Gio trnh Cng ngh Di truyn

PGS TS Trn Nhn Dng

CHNG 3
K THUT PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)
3.1. GII THIU
PCR l ch vit t!t c"# c$% t& Poly%'r#(' Ch#in R'#ction )Ph*n +ng chu,i tr-ng h./ 0
/h*n +ng 1huch 23i g'n45 6y l 17 thu8t c"# (inh h9c /hn t: cho /h;/ nhn <*n %=t 2o3n
DN> %ong %u?n t& h g'n DN> c"# c@ thA (inh v8t thnh nhiu <*n (#oB 17 thu8t ny 2C.c
nh 1ho# h9c ngCDi E7 0 F#ry Eulli( v c=ng (G /ht %inh nH% IJKL t3i cng ty C'tu(M
%Nc O- nguyPn t!c ny 2Q 2C.c % t* chi tit trCRc 2S %=t th8/ niPn <Ti Fhor#n# et alB
)Fl'//' et alB IJUIM P#n't et alB IJUV4B v 2C.c giRi thiu ln 2u tiPn t3i W=i th*o ln th+ LI
T ColO S/ring W#r<or vo nH% IJKX v ng 2Q nh8n 2C.c gi*i thCTng No<'l Wo (inh h9c
vo nH% IJJY5 FA t& 2S 2Q t3o nPn %=t tc 2=ng to lRn 2?i vRi cc nghiPn c+u v (inh h9c
trPn ton th giRi5
3.2. NGUYN L
3.2.1. N!"#$% &' %()% !*% +,-%! +. /0-1
DN> l v8t chZt Oi truyn c"# c@ thA (?ng [uy 2\nh lPn 2Nc t]nh c"# c@ thA )ngo3i tr&
%=t (? lo3i viru( cS v8t chZt Oi truyn l RN>45 6?i vRi nhng (inh v8t cS cZu tr^c t <o
nhn chu_nB cc /hn t: DN> t`n t3i OCRi O3ng 1t h./ vRi /rot'in thnh cc nhia% (!c thA
trong nhn t <o5 Ngoi r#B t3i cc c@ [u#n t: nhC ty thA v l3/ thA )T thGc v8t4B /l#(%iO
cng ch+# DN>5
Cc /hn t: DN> T nhng t <o ho3t 2=ng <nh thCDng chb 2C.c nhn lPn trong [u
trnh /hn <o nguyPn nhia%5 6A thGc hin 2C.c [u trnh nyB 2ci hdi /h*i cS %Nt 'ney%'
tfng h./ DN> /oly%'r#('B (G th#% gi# c"# cc 2o3n %`i cS trnh tG <f (ung g!n vo vo
(.i DN> 1hun v cc ONTP )D'ogyri<onucl'otiO' Tri/ho(/h#t'4 l% ngu`n cung cZ/
nucl'otiO'5 Trong [u trnh /hn <o nguyPn nhia%B cc (.i DN> 1;/ 2C.c %T go!n tch
thnh cc (.i DN> (.i 2@n5 DCRi tc O$ng c"# 'ney%' DN> /oly%'r#('B [u trnh tfng h./
DN> 2C.c g*y r# th'o cch g!n ln lC.t cc nucl'otiO' vo 2o3n %`i 2A 1;o Oi chu,i th'o
nguyPn t!c <f (ung vRi DN> 1hun5
3.2.2. N!"#$% &' 234 56 +("7+ PCR
F7 thu8t tfng h./ DN> ngoi c@ thA cng tun th" nhng nguyPn t!c c@ <*n c"# (#o
ch;/ DN> trong c@ thA nhCng cS (G 1hc <ith
IY
Gio trnh Cng ngh Di truyn
PGS TS Trn Nhn Dng

