LC-TANDEM MS-MRM

MS-MRM
LC-TANDEM
TEMEL ARATIRMA
ARATIRMA VE
VE
TEMEL
KLNK LABORATUVARDA
LABORATUVARDA KULLANIMI
KULLANIMI
KLNK
Prof.Dr.
Dr.Hray
HrayLEKEL
LEKEL
Prof.
DokuzEyll
Eyllniversitesi
niversitesiTp
TpFakltesi
Fakltesi
Dokuz
Aralk2011
2011-- ADANA
ADANA
11Aralk

Ktle Spektrometresi Tarihsel Sreci

Kimya Dalnda Nobel Bilim dl (2002)

(Fenn J. B. ve Tanaka K)
Fenn ve Ta

Ktle Spektrometri (MS)

Bilinmeyen bileiklerin tanmlanmas
Organik ve inorganik molekllerin
yapsal zelliklerinin belirlenmesi
Her tipte bilinen bileiin kantitasyonu
yksek duyarllk ve zgllkte
analitik bir teknik

MS molekllerin ktlelerini tartar

Tek bir hidrojen atomu arl
1.66 X 10-24 g

MS molekllerin ktlelerini tartar

Ktle Spektrometre dorudan molekler
ktleyi lmek yerine moleklleri
ktle/yk orannna (m/z) gre ayrtrr ve
ler
Molekller iyonlara dntrlmeli
(elektriksel olarak + ya da - ykl olmal)
Gaz fazna geirilmeli

Ktle Spektrometresi

yon
kayna

Ktle
Analizr

Atmosferik
basnta
molekln
gaz fazna
geirilmesi ve
iyonizasyonu

Detektr

Gaz fazndaki iyonlarn

vakum altnda m/z e gre
ayrmlanmas

Veri Analizi
m/z

Ktle Spektrumu

Ayrmlanan
iyonlarn
tespiti

Ktle Spektrumu
+ Q 1 : 6 .7 0 0 to 6 .8 3 4 m in fro m S a m p le 8 (M C F ) o f D a ta Q 1 s c a n s M C .w iff, s u b tra c te d (6 .3 9 9 to 6 .5 4 9 ...

M a x. 2 .6 e 5 c p s .

2 2 .0

2 .6 e 5
2 .4 e 5
1 7 .0

sinyal younluu

2 .2 e 5
2 .0 e 5
1 .8 e 5
1 .6 e 5

2 2 .8

1 8 .0

1 0 1 3 .6
1 .4 e 5
1 .2 e 5
-1 8 .0

1 .0 e 5
8 .0 e 4

0 .8

3 8 .0

2 4 .0
1 9 .0

6 .0 e 4
-1 7 .0

3 9 .0

2 .0

4 .0 e 4
-1 6 .0

2 0 .2

2 .0 e 4

3 .0

4 0 .0
2 5 .0

0 .0
990

995

1000

1005

1010

1015

1020

1025
m /z , a m u

1030

ktle/yk (m/z)

1035

1040

1045

1050

1055

1060

LC-MS/MS ile zgl ve duyarl

kantitasyonun srr ????

LC-MS/MS ile zgl ve duyarl

kantitasyonun srr ????
Kompleks biyolojik karmlarn analizinde
ilk boyut, kromatografik olarak
bileenlerine ayrmlanma

Winnik ve Kitchin, Toxicology and Applied Pharmacology, 2008

LC-MS de her analit iin

1. Retansiyon zaman
2. m/z deeri

LC-MS/MS ile zgl ve duyarl

kantitasyonun srr ????

Ayrmlanan bileiklerin
iki aamal MS analizi
ile zgllk artar (MS/MS)

Winnik ve Kitchin, Toxicology and Applied Pharmacology, 2008

Tandem MS (MS/MS)
(Sral Ktle Analizr)
N2 Girii

RF
Ion Guide

Q1

Q2
arpma Hcresi

yon seimi

molekler iyon/
precusor ion

Paralanma

Q3

Dedektr

yon seimi

rn iyon/
product ion

Neden Tandem MS (MS/MS)

Molekler iyon paralanmas

proteinin
peptidlerinin dizilimi

helyumla
arptrlarak
amid
balarnn
kopartlmas

peptidin aa dizilimi

Multiple Reaction Monitoring (MRM)

oklu Reaksiyon zleme

Bileiklerin kantitasyonunun yksek

duyarllk ve zgllkte yapld
hedefli bir tandem MS yntemi

PubMed
MRM 2000-2010
"Multiple Reaction Monitoring"

Yayn/yl

500
400
300
200
100
0
2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010
Yl

Multiple Reaction Monitoring (MRM)

Kantitasyonu yaplacak analit/lere zg ve daha nceden tanmlanm

m/z deerindeki ana iyon ve fragment iyon ikilisi (transition) izlenir.

