Geneti~ki polimorfizam ACC sintaze i ACC

oksidaze kod autohtonih sorti jabuke

Sla|ana Mari}
1
, Radovan Bo{kovi}
2
, @arko Te{ovi}
1
, Milan Luki}
1
1
Institut SRBIJA, Centar za vo}arstvo i vinogradarstvo, ^a~ak
E-mail: nidzovicsladja@yahoo.com
2
Institut za molekularnu genetiku u geneti~ko in`enjerstvo, Beograd
Sadr`aj: Op{ti trendovi u oplemenjivanju jabuke su traganje za korisnim varijantama agronomski
va`nih osobina i pro{irivanje kori{}enog geneti~kog pula. Navedeni trendovi bazirani su na identi-
fikovanju gena i razumevanju procesa koji su uklju~eni u ekspresiju zna~ajnih osobina. Dozrevanje
ploda jabuke je geneti~ki programiran kompleksan fiziolo{ki proces u kome va`nu ulogu ima biljni
hormon etilen. Alelni polimorfizam gena koji kodiraju ACC sintazu i ACC oksidazu, enzime na pu-
tanji biosinteze etilena, prou~avan je kod 24 autohtone sorte jabuke iz kolekcionog zasada Centra za
vo}arstvo i vinogradarstvo u ^a~ku i pore|en sa traja{no{}u njihovih plodova u skladi{tu. Polimor-
fizam je detektovan lan~anom reakcijom polimeraze (PCR metodom) i restrikcionom analizom sa 6
restrikcionih enzima. Identifikovana su dva alela gena koji kodira ACC sintazu (ACS1-1 i ACS1-2)
i tri alela gena koji kodira ACC oksidazu (a, b i c).
Klju~ne re~i: Jabuka, etilen, ACC sintaza, ACC oksidaza, polimorfizam, dozrevanje plodova.
Uvod
Traganje za korisnim varijantama agronomski va`nih osobina i pro{irivanje ko-
ri{}enog geneti~kog pula su op{ti trendovi u oplemenjivanju jabuke i bazirani su na
identifikovanju gena i razumevanju procesa uklju~enih u ekspresiju zna~ajnih osobi-
na.
Dozrevanje i traja{nost ploda jabuke u skladi{tu regulisani su biosintezom ga-
sovitog biljnog hormona etilena. Plod jabuke spada u grupu klimakteri~nih plodova,
~ije je dozrevanje pra}eno naglim pove}anjem brzine respiracije i sinteze etilena
(Knee, 1993). Smatra se da je etilen klju~ni regulator dozrevanja ploda jabuke (The-
ologis, 1992) i da su blokiranje biosinteze etilena i njegovog dejstva primarni meha-
nizmi putem kojih se u kontrolisanoj atmosferi du`ina ~uvanja ploda jabuke produ`u-
je (Lau et al., 1986; Gorney i Kader, 1996, 1997).
Vo}arstvo, Vol. 39. br. 150 (2005, 2), 139148 139
UDK: 634.1.12:547.293.2:581.145.2
Originalan nau~ni rad Original scientific paper
ACC sintaza (1-aminociklopropan-1-karboksilat sintaza) i ACC oksidaza (1-
aminociklopropan-1-karboksilat oksidaza) su enzimi koji katalizuju poslednje dve re-
akcije na putanji biosinteze etilena (Yang i Hoffman, 1984). Kod jabuke je prona|e-
no nekoliko gena koji kodiraju ACC sintazu (Md-ACS), ali je ustanovljeno da je eks-
presija ACS1 gena predominantna u klimakteri~nom plodu jabuke (Dong et al., 1991;
Kim et al., 1992; Lay-Yee i Knighton, 1995; Rosenfield et al., 1996; Harada et al.,
1997). Sunako et al. (1999) su identifikovali novi alel ACS1 gena (ACS1-2), koji u
svom promotoru ima ugra|en retrotranspozon (SINE) veli~ine 162 bp, dok se na toj
poziciji kod alela ACS1-1 nalazi sekvenca od 24 bp. Alel ACS1-2, u pore|enju sa ori-
ginalnim alelom (ACS1-1), ima veoma nisku aktivnost transkripcije. Sunako et al.
(1999), Harada et al. (2000) i Oraguzie et al. (2004) smatraju da homozigotnost alela
ACS1-2 uslovljava nizak nivo produkcije etilena kod nekih sorti jabuke.