i D-ng nhit 2= c#o tho go!n th#y cho 'ney%' h'lic#('5
i Ft h./ vRi 'ney%' DN> /oly%'r#(' ch\u nhit 2A tfng h./ DN> %Ri trong %i
trCDng th]ch h./5
i W th?ng 2iu nhit th]ch h./ c-ng vRi cc 2o3n %`i 2C.c thit 1 chuyPn <itB ch"
2=ng5
PhC@ng /h/ PCR cho /h;/ tfng h./ rZt nh#nh v ch]nh gc t&ng 2o3n DN> riPng
<it5 jy thGc (G l /hC@ng /h/ hin 23i v thu8n tin cho vic gc 2\nh (G cS %Nt c"# %=t
g'n no 2S trong t <o vRi 2= ch]nh gc c#o5
PhC@ng /h/ ny OG# trPn (G 1h% /h ho3t t]nh (inh h9c T nhit 2= c#o c"# 'ney%'
tfng h./ DN> /oly%'r#(' 2C.c t% thZy trong cc vi 1hu_n Thermus aquaticus C# nhit )vi
1hu_n (?ng trong cc (u?i nCRc nSng45 Phn lRn cc DN> /oly%'r#(' chb l% vic T nhit
2= thZ/5 NhCng T nhit 2= thZ/B DN> go!n chNt v v8y DN> /oly%'r#(' 1hng cS nhiu 1h*
nHng l% <in t]nh /hn lRn cc /hn c"# /hn t:5 NhCng cc /oly%'r#(' ch\u nhit ny
ho3t 2=ng T nhit 2= rZt c#oB cS thA lPn 2n Ikk
k
C5 l nhit 2= ny DN> (m <\ <in t]nh )DN>
O3ng go!n (m Ou,i r# v T O3ng thnng45
E=t /h*n +ng PCR l %=t chu,i nhiu chu 1o n?i ti/ nh#uB %,i chu 1o g`% <# gi#i
2o3nh gi#i 2o3n <in t]nhB gi#i 2o3n <!t cN/B gi#i 2o3n 1;o Oi5
3.3. M8Y PCR
3.3.1. M9# PCR 2: ;<=% (C-%>*%+<%4& PCR ?42(<%*)
TrCRc 2yB 1hi chC# cS %y chu 1o nhitB 2A thGc hin 2C.c /h*n +ng PCR cc nh
1ho# h9c gN/ p trT ng3i lRnh
i q^c 2u 'ney%' Fl'nor /oly%'r#(' 2C.c (: O$ng <\ /hn h"y T JL
k
C nPn /h*i
thP% 'ney%' vo ?ng nghi% (#u %,i chu 1o T gi#i 2o3n /hn tch chu,i DN>5
i 6A th#y 2fi chu 1o nhit cc nh 1ho# h9c /h*i (: O$ng Y r#t'r <#th( T Y nhit 2=
1hc nh#u5 Fhi 2% v th#y 2fi Yk 2n YL chu 1o nhit 1h /hin /h+cB Oa gy (#i (St5
sic t% r# 'ney%' Taq /oly%'r#(' v %y PCR tG 2=ng th#y 2fi cc chu 1o nhit 2Q
l% cho 17 thu8t ny /ht triAn nh#nh v 2C.c +ng O$ng r=ng rQi trong nhiu ltnh vGc nghiPn
c+u5
IV
Gio trnh Cng ngh Di truyn
PGS TS Trn Nhn Dng

3.3.2. M@+ 292( +:%! A"9+B ?9# PCR !C? 292 /@ D(7% 2(E%( %(F G4" 1
i E=t <n /h]% 2@n gi*n 2A l8/ cc chC@ng trnh chu 1o nhit v r# cc %nh lnh 2A
%y thGc hin5
i E=t <= vi g: lu 2A ghi nhR cc chC@ng trnh 2Q n3/ vo %yB thGc hin cc %nh
lnh cng nhC ghi nh8n cch th#y 2fi nhit 2= <u`ng " PCR trong cc chu 1o nhit 2A 2iu
chbnh cho 2^ng vRi chC@ng trnh 2#ng 2C.c thGc hin5
vu`ng " PCR l n@i % cc chu 1o nhit 2C.c thGc hin [u# (G 2iu 1hiAn c"# <= vi g:
lu5 Trong cc chu 1o nhitB nhit 2= trong <u`ng " PCR cS thA 2C# lPn c#o h#y h3 gu?ng thZ/
trong %=t thDi gi#n rZt ng!n5 jA l% th#y 2fi 2C.c nhit 2= trong <u`ng " PCRB cS h#i
/hC@ng /h/ h
)I4 qiPn t$c thfi lPn <u`ng " nhng lu`ng 1h] nSng (inh r# t& %=t 2wn /ht nhitB h#y
lu`ng 1h] l3nh (inh r# t& %=t h th?ng c"# %y l% l3nh5 sRi /hC@ng /h/ nyB %y lun
nhit hQy ccn tC@ng 2?i c`ng 1nhB 1h 2!t tin v 1hi %y ho3t 2=ng % th#nh cng 1h `n
o5
)p4 PhC@ng /h/ th+ h#i ho3t 2=ng OG# th'o hiu [u* P'lti'r ngC.c5 Wiu [u* P'lti'r l
nguyPn t!c c"# cc %y 2o nhit 2= 2in t:h Fhi / h#i %Qnh 1i% lo3i vo nh#u v 1hi cS (G
cch <it nhit 2= gi# h#i %Qnh 1i% lo3i th (m (inh r# %=t Ocng 2in v ch]nh (G lCu thng
c"# Ocng 2in ny 1hi 2o lCDng (m /h*n nh (G cch <it nhit 2= gi# h#i %Qnh 1i% lo3i5
Wiu [u* P'lti'r ngC.c l3i v8n hnh th'o 1iAu ngC.c l3iB nght# l 1hi t3o r# %=t Ocng 2in
gi# h#i %Qnh 1i% lo3i th (m t3o r# 2C.c %=t (G cch <it nhit 2= gi# h#i %Qnhh <Pn ny
nSngB <Pn 1i# l3nh5 Fhi th#y 2fi chiu Ocng 2in th nhit 2= c"# h#i %Qnh cng th#y 2fi
ngC.c l3ih <Pn ny l3nhB <Pn 1i# nSng5 Cc %y chu 1o nhit hin n#y 2u 2C.c ch t3o OG#
th'o /hC@ng /h/ th+ h#i nyB nhD v8y % %y trT nPn rZt g9n nhxB gi thnh rm h@n gZ/
nhiu ln (o vRi trCRc 2y5
3.H. CHUIN JK MLU MNA
Eyu DN> c"# 2?i tC.ng cn nghiPn c+u 2C.c ly tr]ch v tinh (3chB (#u 2S tr %yu T 0
pk
k
C )Ph$ l$c I45
3.N. THIOT KO MPI
0 E`i l nhng 2o3n oligonucl'otiO' )IK0pV <#('4 <f (ung vRi trnh tG trPn DN>B g`%
cS %`i gui v %`i ngC.c
IL
Gio trnh Cng ngh Di truyn
PGS TS Trn Nhn Dng

