PH D

1
Universitatea Lucian Blaga Sibiu

MENS
AGITAT
MOLEM

MSc. Ing. Monica MIRONESCU

STUDII I CERCETRI
PRIVIND PRODUCEREA I CARACTERIZAREA
POLIZAHARIDELOR DE ORIGINE MICROBIAN
FOLOSIND MICROORGANISMUL Haloferax mediterranei

Sibiu 2006

2
CUPRINS

Simboluri i abrevieri folosite VI
MOTIVAIE I OBIECTIVELE LUCRRII VII

I. STUDIU BIBLIOGRAFIC
1. BAZELE TEORETICE ALE CERCETRII 1
1.1. Polizaharide extracelulare microbiene (EPS) 1
1.1.1. Microorganisme productoare 1
1.1.2. Localizare, funcii biologice 2
1.1.3. Caracterizarea polizaharidelor extracelulare microbiene 4
1.1.4. Proprietile funcionale ale polizaharidelor extracelulare microbiene 6
1.1.4.1. Proprieti reologice 7
1.1.4.2. Proprieti de asociere 10
1.2. Polizaharidul extracelular produs de H. mediterranei (EPSH) 13
1.2.1. Microorganism productor (Haloferax mediterranei) 13
1.2.1.1. Habitat i importan 13
1.2.1.2. Morfologie, genetic 15
1.2.1.3. Fiziologie 16
1.2.2. Localizarea i funcia biologic a EPSH 17
1.2.3. Caracterizarea EPSH 17
1.2.4. Proprietile funcionale ale EPSH 21
1.3. Conducerea bioproceselor 23
1.3.1. Noiuni generale 23
1.3.1.1. Cinetica creterii microorganismelor 23
1.3.1.2. Sisteme de cultivare a microorganismelor 24
1.3.1.3. Controlul bioproceselor 26
1.3.2. Conducerea principalelor bioprocese de obinere a EPS 29
1.3.3. Conducerea bioproceselor de obinere a EPSH 30
1.3.3.1. Cultivarea arheei Haloferax mediterranei n baloane, cu studiul
creterii i formrii EPSH 30
1.3.3.2. Cultivarea arheei Haloferax mediterranei n bioreactor, cu studiul
creterii i formrii EPSH 31
1.4. Modelarea bioproceselor 34
1.4.1. Modele de cretere a arheei H. mediterranei i producere de EPSH 35

II. CERCETAREA EXPERIMENTAL
2. MATERIALE I METODE 36
2.1. Microorganism i mediile de cultur 36
2.1.1. Microorganism 36
2.1.2. Medii de cultur 36
2.2. Bioproces 38
2.2.1. Cultivarea arheei n baloane dup un plan de experimentare factorial 38
2.2.2. Instalaia de cultivare 40
2.2.2.1. Cerine i realizarea tehnic 40
2.2.2.2. Bioreactorul 40
2.2.2.3. Dotri suplimentare 42
2.2.2.3.1. Recipiente 42
2.2.2.3.2. Obinerea, transmiterea, prelucrarea i interpretarea semnalelor 42
2.2.2.3.3. Pompe i aparatura adiacent 42
2.2.3. Conducerea cultivrii n bioreactor 43
2.2.3.1. Designul experimental 43
2.2.3.2. Pregtirea bioreactorului i aducerea la regimul de cultivare 44
2.2.3.3. Cultivarea propriu-zis 45
3
2.2.3.4. Controlul i reglarea cultivrii n bioreactor 50
2.2.3.5. Analize on-line 51
2.2.3.5.1. Analiza oxigenului dizolvat n mediul lichid 51
2.2.3.5.2. Analiza gazelor evacuate din bioreactor 51
2.3. Metode de analiz 51
2.3.1. Cuantificarea consumului de nutrieni 51
2.3.1.1. Cuantificarea consumului de glucoz 51
2.3.1.2. Cuantificarea consumului de fosfat 52
2.3.2. Cuantificarea biomasei microbiene formate 52
2.3.2.1. Metoda turbidimetric 53
2.3.2.2. Metoda gravimetric 53
2.3.3. Cuantificarea EPSH format 54
2.3.3.1. Metoda colorimetric 54
2.3.3.2. Metoda gravimetric 54
2.3.4. Purificarea EPSH 55
2.3.5. Determinarea compoziiei n monozaharide a EPSH 55
2.3.5.1. Pregtirea probelor pentru analiza HPLC 56
2.3.5.2. Hidroliza acid a EPSH 56
2.3.5.2.1. Analiza SEC a gradului de hidroliz a EPSH 57
2.3.5.2.2. Dozarea monozaharidelor rezultate n urma hidrolizei acide folosind RP-HPLC 59
2.3.5.3. Adaptarea metodei RP-HPLC pentru dozarea monozaharidelor din structura EPSH 60
2.3.5.4. Analiza EPSH 63
2.3.6. Msurtori de spectroscopie n infrarou cu transformant Fourier (FTIR) 63
2.3.7. Determinarea dimensiunii EPSH 64
2.3.8. Msurtori reologice 64
2.3.9. Analiza proprietilor de legare a ionilor de ctre EPSH 66
2.4. Modelarea i simularea creterii i producerii de metabolit 68
2.4.1. Identificarea parametrilor cinetici ai modelului 68
2.4.2. Programe folosite 69
2.4.2.1. Matlab 69
2.4.2.2. LabVIEW 69

3. REZULTATE I DISCUII 70
3.1. Studiul influenei factorilor chimici i fizici asupra creterii microorganismului
i producerii de EPSH 70
3.1.1. Studiul influenei glucozei, magneziului i fosfatului asupra creterii microorganismului
i producerii de EPSH folosind modele de regresie i metodologia suprafeelor
de rspuns la cultivarea n baloane Erlenmeyer 70
3.1.1.1. Influena concentraiei de glucoz, ioni fosfat i ioni magneziu asupra
formrii de biomas microbian 70
3.1.1.2. Influena concentraiei de glucoz, ioni fosfat i ioni magneziu asupra formrii EPSH 76
3.1.2. Studiul influenei glucozei, clorurii de sodiu i temperaturii asupra creterii
microorganismului i producerii de EPSH la cultivarea n sistem batch 82
3.1.2.1. Influena concentraiei de glucoz 83
3.1.2.1.1. Influena concentraiei de glucoz asupra formrii de biomas 83
3.1.2.1.2. Influena concentraiei de glucoz asupra formrii de EPSH 86
3.1.2.2. Influena concentraiei de NaCl 89
3.1.2.2.1. Influena concentraiei de NaCl asupra formrii de biomas 89
3.1.2.2.2. Influena concentraiei de NaCl asupra formrii de EPSH 93
3.1.2.3. Influena temperaturii 95
3.1.3. Identificarea parametrilor cinetici i modelarea fazei batch a bioprocesului 97
3.2. Optimizarea cultivrii n sistem fed-batch 100
3.2.1. Stabilirea momentului iniierii fazei fed-batch 100
3.2.1.1. Rspunsul microorganismului la adaosul de glucoz dup faza batch 100
4
3.2.1.2. Iniierea fazei fed-batch 103
3.2.2. Conducerea proceselor in sistem fed-batch 105
3.2.2.1. Parametrii funciei de alimentare n sistem fed-batch 105
3.2.2.2. Evoluia bioprocesului n medii cu concentraie mare de glucoz i fosfat n
faza fed-batch 106
3.2.2.3. Evoluia bioprocesului n medii cu concentraie medie de glucoz i fosfat
n faza fed-batch 109
3.2.2.4. Evoluia bioprocesului n medii cu concentraie mic de glucoz i concentraie
mare fosfat n faza fed-batch 112
3.2.2.5. Evoluia bioprocesului n medii cu concentraie variabil (mic i mare) de glucoz
i concentraie mic de fosfat n faza fed-batch 115

3.3. Elaborarea, testarea i optimizarea programului BioLab de conducere i
control a bioprocesului 120
3.3.1. Interfaa de proces 121
3.3.2. Nivelul de control 122
3.3.2.1. Controlul i reglarea temperaturii 122
3.3.2.2. Controlul i reglarea pH-ului 124
3.3.2.3. Controlul i reglarea oxigenului dizolvat 125
3.3.2.4. Funcia de alimentare n faza fed-batch 129
3.3.3. Interfaa de utilizare 129
3.4. Caracterizarea EPSH 134
3.4.1. Compoziia n monozaharide a EPSH 134
3.4.1.1. Analiza i optimizarea metodei de hidroliz acid a EPSH 135
3.4.1.1.1. Analiza influenei concentraiei de TFA i a duratei hidrolizei asupra
gradului de descompunere a EPSH 139
ratei de formare a monozaharidelor 140
3.4.1.1.3. Evidenierea gradului de recuperare a monozaharidelor la hidroliza acid 143
3.4.1.2. Determinarea compoziiei n monozaharide a EPSH 146
3.4.1.3. Variaia compoziiei n monozaharide a EPSH pe durata cultivrii 148
3.4.2. Evidenierea legturilor i gruprilor din structura EPSH 150
3.5. Proprietile funcionale ale EPSH 152
3.5.1. Comportamentul reologic al EPSH 152
3.5.1.1. Determinarea timpului de meninere a EPSH naintea analizei i a aciunii forfecrii
asupra structurii 153
3.5.1.2. Funciile de curgere i de viscozitate pentru soluii semiconcentrate 155
3.5.1.3. Aprecierea comportamentului viscoelastic
3.5.1.4. Comportamentul reologic al EPSH sub aciunea temperaturii 162
3.5.2. Dimensiunea EPSH 165
3.5.3. Proprietile de legare a ionilor de ctre EPSH 168

4. CONCLUZII I PERSPECTIVE 177
4.1. Concluzii 177
4.2. Perspective 186
5. BIBLIOGRAFIE 187
6. LISTA LUCRRILOR REALIZATE N CADRUL TEZEI 206
7. ANEXE 201

5
Prinilor mei, cu mult dragoste!

Lucrarea de fa este rezultatul colaborrii dintre Universitatea Lucian Blaga din Sibiu,
Romnia i Universitatea Tehnic Fridericiana din Karlsruhe, Germania, cercetrile practice
fiind desfurate la ambele universiti n perioada ianuarie 2000 februarie 2005. La realizarea
ei au participat civa oameni deosebii crora doresc s le mulumesc pe aceast cale.

Domnului Profesor Universitar Dr. Ing. Vasile Jcanu i mulumesc pentru deschiderea
Dumnealui pentru toate propunerile mele i pentru nelegerea artat.
Domnului Profesor Universitar Dr. Ing. Clemens Posten i mulumesc pentru ncrederea artat
la iniierea acestui proiect i pentru sprijinul la nivel tiinific i financiar acordat pe parcursul
stagiului de cercetare la Universitatea din Karlsruhe.
Mulumesc conducerii Institutului Mechanische Verfahrenstechnik und Mechanik (MVM) i
programului Kompetenznetz Verfahrenstechnik PRO3 pentru bursele acordate.
Doamnei Profesor Universitar Dr. Ing. Vionela Mironescu i mulumesc pentru implicarea activ
i pentru ajutorul acordat la corectarea acestei lucrri.
Tuturor colegilor de la Institutul Mechanische Verfahrenstechnik und Mechanik, n special
colegilor de la Bioverfahrenstechnik, care m-au ajutat s m adaptez la viaa i la modul de lucru
n Germania le mulumesc pe aceast cale.
Le mulumesc Doamnei Maya Ignatova de la Academia de tiine Sofia, Bulgaria i Domnului
Carl Kriger de la Peninsula Technikon, Africa de Sud, cu care am colaborat n cadrul unor
proiecte internaionale la realizarea modelului matematic, respectiv a programului de conducere
i control a bioprocesului.
Domnilor Patrick Pionneau de la Forschungszentrum fr Umwelt (FZU) i Christian Specht de
la Institut fr Wasserchemie (Engler-Bunte Institut) le mulumesc pentru ajutorul la realizarea
determinrilor cromatografice.
Familiei mele, n special soului meu, i mulumesc pentru sprijinul moral i material, fr de
care nu a fi ajuns n acest punct.

1. Decembrie 2005, Sibiu Monica Mironescu

6
MOTIVAIE I OBIECTIVELE LUCRRII

n ultima perioad se manifest un interes crescut pentru microorganismele extremofile folosite
ca i productori de polizaharide microbiene. Acest interes este justificat de caracteristicile unice
la nivel genetic, biochimic, fiziologic i evolutiv al acestor microorganisme [Oren, 2002a],
precum i de metaboliii lor, care prezint nsuiri deosebite [Rodriguez-Valera, 1992]. Un astfel
de microorganism este arheea extrem halofil Haloferax mediterranei. Aceasta se dezvolt la
concentraii foarte ridicate de sare (18-25%) [Anton et al., 1988], putnd fi cultivat n condiii
minime de sterilitate, fcnd bioprocesul atractiv pentru industrie [Oren, 2002b].
Exopolizaharidul produs de Haloferax mediterranei (EPSH) prezint un interes deosebit datorit
structurii i proprietilor lui [Boan et al., 1998]. Acesta conine ioni sulfat i aminozaharuri, care
i confer aciune antiviral, are viscozitate mare i este rezistent la salinitate, temperaturi i pH.
La acest moment, bioprocesul de obinerere a EPSH i proprietile acestuia sunt foarte puin
cunoscute i analizate, principalele cauze fiind relativ recenta izolare a microorganismului i
numrul mare de alte polizaharide (cum este xantanul) care sunt deja foarte bine caracterizate.
Datorit potenialului biotehnologic ridicat al microorganismului i posibilitii identificrii unor
proprieti funcionale deosebite ale polizaharidului, se consider justificat iniierea cercetrilor
detaliate asupra bioprocesului de obinere a EPSH i asupra caracterizrii acestuia.
Lund n considerare cercetrile efectuate pn n prezent asupra polizaharidului extracelular
produs de Haloferax mediterranei, se poate afirma c:
Bioprocesul de cultivare a arheei poate fi mbuntit n scopul aprofundrii cunoaterii
acestuia i a obinerii de EPSH cu randament mare.
n vederea gsirii unor aplicaii valoroase pentru acest polizaharid neconvenional, se
impune analiza mai amnunit a compoziiei (monozaharide constituiente, structura,
conformaia, prezena substituenilor) i proprietilor funcionale ale acestuia (proprietile
reologice i cele chelatinizante).
Lucrarea are urmtoarele obiective:
I. Optimizarea cultivrii haloarheei H. mediterranei pentru producerea n cantitate mare a
polizaharidului extracelular.
I.1. Studiul influenei factorilor fizico-chimici asupra formrii de biomas microbian i de
polizaharid extracelular la cultivarea n baloane i n bioreactor n sistem batch.
I.2. Optimizarea cultivrii n sistem fed-batch.
I.3. Conducerea i controlul bioprocesului n condiii optime.
II. Caracterizarea polizaharidului din punct de vedere al compoziiei gruprilor structurale.
III. Analiza proprietilor funcionale ale polizaharidului (proprieti reologice, comportamentul
n prezena ionilor).
7
1. BAZELE TEORETICE ALE CERCETRII

1.2. POLIZAHARIDUL EXTRACELULAR PRODUS DE Haloferax mediterranei
(EPSH)

1.2.1. Microorganism productor (Haloferax mediterranei)

Microorganismul Haloferax mediterranei aparine domeniului Archaea, diviziunea
Euryarchaeota, ordinul Halobacteriales, familia Halobacteriaceae, genul Haloferax [Grant and
Larsen, 1989]. Acesta este o arhee extrem halofil (haloarhee), ce se dezvolt doar n medii cu
concentraii de la 2 M la aproximativ 3 M NaCl [DSouza et al. 1997].

