habilitando el mantener el
voltaje en un nivel constante mientras que se graban los cambios de corriente. En
forma similar, la corriente en la clula puede ser anclada a la corriente y grabar los
cambios de voltaje. Hay algunas variantes de la tcnica de patch clamp que se
pueden realizar incluyendo, por ejemplo:
Patch Clamp Planar: en lugar de pipetas de vidrio, se usa una superficie
plana puncionada con pequeos hoyos.

Patch cell Attached (Clula-pegada): el electrodo
se mantiene sellado a la membrana celular
mientras que la solucin en la pipeta se altera (por
ejemplo, por la adicin de drogas) y se graba la
actividad de los cambios resultantes.
Presionando la pipeta de Patch sobre la superficie limpia
de una clula se le aplica una succin suave, pudiendo lograr de esta manera un
sello en el orden de los 6. En estas condiciones se pueden aplicar diferentes
estmulos a la fraccin de membrana desde el interior de la pipeta y medir las
respuestas de los canales aislados.

Patch inside out (De adentro hacia fuera): Donde
el rea succionada de la membrana se
desprende de la clula y se expone a la superficie
intracelular de la membrana la que en cambio se
puede exponer a varios medios conteniendo, por
ejemplo, varios ligantes intracelulares.
Una vez establecido el sello, en vez de aplicar estmulos
inmediatamente se puede separar la fraccin de membrana sellada y exponer la
abertura inferior de los canales.

Patch whole cell (De clula completa): Donde se
incrementa la succin rompe la membrana y brinda
acceso del electrodo al ambiente intracelular por un
periodo de tiempo corto, el ambiente intracelular es
diluido por los contenidos de la pipeta.
Se rompe la fraccin de membrana sin destruir el sello
para exponer de esta manera el interior de la clula o del organelo.

Existe otra configuracin llamada Outside Out (Del exterior hacia afuera) que es
equivalente a la clula completa en el sentido de que el interior de la membrana
queda expuesto al contenido en la pipeta y el exterior de la misma es expuesta al
medio exterior.
Las diferentes configuraciones del patch clamp, faculta al investigador a:
Estudiar los canales inicos en diferentes niveles, por ejemplo, se puede
tanto utilizar la tcnica de whole cell (clula completa) para analizar la
actividad de todos los canales de la clula como realizar registros de canal
nico.
Manipular fcilmente la composicin tanto del medio extracelular como del
intracelular durante un registro.
Dentro de sus aplicaciones la tcnica es usada para estudiar clulas
excitables, por ejemplo, aquellas que producen una pequea corriente elctrica
cuando se estimulan. Estas incluyen principalmente clulas nerviosas y fibras
musculares.




CONFIGURACIN DEL MICROSCOPIO:
Cualquier aplicacin de electrofisiologa incluyendo el patch clamp coloca
una gran demanda en la configuracin del microscopio en trminos de estabilidad,
supresin de vibracin, aislamiento de interferencia elctrica, espacio para
manipuladores y acceso al espcimen. La estacin de trabajo de fisiologa FN1 de
Nikon, ha sido diseada especialmente para cubrir las demandas de
electrofisiologa con manipulacin eficiente y un ruido mnimo.
En el diseo del FN1, Nikon ha minimizado el ruido elctrico usando
iluminacin de fibra para llevar luz al sistema desde fuera de la jaula y conectando
pines a tierra en todas las partes principales del microscopio. La vibracin se
minimiza con la rgida construccin y se reduce el temblor cuando se gira el porta-
objetivos y aumentos. La forma simple y delgada con forma de I en el cuerpo
brinda ms espacio de trabajo y un mejor acceso alrededor del microscopio para
posicionar los manipuladores y otros perifricos. El condensador, sub-platina y
torreta se pueden remover por completo del cuerpo del FN1 para obtener ms
espacio libre, dependiendo del experimento. Adems, la altura de la platina fija
puede cambiarse fcil y rpidamente por el usuario. Los objetivos de inmersin en
agua estn aislado de la transmisin elctrica y trmica. El objetivo 16x tiene un
amplio ngulo de aproximacin de 45 y una distancia de trabajo de 3.0mm para
un acceso fcil y una observacin mejorada. La combinacin del objetivo 16x (con
gran A. N.) en combinacin con un cambiador de aumentos intermedio permite a
los usuarios realizar experimentos de patch clamp sin cambiar el objetivo. El FN1
puede ser usado en combinacin con el sistema confocal C1. Con el eje z
motorizado (opcional) y el software mejorado del C1, los usuarios pueden realizar
anlisis de imgenes, reconstruccin 3D de rebanadas, y puede obtener imgenes
3D y datos electrofisiologa alternativos desde el mismo espcimen. Los usuarios
pueden cambiar rpidamente entre la iluminacin IR y DIC-IR para asegurar el
reconocimiento preciso de las micro aguja y mejorar el contraste flexible. El
microscopio tambin permite a los usuarios selecciona la longitud de onda IR
especfica para cada tipo de espcimen:
700-750nm para imgenes de alto contraste de especimenes delgados con
estructuras finas.
800-900nm para imgenes de alto contraste de especimenes gruesos con
estructuras profundas.
Oblicua IR descentrada que brinda contraste flexible desde varios ngulos.
La fijacin suelta de membrana se diferencia ya que usa un sello suelto en
lugar de un gigacello hermtico usando en la tcnica convencional .Una ventaja
del sello suelto es que la pipeta que se usa puede ser movida repetitivamente de
la membrana luego de la grabacin y aun as la membrana permanecer intacta.
Este mtodo permite repetir mediciones en varios lugares de la clula sin destruir
la integridad de la membrana. Por otro lado un gran desventaja es que la
resistencia entre la pipeta y la membrana es reducida grandemente, permitiendo a
la corriente filtrase a travs del sello. Este filtrado puede ser corregido, pero de
todos modos este mtodo ofrece la oportunidad de comparar y constatar
grabaciones hechas desde diferentes reas en la clula de inters.

