Tiyole

polimerler

tiyomerler

kuak

yeni

mukoadezif polimerler olarak geiyor. Bu mukoadezif

polimerler

mukus

tabakasna

kovalent

olarak

balanabiliyor. Mukus %95 i su olan glikoprotein

yapl bir yapdr ve ierisinde

siyalikasit olmas

nedeniyle negatif ykldr.

Absorbsiyon blgesinde, artan temas nedeniyle

peptit ve protein absorbsiyonundaki art fazla olduu
iin,

son

yllarda

uygulamalar
edilmektedir.

iin

peptit

ve

mukoadezif

protein

salmlar

sistemler

tercih

Bu almann amac nazal yoldan peptid

verilebilmesi iin tiyollenmi kitozan ile konjugasyon
yaplarak mikropartikler verili sistemleri gelitirmektir.
Model peptid olarak inslin kullanlmtr.
Kitozan tiyollemek iin 2-iminothiolamin ile kitozana
kovalent balanmtr.

Kitozan-TBA (chitosan-4-thiobutilamin) konjugatnda

polimerin her gramnda 304.8963.45 mol tiyol grubu

bulunur. Bu tiyol gruplarnn % 6.5u oksitlenmitir.

Kitozan-TBA konjugat, inslin ve

permeasyon arttrc mediator glutatyon
karmyla mikropartikler formlasyonu
yaplm.

Kontrol grubu olarak modifiye olmam

kitozan ve inslin mikropartiklleri

kinci kontrol grubu olarak mannitol-inslin

mikropartiklleri kullanlmtr.

100 mm fosfat tamponunda ph 6.8 de

Kitozan-TBA-inslin (tiyollenmi kitozan inslin)

mikropartiklleri byklke 4.390.52 kat ier iken

Kitozanl mikropartikller imemitir.

Kitozan-TBA mikropartiklleri, floresan izotiyosiyatik iaretli inslini
6 saat boyunca kontroll sald gsterilmitir.
Canl farelere nazal verilen
kitozan-TBA inslin mikropartikllerinin mutlak biyoyararlanm
%7.240.76 olduu bulunmutur.
Kitozan-inslin mikropartikllerin MBY %2.04 1.33
Mannitol-inslin mikropartikllerin MBY %1.04 0.27
kan bu sonulardan dolay kitozan-TBA ve indirgenmi glutatyon,
peptidlerin nazal yolla veriliinde umut vaat edici grlmektedir.

GR
Nazal kavitedeki geni yzey oran ve yksek damarlanma
nedeniyle nazal verilen peptidler hzla absorbe olurlar.

Peptidler nazal kan damarlarndan getikten sonra ilk gei

eliminasyonu olmadan etki yerine gidebilirler.

Genellikle peptidlerin ou nazal kaviteye verildiklerinde %

1 veya daha az biyoyararlanm gsterir. Bu dk
biyoyararlanmn sebebi

-Enzimatik bariyer
-Absorbsiyon bariyeri
-Mukosiliyer klerenstir.

Enzimatik

bariyeri yenmek iin enzim inhibitrlerinden

amastatin verilebilir. Ancak bu tr yardmc ajanlar sistemik

olarak absorbe edilirse toksiktir.

Absorbsiyon

bariyerini amak iin peptidler kimyasal olarak

modifiye edilerek nazal mukozadan absorbsiyonlar arttrabilir.

Ancak pek ok permeasyon arttrc, etkili konsantrasyonlarda
nazal mukozada nemli hasarlara sebep oluyor.
Mukosiliyer

azaltlabilinir.

klerens hz mukoadesif polimerlerle

KTOZANn yaplan pek ok farkl almada

nazal ila veriliinde ila emilim yerinde kal sresini
uzatt gsterilmitir.
Ayrca kitozan gecici olarak tight junctionlar aarak

peptid absorbsiyonunu arttrr. Bu nedenle kitozan

nazal peptid veriliinde umut vaat etmektedir.