H. mediterranei este aerob. Este un microorganism chemoorganotrof. Domeniul optim de
temperatur este 35C - 45C. pH-ul optim este 6,5. Prezint cretere optim la un coninut de
sruri de 20% (17% NaCl). Manifest mare necesitate de Mg
2+
, respectiv o concentraie minim
de 0,02M [Torreblanca et al., 1986] [Rodriguez-Valera, 1995].

1.2.2. Localizarea i funcia biologic a EPSH

Polizaharidul este sintetizat extracelular [Anton et al., 1988]. Nu i se cunoate funcia biologic.

1.2.3. Caracterizarea EPSH

Exist foarte puine studii asupra structurii i compoziiei acestui polizaharid. Analiza
compoziiei EPSH indic existena hexozelor neutre n proporie mare, alturi de un procent mic
de hexoamine i acizi uronici. Principalele hexoze neutre sunt manoza (n proporia cea mai
mare), glucoza i galactoza [Anton et al., 1988]. Studiul masei moleculare folosind
cromatografia pe site moleculare (Size Exclusion Chromatography SEC) a permis identificarea
a cinci fraciuni cu diverse mase moleculare variind n limite foarte largi, ntre 10
3
i 10
6

[Mirzarakhmetova et al., 2001]. Aa cum prezint cercetrile legate de compoziie, EPSH,
conine grupri sulfat (6%). Datorit coninutului n grupri sulfat, EPSH prezint poteniale
proprieti biologice (proprieti antivirale sau antitumorale [Rodriguez-Valera, 1992]).
Exist multe aspecte legate de caracterizarea EPSH care necesit cercetri: compoziia n
monozaharide i modul cum aceasta este afectat de condiiile de cultivare, structura,
conformaia, prezena substituenilor.

1.2.4. Proprietile funcionale ale EPSH

Studiul proprietilor reologice arat ca soluiile de EPSH au comportament viscos i
pseudoplastic [Boan et al., 1998], viscozitatea crete considerabil cu concentraia i este stabil
la modificarea condiiilor de pH, temperatur i salinitate n limite largi [Anton et al., 1988].
Nu exist studii ale altor proprieti funcionale ale EPSH.
8

1.3. CONDUCEREA BIOPROCESELOR

1.3.3. Conducerea bioproceselor de obinere a EPSH

La aprecierea comparativ a tipurilor de cultivri prezentate pn acum n literatur, se
consider c:
- EPSH se sintetizeaz n paralel cu formarea de biomas, nregistrnd un maxim de
productivitate la sfritul fazei de cretere exponenial;
- Cultivarea n baloane are durate mult mai mari ale fazei de lag (n jur de 50 ore) i de
cretere exponenial (ntre 6 i 8 zile) fa de cultivarea n bioreactor n sistem batch (faza
de lag aproximativ 20 ore, iar faza exponenial ntre 24 i 48 ore);
- La cultivarea n baloane se nregistreaz formarea unei cantiti foarte mici de EPSH (mai
puin de 0,005 g/l), comparativ cu cultivarea n bioreactor n sistem batch (~ 3,5 g/l);
- Nu este neles i explicat mecanismul de sintez a polizaharidului, precum i fazele n care
acesta este sintetizat, rezultatele din literatur fiind contradictorii.

Nu exist cercetri publicate n literatura de specialitate legate de optimizarea bioprocesului de
obinere a EPSH, motiv pentru care sunt necesare cercetri asupra factorilor inhibitori ai
bioprocesului i pentru stabilirea strategiei de conducere a cultivrii. Astfel, lucrarea i propune
s studieze influena unor compui chimici i ageni fizici asupra cultivrii n scopul identificrii
parametrilor care pot mri producia de EPSH.
Dup identificarea parametrilor, se va urmri stabilirea i optimizarea unei strategii de cultivare
n sistem fed-batch a arheei pentru producererea de exopolizaharid, cu monitorizarea formrii de
biomas i EPSH.

2. MATERIALE I METODE

n cadrul acestei lucrri au fost adaptate/optimizate: instalaia de cultivare, metodele de
cuantificare a biomasei celulare, metodele de cuantificare a polizaharidului, metodele
cromatografice folosite la stabilirea structurii primare a EPSH, modelul matematic al
bioprocesului, metodele pentru analiza proprietilor funcionale ale microorganismului.
A fost elaborat i testat pentru prima dat programul de control i reglare a bioprocesului.

2.1. MICROORGANISM I MEDIILE DE CULTUR

2.1.1. Microorganism

A fost folosit microorganismul Haloferax mediterranei ATCC 33500, provenit de la DSMZ
(Deutsche Sammlung fr Mikroorganismen und Zellkulturen, Germany).
9
2.2. BIOPROCES

2.2.1. Cultivarea arheei n baloane dup un plan de experimentare factorial

Pentru cercetrile n baloane au fost selecionai trei factori: concentraia de glucoz (5 -25- 35
g/l), Mg
2+
(5 -25- 35 g/l) i K
(0,005 -0,015- 0,025 g/l) din compoziia mediului nutritiv. Pentru

studiul influenei acestora asupra bioprocesului s-a folosit un plan de experimentare factorial de
ordinul 2
3
. S-a construit modelul polinomial empiric bazat pe ecuaii de regresie, cu ajutorul
cruia s-au obinut suprafee de rspuns [Xiong et al., 2004].

2.2.2. Instalaia de cultivare

2.2.2.1. Cerine i realizarea tehnic

Instalaia folosit pentru cultivarea microorganismului este prezentat schematic n figura 2.1.

2.2.3. Conducerea cultivrii n bioreactor

2.2.3.1. Designul experimental

Bioprocesele conduse n sistem batch au studiat influena a trei factori (concentraia de glucoz,
concentraia de NaCl i temperatura) asupra producerii de biomas i de EPSH. Pentru aceasta,
s-au realizat cultivri variindu-se un singur parametru, astfel:
Primul set de cultivri a urmrit influena concentraiei de glucoz n domeniul 5 g/l 40 g/l
asupra proceselor de formare a biomasei i a EPSH.
NI Lab-
PC- 1200
Condiionare
semnale
Controler
debit aer
Mo-
tor
Analiza gaze
eliminate din
bioreactor
(O2, CO2)
Conexiune
serial
Bioreactor Mediu fed-
batch
Baz Acid Inocul
Ap rece
Temp
pO2
pH
Figura 2.1. Instalaia de laborator automatizat.
Alimentare bioreactor cu medii lichide;
Sistem de circulaie a apei pentru temperarea coninutului
bioreactorului;
Circulaie gaze;
10
Cel de-al doilea set de cultivri a urmrit influena concentraiei de NaCl n domeniul 125
g/l - 200 g/l asupra proceselor de formare a biomasei i a EPSH.
Cel de-al treilea set de cultivri a urmrit influena temperaturii asupra proceselor de formare
a biomasei i a EPSH. Bioprocesele au fost conduse la dou temperaturi: 38
o
C i 45
o
C.
Bioprocesele conduse n sistem fed-batch au urmrit optimizarea cultivrii n sistem fed-batch n
scopul obinerii de EPSH cu randament maxim. S-a urmrit influena glucozei i fosfatului
asupra producerii de biomas i de EPSH. Pentru aceasta, faza fed-batch a a fost condus astfel:
Concentraie mare de glucoz (2 g/l) i fosfat (0,045 g/l);
Concentraie medie de glucoz (0,7 g/l) i fosfat (0,03 g/l);
Concentraie mic de glucoz (0,1-0,2 g/l) i concentraie mare de fosfat (0,045 g/l);
Concentraie variabil de glucoz i concentraie mic de fosfat.

2.2.3.3. Cultivarea propriu-zis

Parametrii funciei de alimentare n sistem fed-batch

Funcia de alimentare a bioreactorului cu mediu nutritiv n faza fed-batch a bioprocesului a fost
de tip exponenial, avnd forma:

K
LabView
coeficient;
set
rata specific de cretere prescris (setat) pentru faza fed-batch, h
-1
;
c
X
concentraia de biomas, g/l; V
R
volumul mediului n bioreactor, l; y
XS
randamentul
de biomas obinut din substrat, g/g; c
S_in
concentraia de substrat n mediul de alimentare,
g/l; c
S
concentraia de substrat n bioreactor, g/l.
Coeficientul K
LabView
a avut valori variabile, n funcia de concentraia de glucoz c
S_in
i de
turaia iniial a pompei de alimentare cu mediu n faza fed-batch [Mironescu et al., 2003a]; c
X
,

a
fost

stabilit la fiecare experiment, n funcie de valorile practice determinate; V
R
a fost
ntotdeauna 5l; y
XS
= 0,5 g biomas/g substrat (glucoz) [Korz et al., 1995];
set
pentru faza fed-
batch a fost stabilit 0,05 h
-1
pe baza rezultatelor experimentale din cadrul lucrrii; c
S_in
a fost de
50 i 100 g/l; c
S
, a fost variat ntre 0,1 (la limita detectabil) i 2 g/l.

2.3. METODE DE ANALIZ

2.3.1. Cuantificarea consumului de nutrieni

2.3.1.1. Cuantificarea consumului de glucoz

La cuantificarea glucozei s-a folosit testul Glucose Liquicolor (Human, Wiesbaden, Germania).

2.3.1.2. Cuantificarea consumului de fosfat

La cuantificarea PO
4
3
s-a utilizat testul Spectroquant 14842 (Merck, Darmstadt, Germania).
[2.1.]
.
) (
_
_
t
S in S XS
R X set
LabView LabView S
set
e
c c y
V c
K f

11
2.3.2. Cuantificarea biomasei microbiene formate

La cuantificarea biomasei s-au folosit dou metode: o metod spectrofometric, indirect i una
gravimetric, direct, care au fost apoi corelate. La corelarea densitii optice (DO la 600 nm) cu
substana uscat s-au obinut dou funcii de calibrare [Mironescu et al., 2003b]:
- pentru concentraii mici de biomas (ntre 0 i 2,5 g/l):
4555 , 0 4145 , 1
1
= x y cu gradul de precizie R
2
=0,9563 [2.3.]
- pentru concentraii mari de biomas (peste 2,5 g/l):
8409 , 3 735 , 2
2
= x y cu gradul de precizie R
2
=0,9558 [2.4.]
care au fost folosite pentru calcularea concentraiei de biomas y exprimat ca substan uscat
(g/l) n funcie de DO (x n cele dou funcii) a probelor recoltate direct din bioreactor.

2.3.3. Cuantificarea EPSH format

Pentru cuantificarea EPSH s-a folosit acelai principiu ca la cuantificarea biomasei,
urmrindu-se gsirea unei corelaii ntre dou metode de analiz: o metod colorimetric,
indirect i una gravimetric, direct.
Metoda colorimetric a fost adaptat dup [Ramus, 1977] i se bazeaz pe reacia dintre un
reactiv ce conine alcian-blue (colorat albastru intens) i gruprile anionice ale EPSH, cu
formarea unui complex incolor care precipit. Dup separarea precipitatului, se determin
intensitatea coloraiei la 610 nm. Pentru eliminarea srurilor, supernatantul coninnd EPSH a
fost dializat cu apa distilat.
Pentru determinarea gravimetric a EPSH, n dializatul obinut la metoda colorimetric s-a
realizat precipitarea biopolimerului cu alcool etilic 96%, separarea i uscarea.
La corelarea celor dou metode s-a obinut funcia de calibrare [Mironescu et al., 2003c]:
1142 , 4 5361 , 0 + = x y cu gradul de precizie R
2
=0,9967 [2.5.]
unde y reprezint cantitatea de EPSH, g/l, iar x reprezint diferena ntre intensitatea culorii
reactivului cu alcian-blue msurat iniial i dup reacia cu EPSH.

2.3.5. Determinarea compoziiei n monozaharide a EPSH

Pentru determinarea compoziiei n monozaharide a EPSH, o metod deja existent [Du i
Anumula, 1998] a fost adaptat i mbuntit. Metoda presupune hidroliza acid a unui
compus coninnd zaharuri la monozaharide i identificarea a 6 monozaharide: glucozamin
GlcN, galactozamin GalN, galactoz Gal, manoz Man, glucoz Glc i fucoz Fuc folosind
cromatografie de lichid de nalt precizie cu faz invers RP-HPLC (Reverse-Phase High
Precision Liquid Chromatography) cu detecie n fluorescen, dup o prealabil derivatizare cu
acid antranilic a probelor hidrolizate.
La determinarea compoziiei n monozaharide a EPSH au fost parcurse trei etape de lucru:
12
1) Pregtirea probelor pentru analiza HPLC;
2) Hidroliza acid a EPSH;
3) Identificarea monozaharidelor din structura EPSH folosind metoda RP-HPLC.

2.3.5.2. Hidroliza acid a EPSH

Fiecare polizaharid prezint condiii specifice optime de hidroliz acid [Scherz i Bonn, 1998].
Cei mai ntlnii ageni de hidroliz sunt acidul trifluoracetic TFA pentru polizaharidele ce
conin monozaharuri neutre [Levander et al., 2001] [Kaiser i Benner, 2000], aa cum este
EPSH [Parolis et al., 1996]. Pentru optimizarea condiiilor de hidroliz acid a EPSH, s-a
realizat un experiment n care s-a urmrit studiul influenei concentraiei de TFA i a duratei
hidrolizei asupra descompunerii EPSH pn la monozaharide, fr distrugerea acestora. Pentru
determinarea gradului de hidroliz a EPSH s-a folosit cromatografia de excluzie molar
(instalaie de cromatografie LC-DOC Liquid-Chromatography Dissolved Organic Carbon
[Specht i Frimmel, 2000]), iar pentru analiza gradului de recuperare a monozaharidelor s-a
utilizat RP-HPLC.

2.3.5.3. Adaptarea metodei RP-HPLC pentru dozarea monozaharidelor din structura
EPSH

Cromatogramele RP-HPLC obinute la experimentele pentru gsirea condiiilor optime la
hidroliza acid cu TFA au prezentat peak-uri specifice GlcN, GalN, Gal, Man i Glc, dar i
peak-uri noi, neidentificate. Aceste rezultate, corelate cu cercetrile lui [Anton et al., 1988] (care
au identificat prezena n structura EPSH produs de H. mediterranei a manozei, glucozei i
galactozei, dar i a unui alt monomer, neidentificat) au condus la necesitatea mbuntirii
metodei RP-HPLC, pentru identificarea i dozarea altor monozaharide ce ar putea intra n
alctuirea EPSH. La alegerea monozaharidelor de testat s-a inut cont de literatura de
specialitate, patru monozaharide care se gsesc n compoziia exopolizaharidelor microbiene
fiind selectate: D-xiloza (Xi), D-riboza (Ri), arabinoza (Ara), rhamnoza (Rha).
O cromatogram tipic a soluiei multistandard de monozaharide este prezentat n figura 2.6.

2.3.6. Msurtori de spectroscopie n infrarou cu transformant Fourier (FTIR)

Pentru identificarea legturilor i a gruprilor din structura EPSH s-a folosit spectroscopia n
infrarou cu transformant Fourier FTIR (Fourier Transform Infrared Spectroscopy). S-a
2 3
4
6
7
+
8

9
1 Splarea
coloanei
1
0
+
1
1

Figura 2.6. Cromatogram tipic
obinut la analiza unei soluii
multistandard de monozaharide (100
mol/l) prin metoda RP-HPLC
folosind coloana LiChrospher 100
RP-18. 1- GlcN; 2- GalN; 3- exces
reactiv antranilic; 4- Gal; 5- Man; 6-
Glc, 7- Ri; 8- Ara; 9- Xi; 10+11-
Fuc+Rha

1
2
3
4 5
6 9
7+8

13
determinat absorbana probelor n intervalul de lungimi de unda 4000-400 cm
-1
, cu rezoluia de
4 cm
-1
utiliznd instalaia BONEM MB100.
Probele de EPSH liofilizate au fost pregtite conform [Lijour et al., 1994].

