ABSTRAK

Eksperimen ini dijalankan untuk menentukan aktiviti spesifik enzim.

Sebelum itu,penentuan aktiviti fosforilase dan penentuan kepekatan protein
perlu dijalankan.Aktiviti fosforilase boleh ditentukan dengan menggunakan
tindakbalas

terbalikan

melalui

penentuan

kadar

pembentukan

fosfat

takorganik (Pi). Untuk menentukan kepekatan fosfat tak organik,kaedah

spektrofotometer digunakan.Keputusan yang diperoleh digunakan untuk
mengira

kepekatan

fosfat

tak

organik

yang

terhasil

bagi

setiap

ekstrak.Kepekatan fosfat yang terhasil dapat menentukan aktiviti fosforilase

untuk ekstrak.Keputusan eksperimen yang diperoleh ditulis dalam unit
mol/ml/min.Keputusan untuk tabung uji yang berkandungan larutan enzim
0.3 ml ialah tabung uji S1 0.070 mol/ml/min, tabung uji S2 0.109
mol/ml/min,tabung uji M1 0.182 mol/ml/min dan tabung uji M2 0.109
mol/ml/min . Keputusan untuk tabung uji yang berkandungan larutan enzim
0.6 ml ialah tabung uji S1 0.267 mol/ml/min, tabung uji S2 0.070
mol/ml/min,tabung uji M1 0.539 mol/ml/min dan tabung uji M2 0.028
mol/ml/min. Untuk penentuan kepekatan protein dalam ekstrat pula,
kaedah

Folin

Ciocalteau

digunakan.

Melalui

keputusan

yang

diperoleh,kepekatan protein boleh didapati daripada graf yang diplot,iaitu

kepekatan protein didapati tinggi sekali pada tabung uji M1 dengan
kepekatan sebanyak 350 ug/ml diikuti dengan tabung uji S1 iaitu 305 ug/ml,
M2 130 ug/ml dan S2 91 ug/ml .Untuk menentukan aktiviti spesifik
enzim,nilai fosfat yang diperoleh dibahagi dengan nilai protein.Hasil daripada
pengiraan didapati bahawa tabung uji yang berkandungan larutan enzim 0.3
ml ialah tabung uji S1 1.148 x 10

, tabung uji S2 5.989 x 10 5,tabung uji M1

2.600 x 10 5dan tabung uji M2 4.192 x 10 5. Keputusan untuk tabung uji yang
berkandungan larutan enzim 0.6 ml ialah tabung uji S1 4.377 x 105, tabung uji
S2 3.846 x 105,tabung uji M1 7.700 x 105 dan tabung uji M2 1.077 x 105.
TEORI-TEORI (PRINSIP)

Prinsip asas pengasingan protein adalah kerana protein berkebolehan untuk

terlarut dalam larutan berair kerana protein mempunyai ciri-ciri berikut :
i)

terdapat kumpulan berion seperti NH3+ dan COO- dalam molekul

protein yang boleh bertindakbalas dengan molekul air,

ii) terdapat kumpulan berkutub pada permukaan molekul protein

yang boleh bertindakbalas dengan molekul air.
Eksperimen ini dijalankan untuk mengasingkan enzim fosforilase dari ubi
kentang

dan

ekstraknya.

kemudian

ditentukan

aktiviti

spesifik

enzim

ini

dalam

Satu unit enzim boleh ditakrifkan sebagai jumlah yang

memangkinkan satu mikromol substrat dalam satu minit dalam keadaan

tertentu.

Unit

ini

digunakan

untuk

menentukan

keaktifannya

dimana

keaktifan ini juga disebut sebagai keaktifan spesifik iaitu jumlah unit dalam
satu miligram protein. Oleh itu kita boleh katakan keaktifan spesifik sesuatu
enzim adalah:

Aktiviti spesifik enzim = jumlah aktiviti enzim = umol substrat diguna/min

jumlah protein
mg protein

I Ini boleh diterangkan bahawa jika suatu ekstrak enzim menunjukkan

aktiviti spesifik enzim yang tinggi , menunjukkan ia mempunyai enzim dalam
kuantiti yang tinggi. Ekstrak enzim di katakan separa tulen kerana protein
lain yang wujud dengan enzim dalam ekstrak dapat di asingkan. Sebelum
kita boleh menentukan aktiviti spesifik enzim, aktiviti enzim dan kepekatan
protein perlu di tentukan dulu. Dalam eksperimen ini enzim fosforilase akan
di asingkan dengan menggunakan garam ammonium sulfat sebagai bahan
mendakan melalui proses salting-out. Secara amnya keterlarutam protein
dipengaruhi oleh kekuatan ion seperti berikut:
u

1 cizi2
2

Dimana u ialah kekuatan ion, Ci ialah kepekatan ion dan zi ialah Ca pada ion
itu.Aktiviti sesuatu enzim di takrifkan seperti berikut:

Aktiviti enzim

umoles hasil terbentuk

minit

Kaedah spektrofotometer di gunakan untuk menentukan kepekatan fosfat

takorganik dan kaedah ini mengikut prinsip fotometri seperti yang telah
dijalankan pada sesi amali sebelum ini.