E`i gui )('n(' /ri%'r hoNc zorr#rO4 <!t cN/ vRi %3ch 1hun c"# DN> v (m
1;o Oi th'o chiu /hiPn %Q5
E`i ngC.c )#nti ('n(' /ri%'r hoNc R'v'r('4 <!t cN/ vRi %3ch %Q c"# DN> v
(m 1;o Oi ngC.c th'o chiu /hiPn %Q5
+ Trnh tG c"# %`i 2C.c thit 1 (#o cho 1hng cS (G <!t cN/ gi# %`i gui v
%`i ngC.cB 1A c* cZu tr^c 1x/ tSc
+ Nhit 2= g!n %`i c"# %`i gui v %`i ngC.c 1hng 2C.c chPnh lch [u g#
)Fhng nPn [u nhiu G hoNc C n?i ti/ nh#uB thCDng t{ l GB C n|% trong 1ho*ng
Yk}~ GiC~Uk}
+ E`i /h*i <*o 2*% 2" Oi 2A <!t cN/ ch]nh gc5
+ Cc %`i 2C.c ch9n /h*i 2Nc trCng cho trnh tG DN> cn 1huch 23i 1hng
tr-ng vRi cc trnh tG lN/ l3i trPn DN>B %=t %`i chb <% vo %=t v\ tr] nhZt 2\nh trPn
g'n5
+ Trnh tG n|% gi# %`i gui v %`i ngC.c 1hng [u lRn )~Ykkk nu
t?t nhZt l OCRi Ikkk nu4
HQ%( 3. 11 SR (Q%( +(0%( %S+ 20< +T2 U- ?C< 2(V4 +,Q%( +R ;W< XV%! /72 (4<
HQ%( 3. 21 SR /: G"%! !<Y4 (4< ?C< +Z- %$% D,<?*, U<?*,
Cch tnh nhit bt mi:
0 6?i vRi %`i pk nucl'otiO' th nhit 2= g!n %`i 2C.c t]nh nhC (#uh
T% p)>iT4 i V )GiC4
s] O$B 2o3n %`i C>GC>>>T>TCTGTCCTT>C th nhit 2= g!n %`ih
IX
Gio trnh Cng ngh Di truyn
PGS TS Trn Nhn Dng