Castiglione et al. (1999) prou~avali su alelni polimorfizam ACC oksidaze kod
12 vrsta i sorti roda Malus i na osnovu restrikcione analize PCR-om umno`enog frag-
menta gena koji kodira ACC oksidazu, utvrdili postojanje najmanje dve alelne forme
ovog gena (A i B). Predpostavili su da aleli gena koji kodira ACC oksidazu uti~u na
razlike u nivou produkcije etilena kod vrsta i sorti jabuke.
Cilj ovog rada je da identifikuje alele gena koji kodiraju ACC sintazu i ACC ok-
sidazu kod autohtonih sorti jabuke i da testira vezu izme|u alelnih konstitucija autoh-
tonih sorti za nevedene gene i traja{nosti njihovih plodova u skladi{tu.
Materijal i metode
Analizirane su 24 autohtone sorte jabuke iz kolekcionog zasada Centra za vo-
}arstvo i vinogradarstvo u ^a~ku, sakupljene na teritoriji biv{e Jugoslavije. Plodovi
analiziranih autohtonih sorti odlikuju se razli~itom traja{no{}u u skladi{tu. Dobrim
~uvanjem plodova odlikuju se: Bo{njanka, Budimka, Jabuka (Valjevo), Kablarka (Ka-
blar), Muslimka, Pozna kola~ara, Strekinja, [arunka, [umatovka, Valjnika i Zelenika.
Srednje dobrim ~uvanjem plodova odlikuju se sorte: Kamenica 1, Opaljenik 1, Tip 1
(Sirogojno), Tip 2 (Sirogojno) i Zejtinka, dok se lo{im ~uvanjem plodova odlikuju:
Babova~a, Kablarka (Trep~a), Kraljica, Letnja iz Grocke, Petrova~a, Pop Miladin, Sa-
moniklaja i Sinlija.
Genomska DNK izolovana je iz mladog li{}a primenom CTAB mini prep me-
tode (Doyle i Doyle, 1987), koja je prilago|ena za ekstrakciju DNK iz lista, ili pupolj-
ka jabuke.
Za umno`avanje fragmenta gena koji kodira ACC sintazu kori{}eno je 50 ng ge-
nomske DNK, 0,2 Mprajmera (pojedina~no), 200 MdNTP (pojedina~no), 1 x PCR
reakcioni pufer i 2,5 UTaq DNK polimeraze. Kori{}eni su prajmeri ACS1-5F (AGA-
GAGATGCCATTTTTGTTCGTAC; 861-887) i ACS1-5R (CCTACAAACTTGC-
GTGGGGATTATAAGTGT; 1379-1350) specifi~ni za region promotora u kome je re-
trotranspozon SINE insertovan (Sunako et al., 1999). PCR uslovi za ACC sintazu su
bili slede}i: 3 min. na 94
0
C, 35 ciklusa - 1 min. na 94
0
C, 1 min. na 58
0
C i 2,5 min. na
72
0
C, sa finalnom ekstenzijom 10 min. na 72
0
C.
Za umno`avanje fragmenta gena koji kodira ACC oksidazu kori{}eno je 50 ng
genomske DNK, 0,1 M prajmera (pojedina~no), 0,2 mM dNTP (pojedina~no), 1 x
PCR reakcioni pufer, 1,5 mM MgCl2 i 0,625 U Taq DNK polimeraze. Kori{}eni su
prajmeri M11 (GACTTGAGCCTTGTCAATG) i M12 (GATTCCTTGGCCTTCA-
TAGC) specifi~ni za ACC oksidazu, dizajnirani na osnovu cDNK sekvence gena ko-
Vo}arstvo, Vol. 39. br. 150 (2005, 2), 139148 140
ji kodira ACC oksidazu koja se nalazi u EMBL bazi podataka (Castiglione et al.,
1999). PCR uslovi za ACC oksidazu su bili slede}i: 3 min. na 92
0
C, 5 ciklusa - 1 min.
na 92
0
C, 1 min. na 65
0
C i 1min. 30 sec na 72
0
C, 35 ciklusa - 1 min. na 92
0
C, 1 min.
na 60
0
C i 1 min. 30 sec na 72
0
C, sa finalnom ekstenzijom 10 min. na 72
0
C.