2.3.7. Determinarea dimensiunii EPSH

S-a folosit aparatul LS-230, firma BECKMAN COULTER, care permite msurarea particulelor
cu dimensiuni ntre 0,04 m i 0,4 m.

2.3.8. Msurtori reologice

Pentru msurtorile reologice s-a folosit reometrul RHEOPLUS/32, firma PHYSICA, Austria,
avnd geometrie tip con-plac CP 50-2 i sistem de temperare TEK 150P-C.
S-au aplicat dou tipuri de teste: de forfecare i de oscilaie. S-a urmrit i evoluia n timp a
mrimilor reologice la creterea temperaturii pn la 100C, folosind o ramp de 10C/minut.

2.3.9. Analiza proprietilor de legare a ionilor de ctre EPSH

S-a urmrit determinarea capacitii de legare a ionilor de ctre EPSH i comportamentul
biopolimerului n prezena ionilor mono- i divaleni prin msurarea viscozitii intrinsece, a
conductibilitii i a solubilitii soluiilor diluate de EPSH n soluii saline de concentraii
medii.

2.4. MODELAREA I SIMULAREA CRETERII I PRODUCERII DE METABOLIT

2.4.1. Identificarea parametrilor cinetici ai modelului

La identificarea parametrilor cinetici necesari pentru construirea modelului n faza batch s-au
folosit ecuaiile [Zarnea et al., 1980] [Mironescu et al., 2004a]:
;
;
;
X P
P
X S
S
X
X
c r
dt
dc
c r
dt
dc
c
dt
dc
=
=
=

unde rata specific de cretere, h
-1
; c
P
concentraia de metabolit, g/l;
r
S
rata specific de consum a substratului (glucoza), h
-1
; r
P
rata specific de formare a
metabolitului, h
-1
.

[2.6.]

[2.7.]

[2.8.]

;
S XS
r y =

S PS P
r y r =

I
n
S S S
S
S S
K c c K
c
r r
/
max ,
+ +
=

[2.9.]

[2.10.]

[2.11.]
14
3. REZULTATE I DISCUII

3.1. STUDIUL INFLUENEI FACTORILOR CHIMICI I FIZICI ASUPRA CRETERII
MICROORGANISMULUI I PRODUCERII DE EPSH

Principalii ageni chimici care prezint influen asupra formrii de biomas de H. mediterranei
i de EPSH sunt sursa i concentraia de carbon, concentraia de fosfat, magneziu, NaCl, oxigen.

3.1.1. Studiul influenei glucozei, magneziului i fosfatului asupra creterii
microorganismului i producerii de EPSH folosind modele de regresie i
metodologia suprafeelor de rspuns la cultivarea n baloane Erlenmeyer

3.1.1.1. Influena concentraiei de glucoz, ioni fosfat i ioni magneziu asupra formrii
de biomas microbian

Ecuaia de regresie obinut care descrie influena celor trei variabile asupra producerii de
biomas are forma :

3 2 1 3 2 2 1
25618 , 0 42821 , 1 37287 , 0 x x x x x x x + + + [3.1.]
unde y
1
este concentraia de biomas, x
1
este glucoza, x
2
este KH
2
PO
4
i x
3
este MgCl
2
.
6H
2
O
[Mironescu et al., 2003b].
La calcularea adecvanei modelului cu ajutorul funciei F-Fischer, s-a obinut valoarea
F=0,0213389. Aceast valoare este mai mic dect valoarea tabelar a lui F pentru nivelul de
semnificaie 0.05, ceea ce denot c modelul este adecvat pentru descrierea procesului.
Folosind modelul polinomial obinut, se poate estima evoluia produciei de biomas de H.
mediterranei ca funcie de concentraiile de glucoz, fosfat monopotasic i clorur de magneziu.
Pentru aceasta, s-au construit suprafee de rspuns 3-D, din care trei exemple sunt prezentate n
figura 3.2.

3.1.1.2. Influena concentraiei de glucoz, ioni fosfat i ioni magneziu asupra formrii
EPSH

Ecuaia de regresie obinut care descrie influena celor trei variabile asupra producerii de EPSH
are forma:
+ + + =
3 2 1 2
00182 . 0 00139 . 0 0.00577 0.01556 y x x x
3 2 1 3 2
0072 . 0 00562 . 0 x x x x x + + [3.2.]
unde y
2
este concentraia de EPSH, x
1
este glucoza, x
2
este concentraia de KH
2
PO
4
i x
3
este
concentraia de MgCl
2
.
6H
2
O [Mironescu et al., 2003c] .
La determinarea adecvanei modelului cu ajutorul funciei F-Fischer, s-a obinut valoarea
F=0,3592365, valoare care este mai mic dect valoarea tabelar a lui F pentru nivelul de
semnificaie 0.05, deci modelul este adecvat pentru descrierea procesului de producere de
polizaharid extracelular.
Ca i la analiza influenei celor trei variabile asupra biomasei, folosind modelul polinomial
obinut, se poate estima evoluia produciei de biomas de H. mediterranei ca funcie de
+ + + =
3 2 1 1
82138 , 3 16916 , 0 37517 , 1 34264 , 5 y x x x
15
concentraiile de glucoz, fosfat monopotasic i clorur de magneziu, construind suprafee de
rspuns 3-D, prezentate n figurile 3.3., 3.4. i 3.5. Suprafeele obinute folosind metodologia
RSM (Metodologia Suprafeelor de Rspuns) prezint forme deosebite, care ofer informaii
valoroase legate de procesul de biosintez a EPSH [Mironescu et al, 2005b].

Lund n considerare rezultatele obinute la analiza influenei celor trei variabile asupra creterii
(producerii de biomas) i formrii de metabolit primar EPSH, se poate afirma:
- glucoza manifest o foarte puternic influen asupra ambelor bioprocese;
- fosfatul de potasiu are aciune nedefinit;
- clorura de magneziu influeneaz pozitiv producerea de biomas i negativ siteza EPSH.

3.1.2. Studiul influenei glucozei, clorurii de sodiu i temperaturii asupra creterii
microorganismului i producerii de EPSH la cultivarea n sistem batch

Aa cum s-a observat i la analiza influenei concentraiilor de glucoz, ioni magneziu i ioni
fosfat asupra creterii i formrii de metabolit EPSH de ctre H. mediterranei la cultivarea n
baloane, glucoza manifest o aciune foarte puternic aupra microorganismului, influennd
procesul de biosintez a biomasei i pe cel de producere de polizaharid.
De asemenea, modelele 3.1. i 3.2. au relevat existena altor elemente ce influeneaz ambele
bioprocese, reprezentai de factorul liber n ambele modele. Literatura de specialitate relev
importana concentraiei de NaCl asupra producerii de EPSH de ctre arhee [Rodriguez-Valera
et al., 1991]. Astfel, n cadrul experimentelor realizate n bioreactor, unde au fost posibile
reglarea pH-ului, a intensitii agitrii i a temperaturii, precum i aerarea continu a mediului,
s-a urmrit stabilirea influenei a trei factori asupra formrii de biomas i EPSH:
A. Concentraia de glucoz la nceputul cultivrii.
B. Concentraia de NaCl n mediu pe durata cultivrii.
C. Temperatura de regim n timpul cultivrii.
Cultivrile au fost conduse n sistem batch. Pentru fiecare din cultivrile realizate, s-au
determinat cantitile de glucoz consumat, biomas i EPSH formate pe parcursul cultivrii.
Din valorile acestora s-au calculat ratele specifice de formare a biomasei i a EPSH i s-au
determinat funciile care descriu relaiile ntre cantitatea de biomas format, respectiv EPSH
sintetizat i factorii analizai.

3.1.2.1. Influena concentraiei de glucoz

3.1.2.1.1. Influena concentraiei de glucoz asupra formrii de biomas

Cantitatea de biomas format pe durata cultivrii trebuie corelat cu viteza de formare a
acesteia. n acest scop, s-au calculat ratele specifice de cretere n timpul fazei de cretere
exponenial a cultivrilor. Valorile obinute sunt preentate n figura 3.8.

15
5
10
15
20
25
30
35
0
,
0
0
5
0
0
,
0
1
0
,
0
1
5
0
,
0
2
0
,
0
2
5
1
10
Biomasa, g/l
MgCl2, g/l
KH2PO4, g/l
5
10
15
20
25
30
35
0,005
0,015
0,025
1
10
Biomasa, g/l
MgCl2, g/l
KH2PO4, g/l
5
10
15
20
25
30
35
0
,
0
0
5 0
,
0
1
0
,
0
1
5
0
,
0
2
0
,
0
2
5
1
10
100
Biomasa, g/l
MgCl2, g/l
KH2PO4, g/l

58
1
1
1
4
1
7
2
0
2
3
2
6
2
9
3
2
3
5
0,0050
0,011
0,017
0,023
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
0,035
E
P
S
H
,

g
/
l
MgCl2, g/l
KH2PO4, g/l
5
8
1
1
1
4
1
7
2
0
2
3
2
6
2
9
3
2
3
5
0,005
0,012
0,019
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
0,035
E
P
S
H
,

g
/
l
MgCl2, g/l
KH2PO4, g/l
5
8
1
1
1
4
1
7
2
0
2
3
2
6
2
9
3
2
3
5
0,005
0,011
0,017
0,023
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
0,035
E
P
S
H

,

g
/
l
MgCl2, g/l
KH2PO4, g/l

(a) Glucoza 5 g/l
Figura 3.2. (extras) Estimarea influenei celor trei variabile (glucoza, Mg
2+
i PO
4
3-
) asupra produciei de biomas. Suprafaele de rspuns
au fost obinute meninnd concentraia de glucoz constant i variind concentraiile de magneziu i fosfat.
Figura 3.3. Estimarea influenei celor trei variabile (glucoza, Mg
2+
i PO
4
3-
) asupra produciei de EPSH. Suprafaele de rspuns au fost
obinute meninnd concentraia de glucoz constant i variind concentraiile de magneziu i fosfat.
(b) Glucoza 20 g/l (c) Glucoza 35 g/l
(a) Glucoza 5 g/l
(b) Glucoza 20 g/l (c) Glucoza 35 g/l

16

Rata specific de cretere nregistreaz valori mari pentru acest microorganism atunci cnd n
mediul nutritiv iniial exist o cantitate mic de glucoz (n jurul valorii de 5 g/l) i scade cu
creterea cantitii de glucoz n mediu, rezultat care indic efectul inhibitor al glucozei n
cantiti mari asupra formrii de biomas la cultivarea n bioreactor.

3.1.2.1.2. Influena concentraiei de glucoz asupra formrii de EPSH

La toate cultivrile realizate pentru studiul influenei concentraiei de glucoz asupra
microorganismului, cantitatea de EPSH produs la sfritul fazei de cretere exponenial este
n jurul valorii de 5 g/l, att n bioprocesele la care cantitatea de glucoz n mediu a fost mic,
ct i n bioprocesele la care s-a utilizat cantitate mare de glucoz n mediu. Procesul de
sintez a EPSH nu pare a fi corelat cu concentraia de glucoz n mediu i nici cu cantitatea de
biomas format. Rezultatul contrazice observaiile lui [Severina et al., 1989] i [Mironescu et
al., 2003c], referitoare la influena pozitiv a concentraiei de glucoz asupra producerii de
EPSH la cultivarea n baloane. Deoarece diferena dintre cele dou tipuri de bioprocese const
n condiiile fizice ale cultivrii (aerare, pH), rezultatul demonstreaz importana vital a
controlul riguros al bioprocesului.

y = -0,001x + 0,0677
R
2
= 0,9984
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Figura 3.8. Variaia ratei specifice de
cretere cu concentraia iniial de
glucoz n mediul nutritiv la cultivarea
n sistem batch a arheei Haloferax
mediterranei
Figura 3.9. Variaia ratei specifice
de formare a metabolitului (EPSH)
r
EPSH
cu concentraia iniial de
glucoz n mediul nutritiv la
cultivarea n sistem batch a arheei
Haloferax mediterranei
y = -0,0007x + 0,0712
R
2
= 0,9784
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
R
a
t
a

s
p
e
c
i
f
i
c

d
e

c
r
e
t
e
r
e

,

h
-
1

Concentraia glucoz, g/l
R
a
t
a

s
p
e
c
i
f
i
c

d
e

f
o
r
m
a
r
e

E
P
S
H

r
E
P
S
H
,

h
-
1

Concentraia glucoz, g/l
17
La aprecierea evoluiei ratei specifice de formare a metabolitului (EPSH) r
EPSH
n timpul
fazei de cretere exponenial a cultivrilor n funcie de cantitatea de glucoz existent n
mediu (figura 3.9.), se observ c valoarea ratei specifice de formare a EPSH scade cu
creterea concentraiei de glucoz n mediu la nceputul cultivrii.
Lund n considerare rezultatele obinute la cultivrile n sistem batch realizate pentru studiul
influenei concentraiei de glucoz, se pot trage urmtoarele concluzii:
- concentraii diferite de glucoz n mediu la nceputul cultivrii nu influeneaz sinteza
EPSH;
- la concentraii mari, glucoza are efect inhibitor asupra formrii de biomas i EPSH.

3.1.2.2. Influena concentraiei de NaCl

Etapa urmtoare de experimentri a constat n testarea influenei concentraiei de NaCl asupra
formrii EPSH. Alegerea NaCl a fost motivat de urmtoarele observaii:
- microorganismul se dezvolt foarte bine n medii lichide coninnd ntre 10 i 35% sare
[Rodriguez-Valera et al., 1980];
- creterea concentraiei de NaCl pn la 30% prezint influen pozitiv asupra produciei
de EPSH [Rodriguez-Valera et al., 1991];
- n multe cazuri, microorganismele sintetizeaz exopolizaharide ca protecie contra
mediului nconjurtor [Sutherland, 1990]. Deoarece n mediile naturale i artificiale n care
se dezvolt Haloferax mediterranei concentraia de NaCl atinge valori extreme, se poate
presupune c microorganismul produce EPSH pentru a proteja celulele de sruri (NaCl).
Pentru a studia influena NaCl asupra formrii de biomas microbian i EPSH s-au realizat
cultivri n care concentraia de NaCl a variat n domeniul 125 200 g/l, respectiv 2M3,5 M;
concentraia total de sruri existente n mediul de cultur a variat n domeniul 2,43,7 M.
inndu-se cont de rezultatele obinute la studiul influenei concentraiei iniiale de glucoz
asupra microorganismului (punctul 3.1.2.1.), cultivrile s-au realizat n medii cu aproximativ
5 g/l glucoz la nceputul fazei batch.