KEPUTUSAN DAN ANALISIS

Jadual 1 : Tatacara ujian kepekatan fosfat bagi ekstrak S1, S2. M1
dan M2
S1
1

S2
1

M1
1
2

M2
1
2

5% larutan
0.2
kanji (ml)

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

Larutan
Tampan (ml)

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

Larutan
enzim (ml)

0.3

0.6

0.3

0.6

0.3

0.6

0.3

0.6

0.3

0.6

0.3

0.6

0.3

0.6

0.3

0.6

Air
(ml)

1.0

0.7

1.0

0.7

1.0

0.7

1.0

0.7

1.0

0.7

1.0

0.7

1.0

0.7

1.0

0.7

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

suling

Eram selama 2 minit pada 370C

Larutan 25%
0
TCA

1.0

Larutan
glukosa-11.0 1.0 1.0 1.0
fosfat
Eramkan selam 15 minit pada 370C
Larutan 25%
1.0
TCA

1.0

Emparkan dan ambil supernatan sebanyak 1ml utk setiap tabung uji

Jadual 2 : Penentuan kepekatan PI.

Tabung
uji

S1

S2

M1

M2

Supernatan
(ml)
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4

Blank

1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
0.0

Reagen
fosfat
(ml)
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
0.0

Air
suling
(ml)
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
1.0

*Daya
penyerapan
(725nm)
1.043
1.364
1.011
1.058
0.883
0.913
0.443
0.538
1.569
2.089
1.348
1.171
1.358
1.196
0.857
0.973
0.000

Kepekatan
fosfat
g
90
150
70
74
40
50
71
70
120
225
68
71.5
42
65
73
73
0

Kepekatan fosfat diperolehi daripada graf daya penyerapan lawan

kepekatan fosfat kaedah daripada eksperimen 2 yang dijalankan sebelum
ini.
Jadual 3 : Penentuan kepekatan protein menggunakan reagen FolinCiocalteau
Tabung
Uji
1
(Blank)
S1
S2
M1

Reagen
Folin
Beralkalin
(ml)

Daya
Penyerapan
(700nm)

1.0

0.000

820

1.0

1.518

0.0

0.245

1.0

0.590

0.0

0.165

1.0

0.987

Isipadu
Air
(ml)

Kepekatan
Protein
(g/ml)

0.0

1.0

0.000

0.5

0.0

0.5
0.5

Ekstrak
(ml)

Larutan
Cu(g/ml)

0.5

M2

Kepekatan

0.0

protein

0.70

diperolehi

dari

graf

daya

1.0

penyerapan

0.750

lawan

kepekatan protein dalam kaedah Folin-Ciocalteau daripada eksperimen

2 ( tukar unit g mg ).

Penukaran kepekatan protein daripada ug/ml ke mg/ml

Contoh: kepekatan enzim S1
1mg/ml

1000ug/ml

110 ug/ml x 1mg/ml

1000 ug/ml

0.110 mg/ml

PENGIRAAN
S1

0.161nm ( Daripada graf jadual 1.1 = 110 g / ml )

S2

0.356 nm( Daripada graf jadual 1.1 = 245 g / ml )

M1

0.234 nm( Daripada graf jadual 1.1 = 165 g / ml )

M2

0.100 nm( Daripada graf jadual 1.1 = 70 g / ml )

S 1 /M1
S1

mol / Pi / min/ ml
S1 (1)S1(3)
380 180 = 20
( 200 / 95 15 2 ) x 10
= 0.70 mol / ml

g / Protein
Y 1 x 2 x 10
= 110 x 2 x 10
= 2200

S1 (2)S1(4)
450 225 = 225
( 225 / 95 15 2 ) x 10
= 0.789 mol / ml
S2

S2 (1)S2(3)
350 150 = 200
( 200 / 95 15 2 ) x 10
= 0.702 mol / ml
S2 (2)S2(4)