Bu aratrma grubunun yapt dier almalara gre

Tiyollenmi kitozann modifiye olmam kitozana gre daha
yksek mukoadezif ve permeasyon arttrc zelliklerinin

olduu bulunmutur. Kitozan-TBA (chitosan-4-thiobutyl

amidine) konjugat permeasyon mediatr Glutatyon ile
kombine edildiinde permeasyon arttrc etki ok daha yksek

bulunmutur.
Peptid ilalarn oral veriliinde kitozan-TBA n faydas birok
in-vivo almayla gsterilmitir. Ancak nazal peptid veriinin
etkililii daha nceden deerlendirilmemitir. te bu nedenle
bu almada nazal peptid veriliinde kitozan-TBA ile modifiye
edilmemi kitozan formlasyonu kyaslanmtr.

Peptid ila olarak inslin seilmitir. nslin polar,

hidrofilik ve yksek molekl arlkl bir peptid

olmasndan dolay nazal verilii zordur

nslin ykl kitozan-TBA mikropartiklleri

oluturulmutur.
Bu mikropartikller in-vitroda partikl bykl,
ime zellii ve ila salmlar asndan karakterize
edilmi ayrca in vivoda tiyole kitozan

mikropartikllerine kar modifiye olmam kitozan

nazal verili ile deerlendirilmitir.

DENEYSEL ALIMALAR
Kitozan-TBA konjugatnn sentez ve prifikasyonu

Balangta 500 mg kitozan (molekl arl 400 kDa)

500 ml % 1 asetik asitte zld. 1 M NaOH ile pH 6.5a

ayarlandktan sonra 2-iminothiolane HCl eklendi. Oda
scaklnda devaml kartrlmayla 14 saat devam eden
kenetlenme reaksiyonuna brakld. Prifikasyon iin oluan
polimer konjugat 5mM HClde, 2 defa, %1 NaCl ieren 5mM
HCl de ve son olarak pH 3 elde etmek iin 1 mM HClde
dializ edildi. Daha sonra polimer -30 derecede donduruldu.

DENEYSEL ALIMALAR
n vivo almalar iin Nazal Dozaj eklinin
Hazrlanmas
Kitozan-TBA-inslin mikropartiklleri ve kontrol
mikropartikllerin listesi

Kitozan-TBA-inslin ve Kitozan-TBA-nslinFITC Mikropartikllerin Hazrlanmas

Mikropartikller s/y emlsiyon zc buharlatrma

yntemi ile hazrlanmtr.

ncelikle 3 ml donmu kitozan-TBA solsyonu (her

ml de 7.83 kitozan-TBA ieren) zndrlp 2.5 mg

redklenmi glutatyon ve
2.5 ml % 0.95 inslin solsyonu (sr pankreasndan)

2.5 ml % 0.95 FITC-inslin solsyonu eklenir. Karm

20 dk kartrldktan sonra % 0.25 span 20 ieren 90 gr
parafin ya (viskozitesi 11-230 mPas) eklenir.

Kitozan-TBA-nslin ve Kitozan-TBA- inslinFITC Mikropartikllerin Hazrlanmas

Ultraturax kullanlarak emlsiyon oluur olumaz 25 C sabit

scaklkta sulu faz tamamen buharlatrlr.

Ek olarak emlsiyon hava ile kprtlr (5 L/dk)(Additionally

emulsion was bubbled with air) ve 12 saat boyunca pedalla
300 rpm de kartrlr. Bu srada sulu faz tamamen buharlar.
Ya fazna petroleum eter (20 ml) ilave edilerek 10 dk
kartrlr. Mikropartikller santrifjlenerek (3000 rpm de 5 dk)
yal fazdan ayrlr. zerindeki kalntlar ykamak iin birka
sefer petroleum eter ile ykanr. Hava scaklnda kurutularak
nazal verilene kadar 4 C de saklanr.

Partikl Bykl ve ime zellii

Kitozan-TBA-inslin mikropartikllerinin ve kitozaninslin mikropartikllerinin partikl bykl ve su
absorblama kapasite lazer difraksiyon aleti kullanlarak
belirlenmitir.
Mikropartikllerin ime zelliini belirlemek iin pH
6.8 100 mM fosfat tamponunda 37 de inkbe edilir.
Mikropartikllerin artan byklkleri tampon ekler

eklemez ve 30. dk, 1. sa ve 2. sa zamanlarnda ayn

tamponda ierisinde ve devaml titreen su banyosunda
llmtr.