3.1.2.2.1. Influena concentraiei de NaCl asupra formrii de biomas

Rata specific de cretere la cultivarea n sistem batch n condiii controlate scade cu creterea
concentraiei de NaCl n mediu, aa cum se observ din figura 3.12. La cultivarea n
bioreactor n condiii controlate de pH, temperatur, aerare i agitare, valoarea ratei specifice
de cretere scade cu creterea concentraiei de NaCl n mediu,
optim
nregistrndu-se la
cultivarea n mediile cu 125 g/l NaCl. Scderea este evident pentru concentraii cuprinse
ntre 125 i 150 g/l; atunci cnd cantitatea de NaCl este 150 g/l, are valori apropiate.
Scderea cu creterea concentraiei de NaCl poate fi atribuit efectului inhibitor al clorurii
de sodiu asupra dezvoltrii microorganismului.
18

y = -0,0349Ln(x) + 0,2333
R
2
= 0,8302
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
100 125 150 175 200 225

3.1.2.2.2. Influena concentraiei de NaCl asupra formrii de EPSH

Variaia ratei specifice de formare a metabolitului (EPSH) r
EPSH
n timpul fazei de cretere
exponenial cu cantitatea de NaCl din mediu este redat n figura 3.14. Se observ c valoarea
r
EPSH
crete cu creterea concentraiei de NaCl n mediu. La concentraii ale clorurii de sodiu
de 200 g/l n mediu, se ajunge la rate specifice de formare a EPSH de 0,1 h
-1
.
Lund n considerare rezultatele obinute la cultivrile n sistem batch realizate pentru studiul
influenei concentraiei de clorur de sodiu asupra formrii de biomas i de EPSH, se poate
afirma c:
- NaCl are efect inhibitor asupra formrii biomasei i efect stimulator asupra sintezei EPSH;
- microorganismul pare s sintetizeze biopolimerul extracelular ca protecie contra
concentraiilor mrite de NaCl.

y = 0,0252e
0,0072x
R
2
= 0,9492
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
100 125 150 175 200 225

3.1.3. Identificarea parametrilor cinetici i modelarea fazei batch a
bioprocesului

Pentru identificarea parametrilor cinetici ai bioprocesului i pentru modelarea fazei batch, s-a
construit un program folosind MatLab, care se bazeaz pe ecuaii cinetice [Mironescu et al.,
de cretere cu concentraia de
NaCl n mediul nutritiv la cultivarea
n sistem batch a arheei Haloferax
mediterranei
de formare a metabolitului (EPSH)
r
EPSH
cu concentraia de NaCl n
mediul nutritiv la cultivarea n
sistem batch a arheei Haloferax
mediterranei
R
a
t
a

s
p
e
c
i
f
i
c

d
e

c
r
e
t
e
r
e

,

h
-
1

Concentraia NaCl, g/l
R
a
t
a

s
p
e
c
i
f
i
c

d
e

f
o
r
m
a
r
e

E
P
S
H

r
E
P
S
H
,

h
-
1

Concentraia NaCl, g/l
19
2004a]. Programul a fost aplicat pentru mai multe cultivri conduse n sistem batch. Un
exemplu de cum aproximeaz modelul datele experimentale este prezentat n figura 3.16.
Modelul obinut este nesegregat,
nestructurat.

3.2. OPTIMIZAREA CULTIVRII N SISTEM FED-BATCH

Influena glucozei ca surs de carbon asupra dezvoltrii microorganismului i asupra formrii
de EPSH a fost evideniat att de rezultatele cultivrii n baloane, ct i de cele ale cultivrii
n sistem batch n bioreactor. Astfel, s-a considerat c acest factor poate influena i
randamentul de formare a polizaharidului la cultivarea n sistem fed-batch, fiind studiat i la
acest tip de cultivri. Dei experimentele factoriale nu au evideniat aciunea limitant a
fosforului, s-a inut cont de datele prezentate n literatura de specialitate [Anton et al., 1988] i
s-au realizat experimente la care s-a variat concentraia acestuia, urmrindu-se influena
concentraiei de fosfat asupra formrii biomasei i sintezei EPSH.

3.2.2. Conducerea proceselor in sistem fed-batch

Durata fazei fed-batch a fost dependent de volumul bioreactorului, dar i de concentraia de
EPSH, deoarece s-a observat c n toate bioprocesele concentraia polizaharidului crete pn
la atingerea unei valori maxime, dup care se menine constant sau chiar scade.
Sunt prezentate sub form grafic numai fazele batch i fed-batch, faza de lag nefiind
considerat important pentru descrierea procesului.

3.2.2.2. Evoluia bioprocesului n medii cu concentraie mare de glucoz i fosfat n
faza fed-batch

n prima etap s-a urmrit analiza influenei concentraiilor relativ mari de glucoz (2 g/l) i
de fosfat (0,05 g/l) asupra formrii de biomas i EPSH n faza fed-batch. Rezultatele unei
astfel de cultivri sunt prezentate n figura 3.20. Iniierea fazei fed-batch are loc atunci cnd
Figura 3.16. ????????

Figura 3.16. Compararea datelor
experimentale (puncte) cu modelul
matematic (linia continu) obinut
pentru cultivarea n sistem batch a
arheei. Graficele reprezint:
a formarea de biomas x;
b consumul de glucoz S;
c formarea de EPSH
Durata cultivrii, h
b
a
c
20
arheea este n faza de cretere exponenial iar n mediu exist glucoz i ioni fosfat n
cantitate mare. Formarea de polizaharid nu pare, ns, a fi stimulat de condiiile testate, n
bioreactor atingndu-se valoarea maxim de 8,83 g/l EPSH, dup care concentraia acestuia
scade, c
EPSH_medie
fiind 8,5 g/l.

Figura 3.20. Evoluia concentraiilor compuilor i a gazelor eliminate din bioreactor la
cultivarea n sistem fed-batch la care parametrii funciei de alimentare au fost: V
R
= 5 l; m
X
=
7,65 g; c
S_in
= 100 g/l glucoz; c
S
= 2 g/l glucoz; K
LabView
= 27; = 0,05 h
-1
; aproximativ 0,05
g/l fosfat n faza fed-batch. Parametrii aerrii : D
_aer
1 l/minut; pO
2
= 25% n faza fed-batch

n figura 3.20. sunt prezentate i variaiile ratei de preluare a oxigenului OUR, a ratei de
formare a carbonului CPR i coeficientului respirator RQ, care sunt direct corelate cu starea
fiziologic i metabolismul energetic ale populaiei de celule din bioreactor. Se observ c n
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
12 18 24 30 36 42 48 54 60
Durata cultivrii, h
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
1,1
0,04
0,06
0,08
0,1
12 18 24 30 36 42 48 54 60
Fosfat
C
o
n
c
e
n
t
r
a
i
a
,

g
/
l

Durata cultivare, h
Start fed-batch
Fosfat
D
e
b
i
t
e

g
a
z
e
,

g
/
l
.
h

;

C
o
e
f
i
c
i
e
n
t
u
l

r
e
s
p
i
r
a
t
o
r
,

%

creterea temperaturii
la 45C
Glucoza
Biomasa
EPSH
OUR, g/l
.
h
CPR, g/l
.
h
RQ, %
21
faza batch OUR i CPR cresc exponenial, odat cu creterea populaiei microbiene (are loc
intensificarea respiraiei); RQ ajunge la valoarea 0,7, ceea ce arat c procesul decurge n
condiii de aerobioz [Muttzall, 1993].
Analizndu-se comportarea gazelor eliminate din bioreactor, se observ c dup 3,5 ore de la
nceputul fazei fed-batch se produce o modificare a metabolismului energetic, CPR crescnd
pn cnd CPR = OUR = 0,2965 g/l
.
h, devenind apoi mai mare dect OUR. Creterea
populaiei microbiene i formarea de EPSH continu s aib loc fr perturbaii. Modificarea
CPR > OUR ar putea fi datorat ngreunrii transferului oxigenului n bioreactor datorit
creterii viscozitii la acumularea de polizaharid n mediu.
Se poate concluziona c atunci cnd concentraiile ambilor parametri testai (glucoza i
fosfatul) sunt meninute la valori mari, ambele procese, cel de cretere i cel de sintez de
polizaharid extracelular, sunt stimulate; formarea de biomas este favorizat. Atunci cnd se
atinge concentraia maxim de EPSH, concentraia de polizaharid scade sau se menine
constant, n timp ce biomasa continu s se formeze dup o funcie liniar. Din punct de
vedere metabolic, procesul este oxidativ (RQ < 1) [Muttzall, 1994].

3.2.2.3. Evoluia bioprocesului n medii cu concentraie medie de glucoz i fosfat n
faza fed-batch

n cea de-a doua etap a cercetrilor la cultivarea arheei n sistem fed-batch s-a urmrit
analiza influenei concentraiilor medii de glucoz i de fosfat asupra formrii de biomas i
EPSH n faza fed-batch. Rezultatele cultivrii sunt prezentate n figura 3.21.
Dei la iniierea fazei fed-batch concentraia de biomas este dubl fa de cazul anterior
(punctul 3.2.2.2.) iar populaia microbian se gsete nc n faza de cretere exponenial,
condiiile n care concentraiile celor doi compui sunt medii par s stimuleze sinteza
polizaharidului extracelular n defavoarea formrii de biomas. Astfel, iniial concentraia de
EPSH crete rapid pn la valoarea de 9 g/l, dup care stagneaz, metabolismul celular
orientndu-se imediat spre producerea de biomas.
La analiza gazelor eliminate din bioreactor, se observ c la nceputul fazei de cretere
exponeniale OUR > CPR, corespunznd la o concentraie maxim de EPSH sub 3 g/l; n
continuare CPR devine mai mare dect OUR, acest raport meninndu-se pn la sfritul
cultivrii. Deoarece microorganismul se gsete nc n faza de cretere exponenial, acest
comportament nu poate fi pus dect pe seama nrutii transportului oxigenului n mediu
datorit formrii de polizaharid extracelular.
n faza fed-batch RQ crete, atingnd valori n jurul valorii 1 i chiar mai mari, ceea ce indic
orientarea metabolismului spre fermentaie anaerob [Muttzall, 1994].
n concluzie, atunci cnd concentraiile ambilor parametri testai (glucoza i fosfatul) sunt
meninute la valori medii, ambele procese, de cretere i de sintez de polizaharid
22
extracelular, sunt stimulate, formarea de EPSH fiind, ns, clar favorizat. Atunci cnd se
atinge concentraia maxim de EPSH (8,8 g/l n 31 de ore de cultivare n sistem fed-batch),
concentraia de polizaharid scade sau se menine constant, n timp ce biomasa continu s se
formeze. i n acest caz, metabolismul este de tip oxidativ.

cultivarea n sistem fed-batch. Parametrii funciei de alimentare au fost: V
R
= 5 l; m
X
= 19,36
g; c
S_in
= 50 g/l glucoz; c
S
= 0,7 g/l glucoz; K
LabView
= 8,91; = 0,05 h
-1
; aproximativ 0,03 g/l
fosfat n faza fed-batch. Parametrii aerrii : D
_aer
1 l/minut; pO
2

3.2.2.4. Evoluia bioprocesului n medii cu concentraie mic de glucoz i
concentraie mare de fosfat n faza fed-batch

Analiza influenei concentraiilor mici de glucoz (aproximativ 0,1-0,2 g/l) i a concentraiilor
mari de fosfat (0,045 g/l) asupra formrii de biomas i EPSH n faza fed-batch a permis
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
1,1
1,2
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45
Fosfat, g/l Fosfat
Durata cultivrii, h
C
o
n
c
e
n
t
r
a
i
a
,

g
/
l

Start fed-batch
D
e
b
i
t
e

g
a
z
e
,

g
/
l
.
h

;

C
o
e
f
i
c
i
e
n
t
u
l

r
e
s
p
i
r
a
t
o
r
,

%

Glucoza
Biomasa
EPSH
OUR, g/l
.
h
CPR, g/l
.
h
RQ, %
23
identificarea condiiilor optime de cultivare pentru obinerea polizaharidului. Rezultatele unei
cultivri sunt prezentate n figura 3.22.

cultivarea n sistem fed-batch. Parametrii funciei de alimentare au fost: V
R
= 5 l; m
X
= 11,65
g; c
S_in
= 100 g/l glucoz; c
S
= 0,1 g/l glucoz; K
LabView
= 18; = 0,05 h
-1
; aproximativ 0,045
g/l fosfat n faza fed-batch. Parametrii aerrii : D
_aer
1 l/minut; pO
2

Odat cu iniierea fazei fed-batch, se remarc o evoluie foarte diferit a biomasei i
metabolitului. Concentraia de biomas crete foarte puin la nceput i rmne apoi aproape
constant la valori de 5 g/l, n timp ce concentraia de EPSH crete foarte mult, de la 5,69 la
nceputul fazei fed-batch la 14,37 dup 23 ore de alimentare cu mediu cu concentraie mic de
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
0
0,25
0,5
0,75
1
1,25
1,5
1,75
2
2,25
2,5
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0,1
12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
Fosfat, g/l
Start fed-batch
D
e
b
i
t
e

g
a
z
e
,

g
/
l
.
h

;

C
o
e
f
i
c
i
e
n
t
u
l

r
e
s
p
i
r
a
t
o
r
,

%

Fosfat
Durata cultivrii, h
C
o
n
c
e
n
t
r
a
i
a
,

g
/
l

Glucoza
Biomasa
EPSH
OUR, g/l
.
h
CPR, g/l
.
h
RQ, %
24
glucoz i concentraie mare de fosfat. n condiiile n care n mediul nutritiv glucoza devine
limitativ, metabolismul arheei se comut pe producerea de polizaharid.
Pe parcursul fazei batch CPR devine egal cu OUR, dar, spre deosebire de celelalte cultivri,
trecerea la valori CPR > OUR nu este clar delimitat, observndu-se prezena unui domeniu
de variaie.Pe durata fazei fed-batch ratele OUR i CPR, precum i RQ prezint fluctuaii
foarte mari, care ar putea fi datorate concentraiei mari de EPSH, dar i unor modificri la
nivel metabolic.
n concluzie, la cultivarea n sistem fed-batch a arheei n medii cu concentraii mici de
glucoza i concentraii mari de fosfat procesul de sintez de polizaharid extracelular este
stimulat, n timp ce formarea de biomas este inhibat. Atunci cnd se atinge concentraia
maxim de EPSH (14,5 g/l n 48 de ore de cultivare n sistem fed-batch), concentraia de
polizaharid scade sau se menine constant, n timp ce biomasa continu s se formeze.
Metabolismul este de tip oxidativ n faza batch i la nceputul fazei fed-batch, fiind apoi
oxidativ-fermentativ (cu cele dou tipuri de metabolism alternnd) pe durata fazei fed-batch.

3.2.2.5. Evoluia bioprocesului n medii cu concentraie variabil (mic i mare) de
glucoz i concentraie mic de fosfat n faza fed-batch

Pentru a analiza aciunea fosfatului asupra celor dou bioprocese (formarea de biomas i
EPSH), n cea de-a patra etap a cercetrilor s-au realizat cultivri la care s-a urmrit pstrarea
concentraiei de fosfat la valori mici n mediu, variindu-se concentraia de glucoz. Astfel,
faza batch a decurs n condiii identice cu celelalte cultivri, iar faza fed-batch s-a desfurat
n dou etape : etapa I la concentraii mici de glucoz (0,1-0,2 g/l) i de fosfat (0,02 g/l) i
etapa II la concentraii mari de glucoz (2 g/l) i concentraii mici de fosfat. Rezultatele au
relevat c fosfatul nu manifest influen asupra celor dou bioprocese studiate; n schimb, se
relev aciunea glucozei:
- procesul de sintez de polizaharid extracelular este stimulat de concentraii mici de glucoz
n faza fed-batch, n timp ce formarea de biomas este inhibat.
- procesul de formare de biomas este stimulat de concentraii mari de glucoz n faza fed-
batch, n timp ce sinteza de polizaharid extracelular este inhibat.

3.3. ELABORAREA, TESTAREA I OPTIMIZAREA PROGRAMULUI BioLab DE
CONTROL AL BIOPROCESULUI

Cerinele pe care le ndeplinete programul BioLab sunt:
- permite conducerea procesului, prin folosirea funciei de alimentare n sistem fed-batch;
- realizeaz controlul temperaturii, pH-ului i oxigenului dizolvat n mediul nutritiv;
- permite stocarea datelor, cu posibilitatea exportrii lor.
Pentru realizarea acestor deziderate, programul are arhitectur structurat pe trei nivele:
interfaa de proces, nivelul de control i interfaa de utilizare, prezentat n figura 3.24.
25
n cadrul acestei lucrri s-a elaborat programul Biolab, care este adecvat pentru conducerea
i controlul bioprocesului. Programul permite reglarea temperaturii, pH-ului i oxigenului
dizolvat n mediu, precum i alimentarea bioreactorului dup o funcie de tip exponenial cu
foarte bune rezultate practice.

