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in Biotecnologia:
Fundamentos e Aplicaes, N. Lima e M. Mota (eds.), DIFEL, 2000.
12 - Biotecnologia Microbiana:
A Produo de Penicilina
Jos C. Menezes
1,3
, Teresa P. Alves
4
, Joaquim P. Cardoso
2,3,4
1
Professor Auxiliar, IST
2
Professor Catedrtico, IST
3
Departamento de Engenharia Qumica
Centro de Engenharia Biolgica e Qumica,
Instituto Superior Tcnico, Av. Rovisco Pais, P-1049-001 Lisboa, Portugal;
telefone: 218 417 347; fax: 218 419 062; e-mail: cardoso.menezes@ist.utl.pt
4
Administrador, PhD
Companhia Industrial Produtora de Antibiticos, CIPAN, S.A.,
Vala-do-Carregado, P-2601-906 Castanheira do Ribatejo, Portugal.
telefone: 263 856 800; fax: 263 855 086; e-mail: ta.cipan@mail.telepac.pt
SUMRIO
A descoberta e produo em massa de medicamentos capazes de combater doenas infecciosas
constitui uma das maiores realizaes da humanidade. A introduo dos antibiticos em medicina
marcou o incio de uma era em que doenas mortais passaram a ter cura, originando um aumento
de longevidade estimado em 10 anos nos pases industrializados.
Neste captulo rev-se a descoberta da penicilina e a forma como hoje em dia produzida
industrialmente. Discute-se a sua produo por fermentao, a extraco dos caldos fermentados e
a obteno de produtos de maior eficcia teraputica por modificao qumica da penicilina.
Passados mais de meio sculo do incio da produo industrial de penicilina, subsistem ainda
problemas fundamentais por resolver neste processo. Pe-se ainda em evidncia o facto dos
mtodos utilizados na soluo dos problemas de engenharia bioqumica encontrados na produo
industrial de penicilina se terem constitudo em paradigma na investigao e desenvolvimento da
generalidade dos processos de produo dos antibiticos actualmente comercializados.
12.1 INTRODUO
A indstria farmacutica de produo de antibiticos por fermentao nasceu h ca. de 60 anos
com a produo de penicilina, sendo frequentemente utilizada como exemplo de uma biotecnologia
estabelecida [1].
No entanto, apesar da escala a que se produz penicilina, da sua importncia comercial e de ser o
antibitico produzido h mais tempo por fermentao, o conhecimento existente sobre o
microrganismo e o processo de fermentao insuficiente para que seja possvel i) por modificao
gentica dos mecanismos de controlo metablico a acentuao de determinadas caractersticas de
uma estirpe (e.g., produtividade) ou ii) a formulao a priori de meios e condies de cultura mais
adequadas a dada estirpe.
A produo de penicilina realizada por fermentao com um fungo, o Penicillium chrysogenum,
no existindo processos qumicos alternativos economicamente viveis. A partir da penicilina
isolada dos caldos fermentados podem ser sintetizados diversos antibiticos com um valor
teraputico e comercial significativamente superior. Neste captulo revm-se sumariamente estes
processos e utilizaes.
12.2 A DESCOBERTA E A PRODUO INDUSTRIAL
DE PENICILINA
Muitas descobertas cientficas importantes so acidentais. A ocorrncia de factores experimentais
desconhecidos ou no-controlados, com um resultado que notado mas s depois entendido,
responsvel por descobertas que mudaram a histria. A descoberta da penicilina pelo escocs SIR
ALEXANDER FLEMING em 1928 um bom exemplo [2]. As razes que explicam que os antibiticos
no tenham sido descobertos no sculo XIX persistiam no tempo de FLEMING - pex. a inexistncia
de mtodos cromatogrficos e espectrofotomtricos adequados caracterizao e isolamento de um
composto com a instabilidade qumica e trmica da penicilina em soluo - a tal ponto que o feito
extraordinrio da descoberta da penicilina no teve nos anos seguintes grande evoluo [3].
A importncia estratgica da penicilina na Segunda Guerra Mundial fez com que CHAIN e FLOREY,
a trabalharem na aplicao clnica da penicilina desde 1938, constassem de mandatos de captura
alemes em 1940. A precariedade do Reino Unido no incio da guerra obrigou FLOREY a
interromper o trabalho em LONDRES sobre a penicilina e a procurar em 1941 nos EUA o apoio
necessrio para a produo em larga escala.
Apesar da guerra, o trabalho do grupo de CHAIN e FLOREY tornou-se conhecido em todo o mundo,
originando investigao independente sobre a penicilina em vrios pases. A Holanda, onde a
investigao se fez clandestinamente devido ocupao, e a Espanha, devastada pela guerra civil,
tornaram-se mais tarde em grandes produtores mundiais de penicilina [2]. Pelo seu trabalho sobre
a penicilina FLEMING, CHAIN e FLOREY receberam em 1945 o prmio Nobel da medicina.