T% p)XiX4 i V)piX4 LX
k
C
0 6?i vRi %`i pk nucl'otiO' th nhit 2= g!n %`i 2C.c t]nh th'o cng th+ch
T% pp i I5VX p)G i C4 i )> i T4
k
C
3.[. \I]U KIN PH^N _NG PCR
jA th: nghi% PCR cS thA ch3y 2C.cB cn /h*i cS 2y 2" cc thnh /hn (#u 2yh
3.[.1. NF`2
NCRc (: O$ng cho /h*n +ng PCR /h*i th8t tinh 1hitB 1hng ch+# ion noB 1hng ch+#
DN>#('B RN>#('B 'ney%' c!t giRi h3n555NSi cch 1hc l 1hng ch+# <Zt 1o %=t thnh
/hn no 1hc5
3.[. 2. M"%! Ua2( ;b? (/"cc*,) 2(- D(d% V%! PCR
Dung O\ch 2% cho PCR l %=t trong nhng yu t? [u#n tr9ng *nh hCTng 2n chZt
lC.ng /h*n +ng PCR5
Thnh /hn Oung O\ch 2% c"# /h*n +ng PCR thCDng /h$ thu=c vo lo3i 'ney%' DN>
/oly%'r#(' (: O$ng trong PCRB thCDng ch+# %u?i 2% Tri( WCl Ik %EB FCl Lk%E v EgCl
p
I5L%E5 Ngoi r# Oung O\ch 2% PCR ccn cS thA ch+# k5kkI} vS> h#y G'l#tin' v trong %=t
(? /h*n +ng PCR ccn cS thA thP% tr''n h#y or%#%iO'5 Trong cc thnh /hn trPnB *nh
hCTng 2n PCR nhiu nhZt l n`ng 2= EgCl
p
B v v8y 2A cS 2C.c %=t th: nghi% PCR cS 2=
nh3y c#oB /h*n +ng r n;tB ngCDi t# /h*i t?i Cu hS# /h*n +ng <|ng cch thH% Oc %=t n`ng 2=
EgCl
p
th]ch h./ nhZt5
N`ng 2= EgCl
p
cS thA O#o 2=ng t& k5L0L %E5 Ch]nh ion Eg
pi
g!n liPn 1t ONTP vRi
DN> /oly%'r#('B tHng 1h* nHng <% n?i c"# %`i5 N`ng 2= EgCl
p
c#o (m t3o nhiu (*n
/h_% 1hng 2Nc hiuB n`ng 2= EgCl
p
[u thZ/ (m 1hng t3o (*n /h_% PCR5
3.[.3. UNTP (U*-X# %"2&*-G<U* +,<D(-GD(4+*)
D'ogy nucl'o(iO' tri/ho(/h#t' t+c l 2@n v\ 2A cS thA tfng h./ 2C.c cc <*n (#o c"# DN>
2]ch5 ONTP cS cZu t3o g`% %=t 2CDng O'ogyri<o(' cS g!n %=t <#('B cS thA l >O'nin' )O>TP4
h#y Thy%in' )OTTP4 h#y Cyto(in' )OCTP4 h#y Gu#nin' )OGTP4 B T c#r<on' (? I )CI45 v# /hn
t: /ho(/h#t' )tri/ho(/h#t'4 2C.c g!n t3i c#r<on' (? L )CL4 c"# /hn t: O'ogyri<o(' ny v 2y
ch]nh l n@i % ONTP g!n vo 2u Y c"# chu,i <f (ung trPn chu,i DN> 2]ch5 NHng lC.ng 2A
cho /h*n +ng ny g*y r# 2C.c lZy t& cc n?i /ho(/h#t' giu nHng lC.ng c"# tri/ho(/h#t' trPn
IU
Gio trnh Cng ngh Di truyn
PGS TS Trn Nhn Dng

ONTP5 jS cng ch]nh l lu Oo t3i (#o /h*i l ONTP ch+ng 1hng /h*i l ONDP )Oi/ho(/h#t'4
h#y ONEP )%ono/ho(/h#t'45

3.[.H. MC< (D,<?*,)
E`i l nhng 2o3n DN> (.i 2@n ng!n v cn thit cho vic g^c tin /h*n +ng Oy
chuyn tfng h./ DN>5 Ch^ng nh8n r# /hn DN> cn 2C.c nhn lPnB <!t cN/ <f (ung vRi
%=t 2u c"# DN> %yu v t3o r# v\ tr] <!t 2u ti <*n5 Cc %`i ny cS chiu ngC.c nh#uB <#o
g`% %=t %`i gui )orr#rO /ri%'r4 v %=t %`i ngC.c )r'v'r(' /ri%'r45
E`i l yu t? [u#n tr9ng nhZt c"# /h*n +ng PCRB [uyt 2\nh t]nh 2Nc hiu c"# /h*n
+ng5 Trong th: nghi% PCRB 2o3n %`i cS h#i v#i trc ch]nh h )I4 uyt 2\nh nPn t]nh 2Nc hiu
c"# th: nghi%B v nu 2o3n %`i 2C.c ch9n cng 2Nc hiu cho chu,i 2]chB nght# l chb cS thA
<!t cN/ trPn chu,i 2]ch % 1hng thA <!t cN/ 2C.c trPn cc chu,i DN> 1hc ngoi chu,i
2]chB th (*n /h_% PCR cng 2Nc hiu v th: nghi% PCR cng 2Nc hiu5 )p4 FhTi 2=ng %'n
/oly%'r#(' v %'n /oly%'r#(' chb cS thA <!t 2u tfng h./ (.i <f (ung cho chu,i DN> 2]ch
%=t 1hi nS nh8n O3ng 2C.c 2u Y )l 2u % nS g^c tc cho %=t ONTP 2C.c g!n vo4 2#ng
T tnh tr3ng (.i 2i
3.[.N. E%e#?* MNA Taq D-&#?*,4G* (Taq)
q 'ney%' g^c tc cho [u trnh l!/ r/ cc nucl'otiO' >B TB GB C vo %3ch DN> %Ri
tfng h./B nPn 'ney%' (: O$ng /h*i l 'ney%' /oly%'r#(' ch\u 2C.c nhit 2= c#o5
so th8/ niPn IJXkB nh si (inh v8t h9c Tho%#( vroc1 2Q 2n cng viPn u?c gi#
'llor(ton' )v#ng yo%ingB E74 2A nghiPn c+u cc vi (inh v8t C# nhit (?ng trong (u?i
nCRc nSng Kk0Jk
k
C5 ng 2Q /ht hin %=t loi vi 1hu_n /ht triAn %3nh T nhit 2= c#oB cS
IK
Gio trnh Cng ngh Di truyn
PGS TS Trn Nhn Dng