Partikl Bykl ve ime zellii

SONU:
ekilde grld gibi TBAkitozan-inslin
mikropartikllerinin ortalama
partikl bykl tamponla
temas ettikten sonra 2 saat
geene kadar 23.5
3.1den 82.1 8.7 ye
kmtr.
Deneyin sonunda partikl
bykl parafin yann
iindeki mikropartikllere
gre 4.39 0.52 kat fazla
itii bulunmutur.

Kitozan-inslin mikropartiklleri ise ime deneyinde hibir

byme gstermemitir.

Partikl Bykl ve ime zellii

SONU:

pH 6.8 37 100
fosfat tamponunda daildktan
hemen sonraki partikl bykl
dalm

Ayn tamponda 30 dk
kaldktan sonra

Ayn tamponda 1 saat

kaldktan sonra

Ayn tamponda 2 saat

kaldktan sonra

Yklenen inslin ve redklenmi glutatyonu tespit etmek iin HPLC ile analiz
edilmitir.

Farkl mikropartikler sistemlerdeki inslin ve glutatyon ykleme kapasiteleri

tablo 1de gsterilmitir.

Kitozan-TBA-inslin mikropartikllerine yzde olarak yklenen

nslin miktar %38.23 0.98
Glutatyon miktar%9.52 0.62
Partikllerde okside glutatyon tespit edilmemitir.

Tiyole polimer ile inslin arasndaki muhtemel tiol/dislfit deiim reaksiyonlar ile
oluabilecek etkisiz protein fragmentleri HPLC analizinde ek bir pik vermemitir.

TBA-kitozan-inslin Mikropartikllerinden
n-vitro Salm almalar

Kitozan-TBA-FITC-inslin mikropartikllerinden FITC-

inslin salm hz in-vitroda analiz edilmitir ve FTIC-inslin

fluorimeter ile floresan altnda llerek belirlenmitir.

Sonu:
Kitozan-TBA-FITC-inslin
mikropartikllerinden
FITC-inslin salm hz

ekil3de gsterilmitir.

TBA-kitozan-inslin Mikropartikllerinden nvitro Salm almalar

SONU:

6 saat sonra

partikllerden 53.09.1%
FITC-inslin salm
olmutur.

Salm profili, FITC-inslin 15 dakika iinde zlerek hzl

salm yapt sonra da kalan zaman periyodunda kontroll bir

ekilde salm yaptn gstermektedir.

.V Enjeksiyon iin nslin

Solsyonunun Hazrlanmas
nslin solsyonunun i.v enjeksiyonu pozitif
kontrol yaplmtr. .v enjeksiyon iin 3.8 inslin 0.1
mL steril 154mM fosfat tamponu saline ile (pH 7.5)
zndrlr. Daha sonra por genilii 0.22 m olan
selloz asetat filtre biriminden szlerek enjekte edilir.

n-Vivo Deerlendirme

Etik kurul onay

n-vivo almalar erkek Wistor ratlarnda (200-300 gr)
Doz verilmeden nce 6 saatlik alktan sonra 200L kan kuyruk
veninden alnmtr. (0. zamandaki inslin seviyeleri)
Ratlar 4 gruba ayrlm ve farkl dozaj ekilleri verilmitir.
3 fareye 726.31g inslin/kg ieren kitozan-TBA-inslin
mikropartikllerden 1 mg
4 fareye 660.2 g inslin/kg ieren kitozan-inslin mp 1mg
4 fareye 663.55 g inslin/kg ieren mannitol -inslin mp 1mg herbir
burun deliinden verilir.

n-Vivo Deerlendirme

Dier gruba da (4 rat) 13.87 g inslin/kg i.v enjeksiyon verilir .

la verildikten sonra 15. dk ,30.dk, 1.sa, 2.sa, 4.Sa ve 6.saatlerde

200 L kan alnarak beklenmeden hemen ardndan santrifj (4000g
5dk 4) edilir. Plazma rnekleri alnarak ELSA ile analiz edilene
kadar dondurulur.