Za digestiju PCR proizvoda ACC oksidaze upotrebljeno je 6 restrikcionih enzi-
ma koji prepoznaju razli~ita restrikciona mesta: Eco RI, Eco RV, Hind III, Bam H1,
Pst I i Rsa I (Boehringer Mannheim). Digestija DNK fragmenata dobijenih u PCR re-
akcijama ra|ena je na slede}i na~in: 15 l PCR proizvoda me{ano je sa 15 l sme{e
koja se sastoji od restrikcionog enzima (koncentracije 10 U/l), pufera (10 x razbla-
`en) i destilovane vode. Digestija na 37
0
C je trajala oko 12 ~asova.
Rezultati umno`avanja fragmenta gena koji kodiraju ACC sintazu i ACC oksi-
dazu, kao i rezultati digestija analizirani su na 1,5%, odnosno 2% agaroznim gelovi-
ma. Elektroforeza je trajala oko 2 h pri naponu od 70 V/cm, a nakon toga gelovi su bo-
jeni u rastvoru etidijum bromida i fragmenti vizuelizirani osvetljavanjem gela UV
svetlo{}u. Kao marker molekulskih masa kori{}en je 1 Kb plus DNA (GibcoBRL,
Life Technologies).
Rezultati i diskusija
Alelni polimorfizam gena koji kodira ACC sintazu. Umno`avanjem fragmenta ACS1
gena kori{}enjem prajmera ACS1-5F i ACS1-5R detektovana su dva fragmenta
DNK veli~ine 490 i 640 bp. Fragment od 490 bp odgovara alelu ACS1-1, dok frag-
ment od 640 bp, u koji je insertovan retrotranspozon SINE, odgovara alelu ACS1-2
(Sl. 1).
Vo}arstvo, Vol. 39. br. 150 (2005, 2), 139148 141
Sl. 1. PCR proizvodi dobijeni umno`avanjem fragmenta ACS1 gena, koriste}i praj-
mere ACS1-5F i ACS1-5R, kod 8 autohtonih sorti jabuke: 1 - [umatovka, 2 - Po-
zna kola~ara, 3 - Budimka, 4 - Babova~a, 5 - Petrova~a, 6 - Zejtinka, 7 - Muslimka,
8 - Valjnika, 9 - Fuji; razdvojeni na 1,5% agaroznom gelu i bojeni etidijum bro-
midom. M- marker molekulske mase (1 Kb plus DNK)
Fig. 1. PCR products of the amplified fragments of ACS1 gene obtained with pri-
mers ACS1-5F and ACS1-5R in 8 autochthonous apple cultivars: 1 - [umatovka, 2
- Pozna kola~ara, 3 - Budimka, 4 - Babova~a, 5 - Petrova~a, 6 - Zejtinka, 7 - Mu-
slimka, 8 - Valjnika, 9 - Fuji; analyzed on 1.5% agarose gel and stained in ethidium
bromide. M - 1 Kb plus DNA ladder
Dvadeset jedna autohtona sorta je homozigotne za alel ACS1-1 (ACS1-1/ACS1-
1) i tri su hetrozigotne (ACS1-1/ACS1-2) (Tab. 1).
Vo}arstvo, Vol. 39. br. 150 (2005, 2), 139148 142
Tab. 1. Alelna konstitucija ispitivanih autohtonih sorti jabuke za ACS1 gen
Allelic constitution of ACS1 gene for the studied autochthonous apple cultivars
____________________________________________________________________
Alelna konstitucija Autohtona sorta jabuke
Allelic constitution Autochthonous apple cultivar
ACS1-1/ACS1-1
ACS1-1/ACS1-2
ACS1-2/ACS1-2/
Babova~a, Bo{njanka, Budimka, Jabuka (Valjevo), Kablarka
(Trep~a), Kamenica 1, Kraljica, Letnja iz Grocke, Muslimka,
Opaljenik 1, Petrova~a, Pop Miladin, Sinlija, Strekinja, [areni-
ka, [umatovka, Tip 1 (Sirogojno), Tip 2 (Srogojno), Valjnika,
Zejtinka, Zelenika
Kablarka (Kablar), Pozna kola~ara, Samoniklaja
/
Po{to nijedna od analiziranih sorti nije homozigotna za alel ACS1-2, korelacija
izme|u alelne konstitucije ACS1 gena kod autohtonih sorti i traja{nosti njihovih plo-
dova se ne mo`e testirati. Sunako et al., 1999, Harada et al., 2000, Oraguzie et al.,
2004, ukazuju na jasnu korelaciju izme|u homozigotnosti alela ACS1-2 i dobre traja-
{nosti plodova u skladi{tu, a tipi~an primer su sorte Fuji i Ralls Janet.