Multiple Reaction Monitoring (MRM)

Ana iyon ile fragman ion ifti olarak adlandrlan transition kantite
edilecek analite spesifik olup, bir ya da daha fazla rn iyon ifti
izlenerek spesifite artrlm olur.
MS analizi sresince tm m/z deerlerini taramak yerine sadece
belirli m/z aralklarna odaklanlr ve dierleri gz ard edilir.
Bir dizi transition ile birlikte hedef analitin tam retansiyon zaman
birleince kesin bir lm olur.
Tek bir LC- MS/MS deneyi srasnda birden ok analitin lm
mmkndr.

oklu Reaksiyon zleme-MRM

Triple Quadrupole MS/MS

N2 Inlet

RF
Ion Guide

Q1

Q2
Collision Cell

Q3
Detector

Triple Quadrupole Ion Trap MS/MS

N2 Inlet

RF
Ion Guide

Q1

Q2
Collision Cell

Q3

Detector

zotop aretli nternal Standart

MS ncesi (ekstraksiyon,
HPLC enjeksiyonu)
MS koullarndaki
deiiklikleri standardize
etmek ve kesin,
tekrarlanabilir sonular iin

nternal Standart zellikleri

Hedef analit ile
kimyasal zellikleri
kromatografik ayrmlanma zellii
iyonizasyon etkinlii
fragment iyon dalm ayn olmaldr.
Tek fark
olmasdr.

analitten daha ar ktleye sahip

MRM Yntemiyle Kantitasyon

rnek
nternal Standart

(rnek pik alan )

(internal standart pik alan)

x (internal standart konsantrasyonu)

MRM-LC-MS/MS ile
Kantitasyon Alanlar

la Dzeyi Belirlenmesi
Adli Toksikoloji
Tedavi etkinliinin, tedaviye uyumun ve ilaca bal
toksisitenin belirlenmesi amacyla biyolojik svlarda ila
dzeylerinin lm
L rnek hacimlerinde ng, pg dzeyinde duyarllkta
lm
antiepileptik ilalar
kardiyoaktif ilalar
bronkodilatrler
antibiyotikler
antiretroviral ilalar
antipsikotikler
antimetabolitler
immunsupresan ilalar vb.
alkol
Grebe and Sngh Clin. Biochem Rev Feb 2011 Mayo Clinic
illegal ila ve metabolitleri

Yeni Doan Metabolik

Hastalklar
Yeni doan metabolik hastalklarnn taramasnda (NBS)
Amino asit analizleri
Ya asidi oksidasyon defektlerinde karnitin, ail karnitin
Organik asidemi, asidrilerde organik asitler
Dorulama
Tirozinemi I:Tirozin
Propionik asidemi:3-OH-propionik asit
Metil malonik asidemi:MMA
MSUD:Dall aa lerin analizi
CAH:17 OH progesteron
Lizozomal depo hastalklar:Enzim substrat reaksiyon rn
Grebe and Sngh Clin. Biochem Rev Feb 2011 Mayo Clinic

Hormon/Vitamin/Biyolojik Amin
Analizleri
Steroid hormonlar
strojen (E1ve E2)
Kortizol
Testosteron
25-hidroksi vitamin D
HPLC-UV, HPLC-EC
RIA
Otomatize kemilminesans immunoasaay
College of American Patologists LC-MS/MS i referans yntem olarak nerdi
NIST kalite kontrol materyali (SRM 972)
(25OHD2 ve 25OHD 3 ve 3-epi izomerleri)
Grebe and Sngh Clin. Biochem Rev Feb 2011 Mayo Clinic