.v verilite enjeksiyonun ardndan 2.5.dk, 5.dk ve 10.dakikalarda

200L kan alnr. Zaten daha sonraki zamanlarda kan seviyesinin
dmesi beklenir.

n-vivo alma Sonular

Kitozan-inslin mikropartiklleri ve
mannitol inslin mikropartiklleri nazal
verildikten 15 dk sonra maksimum kan

deerlerine gelirler 26.9540.09ng/ml ve

20.0310.47 ng/ml
Kitozan -TBA-inslin mikropartiklleri ise

ratlara veriliinden 30 dk sonra maksimum

plazma seviyesine gelir(91.0310.98 ng/ml)
Bu mikropartikllerin MBY %7.240.76dr.
Yani MBY kitozan-inslin
mikropartikllerinden 3.5 kat fazladr.

Mannitol-inslin mikropartiklleri ise kitozan mikropartikllerinden

neredeyse 7 kat daha fazla etkilidir.

Mikropartikllerin Karakterizasyonu

Mikropartikller kresel ve sert yzeylidir.

Byklk dalmlar znmeyen dispersiyon parafin yann iinde

Kitozan-TBA-nslin mikropartikllerinin %99.8 den fazlas

Kitozan inslinin mikropartikllerinin ise %100 1-59 m arasndadr.
Ortalama partikl ap
Kitozan-TBA-nslin mikropartiklleri iin 18.70.3m
Kitozan inslinin mikropartikllerinin ise 18.50.3m dir.
Bu sonular transmisyon k mikroskobu ile de teyit edilmitir. Her ikisinde
de partikller 10m nin altna olabildiinden solunum sisteminin alt

ksmlarna kaabilir.
Mikropartikl hazrlama srasnda Kitozan-TBA konjugat oluurken inter ve
intra molekler dislfit balar oluur. Bu sayede hazrlama esnasnda
mikropartikllerin stabilitesi artar.

TARTIMA
Yaplan pek ok almada inslin mikropartikllerinin ve inslin

toz formlasyonunun nazal verilen inslin solsyonundan ok

daha yksek biyoyararlanma sahip olduunu gstermitir.
1984 ylnda Nagai ve arklarnn kpeklerle yapt deneysel

almalarda inslinin toz halinin likit formundan daha iyi

absorbsiyon gsterdiini belirtmilerdir.
Schipper ve arklar 1993 ylnda Nazal olarak liyofilize

inslin/dimetil--siklodekstrin toz dozaj eklini tavanlara

uyguladklarnda ayn inslin-siklodekstrin karm solsyonuna
oranla13 kat fazla biyoyararlanm gstermitir.

 Mikropartikller ve toz formlasyonlar nazal mukozaya

temas ettiklerinde nazal mukustan su ekerek viskoz jel
oluturduklar dnlmektedir. Jel formu siliyer klerens hzn
azaltarak formlasyonun nazal mukusta daha fazla kalmasn
salar. (Pereswetoff-Morath 1998)
Soane ve arklarnn koyunlarda yaptklar bir almada

kitozan mikrokrelerinin nazal mukozada yarlanma mr 115

dk iken, kitozan solsyonunun 43 dkdr.
nsanlarda yaplan almada kitozan mikrokrelerinin

yarlanma mr kitozan solsyonundan 2 kat daha fazladr.

(Soane ve ark 1999)

 Kitozan krelerinin bu mukoadezif zellikleri daha nce de belirtildii

gibi nazal mukozada kendiliinden jel formu oluturmasyla ilikilidir.
Ek olarak kitozann mukoadezif zellikleri pozitif yknden de
kaynaklanmaktadr.
Pozitif ykl kitozan ile negatif ykl mukus arasndaki
elektrostatik ilgi in-vitroda gsterilmitir (Schipper ve arklar).
nsanlarda yaplan bir almaya gre pozitif ykl OLMAYAN
niasta mikrokrelerinin nazal yarlanma mrleri kitozan

mikrokrelerine gre ok ok daha ksadr. (Soane ve ark 1999)

Kitozann bu mukoadezif zellii kitozana 2 iminothiolane n
kovalent balanmasyla daha da artar. TBA-Kitozan konjugatnn,

modifiye olmam haline kyasla mukoadeziflii 130 kat artmtr.