Alelni polimorfizam gena koji kodira ACC oksidazu. Umno`avanjem fragmenta gena
koji kodira ACC oksidazu, kori{}enjem prajmera M11 i M12, dobijeni su fragmenti
veli~ine 1500 ili 1600 bp (Sl. 2).
Sl. 2. DNK fragmenti dobijeni PCR-om uz kori{}enje prajmera M11 i M12 za frag-
ment gena koji kodira ACC oksidazu za 8 autohtonih sorti jabuke: 1 - [umatovka, 2
- Pozna kola~ara, 3 - Budimka, 4 - Babova~a, 5 - Petrova~a, 6 - Zejtinka, 7 - Mu-
slimka, 8 - Valjnika; razdvojeni na 1,5% agaroznom gelu i bojeni etidijum bromi-
dom. M - marker molekulske mase (1 Kb plus DNK)
Fig. 2. DNA fragments obtained by PCR using M11 and M12 primers specific for
the fragment of ACC oxidase gene for 8 autochthonous apple cultivars: 1 - [uma-
tovka, 2 - Pozna kola~ara, 3 - Budimka, 4 - Babova~a, 5 - Petrova~a, 6 - Zejtinka, 7
- Muslimka, 8 - Valjnika; analyzed on 1.5% agarose gel and stained in ethidium bro-
mide. M 1 Kb plus DNA ladder

Restrikcionom analizom PCR proizvoda fragmenta gena koji kodira ACC oksi-
dazu sa 6 restrikcionih enzima (Eco RI, Eco RV, Hind III, Bam H1, Pst I i Rsa I) uo-
~en je jasniji polimorfizam. S obzirom da je restrikcija enzimima Eco RI, Eco RV,
Hind III, Bam H1 i Pst I rezultirala u identi~nom modelu polimorfizma, u ovom radu
prikazani su rezultati samo za Bam H1 i Rsa I enzime.
Restrikcijom sa Bam H1 kod svih ispitivanih autohtonih sorti dobijeni su frag-
menti od 830 bp i 760 bp (f2). Polimorfizam je uo~en samo za fragment veli~ine 700
bp (f1) (Sl. 3).
Vo}arstvo, Vol. 39. br. 150 (2005, 2), 139148 143
Sl. 3. DNK fragmenti gena koji kodira ACC oksidazu dobijeni restrikcijom sa Bam
H1 kod 7 autohtonih sorti jabuke: 1- [umatovka; 2 - Zejtinka; 3 - Pozna kola~ara; 4
- Babova~a; 5 - Budimka; 6 - Valjnika; 7 - Zelenika; razdvojeni na 2% agaroznom
gelu i bojeni etidijum bromidom. M - marker molekulske mase (1 Kb plus DNK)
Fig. 3. DNA fragments upon digestion of PCR product of the amplified fragment of
ACC oxidase gene with Bam H1 in 7 autochthonous apple cultivars: 1 - [umatovka;
2 - Zejtinka; 3 - Pozna kola~ara; 4 - Babova~a; 5 - Budimka; 6 - Valjnika; 7 - Zele-
nika; analyzed on 2% agarose gel and stained in ethidium bromide. M 1 Kb plus
DNA ladder

Nakon digestije PCR proizvoda umno`enog fragmenta gena koji kodira ACC
oksidazu sa restrikcionim enzimom Rsa I kod svih ispitivanih autohtonih sorti dobi-
jen je fragment veli~ine 230 bp. Pored ovog fragmenta dobijeni su fragmenti od 530
i 680 bp (obele`eni zajedno kao fragment f1) i 1270 bp (f2) (Sl. 4).
Pore|enjem polimorfizma uo~enog posle restrikcije sa Bam H1 i Rsa I enzimi-
ma identifikovana su 3 alela gena koji kodira ACC oksidazu: a, b i c. Aleli a i c, iden-
tifikovani u ovom radu, odgovaraju alelima Ai B koje su identifikovali Castiglione et
al. (1999). Alel b je novi alel, koji je identifikovan u ovom radu kod 8 autohtonih sor-
ti jabuke (Bo{njanka, Babova~a, Budimka, Jabuka (Valjevo), Muslimka, Pozna kola-
~ara, Samoniklaja, Sinlija). Restrikcionom analizom PCR proizvoda umno`enog frag-
menta gena koji kodira ACC oksidazu sa 6 restrikcionih enzima kod ispitivanih autoh-
tonih sorti jabuke uo~ene su 4 alelne konstitucije: aa, bb, ab i ac.