tPn l Thermus aquaticus5 W#i %C@i nH% (#uB cc nh 1ho# h9c c"# t8/ 2on C'tu( )T8/
2on Cng ngh Sinh h9c C#liorni#4 2Q nh8n thZy r|ng DN> /oly%'r#(' t& Thermus
aquaticus )Taq0/oly%'r#('4 cS 1h* nHng gi*i [uyt vZn 2 c"# 'ney%' <in t]nh (#u %,i chu
1o5 DN> /oly%'r#(' ch\u nhit (: O$ng cho /h*n +ng PCR ln 2u tiPn 2C.c <n trPn th\
trCDng l Taq0/oly%'r#('5 T& 2S 2n n#yB %=t (? vi (inh v8t ch\u nhit 1hc 2Q 2C.c 1h%
/h v ngCDi t# 2Q tch chit thP% 2C.c cc DN> /oly%'r#(' ch\u nhit 2A (: O$ng cho
/h*n +ng PCR nhC Vent0 /oly%'r#(' )Tli0/oly%'r#('4B Pfu0 /oly%'r#('B rTth555
Do 17 thu8t DN> ti tf h./ /ht triAnB t& th8/ niPn IJJkB g'n tfng h./ Taq DN>
/oly%'r#(' cS thA 2C.c g!n vo nhiu Ocng Escherichia coli, nhng E coli %Ri cS thA (*n
(inh Taq /oly%'r#(' nHng (uZt c#o h@n nHng (uZt tr]ch 'ney%' t& T aquaticus nhiu ln5
3.[.[. MNA 5("f% (MNA +*?D&4+*)
DN> t'%/l#t' l %yu DN> % ch^ng t# (m 1huch 23i5 CS thA l DN> 1;/B 2@nB hoNc
RN> 2C.c tch chit t& cc 2?i tC.ng nghiPn c+u5 DN> 1hun cS 2= nguyPn vxn c#o trnh
lyn t3/ chZt5
3.g. CHU Kh NHIT
3.g.1. C(" 5i !<4 %(<b+ 2j /d%1
CS Y gi#i 2o3n ch]nh trong /h*n +ng PCR v ch^ng 2C.c lN/ 2i lN/ l3i nhiu ln )chu
1o4 )thCDng t& pL 2n UL chu 1o45
G<4< ;-Z% /<.% +E%( )O'n#tur#tion4h tch chu,i DN> t& (.i 2i tch thnh p (.i 2@n5
Nhit 2= tHng lPn JV0JXC 2A tch h#i (.i DN> r#5 vCRc ny g9i l <in t]nhB nhit 2= tHng lPn
(m /h v cu n?i hyOrog'n c"# chu,i DN>5 TrCRc chu 1o IB DN> thCDng 2C.c <in t]nh 2n
thDi gi#n %T chu,i 2A 2*% <*o %yu DN> v %`i 2C.c /hn tch hon ton v chb ccn O3ng
(.i 2@n5 ThDi gi#n T gi#i 2o3n ny 1ho*ng h I0p /h^t5
k G<4< ;-Z% /l+ 2mD )#nn'#ling4h g!n cN/ %`i 2Nc trCng th'o nguyPn t!c <f (ung5 S#u
1hi p (.i DN> tch r#B nhit 2= 2C.c h3 gu?ng 2A %`i cS thA g!n vo (.i DN> 2@n5 Nhit 2=
gi#i 2o3n ny /h$ thu=c vo 2o3n %`i v thCDng thZ/ h@n nhit 2= <in t]nh 1ho*ng VL0
XkC5 S: O$ng (#i nhit 2= trong gi#i 2o3n ny Oyn 2n vic 2o3n %`i 1hng g!n hon ton
vo DN> %yuB h#y g!n %=t cch t-y tin5 ThDi gi#n <!t cN/ t& I0p/h^t5
G<4< ;-Z% 5n- U0< )'gt'n(ion4h tfng h./ chu,i DN> %Ri gi?ng chu,i DN> g?c5
DN> /oly%'r#(' g!n ti/ vo (.i tr?ng5 NS <!t 2u <% vo v ho3t 2=ng O9c th'o (.i
IJ
Gio trnh Cng ngh Di truyn
PGS TS Trn Nhn Dng

