Prosedur selanjutnya adalah menentukan Minimum Inhibitory Concentration ( MIC )

sediaan antibiotik terhadap bakteri Staphylococcus aureus, Escherichia Coli,

dan Bacillus

subtillis dengan menggunakan metode MIC padat pada media Nutrien Agar.
Nutrien agar merupakan media pertumbuhan untuk bakteri. NA juga digunakan untuk
pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang tidak selektif, yang berarti mikroorganisme
heterotrof. Media ini merupakan media sederhana yang dibuat dari ekstrak beef, pepton, dan
agar. NA merupakan salah satu media yang umum digunakan dalam prosedur bakteriologi
seperti uji biasa dari air, sewage, produk pangan, untuk membawa stok kultur, untuk
pertumbuhan sampel pada uji bakteri, dan untuk mengisolasi organisme dalam kultur murni.
Antibotik yang digunakan adalah Kloramfenikol . Alat-alat yang akan digunakan
disiapkan seperti tiga buah tabung reaksi steril, pipet volume 10ml dan 1ml yang telah steril, tiga
buah cawan petri steril dan tabung reaksi yang telah dikalibrasi untuk memindahkan media
nutrient aga. Alat-alat yang digunakan harus steril sehingga saat digunakan tidak ada
kontaminasi dari mikroba lain maka hanya ketiga bakteri tersebut (Staphylococcus aureus,
Escherichia Coli,

dan Bacillus subtillis) yang terdapat dalam media nutrient agar untuk

pengujian MIC dari kloramfenikol . Selain itu, pengerjaannya pun dilakukan secara aseptis yaitu
suatu metode atau teknik di dalam memindahkan atau mentransfer kultur bakteri dari satu tempat
ke tempat lain secara aseptis dengan melakukan setiap langkah-langkah kerja di dekat panas api
spiritus agar tidak terjadi kontaminasi oleh mikroba lain dari lingkungan luar ke dalam kultur
antibiotik atau biakan bakteri yang akan dibuat. Semua alat yang akan digunakan dan
bersentuhan dengan antibiotik ataupun nutrient agar seperti pipet, tabung reaksi, ose, dan cawan
petri harus difiksasi terlebih dahulu agar tidak terjadi kontaminasi dari alat yang menempel pada
berbagai benda. Pipet volum tidak boleh difiksasi karena merupakan alat kuantitatif sehingga
saat menggunakan pipet volume dilakukan di dekat api saja.Teknik transfer aseptis ini sangat
esensial dan kunci keberhasilan prosedur mikrobial yang harus diketahui oleh seorang yang
hendak melakukan analisis mikrobiologi.
Kloramfenikol yang akan digunakan berupa larutan antibiotik bening sedikit keruh, sebelumnya
telah diencerkan di dalam labu ukur 100 mL. Pengenceran kloramfenikol pada labu ukur ini
bertujuan untuk mendapatkan konsentrasi yang diinginkan, yaitu sebesar 2500 g/ml, dan
selanjutnya bisa dibuat variasi konsentrasi yang diinginkan. Sebenarnya, kloramfenikol

merupakan drugs of choice untuk bakteri Escherichia Coli namun akan diuji pula efek
hambatnya terhadap Staphylococcus aureus dan Bacillus subtillis
Pengenceran yang dilakukan merupakan pengenceran bertingkat, dengan tujuan
mengurangi konsentrasi antibiotic yang akan digunakan dengan kata lain membuat variasi
konsentrasi antibiotic untuk mengetahui MIC dari kloramfenikol. Pertama kedalam setiap tabung
diisi 1ml dari aquades steril sebagai pelarut yang akan mengencerkan antibiotik, lalu dipipet
sebanyak 1 ml dari antibiotik yang telah dilakukan pengenceran dengan konsentrasi 3,125 g/ml
dan dimasukkan ke dalam tabung pertama sehingga diperoleh konsentrasinya sebesar 1,5625
g/ml lalu tabung reaksi digoyang perlahan agar larutannya homogen karena apabila tidak, akan
terjadi kesalahan yang cukup fatal karena tidak pastinya konsentrasi antibiotik yang akan
digunakan. Selanjutnya ke pengenceran kedua, antibiotik sebanyak 1 ml diambil dari tabung
reaksi yang pertama (konsentrasi 1,5625 g/ml) lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi kedua
yang telah berisi 1ml aquades steril lalu digoyangkan. Dihasilkan antibiotik dengan konsentrasi
0,78125 g/ml. Antibiotic dari tabung reaksi kedua lalu diencerkan lagi dengan mengambil 1 ml
antibiotic pada tabung reaksi kedua (konsentrasi 0,78125 g/ml) dan dipindahkan ke dalam
tabung reaksi yang ketiga dengan 1ml aquades steril lalu digoyangkan sehingga diperoleh
konsentari antibiotik 0,390625g/ml.
Selanjutnya, antibiotik dengan ketiga konsentrasi tersebut masing-masing dipindahkan ke
dalam cawan petri yang telah dipastikan steril dan pengerjaan tetap dilakukan dekat dengan api
agar tidak terkontaminasi oleh bakteri-bakteri dari luar. Caranya sebanyak 1 ml antibiotik yang
telah terdapat dalam tabung langsung dipindahkan kedalam cawan petri lalu ditambahkan 19 ml
nutrient agar. Sedangkan untuk tabung reaksi yang ketiga karena volume antibiotiknya 2 ml
maka pemindahan antibiotic kedalam cawan petrinya dilakukan dengan dipipet 1ml antibiotic
lalu dipindahkan ke dalam cawan petri. Penambahan nutrient agar kedalam masing-masing
cawan petri dilakukan saat nutrient agar tersebut tidak terlalu panas. Cara untuk mengetahui
apakah nutrient agar tersebut sudah dapat dipindahkan ke dalam cawan petri yang telah berisi
antibotik adalah dengan merasakannya menggunakan punggung tangan jika sudah terasa tidak
panas (hangat kuku) nutrient agar baru dipindahkan ke cawan petri, jika nutrient agar
dipindahkan saat masih panas maka dikhawatitkan akan merusak aktivitas dari antibiotiknya dan
jika terlalu dingin makan nutrient agar akan cepat mengeras sehingga sulit untuk dipindahkan.