(Bernkop-Schnrch ve ark 2003a 2004)

 Kitozan ile artm bu mukoadezif zellik tiomerdeki tiol

gruplar ile mukus glikoproteinlerindeki sisteince zengin blge
arasndak idislfit balarndan ileri geldii dnlmtr.
(Leitner ve ark 2003)
Jel formundaki mikropartikllerin nazal mukusa kovalent
balanmasndan dolay TBA-kitozan mukusta kitozandan

daha uzun kalr. Ayrca bu alma grubu tiyomerlerin

mukoadezif zelliklerinin mikropartikl hazrlamada kullanlan
emlsiyon zc buharlatrma teknii ile azalmadn
gstermitir. (Bernkop-Schnrch ve ark 2203b, Krauland ve
Bernkop-Schnrch ve ark 2004)

ime
Mikropartikllerin ime davran nazal mukozada in-situ jel formu
oluturmada nemli rol oynamasndan dolay mikropartikllerin ime
zellii belirlenmitir.
TBA-kitozan-inslin mikropartiklleri parafin ya iinde byklke
18.70.3 dir. Ancak fosfat tamponu ile temas eder etmez
byklkleri 23.53.1den 2 saat sonra 4 kat byr.

Modifiye olmam kitozan, fosfat tamponunda hibir ime zellii

gstermez. Deiiklik yaplmam kitozanda tiyol gruplarnn
olmamasnn yansra ime kapasitesinin olmamas da dk inslin

biyoyararlanmnn olmasna sebep olur

Bu almada TBA-kitozan-inslin mpleri kitozan-inslin
mikropartikllerinden 3.5 kat daha fazla biyoyararlanm gstermitir.

Bu fark sadece yksek mukoadezif zellikle alakal deildir ayn

zamanda permeasyon arttrc mediatr redkte glutatyon da bu
sonuta etkilidir. (Bernkop-Schnrch)

Tiyomer-glutatyon karmnn permeasyon arttrc etkisi invitroda sr nazal mukozasnda insan byme hormonu verilerek
allmtr. (Leither ve ark 2004)
Ayrca tiyole kitozan ve glutatyonlu inslin tabletler farelere oral
verildiinde ok daha artm farmakolojik etki elde edilmitir (kontrol
tabletlere gre) (Krauland ve ark 2004)

Bu alma nazal peptid veriliinde daha ileri almalar iin

basamak olarak kullanlmal bu ynde almalar devam etmelidir.

Bu almada ratlardaki biyoyararlanm bulunmutur ancak rat,

tavan ve insanlarda ok farkl profiller grlr.

Ayrca elde edilen biyoyaralanm %7.270.76 dier aratrma

gruplarna gre olduka dktr. Ancak farkl almalar
kyaslamak da zordur. nk

Farkl hayvan deneyleri

Farkl deney koullar
Nazal formlasyonlarn sonucu olarak farkl MBY ve BBY lar
kar.
Bu alma bu konuda daha ileri almalar yaplmas gerektiinin
kantdr.

SONU
Bu almada tiyole kitozan, modifiye edilmemi kitozanla
karlatrlarak peptidlerin nazal verilebileceine kant oluturmakta ve
bu konuda daha ileri almalar yaplmas gerektiinden bahsedilmitir.

Nazal olarak tiyole kitozanla verilen inslin, modifiye edilmemi

kitozandan daha yksek biyoyararlanm gsterir.

ki verili sisteminde grlen efikasite farkll kitozan-TBA

glutatyon sisteminin yksek mukoadezif ve permeasyon arttrc
mediatr ile ilikilidir.

Bu ila verili sistemi, teraptik peptid ila veriliinde

kullanilabilir bir sistem olabilir.