Klinik Laboratuvarda LC-MS/MS

Dier Yntemler (mmun lm-HPLC-GCMS)
ile Karlatrldnda

DUYARLILIK

ZGLLK

SONU VERME
SRES

Klinik Laboratuvarda LC-MS/MS

Dier Yntemler ile Karlatrldnda
Otomatize immun lm yntemleri
Sonu verme sresi ksa
Snrl manuel ilem gereklilii

zellikle dk konsantrasyonlarda analitik spesifitesi yetersizlii

Snrl dinamik aralk
Monoklonal antikor gereklilii
Tekrarlanabilirlik yetersizlii
Yksek reaktif maliyeti
Radyoaktif atk uzaklatrlmas, uzun inkbasyon sresi, apraz reaktiviteyi
engellemek iin organik ekstraksiyon/kromatografi gereklilii (RIA)

GC-MS ve HPLC

GC-MS non-polar uucu ve sya dayankl metabolit analizinde uygun

aknn daha uzun (zellikle GC-MS rnek derivatizasyonu gerektirmesi)
Analitik spesifite daha dk (zellikle konvansiyonel HPLC)

LC-MS/MS ile lm Snrllklar

rnek hazrlnda manuel ilem gereklilii
Analizin komplekslii, kullanc eitimi,
deneyim gereklilii
Cihazn kurulum maliyeti, bakm ve
srdrlebilirlii

1985
1986
1987
1988
1989
1990
1991
1992
1993
1994
1995
1996
1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
2010

Yayn/yl

PubMed Oxidative stress

14000

12000

10000

8000

6000

4000

2000

Yl

PubMed
Oxidative stress LC-MS/MS
60
Yayn/yl

50
40
30
20
10
0
0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10
0
20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20

Yl

Oksidatif stres deerlendirmesinde

LC-MS/MS kullanm
Oksidatif stres biyobelirtelerinin oklu kantitasyonunda

rnek hazrlk aamasnda kimyasal derivatizasyon

ilemine nadiren gerek duyulmas
n ayrmlama ilemleri ve rnek hazrl ile ardk
olarak (in-line) kullanlabilmesi
yksek duyarllk ve zgllkte analiz

*Giustarini, D., et al., Crit Rev Clin Lab Sci, 2009.

*Winnik and Kitchin, Toxicology and Applied Pharmacology, 2008

LC-MS/MS ile zoprostanlarn lm

LC-MS/MS ile
Tiyol Biyobelirtelerin lm

LC-MS/MS le
Okside Aromatik Amino Asit lm

LC-MS/MS ile
8-OHdG ve likili DNA Biyobelirteleri lm

8-Hidroksi-2-deoksi-guanozin (8OHdG)
Oksidatif DNA hasarnn klasik bir biyobelirtei
8OHdG lm yntemleri:
HPLC-ECD
GC-MS
LC-MS
Enzimatik teknikler
LC-MS/MS (Avrupa Oksidatif DNA Hasar Standartlar Komitesi (ESCODD)
nerisi)

DNA BAZ HASARI LM N

LC-MS/MS-MRM YNTEM
OPTMZASYON VE
GEERL KILMA ALIMALARI

8OHdG (8-hidroksi-2 deoksiguanozin)

O

HN
H2 N

N
H

N
HO H

C4-OH-adduct radical
O
HN
H2 N

O OH
N
H

N
H

guanine

. OH

HN
H2 N

H
N
H

C5-OH-adduct radical

HN
H2 N

-eOH
H

N
H

C8-OH-adduct radical

,-H+

O
N

HN
H2N

OH
N

N
DNA

8-hydroxyguanine

ScdA (8,5'-siklo-2 deoksiadenozin )

Gere ve Yntem

LC-MS/MS
HPLC (Shimadzu LC-20AD)
Triple Quadrapole Ion Trap LC-MS/MS (Applied
Biosystems 4000 Q-TRAP)
Elektrosprey iyonizasyon (Turbo V iyon kayna)
MRM-pozitif iyon modu
Analyst Software Version 1.5

LC Koullar
Kolon zellikleri: RP C18, 2.1 mm x 150 mm, 3.5 m
Guard kolonu: 2.1 mm x 12.5mm, 5 m
Mobil faz: %2 Asetonitril, %95 dH2O
Ak hz: 0.3 mL/dk
Enjeksiyon hacmi: 10 20 L