DN>5 Nhit 2= 1;o Oi /h$ thu=c DN>0/oly%'r#('5 ThDi gi#n c"# <CRc ny /h$ thu=c vo
c* DN>0/oly%'r#(' v chiu Oi %*nh DN> cn 1huch 23i5 NhC %=t [uy t!c Ikkk</ I
/h^t 5
Cc 2o3n DN> %Ri 2C.c hnh thnh l3i 2C.c (: l% 1hun 2A tfng h./ cho cc chu 1o
ti/ th'o5
NhC v8y (? lC.ng <*n (#o (m tHng gZ/ p (#u %,i chu 1o v (#u n chu 1oB t]nh th'o lu
thuyt (? lC.ng <*n (#o l p
n0I
N h i e t o
T h i g i a n
J L C
k
J V C
k
X p C
k
U p C
k
U p C
k
V C
k
L I
V L
p U
3 5 c h u k y
HQ%( 3. 3 . C(" 5i %(<b+ D(d% V%! PCR 5(".2( ;Z< ?@+ ;-Z% !*%* STS
3.g.2. C92 +E%( %o%! 5(92
TE%( %o%! T-"2(M-p%
0 q 2Nc 2iA% cho /h;/ tG 2=ng tHng h#y gi*% nhit 2=B 2C.c (: O$ng ch]nh trong vic
l% gi*% (G *nh hCTng c"# /ri%'r0Oi%'r <|ng cch gi*% nhit 2= <!t %`i tron! cc ln lN/
l3i <#n 2u c"# chu trnh nhit5 T]nh nHng ny 2C.c (: O$ng trong 17 thu8t >zqP5
HQ%( 3. H. M@+ 2(" 5i AqLP 9D Ur%! +-"2( U-p% PCR1 s 13 2(" 5i ;t"B %(<b+ ;@ /l+ 2mD 2(" 5i 1 &0
[HBN
-
CB %(<b+ ;@ /l+ 2mD 2(" 5i 13 &0 N1B3
-
C. C(" 5i ;t" +<$% 234 2N 2(" 5i G4" &0 Nu
o
C :% ;a%( G"W+ 2N
2(" 5i.
TE%( %o%! !,4U<*%+
pk
Gio trnh Cng ngh Di truyn
PGS TS Trn Nhn Dng

0 Cng ngh gr#Oi'nt nhit cho /h;/ ci 2Nt nhit 2= 1hc nh#u !i"a cc hng hoNc cc
ging /h*n +ng trPn c-ng <loc1 nhit5 T]nh nHng ny gi^/ ngCDi (: O$ng cS thA tin hnh
th: nghi% nhiu nhit 2= <!t cN/ 1hc nh#u trong c-ng %=t ln ch3y %yB t?i Cu /h*n +ng
PCR chb 1huch 23i nhng <Hng chuyPn <it )thCDng l tHng nhit 2= <!t cN/ lPn 2A gi*% (?
/hn 2o3n 1hng 2Nc trCng4
3. v. PCR Tw (NESTEM PCR)
F7 thu8t PCR tf (: O$ng p cN/ %`i th#y v I cN/ %`i nhC 17 thu8t PCR cf 2iAn5 CN/ %`i
th+ h#i n|% gi# cN/ %`i th+ nhZt5 F7 thu8t PCR tf ccn g9i l 17 thu8t PCR p <CRc5 F7 thu8t
ny cS nhiu 2o3n (*n /h_% DN> h@n l 17 thu8t PCR cf 2iAnB (? 2o3n DN> 2C.c /ht hin
nSi lPn t]nh 2\nh lC.ng tC@ng 2?i c"# /h*n +ng5 F7 thu8t PCR tf 2C.c qo v c=ng (G cng <?
vo nH% IJJXB 2Q 2C.c Nguyan 6+c Tr9ng et al / O$ng t3i trCDng 63i h9c Cn Th@ nH%
pkkX )hnh Y5L4
E I p Y V L X U K J Ik Ep
HQ%( 3. N. P(: U<b% ;<b% U< 2(x% ;-9% /b%(
;W? +,l%! 292 ?y" +f?1
Eh Ikk </ l#OO'rM
I0Yh %yu t% nhia% <nh nNng
Vh %yu t% nhia% trung <nh
Lh %yu t% nhia% nhx
X0Jh %yu t% 1hng <nh
Ikh ging tr?ng
Eph I 1< l#OO'r
3.z. REAL TIME PCR
R'#l ti%' PCR l /h*n +ng PCR % 1t [u* hiAn th\ ng#y (#u %,i chu 1o /h*n +ng5
ThGc hin /h*n +ng PCR gi^/ nghiPn c+u viPn 1hng /h*i thGc hin 2in Oi g'l #g#ro(' v
1hng (: O$ng chZt 'thiOu% <ro%iO' 2=c h3i5 Tuy nhiPn 17 thu8t r'#l ti%' PCR /h*i 1t h./
vRi 17 thu8t PCR cf 2iAn 2A gy OGng 2CDng chu_n 2A cS 1t [u* ch]nh gc5 F7 thu8t R'#l
ti%' PCR cS thA gc nh8n %8t (? vi (inh <#n 2u cng nhC (? lC.ng co/y 1huch 23i nhCng
1hng cho <it 1]ch thCRc (*n /h_% PCR (inh r#5
pI
JLk </
LpX </
</
pLk </
Gio trnh Cng ngh Di truyn
PGS TS Trn Nhn Dng