12.3 O PARADIGMA DA PRODUO INDUSTRIAL
DE PENICILINA
A quantidade de penicilina fabricada nos EUA na primeira metade da dcada de 40, praticamente o
nico produtor neste perodo, aumentou mais de 5 ordens de grandeza com o programa concertado
de investigao e desenvolvimento lanado pelo governo americano durante a guerra, atingindo-se
na altura do desembarque na Normandia uma produo anual suficiente para as necessidades
militares dos aliados (Fig. 12.1).
FROMORDINARY
MOLD -
the Greatest Healing
Agent of this War
FROMORDINARY
MOLD -
the Greatest Healing
Agent of this War
ciclizao em 2 passos
benzil-penicilina ( ) PENG
isopenicilina-N ( ) IPN
fenilacetato (activado)
cisteinil-D-valina
(LLD - )
Quadro 12.2 - A biossntese de penicilina-G pelo P. chrysogenum.
12.6 O ISOLAMENTO DA PENICILINA DOS
CALDOS FERMENTADOS
Os processos de isolamento da penicilina G e da penicilina V so semelhantes pelo que se iro
descrever em conjunto. Consistem basicamente de duas operaes: extraco seguida de
cristalizao.
No fim da fermentao o caldo fermentado, contendo ou no descargas parciais, arrefecido a
temperaturas abaixo dos 10C e enviado para o sector de extraco onde por adio de uma
determinada percentagem de formol (0,5 1%, se procede inactivao do microorganismo). A
adio deste composto tem tambm por objectivo a preveno da degradao da penicilina por
aco das beta-lactamases.
12.6.1 - Extraco dos Caldos Fermentados
Quaisquer que sejam os processos de extraco de penicilina (G ou V) o objectivo obter um
solvente rico neste antibitico, normalmente o acetato de butilo, a partir do qual se isola o
antibitico [7]. Normalmente o rendimento global de extraco depende pouco do mtodo
utilizado e ronda os 85 90%. Para se obter a soluo rica do antibitico no acetato de butilo
podero pelo menos utilizar-se os trs processos alternativos descritos a seguir.
12.6.1.1 - EXTRACO USANDO FILTROS ROTATIVOS
E EXTRACTORES CONTNUOS PODBIELNIAK
O caldo fermentado contendo ou no descargas parciais, ao pH de fermentao (cerca de 6.5) e a
cerca de 10C, alimentado a filtros rotativos sob vcuo de tipo especial string discarge filters
onde feita a separao slido/lquido. Durante a filtrao o bolo do filtro lavado com gua de
modo a que o filtrado emerja do filtro com uma concentrao de penicilina da ordem das
20.000 U/ml. O rendimento desta operao ([penicilina no caldo filtrado/penicilina no caldo
fermentado] x 100) situa-se normalmente nos 90 95%. A extraco da penicilina do caldo filtrado
efectuada com solventes imiscveis com a gua sendo o mais comum o acetato de butilo. O pH
ptimo de extraco situa-se na gama 2 10%. Esta extraco efectuada em contracorrente em
extractores contnuos de vrios andares sendo o mais vulgar destes extractores o Podbielniak.
Conforme as necessidades de caudal e o rendimento requerido podem ser usados grupos de
mquinas em srie. O esquema de extraco mostrado na figura seguinte:
Agente antiemulsionante
cido sulfrico diludo
Agente molhante
Caldo de Penicilina Caldo exausto de Penicilina
Acetato de Butilo Rico Acetato de Butilo
Do acetato de butilo rico obtido pode-se isolar a penicilina G ou V sob a forma de sal de potssio
por alguns processos diferentes.
12.6.1.2 - EXTRACTORES DECANTADORES
(WHOLE BROTH EXTRACTORS)
Os extractores decantadores so mquinas desenvolvidas pela Westflia que permitem a extraco
directa do caldo fermentado para o solvente (normalmente acetato de butilo). Existem vrios
modelos de mquinas que s diferem no caudal que podem processar. Normalmente as mquinas
so combinadas em srie e o rendimento obtido ([penicilina no solvente/penicilina no caldo
fermentado] x 100) depende do nmero de mquinas em srie. Para duas mquinas em srie o
rendimento da ordem de 96% enquanto que para 3 mquinas em srie o rendimento se aproxima
de 98%. O investimento numa terceira mquina pode todavia no compensar o aumento de
rendimento. Devido ao facto de a separao no Extractor Decantador dar origem a um solvente
com algum grau de turvao necessrio existir a montante um clarificador do tipo separador
lquido / lquido. O processo de extraco da penicilina para o acetato de butilo processa-se nas
seguintes condies.