MS Koullar
Kaynak baml parametreler

Bileik baml parametreler

curtain gas: 10 psi

DP: 61

ion spray voltage: 5.500 V

EP: 10

temperature: 500 C

CE: 25

ion source gas 1: 50 psi

CXP: 10

ion source gas 2: 50 psi

dwell time: 150 ms

duration time: 26 dk

MRM Ana yon/rn yon iftleri

ScdA
ScdA 15N5
8OHdG
8OHdG 15N5

MRM
Transition
(m/z)
250/164
255/169
284/168
289/173

Retansiyon
Zaman
(dk)
4.7
4.7
5.3
5.3

Sonular

S-cdA Fragmantasyonu
250

N H 2
N

m /z 1 6 4
H O

+ H

Ana iyon

O
H

O H

164
rn iyon

8-OH-dG Fragmantasyonu
O

168

NH

HO

rn iyon

N
HO

NH2

m /z 1 6 8 (B H 2 )
+2H

CH2
O
H

OH

m /z 1 1 7 (S + )

284
Ana iyon

S-cdA yon Kromatogram (0-26 dk)

Intencity (cps)

S-cdA
RT: 4.72 dk

Retansiyon zaman (dk)

8-OH-dG yon Kromatogram (0-26 dk)

Intencity (cps)

8-OH-dG
RT: 5.32 dk

Retansiyon zaman (dk)

8-OH-dG Standart Grafii

( 0.2, 0.5, 1, 2.5, 5, 10, 25, 50 pmol/mL) (n:2)

ScdA Standart Grafii

(0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 2.5, 5, 10, 25 pmol/mL) (n:2)

konsantrasyon
(pmol/mL)

drar S-cdA yon Kromatogram

Intencity (cps)

R-cdA
m/z 250.0 164.0

S-cdA
m/z 250.0 164.0

R-cdA15N5
m/z 255.0 169.0
RT: 4.02 dk

S-cdA15N5
m/z 255.0 169.0
RT: 4.84 dk

Retansiyon zaman (dk)

Intencity (cps)

drar 8-OH-dG yon Kromatogram

8-OH-dG
m/z 284.0 168.0
8-OH-dG15N5
m/z 289.0 173.0
RT: 5.38 dk

Retansiyon zaman (dk)

Gn-ii Tekrarlanabilirlik
Ortalama
(pmol/mL)
(n=10)

SD

% CV

S-cdA

0,25

0,0121

4,94

8-OH-dG

0,20

0,0106

5,24

Gnler-aras Tekrarlanabilirlik
Ortalama
(pmol/mL)
(n=10)

SD

% CV

S-cdA

0,15

0,0137

9,25

8-OH-dG

0,14

0,0031

2,31

En Dk Tespit Limiti (LOD)

En Dk Kantitasyon Limiti (LOQ)
LOD

LOQ

S-cdA

1,1x10-3 pmol/mL
(S/N =3.5)

4,4x10-3
pmol/mL
(S/N=12.6)

8-OH-dG

1.8x10-4 pmol/mL
(S/N=3.6)

5,8x10-4
pmol/mL
(S/N =11)

nternal Standart Kullanarak drar rneklerinde

S-cdA Kantitasyonu
S-cdA
S-cdA 15N5
*S-cdA
S-cdA
Ana yon Ana yon 164/169
(pmol/mL) (nmol/L)
164
169

drar
rnei

Kreatinin
(mmol/L)

S-cdA (nmol/
mmoL kreatinin)

1.rnek

14000

53300

0,26

0,24

0,24

6,26

0,04

2.rnek

18500

130000

0,14

0,13

0,13

14,23

0,01

3.rnek

16900

42100

0,40

0,37

0,37

18,25

0,02

4.rnek

23700

138000

0,17

0,16

0,16

3,56

0,04

*S-cdA (pmol/mL)= (0,26)ax(0.076 mM)bx(24L)cx(1000)d/(2000)e

a: 164/169 pik alanlarnn oran
b: nternal standart konsantrasyonu
c: Eklenen internal standart miktar
d: Lden mLye dnm faktr
e: nternal standart dilsyon faktr

nternal Standart Kullanarak drar rneklerinde

8-OH-dG Kantitasyonu
drar
rnei

8-OH-dG 8-OH-dG15N5
Ana yon
Ana yon
168
173

168/173

*8-OH-dG
(pmol/mL)

8-OH-dG
(nmol/L)

8-OH-dG nmol/
Kreatinin
mmoL kreatinin
(mmol/L)

1.rnek

108000

2380000

0,05

0,20

0,20

6,26

0,03

2.rnek

398000

5320000

0,07

0,33

0,33

14,23

0,02

3.rnek

284000

2910000

0,10

0,43

0,43

18,25

0,02

4.rnek

359000

9110000

0,04

0,17

0,17

3,56

0,05

*8-OH-dG (pmol/mL)= (0,05)ax(0.092 mM)bx(2.4L)cx(1000)d/(50)e

a: 168/173 pik alanlarnn oran
b: nternal standart konsantrasyonu
c: Eklenen internal standart miktar
d: Lden mLye dnm faktr
e: nternal standart dilsyon faktr