Vo}arstvo, Vol. 39. br. 150 (2005, 2), 139148 144
Sl. 4. DNK fragmenti (f1 i f2) dobijeni digestijom fragmenta gena koji kodira ACC
oksidazu sa Rsa I kod 7 autohtonih sorti jabuke: 1- Zelenika; 2- [umatovka; 3- Ba-
bova~a; 4- Budimka; 5- Bo{njanka; 6- Zejtinka; 7- Pozna kola~ara; razdvojeni na
2% agaroznom gelu i bojeni etidijum bromidom. M marker molekulske mase (1
Kb plus DNK)
Fig. 4. DNA fragments (f1 and f2) upon digestion of PCR product of the amplified
fragment of ACC oxidase gene with Rsa I in 7 autochthonous apple cultivars: 1 -
Zelenika; 2 - [umatovka; 3 - Babova~a; 4 - Budimka; 5 - Bo{njanka; 6 - Zejtinka; 7
- Pozna kola~ara; analyzed on 2% agarose gel and stained in ethidium bromide. M
1 Kb plus DNA ladder
[ematski su prikazani fragmenti DNK dobijeni nakon digestije sa kori{}enim
restrikcionim enzimima i odgovaraju}e alelne konstitucije:
Bam H1 Rsa I Alelna konstitucija
Allelic constitution
f
2
/ f
1
/ aa
f2 / f
2
/ bb
f
2
/ f
1
f
2
ab
f
1
f
2
f
1
f
2
ac
Od 24 analizirane autohtone sort 15 ima alelnu konstituciju aa, 1 konstituciju
bb, 7 konstituciju ab i 1 konstituciju ac (Tab. 2).
Castiglione et al. (1999) su utvrdili prisustvo dva alela (Ai B) gena koji kodira
ACC oksidazu kod 12 vrsta i sorti roda Malus Miller. Homozigotna konstitucija alela
A uo~ena je kod M. x purpurea (Barbier) Aldenhamensis, M. pumila Mill. Anto-
novka, M. x gloriosa Lemoine, M. x adstringens Zabel klon Hopa 138-1, M. pumila
Mill. x M. floribunda 821 hibrid Florina, M. prunifolia (Willd.) Borkh., M. pumila
Golden Delicious. Homozigotna konstitucija alela B je kod M. pumila Mill. Fuji,
M. x zumi Calocarpa, dok je heterozigotna konstitucija uo~ena kod M. pumila Ga-
la, Malus Dolgo i M. x floribunda Sieb. ex Van Houtte.
Alel c, identifikovan u ovom radu, odgovara alelu B koga su identifikovali Ca-
stiglione et al. (1999), navode}i da bi ovaj alel mogao imati pozitivan uticaj na traja-
{nost plodova u skladi{tu. Interesantno je napomenuti da se plod sorte Zelenika odli-
kuje dobrom traja{no{}u u skladi{tu, a da je njena alelna konstitucija za gen koji ko-
dira ACC oksidazu ac.