3.4. CARACTERIZAREA EPSH

n vederea gsirii unor aplicaii n industria alimentar sau n alte domenii, polizaharidul a fost
caracterizat din punct de vedere al compoziiei i al proprietilor funcionale.

3.4.1. Compoziia n monozaharide a EPSH

3.4.1.1. Analiza i optimizarea metodei de hidroliz acid a EPSH

gradului de descompunere a EPSH

Pentru studiul influenei concentraiei de acid trifluoracetic TFA ca agent de hidroliz i a
duratei hidrolizei asupra gradului de descompunere a EPSH s-au realizat analize de
cromatografie de excluzie molar SEC. Analiza cromatografic ofer o apreciere cantitativ
comparativ. Astfel, lund n consideraie intensitatea semnalelor DOC la momentul
AGIT_AI
DO_AI
TEMP_AI
pH_AI
GRAPH
GRAPH
GRAPH
GRAPH

BAZA DE DATE
MS ACCESS
CALIBRARE
CALIBRARE
CALIBRARE
CALIBRARE
TEMP_DO
pH_DO
AGIT_AO
Interfaa de proces
Nivelul de control
Interfaa de utilizare
CONTROL
P.I.D.
CONTROL
ON/OFF
BAL_SI

N
A
T
I
O
N
A
L

I
N
S
T
R
U
M
E
N
T
S
L
A
B

P
C
-
1
2
0
0
FEED_AO
ALIMEN-
TARE

Figura 3.24. Structura
programului BioLab
26
corespunztor monozaharidelor, se poate observa o variaie a valorii acesteia, cauzat de
variaia concentraiei n monozaharide a probelor tratate diferit.
Pe baza rezultatelor obinute se poate ntocmi o scar a aciunii concentraiei de TFA asupra
EPSH, ordinea fiind
3M > 4,5M > 2M > 1M >> 0,1M [Mironescu et al., 2004c].

3.4.1.1.2. Analiza influenei concentraiei de TFA i a duratei hidrolizei asupra ratei
de formare a monozaharidelor

Pentru studiul influenei concentraiei de TFA i a duratei hidrolizei asupra ratei de formare a
monozaharidelor s-a utilizat o alt metod cromatografic, cromatografia de lichid cu faz
invers RP-HPLC, care permite dozarea individual a monozaharidelor din compoziia EPSH
rezultate la hidroliza acid.
Analizele RP-HPLC ale concentraiilor de monomeri manoza i glucoza indic scderea
intensitii aciunii TFA asupra EPSH n ordinea
Pentru monozaharidele neutre manoza (Man) i glucoza (Glc), care constituie principalii
componeni ai polizaharidului, concentraia maxim a fost atins la tratamentul cu TFA 3M
timp de 6 ore, rezultatul fiind n acord cu determinrile SEC.
Aciunea TFA este difereniat pentru cele dou monozaharide neutre majoritare din
compoziia EPSH, manoza fiind eliberat mult mai repede din structura acestuia dect
glucoza. aceast analiz oferind i informaii legate de modul de aciune a agentului de
hidroliz asupra polizaharidului i informaii legate de conformaie.
Corelnd rezultatele celor dou tipuri de analize cromatografice folosite, condiiile optime de
hidroliz a EPSH sunt corespunztoare tratamentului cu TFA 3M 6 ore la 100
o
C.

3.4.1.2. Determinarea compoziiei n monozaharide a EPSH

O cromatogram tipic obinut la analiza unei probe de EPSH purificat i liofilizat este
prezentat n figura 3.41. Cromatografia de lichid cu faz invers RP-HPLC permite analiza
monomerilor din compoziia polizaharidului EPSH, cu identificarea a ase monozaharide. Cei
ase monomeri identificai sunt: aminozaharuri (glucozamina i galactozamina) i zaharuri
neutre (manoza, glucoza, galactoza i riboza). Astfel, metoda cromatografic ofer informaii
valoroase asupra compoziiei EPSH.

3.4.1.3. Variaia compoziiei n monozaharide a EPSH pe durata cultivrii

Unele microorganisme sintetizeaz polizaharide a cror compoziie variaz pe parcursul
cultivrii, nu numai n funcie de sursa de carbon i de concentraia acesteia, dar i de stadiul
de dezvoltare [Bryan et al., 1986].

27
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
P1 P2 P3 P5 P7 P8 P9
%

d
i
n

c
a
n
t
i
t
a
t
e
a

t
o
t
a
l

m
o
n
o
z
a
h
a
r
i
d
e

m
a
j
o
r
e
GlcN GalN Gal Man Glc Ri

Figura 3.41. Cromatogram obinut folosind RP-HPLC cu detecie n fluorescen (volum de
injecie 100 l, coloan LiChrospher 100 RP-18, excitaie 360 nm, emisie 425 nm) la analiza
EPSH (2,8 g/l) hidrolizat cu TFA 3M 6 ore. 1 GalN; 2 GlcN; 3 Gal; 4- Man; 5 Glc; 6 Ri.

Nu exist studii legate de comportamentul EPSH la trecerea acestuia prin diverse stadii de
dezvoltare. Din acest motiv, determinarea compoziiei n monozaharide a polizaharidului pe
parcursul cultivrii este important, o astfel de analiz putnd oferi i informaii legate de
stabilitatea compoziiei EPSH. n figura 3.42. este prezentat rezultatul obinut la analiza
cromatografic a probelor recoltate; variaia fiecrui component major a fost calculat ca
procent din cantitatea total de componeni majori, considerat 100%.

Deoarece variaiile monomerilor sunt ns destul de mici pentru a fi luate n considerare, se
poate determina un raport mediu ntre componentele majore. Considernd galactozamina ca
element de referin, s-a obinut urmtorul raport:
Figura 3.42. Variaia compoziiei procentuale n monozaharide pe parcursul unei cultivri n
sistem fed-batch
GlcN GalN Gal Man Glc Ri
0
50
100
150
200
250
300
350
400
6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Timpul de eluie, min.
I
n
t
e
n
s
i
t
a
t
e
a

s
e
m
n
a
l
u
l
u
i

f
l
u
o
r
e
s
c
e
n
t
1
3
4
5
6
2
28
GlcN : GalN : Gal : Man : Glc : Ri = 1,65 : 1 : 4 : 19 : 12 : 3

3.4.2. Evidenierea legturilor i gruprilor din structura EPSH

Un spectru tipic al EPSH obinut la analiza FTIR a acestuia este prezentat n figura 3.43.
Analiza spectrului n infrarou ofer informaii foarte valoroase despre structura EPSH. Este
evideniat prezena acizilor uronici (banda spectral aflat ntre frecvenele 1630-1730 cm
-1
),
a aminozaharurilor (1550 cm
-1
)i a gruprilor sulfat (banda cuprins n intervalul 12301280
cm
-1
i centrat la 1250 cm
-1
) n compoziia polizaharidului microbian, precum i a cantitilor
mari de ap legat la nivelul acestuia .

3.5. Proprietile funcionale ale EPSH

Cercetrile prezentate n acest capitol au urmrit identificarea unor proprieti funcionale ale
EPSH. Lund n considerarea particularitatea acestui biopolimer de a se adapta la condiii de
salinitate foarte mare, s-a considerat mportant s se realizeze analize asupra structurii
acestuia i a modului cum este influenat aceasta de prezena srurilor ionilor monovaleni i
divaleni. Studiile s-au realizat n urmtorii pai:
Studiul comportamentului reologic al EPSH
- caracterizarea din punct de vedere reologic a polizaharidului;
- analiza influenei ionilor Na
+
Cl
-
asupra comportamentul reologic al biopolimerului.
Determinarea dimensiunilor polizaharidului ca atare i n prezena ionilor mono- i
divaleni.
Studiul capacitii de legare a ionilor mono- i divaleni de ctre EPSH folosind
msurtori de viscozitate intrinsec, conductibilitate i turbiditate.
A
b
s
o
r
b
a
n
a
,

%

Lungimea de und, nm
Figura 3.43. Spectrul FTIR al EPSH purificat
29
Corelarea rezultatelor acestor analize contribuie la nelegerea comportamentului
polizaharidului sintetizat de H. mediterranei n diverse condiii i a modului cum poate fi
influenat acest comportament n scopul gsirii unor aplicaii valoroase pentru EPSH.

3.5.1. Comportamentul reologic al EPSH

Cunotinele foarte limitate legate de proprietile reologice ale EPSH impun cercetarea
acestuia n diverse condiii.

3.5.1.2. Funciile de curgere i de viscozitate pentru soluii semiconcentrate

n prima etap a caracterizrii polizaharidului din punct de vedere a comportamentului
reologic, s-a urmrit obinerea funciilor de curgere (care exprim dependena efortului de
forfecare de rata de forfecare) i de viscozitate (viscozitatea n funcie de rata de forfecare) a
EPSH. Curbele obinute arat c EPSH manifest caracter pseudoplastic (sensibilitate la
forfecare), viscozitatea scznd cu creterea ratei de forfecare. Se observ c EPSH are
comportament pseudoplastic mult mai puin pronunat dect xantanul.

3.5.1.3. Aprecierea comportamentului viscoelastic

Comportamentul predominant solid sau predominant lichid n sistemele polizaharidice n
diverse condiii poate fi caracterizat prin msurarea rezistenei lor la deformaii oscilatorii la
amplitudine joas prin msurarea modulului de elasticitate G i a modulului de viscozitate
G, precum i a modulului complex i a viscozitii complexe [Morris, 1991].
Aprecierea comportamentului viscoelastic al EPSH s-a realizat n comparaie cu xantanul,
evoluia modulelor de elasticitate i de viscozitate a celor dou polizaharide fiind prezentat n
figura 3.46. Ambele polizaharide au comportament similar n soluiile 5%, dar cu solveni
diferii: apa pentru xantan i soluia salin nativ pentru EPSH. Aa cum se observ din figura
3.46., pentru cele dou soluii G > G ntr-o prim faz, ceea ce indic predominana
caracterului solid al ambelor polizaharide la frecvene joase. Acest comportament este
specific reelelor sub form de gel, ceea ce arat c att xantanul n medii apoase, ct i al
EPSH n mediul lui natural formeaz un hidrogel, fenomen des ntlnit la polizaharide
[Morris, 1991]. G nu este mult mai mare dect G, ceea ce arat c gelul format nu este
foarte puternic.
n cazul xantanului, se cunoate c n ap acesta formeaz gel prin asocierea lanurilor i
stabilirea unei reele intermoleculare; gelul format se ncadreaz n categoria gelurilor aa-
numite slabe [Norton et al., 1984]. Gelul format este suficient de rezistent pentru a reine
particulele mici (care altfel ar sedimenta), bule de aer mici sau picturi mici de ulei, pn se
ating frecvene de 50 s
-1
ale oscilaiei. n jurul acestei valori a frecvenei are loc destructurarea
gelului de xantan, aa cum se observ din figura 3.46.
30
Gelul format de EPSH n mediul salin natural este mult mai slab, structura acestuia
destabilizndu-se la frecvena de 5 s
-1
.
Odat ce structura ambelor geluri se destabilizeaz, G se menine la valori apropiate de cele
avute iniial, iar valoarea G scade foarte mult, rezultat care pune n eviden trecerea ntr-o
form n care starea lichid este predominant. Deoarece cele dou module evolueaz n
paralel, se poate afirma c structura nou format este stabil.
10
-10
10
-8
10
-6
10
-4
10
-2
10
0
10
2
10
4
Pa
G'
G''
10
-1
10
0
10
1
10
2
10
3
1/s
Angular Frequency

Figura 3.46. Modulul de elasticitate G i modulul de viscozitate G n funcie de frecven
pentru soluii 5% de xantan n ap (cerc), EPSH n ap (triunghi) i EPSH n soluii native cu
200 g/l NaCl (ptrat)

Deoarece s-a constatat c Haloferax mediterranei produce polizaharidul extracelular ca
protecie contra mediului salin, s-a luat n considerare posibilitatea ca EPSH s-i modifice
conformaia la scoaterea din mediul salin. Astfel, pe lng msurtorile dinamice ale EPSH n
mediul ei natural (aproximativ 200 g/l NaCl), s-au fcut determinri reologice i pentru
polizaharid n medii saline naturale diluate i n soluii apoase (n absena srii). Rezultatele
sunt prezentate n figurile 3.47. 3.49.
Odat ce cantitatea de clorur de sodiu din soluia salin de EPSH scade prin diluare cu ap,
au loc modificri la nivel structural, care pot fi puse n eviden de ctre msurtorile
reologice. Astfel, chiar i n medii diluate 1 : 10 cu ap, n domeniul de frecvene analizat
(10
-1
10
1
s
-1
) polizaharidul se comport ca un gel structurat (modulul de viscozitate i de
elasticitate nregistreaz valori paralele [Morris, 1991]) la care starea lichid este
predominant (G> G) [Cesaro et al., 1992].
Frecvena angular
31
Acest rezultat ofer informaii valoroase asupra ncrcrii ionice a EPSH, deoarece
comportamentul polizaharidului poate fi direct corelat cu caracterul amfolitic al acestuia. n
mediul natural, tria ionic a soluiei saline este foarte mare (I 425) i neutralizeaz sarcinile
pozitive i negatice ale EPSH. Gelul biopolimeric are o anumit conformaie, stabil. Diluarea
cu ap a mediului conduce la modificarea triei ionice a acestuia. n aceste condiii,
modificarea de structur nu poate fi datorat dect faptului c sarcinile polizaharidului nu mai
sunt n totalitate neutralizate, ceea ce determin distrugerea structurii iniiale cu formarea unei
alte structuri.
10
-9
10
-8
10
-7
10
-6
10
-5
10
-4
10
-3
10
-2
10
-1
10
0
Pa
G'
G''
10
-1
10
0
10
1
1/s
Angular Frequency

Figura 3.47. Modulul de elasticitate G i modulul de viscozitate G n funcie de frecven
pentru soluii 5% de EPSH n ap (cerc), EPSH n mediu natural salin concentrat (triunghi),
EPSH n mediu salin diluat 1 : 10 cu ap distilat (ptrat), EPSH n mediu salin diluat 1 : 5
cu ap distilat (romb), EPSH n mediu salin diluat 1 : 2 cu ap distilat (rozet)

Un astfel de comportament este ntlnit la poliamfionii cu trie ionic mare [Nisato and
Candau, 2002]. Se poate deci afirma c EPSH se manifest ca un poliamfion cu ncrctur
ionic mare. innd cont de componena acestuia, polizaharidul are caracter polianionic mai
puternic, dat de gruprilor carboxil i de gruprile sulfat; caracterul policationic este dat de
gruprile amino din structura aminozaharurilor, n numr destul de mic n structura EPSH.
La toate analizele efectuate, modulul de viscozitate rmne n acelai domeniu de valori, att
pentru EPSH n mediu salin, ct i pentru probele diluate cu ap (pn la 100% ap), G fiind
foarte puin dependent de frecven, fenomen observat i la xantan [Stokke et al., 1998].
i n evoluia viscozitii complexe se poate identifica modificarea de structur, att pentru
xantan, ct i pentru EPSH (figura 3.49.a.). Viscozitatea complex * descrete pentru toate
Frecvena angular, s
-1

32
10
-2
10
-1
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
5
10
6
10
7
tan( )
10
-1
10
0
10
1
10
2
1/s
Angular Frequency
soluiile analizate la tratamentul la frecvene joase (0,1 1 s
-1
). Odat cu creterea frecvenei,
* capt o alur cresctoare. Acest comportament este diferit de al altor polizaharide i
indic o posibil aplicare a soluiilor apoase de EPSH n medii supuse la ocilaii puternice, ca
ageni de viscozitate.
Momentul trecerii din starea predominant solid n cea predominant lichid este foarte bine
determinat prin calcularea tangentei de pierdere (figura 3.49.b.). Acest moment este direct
corelat cu masa molecular, el aprnd mai repede la sistemele ce conin substane cu mase
moleculare mai mari [Stokke et al., 1998].
Astfel, din analizele reologice realizate se poate aprecia c masa molecular a EPSH n stare
nativ (n mediu salin concentrat) este mai mare dect a xantanului i c la scoaterea
polizaharidului produs de H. mediterranei din mediul lui natural are loc o modificare a
structurii, cu scderea masei moleculare.
10
-3
10
-2
10
-1
10
0
10
1
10
2
Pas
| *|
10
-1
10
0
10
1
10
2
1/s
Angular Frequency