3.z.1. T4AM4% P,-/*
M{%! ;-Z% U| T4AM4% (T4AM4% D,-/*). 6o3n Oc T#[E#n Pro<' l 2o3n
oligonucl'otiO' cS trnh tG <f (ung vRi %=t 2o3n n|% gi# p 2o3n %`i trong /h*n +ng PCR5
NgCDi t# thit 1 (#o cho nhit 2= <!t cN/ c"# 2o3n Oc ny lun lun c#o h@n nhit 2= <!t
cN/ c"# p 2o3n %`i5 S*% /h_% PCR cS chiu Oi ILk </5 6o3n Oc T#[E#nPro<' g!n p %u
R'/ort'r z>E v u'nch'r T>ER> T p 2u5 Fhi p %u R'/ort'r z>E T gn u'nch'r
T>ER>B [u'nch'r T>ER> +c ch (G /ht [u#ng c"# %u T>ER>5 l %,i chu 1o PCRB
2u tiPn 2o3n Oc g!n vo v\ tr] gi# p 2o3n %`i trCRcB (#u 2S p 2o3n %`i (m g!n vo5 Fhi cc
%ononucl'otiO' n?i vo 1;o Oi 2o3n DN> th 2o3n Oc <\ 2nh <8t lPn !#$ r# l% pB tch
u'nch'r v R'/ort'r r# l% R'/ort'r /ht [u#ng5 S#u nhiu chu 1o 1huch 23iB (? lC.ng
%u /ht [u#ng (m tHng tb l thu8n th'o (*n /h_% PCR5 W th?ng [u#ng ghi nh8n nhng
2CDng <iAu Oian tC@ng +ng vRi (*n /h_% PCR (inh r#5 F7 thu8t R'#l ti%' T#[E#nPro<'
ch]nh gc v /ht hin nh#nh vi (inh v8t gy <nh5 F7 thu8t ny 2Q 2C.c Nguyan 6+c Tr9ng
et al / O$ng t3i trCDng 63i h9c Cn Th@ nH% pkkX )hnh Y5X4
HQ%( 3. [1 G<d% ;C 2(} &F~%! ("i%( A"4%! +o%! &$% 234 292 %!(<b? +(V2 +(*- 2(" 5i S11 GW 2-D#
4?D&<2-% &0 1u
1u
S21 GW 2-D# 4?D&<2-% &0 1u
g
S31 GW 2-D# 4?D&<2-% &0 1u
N
SH1 GW 2-D# 4?D&<2-% &0 1u
3
SN1
GW 2-D# 4?D&<2-% &0 1u
1
H41 ?y" +f? GS %(<? /b%( %m%! (dng tnh) 211 ?y" +f? GS M<% T,"%!
2(x% ;-9% kt qu Tng ng 10
7
; 31 ?y" +f? &| ,% )? +E%( NTC1 ;W< 2(V%! 5(f%! 2(V4 MNA
C92( +(R2 (<b% R*4&+<?* PCR T4AM4%P,-/*
pp
Gio trnh Cng ngh Di truyn
PGS TS Trn Nhn Dng

Ph# 2CDng chu_n
vCRc Ih 6o n`ng 2= DN> #%/licon )(*n /h_% PCR4
vCRc ph OG# vo n`ng 2= t]nh (? 2o3n DN> 2Q 2C.c nhn lPn <|ng PCR
)co%$ am%licon4
vCRc Yh /h# loQng (*n /h_% PCR thnh cc n`ng 2=h Ik
Ik
B Ik
U
B Ik
L
B Ik
Y
B
Ik
I
B 2A gy 2CDng chu_n
Ph# Oung O\ch cho /h*n +ng PCR trPn %y R'#l0ti%' PCR th'o cng
th+c c"# nh (*n guZt %y r'#l ti%' PCR >//li'O <io(y(t'%
3.z.2. M0" SYJR GREEN
S Ur%! ?0" SYJR GREEN5 6Nc t]nh c"# chZt SvR GRN l /ht %u huonh
[u#ng 1hi n|% ch'n vo (.i DN> 2i5 S? lC.ng (*n /h_% DN> (inh r# cng nhiu th cCDng
2= %u cng c#o5 Tuy nhiPn /hC@ng /h/ O-ng SvR GRN gN/ trT ng3i v (#u /h*n +ng
cS nhiu 2o3n %`i <!t cN/ vRi nh#u thnh nhng (.i ng!n DN> 2i Oi pk0Vk </5 Do 2S 1hi
thit 1 /h*n +ng ch^ng t# /h*i t]nh ton lC.ng DN> v&# 2" cho cc 2o3n %`i 1hng tG <!t
cN/ vRi nh#u5 D-ng SvR GRN 2A 2nh OZu (*n /h_% PCR <|ng cch /h# chung SvR
GRN vo cng th+c PCR chu 1o %Nc 2\nh c"# %y5 F7 thu8t ny 2Q 2C.c Nguyan 6+c
tr9ng et al / O$ng t3i trCDng 63i h9c Cn Th@ nH% pkkX )Wnh Y5U4
4) C92( +(R2 (<b%1
i Ch9n I %yu DN> (3ch 2A 2o D O-ng l% chu_n 2A 2\nh lC.ng %=t %yu (*n
/h_% PCR trPn g'l #g#ro(' <|ng chC@ng trnh u#ntity on'5
i S#u 1hi t]nh gong h% lu.ng DN> c"# %yu (*n /h_% PCR t]nh (? <*n co/i'(h
IIgIk
Ik
i Ph# loQng (*n /h_% PCR thnh cc n`ng 2=h Ik
Ik
B Ik
J
B Ik
U
B Ik
L
B Ik
V
B Ik
Y
B Ik
p
B
Ik
I
2A gy OGng 2CDng chu_n5
0 Ph# %#(t'r %ig cho /h*n +ng R'#l ti%' PCR
/) K.+ A"d
pY
Gio trnh Cng ngh Di truyn
PGS TS Trn Nhn Dng