FOSFATO DE PIRIDOXAL.

La caracterstica definitiva de la catlisis por la transaminasa es la
participacin coenzimtica del fosfato de piridoxal, llamado en ocasiones coenzima
de los aminocidos. Aunque el tema es por ahora su papel en las reacciones de
transaminacin, esta coenzima tambin participa en otros tipos de
transformaciones de aminocidos, como la descarboxilacin y la racemizacin (L-
aminocido D-aminocido).
El fosfato de piridoxal representa la forma metablicamente activa de la
vitamina B6 llamada piridoxal, que es una piridina sustituida. La oxidacin de un
grupo hidroximetlico (-CH2OH) a un grupo aldehdo, y la fosforilacin del segundo,
producen fosfato de piridoxal.
El sitio activo del fosfato de piridoxal reside en el grupo aldehdo, el cual
puede reaccionar con los grupos amino libres (por ejemplo, en aminocidos) para
formar un enlace imnico bsico de Schiff (C=N-). De hecho, antes de reaccionar
con un aminocido, el fosfato de piridoxal se une de modo covalente a la enzima
mediante ese nico enlace, alterando el grupo -amino de un residuo de lisina en
la cadena polipetdica. La primera fase de una reaccin implica la formacin del
derivado aldehdico del fosfato de piridoxal (PirP), el cual reacciona luego con el
grupo amnico del sustrato del aminocido para formar una nueva base de Schiff
entre la coenzima y este sustrato.
Sea una transaminacin, una descarboxilacin o una racemizacin, el
destino subsecuente del complejo ternario durante el resto de la reaccin es
controlado por la especificidad cataltica del sitio activo de la enzima. Los
fenmenos que describen a la transaminasa se esquematizarn ms adelante. El
mecanismo propuesto consta de dos fases. Primero, el aminocido (sustrato 1) se
convierte en un -cetocido por reordenamiento del enlace imnico, a lo que sigue
una hidrlisis para formar el -cetocido (producto 1). Ntese que el grupo amino
permanece con el conjugado enzima-coenzima como fosfato de piridoxamina. La
segunda fase (justo el inverso de la primera) comienza con la formacin de una
base de Schiff a partir del -cetocido aceptor (sustrato 2); luego se forma el
aminocido correspondiente (producto 2). La reaccin es un ejemplo de
mecanismo tipo ping pong.

REFERENCIAS. Bioqumica, las bases moleculares de la estructura y funcin
celular. Albert L. Lehninger. Ediciones Omega Barcelona. 2da edicin.





REFERENCIAS.

Tesis: Canales inicos y fotocorrientes en plantas vasculares. Universidad
de Colima. Sandoval lvarez Leandro. Centro universitario de
investigacions Biomdicas. Pag. 26-30.

Patch Clamp. Recuperado de:
http://www.tecnicaenlaboratorios.com/Nikon/Info_patch_clamp.htm


La tcnica de Patch Clamp. Recuperado de:
http://acercandolabiofisica.blogspot.mx/2009/10/la-tecnica-del-patch-
clamp.html