Figura 3.49. Viscozitatea complex * (a) i tangenta de pierdere tan (b) n funcie de
frecven pentru soluii 5% de EPSH n ap (cerc) , EPSH n mediu salin concentrat
(triunghi), EPSH n mediu salin diluat 1 : 10 cu ap distilat (ptrat), EPSH n mediu salin
diluat 1 : 5 cu ap distilat (romb), EPSH n mediu salin diluat 1 : 2 cu ap distilat (rozet),
comparativ cu xantanul (linie cu cruce)

3.5.1.4. Comportamentul reologic al EPSH sub aciunea temperaturii

La 30C i la aplicarea rampei de temperatur pn la 100C, cele dou polizaharide au
comportament de hidrogel cu faza solid predominant (G este mult mai mare dect G,
diferena ntre cele dou module este de 10
6
). Toate modulele au valori uor mai mari pentru
EPSH dect pentru xantan, ajungndu-se la diferena de aproape o unitate la modulul complex
(figura 3.50.). Aceast diferen se menine aproape neschimbat i atunci cnd ambele probe
sunt nclzite pn la temperatura de 100C, cu rata de nclzire de 10C/minut.
Frecvena angular, s
-1

Frecvena angular, s
-1

a b
T
a
n
g
e
n
t
a

d
e

p
i
e
r
d
e
r
e

t
a
n

33
La meninerea temperaturii la 100C, comportamentul celor dou EPS se difereniaz. La
xantan, viscozitatea complex scade rapid i nu se stabilizeaz la un nivel constant.
Cu totul diferit este comportamentul polizaharidului sintetizat de H. mediterranei la
meninerea la 100C. Acesta este mult mai rezistent la temperatur comparativ cu xantanul,
toate modulele i viscozitatea meninndu-se la valorile iniiale.
Acest rezultat relev existena unui alt posibil domeniu de aplicare al EPSH, ca agent de
viscozitate n medii cu temperatur ridicat.
Msurtorile reologice realizate n cadrul acestei lucrri ofer informaii valoroase, care ajut
la caracterizarea polizaharidului sintetizat de Haloferax mediterranei, evideniind caracterul
pseudoplastic al acestuia, caracterul puternic amfolitic i rezistena la temperatur a acestuia.
10
-4
10
-3
10
-2
10
-1
10
0
10
1
10
2
10
3
Pa
G'
G''
10
2
140
180
220
260
300
340
380
420
500
Pa
|G*|
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 17 min
Time t

Figura 3.50. Influena temperaturii (linia punctat) asupra modulului de elasticitate (G),
modulului de viscozitate (G) i modulului complex * G la soluiile apoase 5% de EPSH
(romb) i xantan (triunghi) la testul de temperatur combinat cu un test de oscilaie la
amplitudine (1 %) i frecven (50 s
-1
) constante

Pe baza acestor proprieti, polizaharidului i se pot gsi aplicaii ca agent de viscozitate n
medii saline supuse la diverse temperaturi (inclusiv temperaturi ridicate).
O posibil aplicaie a EPSH ar fi ca ambalaj sub form de biofilm pentru produse alimentare
conservate prin srare, aa cum este petele proaspt. Acest tip de ambalaj face parte din
categoria ambalajelor active deoarece ndeplinete funcii multiple [Ozdemir and Floros,
2004]: are aciune antimicrobian datorit gruprilor sulfat [Cha and Channan, 2004], are
Timpul, min.
30C
100C

* G xantan
* G EPSH
34
aciune de conservare datorit prezenei unei cantiti foarte ridicate de NaCl n compoziia sa,
este biodegradabil.

3.5.2. Dimensiunea EPSH

Msurtorile reologice au relevat posibilitatea modificrii structurii EPSH n medii cu diverse
trii ionice. Pentru completarea acestor cercetri, s-a considerat oportun s se analizeze
dimensiunile polizaharidului n diverse condiii: n stare nativ n soluia salin (unde ionii de
sodiu i de clor neutralizeaz sarcinile polizaharidului), n prezena srii unui ion divalent
(clorura de calciu) i n absena ionilor (soluie apoas). Rezultatele sunt prezentate n figurile
3.52., 3.53., 3.54.

n mediul salin natural, dimensiunea particulelor nregistreaz o distribuie destul de larg;
particulele de polizaharid au dimensiuni cuprinse ntre 0,07 i 2 m, majoritatea acestora
avnd ns peste 0,2 m. Distribuia dimensiunilor polizaharidului se modific n absena
ionilor Na
+
Cl
; distribuia dimensiunilor particulelor este mult mai restrns, majoritatea

particulelor avnd dimensiuni n jurul valorii 0,4 m. Un numr restrns de particule au
dimensiuni mai mari, cuprinse ntre 1,5 i 2 m. Aceast difereniere a distribuiei
Diametrul particulelor, m
D
i
s
t
r
i
b
u
i
a

d
i
m
e
n
s
i
u
n
i
l
o
r
,

%

D
i
s
t
r
i
b
u
i
a

d
i
m
e
n
s
i
u
n
i
l
o
r
,

%

D
i
s
t
r
i
b
u
i
a

d
i
m
e
n
s
i
u
n
i
l
o
r
,

%


Figura 3.52. Dimensiunea EPSH n mediul
salin natural (200 g/l NaCl)
apos
salin reconstituit cu ioni divaleni de calciu
(5 g/l EPSH n soluie 200 g/l CaCl
2
)

35
dimensiunilor particulelor n mediu salin fa de mediul apos este dat de modul cum sunt
neutralizate sarcinile poliamfionului biopolimeric n cele dou medii:
- n prezena ionilor de Na
+
i de Cl
sarcinile lanurilor polimerice sunt neutralizate de ctre

cei doi ioni. Acest lucru permite ca n mediul salin natural s se formeze att particule de
dimensiuni medii, ct i particule de dimensiuni mari, prin unirea particulelor mici.
- n mediul apos, sarcinile existente la nivelul lanurilor polizaharidice nu se mai pot
neutraliza. Lanurile individuale se resping (ncrcarea lor fiind predominant negativ) i
se menin n soluie, formndu-se astfel particule cu dimensiuni medii n proporie mare.
Msurtorile asupra dimensiunii realizate n cadrul acestei lucrri nu dau informaii despre
forma particulelor.
n prezena ionilor de calciu, au loc transformri care se reflect asupra dimensiunilor
particulelor de EPSH. n mediul lichid coninnd ioni Ca
2+
i Cl
are loc formarea de agregate

coloidale (flocoane) de dimensiuni mari, acest proces fiind cauzat n principal de ionul de
calciu, divalent. Acesta neutralizeaz sarcinile negative ale EPSH i formeaz puni de Ca
2+
,
ceea ce permite asocierea lanurilor i formarea de agregate de dimensiuni mari.
Astfel, analiza distribuiei dimensiunilor particulelor de polizaharid evideniaz caracterul
predominant polianionic al EPSH, precum i importana tipului de ioni existeni n mediul
lichid n care se gsete biopolimerul.

3.5.3. Proprietile de legare a ionilor de ctre EPSH

Pentru aprecierea capacitii de legare a ionilor i a modului n care acest proces influenaz
proprietile EPSH, s-au determinat variaiile de solubilitate, conductibilitate i viscozitate
intrinsec n probele de EPSH tratate cu soluii saline ale cationilor monovaleni (Na
+
i K
+
) i
divaleni (Ca
2+
i Mg
2+
).
n figura 3.55. sunt prezentate rezultatele obinute la analiza influenei cationilor asupra
turbiditii EPSH. Fiecrei concentraii ale srurilor celor patru ioni i corespund dou
coloane; prima coloan din fiecare set corespunde valorii turbiditii probelor iniiale, iar cea
de-a doua coloan corespunde turbiditii msurate n probe dup ndeprtarea coloizilor.
EPSH are un comportament difereniat n soluiile saline analizate, formnd un sistem dispers
cu particule a cror dimensiune i stabilitate depind de ionii existeni i de concentraia n care
se gsesc acetia. Astfel, la analiza turbiditii soluiilor saline ale polizaharidului imediat
dup adugarea srurilor se observ c:
- EPSH se solubilizeaz cel mai bine n soluiile de NaCl; cu ct concentraia de NaCl este
mai mare, cu att solubilitatea polimerului, reflectat ca i scdere a turbiditii, crete.
- polizaharidul manifest afinitate mai mare la ionii K
+
dect la ionii Na
+
.
- n soluiile saline ale ionilor divaleni (calciu i magneziu), poliglucidul se comport
diferit. n prezena ionilor Ca
2+
are loc o scdere accentuat a turbiditii cu creterea
36
concentraiei ionice. n cazul tratamentului EPSH cu soluia salin de MgSO
4
, creterea
concentraiei ionice nu modific turbiditatea probelor. De acest comportament este
probabil rspunztor anionul sulfat din soluiile de MgSO
4
, care are rol n meninerea
polizaharidului n soluie, neutraliznd mult mai eficient sarcinile pozitive din componena
polizaharidului dect anionul Cl
din compoziia clorurii de calciu. n aceste condiii se

formeaz reele intra- i interpolizaharidice stabile.

Figura 3.55. Variaia turbiditii soluiilor de EPSH cu tipul cationului i concentraiile saline n
soluiile saline iniiale (prima coloan, nuana deschis) i dup ndeprtarea coloizilor de
dimensiuni mai mari de 0,45 m (coloana a doua, nuana nchis)

Dup separarea particulelor mai mari de 0,45 m, considerate ca fiind nedispersate i
nedizolvate, filtratul obinut este tot un sistem dispers, avnd particule cu dimensiuni foarte
mici. Aa cum se observ n figura 3.55. din al doilea set de coloane, turbiditatea tuturor
probelor scade dup ndeprtarea particulelor coloidale mari. Lund n considerare rezultatele
obinute, gradul de formare a coloizilor de ctre EPSH n soluiile saline analizate poate fi
ordonat astfel: Ca
2+
> K
+
> Na
+
. Ca
2+
este cel mai bun agent de coagulare a EPSH, fenomen
observat i n cazul altor polizaharide [Sutherland, 1994] [Cesaro et al., 1992].
Ionul Mg
2+
nu poate fi inclus n aceast ordonare, datorit faptului c alturi de aciunea
acestuia, anionul din soluia folosit influeneaz puternic comportamentul polizaharidului.

Pentru aprecierea gradului de legare a ionilor mono- i divaleni la polizaharid, s-au fcut
determinri conductometrice. Influena ionilor mono- i divaleni asupra conductibilitii
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
T
u
r
b
i
d
i
t
a
t
e
a
,

7
2
0

n
m

1% 2% 5% 10% 1% 2% 5% 10% 1% 2% 5% 10% 1% 2% 5% 10%
CaCl2 MgSO4 KCl NaCl
37
soluiilor de EPSH este prezentat n figura 3.56. Diferena de conductibilitate ntre soluia de
electrolit ca atare i soluia de electrolit n care s-a adugat 1% EPSH este datorat ionilor
reinui la suprafaa biopolimerului n soluiile polizaharidului.
Se poate ntocmi o scal a selectivitii de legare a cationilor la EPSH pentru concentraii
ionice mari: Ca
2+
> K
+
> Na
+
> Mg
2+
. Rezultatul este n acord cu alte studii din literatur
efectuate asupra altor polizaharide microbiene n prezena ionilor de calciu, potasiu i sodiu
[Belitz and Grosch, 1999]. Dei conductibilitatea clorurii de calciu este mai mic dect cea a
clorurii de potasiu, calciul este mai bine reinut de polizaharid. Acest rezultat indic posibila
formare de legturi intermolecuulare, n care este implicat doar ionul de calciu prin legturi
coordinative (aa cum este cazul caragenanului). Ionul K
+
se leag intramolecular la EPSH,
capacitatea lui de legare fiind mai mare dect cea a ionului Na
+
; datorit dimensiunilor mai
mici ale ionului de potasiu n forma hidratat, acesta poate penetra reeaua polimeric i se
poate lega la polizaharid, neutraliznd ionul sulfat. Un comportament similar este observat la
tratamentul cu ioni de potasiu a -caragenanului [Linden and Lorient, 1999].

n figura 3.57. este prezentat evoluia viscozitii intrinseci a EPSH 1% n soluiile saline ale
ionilor mono- i divaleni n funcie de inversul radicalului triei ionice I. Aceast exprimare
permite determinarea anumitor parametri de conformaie. Ionii monovaleni au influen
diferit asupra EPSH fa de ionii divaleni, precum i unul fa de cellalt. Ca i n cazul
conductibilitii, influena ionilor asupra viscozitii intrinseci este corelat cu legarea
acestora la polizaharid.
-5
5
15
25
35
45
55
65
75
85
95
105
C
o
n
d
u
c
t
i
b
i
l
i
t
a
t
e
,

m
S
/
c
m
CaCl2
KCl
NaCl
MgSO4
1 2 5 10 conc. sare, g/l

C
o
n
d
u
c
t
i
b
i
l
i
t
a
t
e
,

m
S

CaCl
2

KCl
NaCl
MgSO
4

Figura 3.56. Variaia conductibilitii
soluiilor saline cu 1% EPSH.
Valorile sunt calculate ca diferen
ntre conductibilitatea soluiilor de
sare (ca atare) i conductibilitatea
soluiilor saline cu 1% EPSH
38
n cazul ionilor divaleni, pentru trii ionice mici, viscozitatea intrinsec are valori
asemntoare. Cu creterea triei ionice are loc scderea viscozitii intrinseci, datorat unor
modificri la nivelul conformaiei cauzate de formarea de puni intermoleculare n prezena
ionilor divaleni. Formarea acestor puni determin crearea unor structuri de ghem care se
strnge cu creterea ncrcrii ionice a soluiei.
Creterea [] cu creterea triei ionice n cazul soluiilor 1% de EPSH ale ionilor monovaleni
poate fi explicat prin legarea acestora la nivel intramolecular cu polizaharidul, cu formarea
unor reele cu dimensiuni mari. Aa cum prezint analizele de viscozitate intrinsec, n
soluiile care conin ioni de potasiu se formeaz reele cu dimensiuni mult mai mari dect n
soluiile saline ale ionului de sodiu.
0,75
0,8
0,85
0,9
0,95
1
1,05
1,1
1,15
1,2
0 2 4 6 8 10 12 14
CaCl2
MgSO4
KCl
NaCl

Figura 3.57. Variaia viscozitii intrinseci cu tria ionic pentru soluii saline cu 1% EPSH

Acest comportament este diferit pentru EPSH fa de alte polizaharide microbiene [Eteshola
et al., 1996], fiind probabil datorat adaptrii biopolimerului la medii cu concentraii foarte
ridicate de ioni monovaleni. Ionul K
+
se leag mai eficient datorit dimensiunilor sale mici.

Cu ajutorul determinrilor de viscozitate intrinsec se poate calcula parametrul de flexibilitate
B al lanurilor polimerice. Acesta se determin cu relaia
[ ] ( )
3 , 1
1 , 0
S
B = [3.16.]
unde S panta dreptei care aproximeaz comportamentul [] n funcie de I
-5
;
[]
0,1
viscozitatea intrinsec n soluie 0,1 M, dl/g;
Cunoscnd B, se poate calcula indicele de persisten a cu relaia a = 0,26 / B. Acesta indic
lungimea lanului polimeric care se menine alungit, fr plieri. Valori ale acestuia sub 7
indic o conformaie de ghem i valori mai mari dect 7 o conformaie alungit [Eteshola et
al., 1996]. La calculul celor doi indici , B i a, se obin valorile:
B
CaCl2
= 0,0364 a
CaCl2
= 7,1378
I
1

[
]
,

l
/
g

.