O caldo fermentado com ou sem descargas parciais alimentado ao sistema de extractores a uma
temperatura da ordem dos 10C. O pH ptimo para a extraco situa-se na gama 2 10%. A
Podebielniak
quantidade de solvente a utilizar tendo em conta o rendimento de extraco calculada para ter um
solvente rico contendo cerca de 70.000 U/ml de penicilina.
O esquema de extraco usando dois extractores decantadores em srie o seguinte:
caldo agentes molhantes solvente fresco
fermentado H
2
SO
4
solvente semi rico
caldo
solvente rico semi exausto
12.6.1.3 - COMBINAO DE SISTEMAS DE MEMBRANAS COM
EXTRACTORES CONTNUOS TIPO PODBIELNIAK
Este sistema provavelmente o menos utilizado na indstria de produo de penicilina mas
constitui uma opo vlida. Este sistema advogado para separao slido/lquido em
antibiticos que necessitam de utilizar adjuvante de filtrao na filtrao convencional o que no
normalmente o caso da fermentao de penicilina. Basicamente o sistema de filtrao por
membranas para a separao slido/liquido da penicilina dever incluir uma microfiltrao com
diafiltrao como uma primeira operao de filtrao. Nesta introduzido um factor de diluio
aprecivel seguindo-se uma concentrao do caldo filtrado por nanofiltrao ou osmose inversa. A
nanofiltrao tem vantagens sobre a osmose inversa j que a grande maioria dos sais inorgnicos
sero eliminados atravs da membrana o que no acontece na operao de osmose inversa.
Aps obteno do caldo filtrado rico em penicilina com um rendimento de 9095% a extraco
efectuada para acetato de butilo em Podbielniaks como descrito na primeira alternativa.
12.6.2 - Cristalizao da Penicilina (G ou V)
Independentemente do processo utilizado para a obteno do acetato de butilo rico em penicilina os
processos de cristalizao da penicilina so basicamente os mesmos. Iremos apenas descrever um
dos processos de cristalizao mais utilizados industrialmente que permite obter uma penicilina G
potssica de excelente qualidade.
Neste processo o acetato de butilo rico em penicilina primeiro descolorado com carvo activado o
qual removido por filtrao. O solvente purificado contactado com uma soluo de bicarbonato
de potssio a cerca de 23% de modo a que o pH de extraco seja cerca de 6,2 6,5. A razo
volumtrica de solvente/soluo de bicarbonato de potssio tal que a concentrao de penicilina
na soluo de bicarbonato de potssio seja da ordem das 550 000 U/ml tendo em conta o
rendimento de extraco que da ordem dos 98%.
As duas fases, orgnica e aquosa, aps um perodo de contacto adequado so separadas num
separador centrfugo lquido/lquido sendo o solvente exausto enviado para a instalao de
recuperao de solventes. A fase aquosa que contm a penicilina extrada como se disse numa
concentrao de cerca de 550.000 U/ml ento processada para cristalizao da penicilina do
seguinte modo: cerca de 4 volumes de n-butanol so adicionados soluo aquosa rica em
penicilina e procede-se de seguida destilao da mistura a baixa presso e a baixa temperatura
para no degradar a penicilina. O butanol forma um azeotropo com a gua com uma composio
aproximada de 63% de butanol e 37% de gua (peso/peso).
medida que prossegue a destilao a gua vai sendo removida at que se atinge a situao em
que o butanol existente no evaporador/cristalizador tem uma humidade inferior a 1%. A operao
caldo exausto +
+miclio
de destilao ento terminada e a suspenso dos cristais de penicilina potssica enviada para
filtros adequados. Aps filtrao os cristais so lavados com butanol e depois de secos com ar no
filtro so descarregados para secadores. Aps secagem so peneirados, misturados, embalados e
analisados.
12.7 PRODUO DE PENICILINA G POTSSICA
EM PORTUGAL
A actual Brocades Portuguesa em Matosinhos tem uma instalao de produo de penicilina G
potssica mas a sua capacidade no conhecida.
A CIPAN S.A. embora no produza industrialmente penicilina detm know-how de fabrico quer ao
nvel fermentativo quer extractivo para este antibitico. A deteno deste know-how permitiu j
CIPAN S.A. a construo de uma fbrica para a produo de penicilina G potssica em Madras no
sul da ndia com uma capacidade de cerca de 700 ton/ano.A fbrica entrou em funcionamento em
1994 tendo o investimento sido de cerca de 55 milhes de USD (1994). constituida por trs
sectores distintos: fermentao semi-descontnua com um volume instalado de 1.000 m
3
, extraco
com capacidade para cerca de 2.200 Kg/dia de penicilina G potssica e unidade de recuperao de
solventes.