HQ%( 3. g1 G<d% ;C 2(} &F~%! ("i%( A"4%! +o%! &$% 234 292 %!(<b? +(V2 +(*- 2(" 5i ST11 GW 2-D#
&0 1u
1u
ST21 GW 2-D# &0 1u
g
ST31 GW 2-D# &0 1u
N
STH1 GW 2-D# &0 1u
3
STN1 2-D# &0 1u
1
K/1 +f? P-G+
5(f%! /b%( C/1 Tf? &`% /b%( M+1 21 M<% +,"%! NTC1 \W< 2(V%! 5(f%! 2(- MNA
3.1u. C8C _NG MNG
F7 thu8t PCR 2C.c +ng O$ng r=ng rQi trong nhiu ltnh vGc 1hc nh#uB t& nghiPn c+u
1ho# h9c 2n (*n guZt v 2Di (?ng gQ h=i5 Nhng +ng O$ng ch]nh c"# 17 thu8t PCR lh
0 c 2\nh cc 2o3n trnh tG cn nghiPn c+u
0 Pht hin 2=t <in
0 NghiPn c+u [u trnh tin ho /hn t:
0 Ph$c h`i cc g'n 2Q t`n t3i hng triu nH%
0 Ch9n gi?ng v8t nuiB cy tr`ng
0 qG# ch9n cc cN/ ch# %x thun ch"ng trong thDi gi#n ng!n
0 c 2\nh cc loi %RiB cc loi 2Nc hu <|ng /hC@ng /h/ Oi truyn /hn t:
h9c 0 Fho# h9c hnh (G5
0 Chu_n 2on ch]nh gc cc <nh nhia% tr-ng t& vi 1hu_nB nZ%B viru(
0 Chu_n 2on (R% cc <nh gy r# Oo ung thCB cc <nh Oi truyn
pV
Gio trnh Cng ngh Di truyn
PGS TS Trn Nhn Dng

0 c 2\nh huyt th?ngB truy t% OZu vt t=i /h3%
0 q 17 thu8t nn cho cc 17 thu8t 1hc nhCh R>PDB SSR
Nguyan Th\ Thu q#n et al )pkkY4 gc 2\nh giRi t]nh T h'o <|ng 17 thu8t PCR5 T#ng et
al )pkkk4 2Q O-ng 17 thu8t PCR co%/'titiv' 2A 2\nh lC.ng SSs )hit' S/ot SynOro%'
siru(4 nhia% trong Penaeus mono&on z#<riciu( 2A /hn lo3i gi#i 2o3n nhia% SSs thnh
%+c 2= nhxB trung <nh v nNngB t& 2S cS cch g: lu th]ch h./ l% gi*% thit h3i trong ngh
nui t%5 Pht hin nh#nh 'almonella (//5 trong thGc /h_% )Ph_% Einh Thu et alB pkkX45
/ O$ng 17 thu8t PCR (*n guZt v= FT ch_n 2on <nh 2?% tr!ng trPn t% )Nguyan 6+c
Tr9ng et alB pkkX45 Dung et al )pkkJ4 2Q OG# vo 17 thu8t PCR /ht hin vi (inh v8t gy
<nh vng l gn g#nh trPn cy ch#nh solc# cS thA (?ng (St trong rA cy (#u 1hi vCDn ch#nh
<nh 2Q <\ 2?n <d v nhia% <nh vng l gn g#nh Oo vi 1hu_n Can&i&atus qi<'ri<#ct'r
#(i#ticu( gy r#5
CU HI
I5 So (nh c@ ch c"# PCR v [u trnh (#o ch;/ DN> trong t <o5
p5 Trnh <y nguyPn t!c thit 1 %`i5
Y5 Trnh <y cc thnh /hn cn thit cho %=t /h*n +ng PCR5
V5 SG 1hc <it gi# PCR v r'#l ti%' PCR thA hin T ch, no
L5 So (nh ng!n g9n %y gr#Oi'nt PCR v %y PCR cf 2iAn
X5 So (nh R'#l ti%' PCR T#[E#n Pro<' v R'#l ti%' Syvr Gr''n
pL