Zaklju~ak
Na osnovu analize alelnog polimorfizma gena koji kodiraju ACC sintazu i ACC
oksidazu kod 24 autohtone sorte jabuke mogu se izvesti slede}i zaklju~ci:
- Identifikovana su dva alela gena koji kodira ACC sintazu - ACS1-1 i ACS1-2;
- Analizirane autohtone sorte su homozigotne za alel ACS1-1 ili heterozigotne
(ACS1-1/ ACS1-2);
- Po{to sorte homozigotne za ACS1-2 nisu identifikovane, uticaj ove alelne kon-
stitucije na traja{nost plodova u skladi{tu se ne mo`e testirati;
- Identifikovana su tri alela gena koji kodira ACC oksidazu a, b, c, od kojih je
alel b prvi put opisan u ovom radu;
Vo}arstvo, Vol. 39. br. 150 (2005, 2), 139148 145
____________________________________________________________________
aa Kablarka (Kablar), Kablarka (Trep~a), Kamenica 1,
Kraljica, Letnja iz Grocke, Opaljenik 1, Petrova~a,
Pop Miladin, Strekinja, [arenika, [umatovka, Tip 1
(Sirogojno), Tip 2 (Sirogojno), Valjnika, Zejtinka
____________________________________________________________________
bb Bo{njanka
____________________________________________________________________
ab Babova~a, Budimka, Jabuka (Valjevo), Muslimka,
Pozna kola~ara, Samoniklaja, Sinlija
____________________________________________________________________
ac Zelenika
____________________________________________________________________
Tab. 2. Alelna konstitucija ispitivanih autohtonih sorti jabuke za gen koji kodira
ACC oksidazu
Allelic constitution of ACC oxidase gene for the studied autochthonous
apple cultivars
____________________________________________________________________
Alelna konstitucija Autohtona sorta jabuke
Allelic constitution Autochthonous apple cultivars
- Identifikovana su ~etiri fenotipa gena koji kodira ACC oksidazu: aa, bb, ab i
ac;
- Nedostatak korelacije izme|u alelne konstitucije gena koji kodiraju ACC sin-
tazu i ACC oksidazu i traja{nosti plodova autohtonih sorti, ukazuje na zna~ajan uticaj
drugih faktora. S toga bi bilo interesantno klonirati i sekvencionirati region promoto-
ra i kodiraju}i region gena za ACC sintazu, kao i alel a gena za ACC oksidazu kod
sorte [umatovka ~iji se plodovi odlikuju veoma dobrom traja{no{}u, a alelne konsti-
tucije navedenih gena ne odgovaraju o~ekivanim. S obzirom da je dozrevanje ploda
geneti~ki programiran kompleksan fiziolo{ki proces, pored faktora koji su uklju~eni u
sintezu etilena, va`no je prou~iti i faktore uklju~ene u percepciju etilena.
Literatura
Castiglione, S., Pirola, B., Sala, F., Ventura, M., Pancaldi, M., Sansavini, S. (1999):
Molecular studies of ACC synthase and ACC oxidase genes in apple. Acta Hor-
ticulturae, 484: 305-309.
Dong, D. J., Kim, W. T., Yip, W. K., Thompson, G. A., Li, L., Bennett, A. B., Yang,
S. F. (1991): Cloning of a cDNAencoding 1-aminocyclopropane-1-carboxylate
synthase and expression of its mRNA in ripening apple fruit. Planta, 185: 38-
45.
Doyle, J. J., Doyle, L. J. (1987): A rapid DNA isolation procedure for small quantiti-
es of fresh leaf tissue. Phytochemical bulletin, 19: 11-15.
Gorney, J. R., Kader, A. A. (1996): Controlled-atmosphere suppresion of ACC syntha-
se and ACC oxidase in Golden Delicious apples during long-term cold stora-
ge. J. Am. Soc. Hortic. Sci., 121: 751-755.
Gorney, J. R., Kader, A. A. (1997): Low oxygen and elevated carbon dioxide atmosp-
heres inhibit ethylene biosyntesis in preclimacteric and climacteric apple fruit.
J. Am. Soc. Hortic. Sci., 122: 542-546.
Harada,T., Sunako, T., Sakuraba, W., Goto, S., Senda, M., Akada, S., Niizeki, M.
(1997): Genomic nucleotide sequence of a ripening-related 1-aminocyclopropa-
ne-1-carboxylate synthase gene (MdACS-1) in apple (accession no. U89156)
(PGR97-066). Plant Physiol., 113: 1465.
Harada, T., Sunako, T., Wakasa, Y., Soejima, J., Satoh, T., Hiizeki, M. (2000): An al-
lele of the 1-aminocyclopropane-1-carboxylte synthase gene (Md-ACS1) acco-
unts for the low level of ethylene production in climacteric fruts of some apple
cultivars. Theor. Apple. Genet., 101: 742-746.
Kim, W. T., Silverstone, A., Yip, W. K., Dong, J. G., Yang, S. F. (1992): Induction of
1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase mRNA by auxin in mung bean
hypocotyls and cultured apple shoots. Plant Physiol., 98: 465-471.
Knee, M. (1993): Pome fruits. In: Biochemistry of fruit ripening, Seymour, G.B.,
Taylor, J.E., Tucker, G.A. (eds)., Chapman & Hall, London, pp. 325-346.