Pemindahan nutrient agar dari wadahnya ke dalam cawan petri tidak melalui pipet volume
karena nutrient agar nantinya akan mengeras di dalam volume pipet sehingga untuk menghindari
hal tersebut digunakan tabung reaksi yang sudah dikalibrasi 19 ml sebagai media perantara.
Kalibrasi dilakukan dengan menggunakan dua buah tabung reaksi yang ukurannya dianggap
sama, satu steril dan satu lagi tidak steril. Air diukur dengan menggunakan gelas ukur sebanyak
19 ml kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang tidak steril, batas ditandai dengan
menggunakan spidol, tabung reaksi steril diletakkan sejajar dengan tabung reaksi lainnya
kemudian ditandai batasnya sama dengan batas pada tabung reaksi sebelumnya. Campuran
antara antibiotik dengan nutrient agar selanjutnya di homogenkan dengan cara memutar cawan
(digoyangkan) secara perlahan di atas permukaan datar. Setelah homogen, antibiotik didiamkan
beberapa saat sampai nutrien agar mengeras.Agar yang masih cair ditandai dengan warnanya
yang jernih, sedangkan agar yang sudah padat ditandai dengan warnanya yang agak keruh serta
konsistensi yang tinggi, bisa diuji dengan cara dibalikkan. Agar tidak akan jatuh apabila sudah
padat. Prosedur ini dilakukan untuk setiap antibiotik pada masing-masing tabung reaksi.
Selanjutnya dibuat control positif dan control negative, untuk control positif terdiri dari nutrient
agar yang telah memadat didalam cawan petri lalu dioleskan ketiga suspensi bakteri di area yang
berbeda.sedangkan untuk control negatifnya hanya terdiri dari nutrient agar saja. Control positif
dan control negative tersebut akan digunakan sebagai pembanding dalam pengamatan.
Setelah campuran tersebut mengeras/memadat selanjutnya masing-masing suspensi bakteri
digoreskan pada area yang berbeda pada tiap cawan petri yang telah dibagi menjadi tiga bagian
sama besar sebanyak satu ose. Goresan yang dibuat harus dilakukan secara zigzag agar koloni
bakteri yang tumbuh nantinya tidak mengalami penumpukan. Setelah ketiga suspensi bakteri
tersebut dioleskan pada masing-masing area yang berbeda pada media nutrient agar, selanjutnya
cawan petri tersebut dibungkus rapi dengan Koran dalam posisi terbalik. Hal ini dilakukan agar
pada saat inkubasi, air yang menguap tidak menetes ke media agar yang sudah terisi bakteri
karena jika media tersebut tertetesi air, maka akan mengganggu proses pengamatan bakteri dan
daya hambat antibiotik. Cawan petri yang telah terbungkus koran dengan rapi lalu diinkubasi di
dalam incubator selama 18-24 jam dengan suhu 37C, kondisi ini merupakan kondisi yang
sangat baik untuk pertumbuhan bakteri.
Setelah diinkubasi selama kurang lebih 19 jam, cawan dikeluarkan dari incubator
kemudian diamati pertumbuhan bakterinya pada masing-masing cawan petri untuk dilihat MIC(

Minimum Inhibitory Consentration) dari kloramfenikol terhadap tiga suspensi bakteri yang
berbeda. Namun, pada percobaan kali ini tidak didapatkan MIC dari kloramfenikol terhadap
Staphylococcus aureus, Escherichia Coli, maupun Bacillus subtillis. Untuk Staphylococcus
aureus dan Bacillus subtillis, MIC kloramfenikol tidak didapatkan karena kloramfenikol
memang bukan drug of choice untuk bakteri ini sehingga tidak memengaruhi pertumbuhan
bakteri itu sendiri. Sedangkan untuk Escherichia Coli, MIC nya juga tidak diperoleh karena
konsentrasi antibiotic yang dibuat saat pengenceran terlalu rendah. Hal tersebut dapat diamati
bahwa terdapat pertumbuhan koloni bakteri pada media agar nutrient disetiap konsentrasi yang
telah dibandingkan dengan control negative dan control positifnya. Berdasarkan literature yaitu
pada Farmakope Indonesia dicantumkan bahwa MIC dari kloramfenikol adalah 36 g/ml
sementara konsentrasi terbesar yang dibuat adalah 1,5625 g/ml. Jadi konsentrasi tersebut tidak
mampu menghambat pertumbuhan bakteri dan juga jumlah dari antibiotiknya sedikit yaitu hanya
1ml dalam 20ml media pertumbuhan nutrient agar.
Kerja dalam praktikum mikrobiologi ini sangat membutuhkan ketelitian dan keseriusan
sehingga dapat mencapai tujuan praktikum. Selain itu, kerja aseptis sangat ditekankan untuk
mencegah kontaminasi bakteri yang nantinya akan mengganggu hasil pengamatan . Untuk itu
diharapkan pada praktikum selanjutnya, dapat dikerjakan lebih hati-hati dan teliti agar
mendapatkan hasil sesuai dengan yang diharapkan dan tujuan dari praktikum itu sendiri dapat
tercapai dengan baik.