Normal Akcier Dokusunda S-cdA ve 8-OH-dG

S-cdA
R-cdA

R-cdA15N5

S-cdA15N5

8-OH-dG

8-OH-dG15N5

Tmrl Akcier Dokusunda S-cdA ve 8-OH-dG

S-cdA
R-cdA

R-cdA15N5

S-cdA15N5

8-OH-dG

8-OH-dG15N5

AKCER KANSERNDE
OKSDATF HASARIN
DOKU VE DRARDA
DNA BAZ HASARI VE 8-ZOPROSTAN
DZEYLER LE GSTERLMES

DYET ALAN
FENLKETONRL
OCUKLARDA
FONKSYONEL
B12 VTAMN
EKSKLNN
NCELENMESNDE
MMA VE
HOMOSSTEN
DZEYLERNN
BELRLENMES

Genetik ve
Biyokimya

nsan genom projesinin

sonlanmas
nsan Genom Projesinin
ilgin bir sonucu: mRNA
ve protein saylarnn
arasndaki zayf
korelasyonun ortaya
konmas
nsan genomunda
25-30 000 protein
kodlayan gen
nsan proteomu >
500 000 protein
White House Press Release, June 26, 2000

Proteomiks &MS (PubMed)

Proteomiksde MRM uygulama alanlar

EKSPRESYONEL PROTEOMKS
Protein
Tanmlama
Doku hcre,
organel vb
proteinleri

Protein Ekspresyon
Analizi (greceli &
mutlak kantitasyon)
Bir duruma zg
proteinler tanmlanmas
(diferansiasyon, evre,
ila yant vb)

Protein Biyobelirte
Keif (Discovery)
Dorulama (Verification)
Geerlilik onaylama
(Validation)

FONKSYONEL PROTEOMKS
Proteinler aras
etkileim analizi
Biosentez yollar,
sinyal yolaklar,
multiprotein
karmlar

Protein modifikasyon
haritalamas
(PTM analizi
fosforilasyon,glikozilasyon,
oksidasyon vb)

MRM Yntemiyle Protein Kantitasyonu

Metot
Gelitirme
Basamaklar

Hedef
Protein

Hedef
Peptid

Ktle

Y
k

Q1 ncl iyon m/z

Q2 transition m/z
/ncl/rn
iyon ifti:
744.8/959.4

MRM Yntemiyle Protein Kantitasyonu

MRM Yntemiyle Protein Kantitasyonu

MRM Yntemiyle Protein Kantitasyonu

MRM Yntemiyle Protein Kantitasyonu

MRM Yntemiyle Protein Kantitasyonu

76

nsan Plazmasndaki Proteinlerin

Dinamik Aral
1,000,000,000

Albumin, IgG

100,000,000

Apolipoprotein E

10,000,000

amol/uL plazma

1,000,000
100,000

L-selectin

10,000
1,000

IL-8

100
10
1
0

10

20

30

40

50

60

Plazma Proteinleri

Anderson, N.L. and Anderson, N.G., Molecular & Cellular Proteomics, 2003, 2(1): 50.

rnek Hazrlama Yaklamlar

MRM-Metabolomiks (<1500 Da)

Hedefli olmayan

Hedefli

Hcre, doku ya da
organizmada bulunan tm
bilinen ve bilinmeyen
(100-1000 lerce) metabolitin
incelenmesi

Belirlenmi metabolitlerin
(10-100 lerce) kantitasyonu

Amino asitler ve trevleri

eker fosfatlar
Nukleotidler
Koenzim A ve trevleri
Karboksilik asitler
Lipidler ve trevleri..

Hastalk metabolizmas

Hcresel metabolik olaylar

Terapotik hedefler
lalarn etki mekanizmalar
Var olan biyobelirtelerin
validasyonu..

Grubumuz
Ar. Gr.Melis KANT
Ar. Gr. Merve Ak
Ar. Gr. Gamze TUNA
(DETF Tbbi Biyokimya AD)
Teekkr
Prof. Dr. Gldal KIRKALI
Prof. Dr. Miral DZDAROLU
(NIST/Washington DC)