Lau, O. L., Liy, Y., Yang, S. F. (1986): Effect of fruit detachment on ethylene biosynte-
sis and loss of flesh firmness, skin color and starch in ripening Golden Delici-
ous apples. J. Am. Soc. Hortic. Sci., 111: 731-734.
Lay-Yee, M., Knighton, M. (1995): A full-length cDNA encoding 1-aminocyclopro-
pane-1-carboxylate synthase from apple. Plant Physiol., 107: 1017-1018.
Vo}arstvo, Vol. 39. br. 150 (2005, 2), 139148 146
Oraguzie, C. N., Iwanami, H., Soejima, J., Harada, T., Hall, A. (2004): Inheritance of
the Md-ACS1 gene and its relationship to fruit softening in apple (Malus x do-
mestica Borkh.). Theor. Apple. Genet., 108: 1526-1533.
Rosenfield, C. L., Kiss, E., Hrazdina, G. (1996): Md-ACS2 (accession no. U73815)
and Md-ACS3 (accession no. U73816): Two new 1-aminocyclopropane-1-car-
boxylate synthase in ripening apple fruit (PGR96-122). Plant Physiol., 112:
1735.
Sunako, S., Sakuraba, W., Senda, M., Akada, S., Ishikawa, R., Niizeki, M., Harada, T.
(1999): An allele of the ripening-specific 1-aminocyclopropane-1-carboxylate
synthase gene (ACS1) in apple fruit with a long storage life. Plant Physiol., 119:
1297-1303.
Theologis, A. (1992): One rotten apple spoils the whole bushel: the role of ethylene
in fruit ripening. Cell, 70: 181-184.
Yang, S. F., Hoffman, N. E. (1984): Ethylene biosynthesis and its regulation in higher
plants. Annu. Rev. Plant Physiol., 35: 155-189.
Primljeno: 13. 01. 2005.
Prihva}eno: 28. 03. 2005.
Vo}arstvo, Vol. 39. br. 150 (2005, 2), 139148 147
GENETIC POLYMORPHISM OF ACC SYNTHASE AND ACC OXIDASE IN
AUTOCHTHONOUS APPLE CULTIVARS
Sla|ana Mari}
1
, Radovan Bo{kovi}
2
, @arko Te{ovi}
1
, Milan Luki}
1
1
ARI SERBIA, Friut and Grape Research Centre, ^a~ak
E-mail: nidzovicsladja@yahoo.com
2
Institute of Molecular Genetics and Genetic Engineering, Belgrade
Summary
General trends in apple breeding involve the search for useful variants of agro-
nomically important properties and expansion of the genetic pool used. The stated
trends are based on the identification of genes and understanding of the processes
involved in the expression of the major properties. Since the fruit ripening is geneti-
cally programmed complex physiological process, it is of prime importance to inves-
tigate factors included in the synthesis of plant homone ethylene, a key regulator of
apple fruit ripening.
Allelic polymorphism of the genes encoding ACC synthase and ACC oxidase,
enzymes on ethylene biosynthetic pathway, was studied in 24 autochthonous apple
cultivars from the collection planting of the Fruit and Grape Research Centre and
compared to their fruit storage capability. Polymorphism was detected by chain
polimerase reaction (PCR method) and restriction analysis with 6 restriction enzymes
type II (Eco RI, Eco RV, Hind III, Bam H1, Pst I and Rsa I).
Based on the analysis of PCR product of amplified fragment of the gene encod-
ing ACC synthase, two alleles of ACS1 gene were identified: ACS1-1 and ACS1-2,
and analyzed autochthonous cultivars were homozygous for allele ACS1-1 or het-
erozygous (ACS1-1/ACS1-2).
Restriction analysis of PCR product of amplified fragment of the gene encod-
ing ACC oxidase in the studied material resulted in the identificatiion of three alleles:
a, b and c and four phenotypes: aa, bb, ab and ac. Allele b is a new allele, described
for the first time in this paper.
Key words: Apple, ethylene, ACC synthase, ACC oxidase, polymorphism, fruit
ripening.
Author's address:
Mr Sla|ana Mari}
Institut SRBIJA,
Centar za vo}arstvo i vinogradarstvo
Kralja Petra I 9
32000 ^a~ak
Srbija i Crna Gora
Vo}arstvo, Vol. 39. br. 150 (2005, 2), 139148 148