1
0
-
1

39
B
MgSO4
= 0,161 a
MgSO4
= 1,6152
B
KCl
= -0,019 a
KCl
= -13,6614
B
NaCl
= -0,03 a
NaCl
= - 8,6534
Astfel, calculele indic formarea de ghem n prezena ionilor divaleni i formarea de lanuri
alungite n soluiile ionilor monoaleni.

La analiza proprietilor de legare a ionilor de ctre EPSH, se poate afirma c:
- polizaharidul manifest o bun capacitate de legare a ionilor mono- i divaleni, ordinea
fiind Ca
2+
> K
+
> Na
+
> Mg
2+

- n prezena ionilor, se formeaz particule coloidale;
- tipul i numrul ionilor influeneaz numrul coloizilor formai, ordinea fiind
Ca
2+
>> K
+
> Na
+
> Mg
2+

- tipul i numrul ionilor influeneaz conformaia coloizilor formai, ionii divaleni
formnd puni intermoleculare care determin plierea moleculelor i formarea unei
conformaii de ghem, iar ionii monovaleni legndu-se intramolecular, ceea ce determin
pstrarea lanurilor lineare alungite.

Proprietatea EPSH de a forma agregate mari care pot fi separate uor prin filtrare n prezena
ionului de calciu poate constitui un punct de plecare pentru aplicaii foarte importante pentru
industria alimentar.

4. CONCLUZII I PERSPECTIVE

4.1. Concluzii

Cercetarea a fost orientat pe trei planuri principale:
I. Optimizarea cultivrii arheei pentru producerea cu randament maxim a EPSH.
II. Analiza compoziiei polizaharidului.
III. Analiza proprietilor funcionale ale biopolimerului.

I. Optimizarea cultivrii arheei pentru producerea cu randament maxim a EPSH

La cultivarea microorganismului s-au monitorizat cantitile de biomas i polizaharid
formate pe parcursul bioproceselor. n cadrul acestei lucrri au fost elaborate i optimizate
metode combinate (spectrofotometrice i gravimetrice) pentru cuantificarea celor doi produi
[Mironescu et al., 2003b i c].
Pentru optimizarea bioprocesului n scopul maximizrii randamentului de EPSH, s-au realizat
cultivri n baloane i n bioreactor (n sistem batch i fed-batch).

Cultivrile n baloane, care au urmrit determinarea influenei concentraiei a trei compui
chimici: glucoza (5 - 35 g/l), clorura de magneziu (5 - 35 g/l) i fosfatul de potasiu
40
(0,005 - 0,035 g/l) asupra formrii de biomas microbian i sintezei de EPSH, au permis
construirea a cte un model polinomial i a suprafeelor de rspuns pentru fiecare din cele
dou procese (evoluia biomasei i EPSH n funcie de cei trei parametri studiai). Analiza
celor dou modele i a celor 18 suprafee de rspuns obinute a permis identificarea
condiiilor care favorizeaz bioprocesele astfel:
- Creterea microorganismului i producerea de biomas sunt favorizate de concentraii
mari de glucoz i magneziu i de concentraii sczute de fosfat. Pentru intervalele de
concentraie testate, aceste valori sunt : glucoz = 35 g/l ; MgCl
2
.
6H
2
O = 35 g/l; KH
2
PO
4

= 0,005 g/l. n aceste condiii, sinteza EPSH este inhibat.
- Formarea de polizaharid extracelular este stimulat de concentraii extreme ale sursei de
magneziu i fosfat, fie concentraii mari, fie concentraii mici ale fiecruia. Pentru
domeniul de concentraii analizat, procesele metabolice sunt orientate spre sinteza EPSH
n condiiile: glucoz = 35 g/l ; MgCl
2
.
6H
2
O = 5 g/l; KH
2
PO
4
= 0,005 g/l
- Pentru stimularea simultan a celor dou procese, formarea de biomas i EPSH,
condiiile optime la cultivarea n baloane corespund concentraiilor maxime testate a celor
trei compui : glucoz = 35 g/l ; MgCl
2
.
6H
2
O = 35 g/l; KH
2
PO
4
= 0,025 g/l.
Cele dou modele matematice obinute au indicat existena i a altor parametri ce pot
influena puternic ambele bioprocese [Mironescu et al., 2005 a i b].
n continuare, experimentele n bioreactor au fost conduse meninndu-se clorura de
magneziu la valoarea de 35 g/l, care stimuleaz ambele bioprocese. Concentraiile de glucoz
i fosfat de potasiu au continuat a fi optimizate n cadrul cultivrilor n bioreactor.

Primul set de cultivri n bioreactor au fost conduse n sistem batch, urmrindu-se
influena concentraiei de glucoz i de NaCl asupra formrii de biomas i polizaharid;
spre deosebire de cultivrile n baloane, acest tip de cultivare a prezentat avantajul de a
permite controlul mai riguros al parametrilor fizici ai cultivrii. n domeniile de
concentraii cercetate (5 40 g/l glucoz i 125 200 g/l NaCl), s-au obinut urmtoarele
rezultate:
- Conducerea cultivrilor n sistem batch cu cantiti mici de glucoz stimuleaz formarea
de biomas i EPSH, n timp ce cantiti mari de glucoz au aciune inhibitoare asupra
ambelor procese i prelungesc foarte mult durata cultivrii. Cantitatea optim de glucoz
n mediu la nceputul cultivrilor este 5 g/l.
- NaCl manifest efect inhibitor asupra producerii de biomas i efect stimulator asupra
sintezei de EPSH. Cantitatea optim de sare n mediu este 125 g/l dac se urmrete
obinerea de biomas i 200 g/l dac se urmrete producerea de EPSH.
- EPSH este sintetizat pn se atinge o concentraie de aproximativ 6 g/l n mediile cu 200
g/l NaCl i 5 g/l glucoz la nceputul fazei batch, dup care arheea nceteaz s produc
41
polizaharid. Cantitatea maxim de biomas produs este de 20 g/l (la cultivarea cu 40 g/l
glucoz i 125 g/l NaCl).
Determinrile au permis identificarea rolului biologic al polizaharidului sintetizat de H.
mediterranei, i anume acela de barier de protecie a celulei contra salinitii accentuate.
Pe lng componenii mediului nutritiv, la cultivrile n sistem batch s-a urmrit i efectul
varierii temperaturii n domeniul optim de dezvoltare pentru arhee asupra bioprocesului.
Pentru valorile testate (38C i 45C), temperatura nu influeneaz semnificativ producerea de
polizaharid extracelular. Temperatura mai ridicat (45C) are efect pozitiv asupra creterii
populaiei microbiene, prin scderea viscozitii mediului i uurarea accesului oxigenului la
celule.
Astfel s-au identificat condiiile de cultivare optime pentru sinteza de EPSH: 5 g/l glucoz la
nceputul fazei batch, 200 g/l NaCl n mediul de cultivare i conducerea cultivrii la
temperatura de 38C.
Pentru descrierea matematic a bioprocesului n care este implicat H. mediterranei a fost
folosit o metodologie bazat pe modele cinetice. S-a obinut modelul nestructurat i
nesegregat al bioprocesului, care descrie cu acuratee consumul de glucoz i formarea de
biomas arheic i polizaharid n faza batch.

Conducerea cultivrilor n sistem batch i cu medii de cultur optimizate din punct de
vedere a compoziiei a permis creterea cantitii de EPSH produs de ctre arhee (pn la
6 g/l), dar productivitatea a rmas nc foarte mic. Din acest motiv, cea de-a doua etap a
cercetrilor legate de cultivarea n bioreactor a urmrit elaborarea unui procedeu de
cultivare n sistem fed-batch a microorganismului.
n prima etap s-a urmrit stabilirea momentului iniierii fazei fed-batch, observndu-se c:
- Faza fed-batch trebuie iniiat atunci cnd n mediu se atinge concentraia de glucoz
urmrit pe parcursul fazei fed-batch;
- La monitorizarea momentului cnd se atinge concentraia de glucoz urmrit a fi
meninut constant pe durata fazei fed-batch se pot folosi msurtorile on-line ale oxigenului
dizolvat, cu identificarea saltului pe care l face pO
2
la scderea concentraiei de glucoz sub
2,5 g/l [Mironescu et al., 2003a].
Folosirea acestor observaii a permis identificarea momentelor nceperii fazei fed-batch cu
foarte bun precizie. Folosirea funciei de alimentare de tip exponenial, cu setarea ratei
specifice de cretere =0,05 h
-1
i cu introducerea termenului K
LabView
de reglare a turaiei
pompei de alimentare determin meninerea n mediul nutritiv din bioreactor a concentraiilor
dorite de surs de carbon sau de fosfat.
n cea de-a doua etap s-a studiat influena concentraiilor de glucoz i fosfat asupra celor
dou bioprocese, de formare a biomasei microbiene i EPSH la cultivarea n sistem fed-batch.
42
Concluziile au fost:
Glucoza are aciune evident asupra formrii biomasei i EPSH n faza fed-batch:
- dac se urmrete producerea de biomas microbian, procesul trebuie condus astfel nct
n etapa fed-batch n mediul nutritiv s se menin concentraii mari de glucoz (2 g/l);
- dac se urmrete producerea de EPSH, procesul trebuie s decurg astfel nct n faza
fed-batch mediul nutritiv s conin cantiti mici de glucoz (0,1 - 0,2 g/l).
n domeniul de concentraii analizate (0,02 0,05 g/l), fosfatul nu manifest aciune
evident asupra bioproceselor analizate.
n condiii favorabile (0,1-0,2 g/l glucoz, 200 g/l NaCl n mediul din bioreactor n faza
fed-batch), microorganismul sintetizeaz EPSH pn cnd n mediu se atinge o
concentraie maxim a acestuia, de aproximativ 14,5-15 g/l. Aceast cantitate nu poate fi
depit chiar i atunci cnd procesul decurge la concentraii optime de glucoz pentru
sinteza de biopolimer (0,1 - 0,2 g/l), fiind probabil dictat genetic.

Astfel, cercetrile legate de bioproces au permis stabilirea influenei anumitor compui
chimici i parametri fizici asupra formrii de biomas i EPSH i optimizarea compoziiei
mediului nutritiv i a condiiilor fizice de cultivare.
A fost stabilit o strategie de cultivare n sistem fed-batch care a permis creterea
randamentului de producere a exopolizaharidului de 5 ori fa de valorile raportate n
literatur.

Pentru conducerea i controlul riguros al bioprocesului, n cadrul tezei a fost elaborat
aplicaia Biolab scris cu ajutorul limbajului de programare LabVIEW. Aplicaia permite
reglarea temperaturii, pH-ului i oxigenului dizolvat n mediu, precum i alimentarea
bioreactorului dup o funcie de tip exponenial cu foarte bune rezultate practice.

II. Analiza compoziiei polizaharidului.

n vederea gsirii unor aplicaii valoroase pentru acest polizaharid neconvenional, n cadrul
tezei s-a realizat analiza amnunit a compoziiei EPSH. Pentru analiza compoziional, ntr-
o prim etap s-a optimizat metoda de hidroliz acid cu acid trifuoracetic folosind
cromatografia de excluzie molar SEC i cromatografia de lichid de nalt precizie cu faz
invers RP-HPLC. Ambele tipuri de analize cromatografice au indicat scderea intensitii
aciunii TFA asupra EPSH n ordinea
Aceast aciune este difereniat pentru monozaharidele din compoziia EPSH. Astfel, dintre
monomerii neutri majoritari manoza i glucoza, manoza a fost eliberat mult mai repede dect
glucoza din structura biopolimerului, ceea ce indic o ordonare difereniat a acestora n
43
lanurile polizaharidice; manoza se gsete la exterior, fiind astfel mai uor accesibil dect
glucoza.
Corelnd rezultatele celor dou tipuri de analize cromatografice folosite, condiiile optime de
hidroliz a EPSH au fost gsite a fi corespunztoare tratamentului cu TFA 3M 6 ore la 100
o
C.
Metoda RP-HPLC a fost mbuntit n cadrul tezei astfel nct s permit identificarea unui
numr mai mare de monozaharide (10) dect cea iniial (5) i apoi a fost utilizat pentru
identificarea monomerilor din structura biopolimerului. Cu ajutorul metodei cromatografice s-
au identificat ase monomeri:
- aminozaharuri : glucozamina i galactozamina;
- zaharuri neutre : manoza, glucoza, galactoza i riboza.
Dintre acestea, manoza, glucoza, glucozamina i galactoza au fost gsite i de ctre ali
cercettori ca fiind monozaharidele componentele EPSH [Anton et al., 1988] [Parolis et al.,
1996]. Galactozamina i riboza nu au fost evideniate de nici o surs din literatur. Formarea
acestora poate fi datorat condiiilor specifice de cultivare a arheei, realizate n cadrul acestei
lucrri, dar i metodei de identificare a monomerilor, care este foarte sensibil (detecteaz
monozaharidele pn la nivel de nanomoli).

La studiul variaiei compoziiei n monozaharide a EPSH pe parcursul cultivrii s-au obinut
c variaiile monomerilor sunt prea mici pentru a fi luate n considerare. S-a determinat astfel
raportul mediu ntre componentele majore. Considernd galactozamina ca element de
referin, s-a obinut urmtorul raport:
GlcN : GalN : Gal : Man : Glc : Ri = 1,65 : 1 : 4 : 19 : 12 : 3

Analiza spectrului n infrarou folosind FT-IR a oferit informaii foarte valoroase despre
structura EPSH. A fost evideniat astfel prezena acizilor uronici, a aminozaharurilor i a
gruprilor sulfat n compoziia polizaharidului microbian, precum i a cantitilor mari de ap
legat la nivelul acestuia.

III. Analiza proprietilor funcionale ale biopolimerului.

Pentru determinarea proprietilor funcionale, s-a analizat comportamentul reologic al
diverselor soluii de EPSH n mediul de cultur i n soluii dializate, dimensiunea particulelor
n diverse medii precum i capacitatea de legare a ioni mono- i divaleni.

Msurtorile reologice au relevat c:
- EPSH manifest caracter pseudoplastic, mai puin pronunat dect al xantanului.
- n domeniul de frecvene cercetat (10
-1
10
1
s
-1
) n stare nativ n mediul natural,
polizaharidul se manifest ca un gel cu faza solid predominant; odat cu adaosul de ap
44
n mediul natural, are loc destabilizarea gelului i formarea unui gel stabil cu faza lichid
predominant;
- EPSH are caracter amfolitic puternic (trie ionic mare), relevat de comportamentul diferit
al polizaharidului n medii cu trie ionic diferit;
- EPSH are mas molecular mai mare dect xantanul;
- biopolimerul i pstreaz structura sub aciunea temperaturilor ridicate, fiind rezistent la
100C pe durat mai ndelungat dect xantanul.

Analiza distribuiei dimensiunilor particulelor de polizaharid n soluii cu ioni de calciu i
sodiu i n medii apoase au evideniat caracterul predominant polianionic al EPSH,
precum i importana tipului de ioni existeni n mediul lichid n care se gsete
biopolimerul asupra dimensiunilor particulelor:
- n prezena ionilor monovaleni (cum este ionul Na
+
), are loc formarea de reele
polimerice cu dimensiuni distribuite ntr-un domeniu larg (0,07 - 2 m);
- n prezena ionilor divaleni (cum este Ca
2+
) se formeaz flocoane coloidale (2 - 4 m) ce
se pot separa din mediu prin filtrare;
- n mediul apos se formeaz particule cu dimensiuni intermediare ntre cele formate n
mediul cu ioni de sodiu i n prezena ionilor de calciu (0,2 1 m).