Aktiviti Spesifik
Enzim
X1/Y1 = 0.70 /2200
= 0.00032

X2/Y1 = 0.789 / 2200

= 0.000336

Y 2 x 2 x 10
= 245 x 2 x 10
= 4900

X3/Y2 = 0.792 / 4900

= 0.000162

X4/Y2 = 0.842 / 4900

340 100 = 240

( 240 / 95 15 2 ) x 10
= 0.842mol / ml
S 1 /M1

= 0.00017

U mol / Pi / min/ ml

M1

g / Protein

M1 (1)M1(3)
310 220 = 90
( 90 / 95 15 2 ) x 10
= 0.316 mol / ml

Aktiviti Spesifik
Enzim
X5/Y3 = 0.316 / 3300
= 0.000096

Y 3 x 2 x 10
= 165 x 2 x 10
= 3300

M1 (2)M1(4)
410 300 = 110
( 110 / 95 15 2 ) x 10
= 0.386 mol / ml
M2

X6/Y3 = 0.386 / 3300

= 0.0001

M2 (1)M2(3)
320 130 = 90
( 90 / 95 15 2 ) x 10
=0.316 mol / ml

Y 4 x 2 x 10
= 90 x 2 x 10
= 1800

X7/Y4 = 0.316 / 1800

= 0.00018

M 2 ( 2 ) M 2 (4 )
340 120 = 220
( 220 / 95 15 2 ) x 10
= 0.772mol / ml

X8/Y4 = 0.772 / 2600

= 0.00030

PERBINCANGAN
Eskperimen ini dijalankan untuk menentukan aktiviti spesifik enzim.Sebelum
itu,penentuan

aktiviti

enzim

dan

penentuan

kepekatan

protein

perlu

dijalankan.
Fosforilase memangkinkan tindakbalas berikut:
(kanji)n +Pi <-----> (kanji)n-1 + glikosa-1-fosfat
Aktiviti

fosforilase

terbalikan

melalui

boleh

ditentukan

penentuan

kadar

dengan

menggunakan

pembentukan

fosfat

tindakbalas
takorganik

(Pi).Dalam ujikaji ini,larutan tampan ditambahkan untuk menstabilkan atau

mengekalkan nilai pH.Tabung uji 3 dan 4 digunakan sebagai kawalan.Pada
bahagian pertama,selama 2 minit pengeraman digunakan.Selepas itu,TCA
ditambahkan ke dalam tabung uji 3 dan 4 bagi setiap larutan estrat untuk

memberhentikan tindakbalas enzim.Pada masa yang sama,Glukosa-1-fosfat

sebanyak 1 ml ditambahkan ke tabung uji 1 dan 2.Masa pengeraman untuk
bahagian ini ialah selama 15 minit.Ini merupakan masa yang optimum untuk
enzim(E)

bertindakbalas

kompleks

dengan

substrat(S)

enzim-substrat(ES).ES

ini

dan

menghasilkan

memberikan

hasil(P)

suatu
serta

membebaskan enzim(E) sekali lagi.Kemudian, tambahkan TCA sebanyak 1ml

ke tabung uji 1 dan 2 untuk memberhentikan aktiviti fosfarilase.Untuk
menentukan

kepekatan

fosfat

tak

organik,kaedah

spektrofotometer

digunakan.Keputusan yang diperoleh digunakan untuk mengira kepekatan

fosfat tak organik yang terhasil bagi setiap ekstrak.Kepekatan fosfat yang
terhasil dapat menentukan aktiviti fosforilase untuk ekstrak S1,S2 dan
M1,M2.

KESIMPULAN
Keputusan

yang

diperoleh

menggambarkan

keadaan

yang

sebenar.Mengikut prinsip,sepatutnya ekstrat yang telah diemparkan secara

berperingkat,pada

akhir

akan

mendapat

ekstrat

yang

berkandungan

tulen,maka aktiviti spesifiknya dijangkakan tinggi.

RUJUKAN
1.

Nik Norulaini Nik Abdul Rahman, Prinsip Biokimia, Pusat Pengajian

Pendidikan Jarak Jauh, 1985.

2.

David T.Plummer, An Introduction to Practical Biochemistry, 2 nd

edition, McGraw-Hill Company, UK, 1978.

3.

Johari Mohd Saad, Metabolisma Asid Amino, Dewan Bahasa dan

Pustaka, 1990

4.

Keith Wilson & John Walker, Principles and Techniques of Practical

Biochemistry, 4th edition, Cambridge University Press, 1994.

5.

Lim Phaik Ee, Ang Tian Tse, Prinsip dan Eksperimen Enzim, Dewan
Bahsa dan Pustaka, Malaysia, 1988.