As Figuras 12.3A e 12.3B mostram aspectos desta fbrica. O desenvolvimento da tecnologia de
produo da penicilina G foi levado a cabo na Instalaao Piloto de Fermentaoda CIPAN, S.A.
constituida por vrios fermentadores e respectivos sistemas de controlo com capacidades desde 200
a 1.050 litros. As Figuras 12.4A e 12.4B do uma ideia desta instalao.
Figura 12.3 - Vista parcial da fbrica para a produo de penicilina G potssica em
Madras, ndia, construda pela CIPAN em 1994.
A. Edifcio de extraco e a zona de utilidades em construco;
B. Vista geral da fbrica acabada.
12.8 CONCLUSO
A indstria farmacutica de produo de antibiticos por fermentao nasceu h 50 anos com a
produo de penicilina.
Neste artigo mostrou-se o empreendimento extraordinrio de engenharia que foi o desenvolvimento
do processo de cultura submersa para a produo industrial de penicilina. O esforo conjunto de
microbiologistas e engenheiros, ao longo de mais de 50 anos, permitiu aumentar quase 5 ordens de
grandeza os ttulos finais de penicilina numa fermentao [1;3].
Mostrou-se a importncia que a penicilina tem actualmente quer pelo seu valor teraputico
intrnseco, nomeadamente em formulaes veterinrias, quer como matria prima para a produo
de diversos antibiticos derivados mais eficazes sob o ponto de vista de espectro bacteriano, de
estabilidade a pHs baixos e de resistncia a beta-lactamases. Esta resistncia a beta-lactamases
A B
pode ainda ser drasticamente aumentada por formulao com compostos inibidores de
beta-lactamases, sendo os mais representativos o cido clavulnico o sulbactam e o tazobactam.
Por esta razo, apesar do aparecimento de um nmero crescente de bactrias patognicas resistentes
a antibiticos beta-lactmicos a penicilina tem mercado assegurado pelo menos durante a prxima
dcada [7;9;11;20].
a)
b)
Figura 12.4 - Vista parcial da INSTALAO-PILOTO da CIPAN.
A. Perspectiva geral de um fermentador de 1.050 l;
B. Topo do tanque com as entradas para adies e o mdulo de controlo.
12.9 PROBLEMAS DE REVISO
1. Qual a quantidade em gramas que corresponde a um BOU de Penicilina G Potssica e a um
BOU de Penicilina V Potssica (BOU < > Billion Oxford Units) ?
2. As massas moleculares da Penicilina G Benzatnica e da Penicilina G Procana so
respectivamente 909 e 588,7 g/mole, contendo a primeira duas molculas e a segunda uma
molcula de Penicilina G sob a forma cida. Quais so as actividades tericas de cada uma
destas penicilinas expressas em U/mg ?
3. A resistncia desenvolvida por microorganismos amoxicilina muito maior do que mistura
de amoxicilina e clavulanato de potssio (inibidor de beta-lactamases). Justifique a razo deste
fenmeno.
4. A Penicilina G e seus sais s podem ser administradas por via injectvel enquanto que a
penicilina V pode ser administrada por via oral. Porqu ?
5. Na hidrlise enzimtica da Penicilina G a 6-APA pela Penicilina G Amidase qual o volume de
hidrxido de sdio 4N necessrio para converter 50 kg de Penicilina G a 6-APA com 98% de
converso ?
6. Qual a morfologia mais favorvel produo de penicilina e porqu ?
7. Em qual dos tipos limites de morfologia filamentosa ou em pellets de esperar, para as
mesmas condies de cultura no seio do meio de fermentao, maior represso catablica por
substratos facilmente metabolizveis ?
8. A partir dos dados na Fig. 12.2, calcule as quantidades aproximadas de substratos e precursor
consumidas numa fermentao de Penicilina com durao tpica, conduzida num fermentador
de 100 m
3
com um volume til 70% do volume nominal.
9. Sabendo que a concentrao em g/l de pptidos solveis (C
5,0
H
9,8
O
2,4
N
1,4
S
0,02
) devidos
formulao do meio de cultura com guas de macerao de milho, ca. de metade da de
acares redutores no incio da fermentao, e assumindo a exausto do meio em pptidos
A B
solveis na fase de crescimento, calcule a importncia desta fonte C em relao a outras fontes
presentes na formao de biomassa at s 40 h de fermentao (despreze a existncia de lise).
10. Na extraco de Penicilina G de um caldo fermentado com um ttulo de 65.000 U/ml
obteve-se 36 kg/m
3
de Penicilina G Potssica com uma actividade de 1.585 U/mg. Qual foi o
rendimento global da operao de extraco ?
Palavras-Chave
Pencillium chrysogenum, penicilina, produo de antibiticos, fermentao de antibiticos,
extrao de antibiticos, beta-lactmicos, 6-APA, penicilinas semi-sintticas
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