Studiul proprietilor de legare a ionilor mono- i divaleni de ctre EPSH a relevat c :
- la tratamentul soluiei apoase a acestuia cu soluii de electrolit se formeaz un sistem
dispers ce conine particule coloidale cu dimensiuni i conformaii diferite. EPSH este
solubil n soluiile ionilor monovaleni, ionul de sodiu manifestnd aciune de solubilizare
mai mare dect cel de potasiu. n prezena ionilor divaleni, n special a calciului, se
produce aglomerarea unitilor polimerice individuale i formarea de flocoane.
Selectivitatea de legare a cationilor la EPSH este: Ca
2+
> K
+
> Na
+
> Mg
2+
.
- i tipul cationului prezint influen asupra comportamentului polizaharidului, ionul sulfat
acionnd ca agent de legare a lanurilor de polizaharid, n timp ce ionul clor nu manifest
aceast aciune.
- n prezena ionilor divaleni polizaharidul are conformaie de ghem, iar n medii ce conin
ioni monovaleni se formeaz lanuri lineare alungite.

4.2. Perspective

Lucrarea de fa se ncadreaz ntr-un proiect mai larg, iniiat la Universitatea din Karlsruhe,
Germania, la Institutul de Ingineria Proceselor, departamentul de Ingineria Bioproceselor,
condus de Prof. Dr. Ing. Clemens Posten, care urmrete analiza integrat a bioproceselor de
obinere a noi biopolimeri. n cadrul acestui proiect a fost conceput i aceast cercetare, care
45
va continua cu un proiect de colaborare ntre Universitatea Lucian Blaga din Sibiu i
Universitatea din Karlsruhe privind aplicabilitatea metaboliilor produi de microorganisme
extremofile.

A fost iniiat un studiu care urmrete identificarea arheei Haloferax mediterranei n lacurile
de la Ocna Sibiului, alturi de alte halofile. Studiul face parte dintr-un grant de cercetare
AGRAL (conductor Prof. Dr. Biol. Letiia Oprean) n derulare i va permite mbunirea
cunotinelor legate de microorganism.

Pe baza proprietilor identificate n cadrul acestei lucrri la polizaharidul extracelular
sintetizat de H. mediterranei, a fost fcut o propunere de grant CNCSIS pentru anul 2006,
intitulat Folosirea polizaharidelor microbiene ca biofilme cu rol antimicrobian (conductor
de grant Prof. Dr. Ing. Vionela Mironescu).

BIBLIOGRAFIE SELECTIV

9. Anton, J,, Inmaculada Meseguer and F. Rodriguez-Valera, 1988, Production of an extracellular
polysaccharide by Haloferax mediterranei, Applied and Environmental Microbiology, 54 (10),
p.2381-2386
12. Barnes, H.A., Hutton, J.F., Walters, K., 1989, An introduction to rheology, Elsevier Science,
Amsterdam
17. Belitz, H.D., Grosch, W., 1999, Food chemistry, Springer Verlag Berlin Heidelberg
19. Boan, I.F., Garcia-Quesada, J.C., Anton, J., Rodrguez-Valera, F., Marcilla, A., 1998, Flow
properties of haloarchaeal polysaccharides in aqueous solutions, Polymer, 39, 6945-6950
20. Braccini, I., Grasso, R., Perez, S., 1999, Conformational and configurational features of acidic
polysaccharides and their interactions with calcium ions: a molecular modeling investigation,
Carbohydrate Research, 317, p. 119-130
22. Bryan, A., Linhardt, R.J., Daniels, L., 1986, Variation in composition and yield of
exopolysaccharides produced by Klebsiella sp. Strain K32 and Acinetobacter calcoaceticus BD4,
Applied and Environmental Microbiology, 51 (6), p. 1304-1308
27. Cerna, M., Barros, A., Nunes, A., Rocha, S.M., Delgadillo, I., Copikova, J., Coimbra, M.A.,
2003, Use of FT-IR spectroscopy as a tool for the analysis of polysaccharide food additives,
Carbohydrate Polymers, 51, p. 383-389
29. Cesaro, A., Gamini, A., Navarini, L., 1992, Supramolecular structure of microbial polysaccharides
in solution: from chain conformation to rheological properties, Polymer, 19, p. 4001-4008
30. Cha, D.S., Chinnan, M.S., 2004, Biopolymer-Based Antimicrobial Packaging: A Review, Critical
Reviews in Food Science and Nutrition, 44:223237
37. DasSharma, S, Arora, P., 2001, Halophiles, Encyclopedia of life sciences, Nature publishing
group, www.els.net
43. DSouza, S., Altekar, W., DSouza, S.F., 1997, Adaptive response of Haloferax mediterranei to
low concentrations of NaCl (<20%) in the growth medium, Archives Microbiology, 168, 68-71
44. Du, P., Anumula, K.R., 1998, Quantitative analysis of monosaccharides from glycoproteins by
fast HPLC with highly sensitive fluorescent detection, Journal of Biomolecular Techniques, 9
(4), p. 31-33
45. Dumitriu, S., 2002, Polysaccharides as biomaterials, in Polymeric biomaterials. Second edition,
revised and expanded, ed. by Dumitriu, S., Marcel Dekker Inc., New York-Basel, p. 1-61
55. Garcia Lillo, J.A., Rodriguez-Valera, F., 1990, Effects of culture conditions on poly(b-
hydrohybutyric acid) production by Haloferax mediterranei, Applied and Environmental
Microbiology, 56(8), p. 2517-2521
46
58. Grant, W., Larsen, H., 1989, Group III. Extremely halophilic archaeobacteria order
Halobacteriales, in Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, ed. by N.R. Krieg and J.G.
Holt, Williams & Wilkins, Baltimore, Md., p. 2216-2230
71. Kaiser, K., Benner, R., 2000, Determination of amino sugars in environmental samples with high
salt content by HPAEC-PAD, Analytical Chemistry, 72
77. Kis-Papo, T., Oren, A., 2000, Halocins: are they involved in the competition between halobacteria
in saltern ponds?, Extremophiles, 4(1), p. 35-41
78. Korz, D.J., Rinas, U., Hellmuth, K., Sanders, E.A., Decker, W-D., 1995, Simple fed-batch
technique for high-cell density cultivation of Escherichia coli, Journal of Biotechnology, 39, p.
59-65
83. Levander, F., Svensson, M., Radstrom, P., 2001, Small-scale analysis of exopolysaccharides
from Streptococcus thermophillus grown in a semi-defined medium, BMC Microbiology, 1
(23)
85. Lijour, Y., Gentric, E., Deslandes, E., Guezennec, J., 1994, Estimation of the sulphate content of
hydrothermal vent bacterial polysaccharides by Fourier Transform Infrared Spectroscopy,
Analytical Biochemistry, 220, p. 244-248
88. Linden, G., Lorient, D., 1999, New ingredients in food processing, Woodhead Publishung Ltd.,
Cambridge, England
101. Mironescu, M., Ignatova, M., Posten, C., 2003a, Modelling and optimal control of Haloferax
mediterranei fed-batch cultivation, Proceedings of the International Conference Automatics
and Informatics 03, Sofia, Bulgaria, 6-8 Oct., p. 175-178
102. Mironescu, M., Mironescu, I.D., Jcanu V., Posten, C., 2003b, Influence of cultivation media on
halobacteria I. Growth and biomass formation, Acta Universitatis Cibiniensis, 7 (1), p. 17-24
103. Mironescu, M., Mironescu, I.D., Jcanu V., Posten, C., 2003c, Influence of cultivation media on
halobacteria II. Polysaccharides production, Acta Universitatis Cibiniensis, 7 (1), p. 25-32
104. Mironescu, M., Ignatova, M., Posten, C., 2004a, Optimal glucose feeding profile aplication in
Haloferax mediterranei fed-batch cultivation, Proceedings of the Conference Computer
Aplications in Biotechnology CAB9, Nancy, 29-31 martie, p. 366-372
105. Mironescu, M., Mironescu, V., 2004b, The complexant properties of exopolysaccharides
produced by the archaebacterium Haloferax mediterranei, Scientifical researches.
Agroalimentary Processses and Technologies, vol. X, no.1, Ed. Agroprint Timisoara, Romania
106. Mironescu, M., Specht, Posten, C., 2004c, Optimisation of acid hydrolysis of halobacterial
polysaccharides to monosaccharides using chromatography, Conferinta Cluj
107. Mironescu, M., Oprean, L., Jcanu, V., 2005a, Optimisation of cultivation media composition
for biomass production by haloarchaea using response surface methodology, Proceedings of the
International Conference ............., Sibiu, 12-13 mai, p. .....
108. Mironescu, M., Oprean, L., Mironescu, I.D., 2005b, Conferina biologie sibiu
110. Mirzarakhmetova, D., Perner, I., Posten, C., 2001, Gewinnung und Charakterisierung bakterieller
Polysaccharide, Wiss. Abschlussber. 36. Internationales Seminar Univ. Karlsruhe
113. Morris, E.R., 1991, Pourable gels: polysaccharides that stabilise emulsions and dispersions by
physical trapping, IFI, 1, p. 32-38
114. Muttzall, K., 1993, Einfhrung in die Fermentationstechnik, Behrs Verlag GmbH, Hamburg
115. Muttzall, K., 1994, Modellierung von Bioprozessen, Behrs Verlag GmbH, Hamburg
117. Nielsen, J., Villadsen, J., 1992, Modelling of microbial kinetics, Chemical Engineering Science,
vol. 47, no. 17/18, p. 4225-4270
119.Nisato, G., Candau, S.J., 2002, Structure and properties of polyampholyte gels, in Polymer gels
and networks, ed. by Y. Osada, A.R. Khoklov, Marcel dekker Inc., Basel, Switzerland, p. 131-
161
120 Norton, I.T., Goodall, D.M., Frangou, S.A., Morris, E.R., Rees, D.A., 1984, Mechanism and
dynamics of conformational ordering in xanthan polysaccharide, Journal of Molecular Biology,
175, p. 371-379
121. Ombrelli, M., Eckmann, D.M., Composto, R., 2003, Dextran grafted silicon substrates:
preparation, characterization and biomedical applications, Materials Research Society
Proceedings, 774
123. Oprean, L., Mironescu, M., 2005, Aspecte bioenergetice ale halofilismului, Raport noiembrie
2005 la Grantul AGRAL nr. 2032/2004-2007 Studii privind reevaluarea i elaborarea de soluii
pentru valorificarea lacurilor de la Ocna Sibiului ca obiectiv turistic, balneoclimateric i de
agrement turistic, conductor grant Prof. Dr. Biol. Letiia Oprean
127. Oren, A, 2002a, Diversity of halophilic microorganisms: Environments, phylogeny, physiology
and applications, Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 28, 56-63
47
128. Oren, A, 2002b, Molecular ecology of extremely halophilic Archaea and Bacteria, FEMS
Microbiology Ecology, 39, p. 1-7
129. Ozdemir, M., Floros, J.D., 2004, Active Food Packaging Technologies, Critical Reviews in Food
Science and Nutrition, 44, p.185193
130. Parolis, H., Parolis, L.A.S., Bon, I.F., Rodrguez-Valera, F., Widmalm, G., Manca, M.C.,
Jansson, P.-E., Sutherland, I.W., 1996, The structure of the exopolyaccharide produced by the
halophilic archaeon Haloferax mediterranei strain R4 (ATCC 33500), Carbohydrate Research,
295, 147-156
140. Ramus, J., 1977, Alcian blue: a quantitative aqueous assay for algal acid sulphated
polysaccharides, Journal of Phycology, 13, 345-348
147. Rodriguez-Valera, F., Ruiz-Berraquero, F., Ramos-Cormenzana, A., 1980, Isolation of extremely
halophilic bacteria able to grow in defined inorganic media with single carbon source, Journal of
General Microbiology, 119, p. 535-538
149. Rodriguez-Valera, F., Garcia Lillo, J.A., 1990, Halobacteria as producers of poly--
hydroxyalkanoates, in Novel biodegradable microbial polymers, ed. by Daves, E.A., p. 425-425
150. Rodriguez-Valera, F., Garcia Lillo, J.A., Antn, J., and Meseguer, I., 1991, Biopolymer
production by Haloferax mediterranei, in General and applied aspects of halophilic
microorganisms, ed. by Rodriguez-Valera, F., Plenum Press, New York, p. 373-380
151. Rodriguez-Valera, F., 1992, Biotechnological potential of halobacteria, Biochemical Society
Symposiums, 58, p. 135-147
152. Rodriguez-Valera, F., 1995, Cultivation of halophilic Archaea, in Archaea, a laboratory manual,
ed. by Robb, F.T., Place, A.R., Sowers, K.R., Schreier, H.J., DasSharma, S., Fleischmann, E.M. ,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, p.13-16
153. Rougeaux, H., Pichon, R., Kervarec, N., Raguenes, G.H.C., Guezennec, J.G., 1996, Novel
bacterial exopolysaccharides from deep-sea hydrothermal vents, Carbohydrate Polymers, 31, p.
237-242
162. Severina, L.O., Usenko, I.A., Plakunov, V.K., 1989, Biosynthesis of an exopolysaccharide by the
extreme halophilic archaebacterium Halobacterium mediterranei, Mikrobiologiya, 58(4), p.557-
561
165. Specht, C., Frimmel, F.H., 2000, Specific interactions of organic substances in Size-Exclusion
Chromatography, Environmental Science and Technology, 34, 2361-2366
168. Stokke, B.T., Christense, B.E., Smidsrod, O., 1998, Macromolecular properties of xanthan, in
Polysaccharides. Structural diversity and functional versatility, ed. by S.Dumitriu, Marcel
Dekker Inc., New York, p. 433-472
169. Sutherland, J.W., 1990, Biotechnology of microbial exopolysaccharides, Cambridge University
Press
170. Sutherland, J.W., 1994, Structure-function relationships in microbial exopolysaccharides,
Biotechnological Advances, 12, p.393-448
171. Sutherland, J.W., 1999, Biofilm exopolysaccharides, in Microbial extracellular polymeric
substances, ed. by Wingender, J., Neu, R., Flemming, H-C., Springer Verlag, Berlin-Heidelberg
172. Sutherland, J.W., 2002, A sticky business. Microbial polysaccharides: current products and future
trends, Microbiology today, 29, p. 70-71
179. Toreblanca, M., Rodriguez-Valera, F., Juez, G., Ventosa, A., Kamekura, M., Kates, M., 1986,
Classification of non-alkaliphilic halobacteria based on numerical taxonomy and polar lipid
composition and description of Haloarcula gen. nov. and Haloferax gen. nov., System. Appl.
Microbiology, 8, 89-99
180. Townsend, R., Manzi, A., Merkle, R.K., Rohde, M.F., Spellman, M., Smith, A., Carr, S.A., 1997,
Quantitative monosaccharide analysis : a multi-center study, Journal of Biological Techniques, 8
(1)
194. Xiong, Y-H., Liu, J-Z., Song, H-Y., Ji1, L-N., 2004, Enhanced production of extracellular
ribonuclease from Aspergillus niger by optimization of culture conditions using response surface
methodology, Biochemical Engineering Journal, 21, 27-32
197. Zarnea, G., Mencinicopschi, Gh., Brgrea, t., 1980, Bioingineria preparatelor enzimatice
microbiene, Ed. Tehnic, Bucureti

PH D

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

PH D

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

1

Universitatea Lucian Blaga Sibiu

(0,005 -0,015- 0,025 g/l) din compoziia mediului nutritiv. Pentru

; distribuia dimensiunilor particulelor este mult mai restrns, majoritatea

sarcinile lanurilor polimerice sunt neutralizate de ctre

are loc formarea de agregate

din compoziia clorurii de calciu. n aceste condiii se

You might also like