104

GLAY ZCENGZ/ENDSTRYEL RETMDE GEN TEKNOLOJLER

ENDSTRYEL RETMDE
GEN TEKNOLOJLER
Glay ZCENGZ*
Modern biotechnology is now over 25 years old. In 1972, the
birth of recombinant DNA technology propelled biotechnology
to new heights and led to the establishment of a new industry.
Within four years of the discovery of recombinant DNA
technology, genetically engineered bacteria were making
human insulin and human growth hormone. This led to an
explosion of investment activity in new companies, mainly
dedicated to the innovation via genetic approaches in
pharmaceutical, food, beverage and many other sectors.

Giri

nsanolu mikroorganizmalar yzyllardr kendi yarar iin kullanmaktadr. Bu srete, bilimsel gelimelerin mikroorganizmalarn
rolnn anlalabilmesine izin vermesiyle birlikte biyoteknoloji
terimi ilk kez 1919da kullanlm ve faydal rnlerin ham
materyalden canl organizmalar tarafndan oluturulmas eklinde
tanmlanmtr. Gnmzde bu tanm, canl organizmalarn ya da
onlarn rnlerinin insan yaamn ve evresini olumlu ynde deitirecek biimde kullanlmasn salayan teknolojileriin bir toplamn ierecek ekilde geniletilmi, ounlukla gen teknolojileri ve genetik
rekombinasyon (genetik materyalin yenibileimi) terimleri ile birlikte
kullanlr hale gelmitir. Mikroorganizmalarn (bakteriler, mayalar, kf
ve dier mantarlar, algler) metabolik aktiviteleri sonucu faydal rnler
(metabolitler) oluturmalarna dayanan ve fermentasyon endstrisi ad
verilen sektrn nemi, temelini oluturan mikroorganizmalarn 5 ayr
zelliinden kaynaklanmaktadr: (1) Hcre yzey alannn hcre
hacmine oran yksek olduundan, mikroorganizmalar besinleri hzla
hcre iine alabilir, bylece hzl reyebilir ve ksa srede bol miktarda
rn oluturabilirler, (2) Biyokimyasal aktiviteleri mthi bir eitlilik
gsterir, dolays ile ok eitli rnlerin elde edilmesinde kullanlabilirler, (3) Farkl evresel ortamlara kolaylkla uyum gsterebilirler, bu
nedenle doadan elde edilen mikroorganizmalar rahatlkla bir labaratuvarn kltr iesinde ya da bir fabrikann fermentr adn verdiimiz
byk retim tanklarnda ucuz besin maddeleri kullanlarak retilebilirler, (4) Bileiklerin aktif ve inaktif formlarnn kark olarak sentezlendii kimyasal sentezin aksine, mikroorganizmalarn biyosentezle
oluturduklar bileikler genellikle aktif formdadr, ve (5) Hcrelerini ya
*

Prof. Dr., Orta Dou Teknik niversitesi , Biyoloji Blm

Avrasya Dosyas, Molekler Biyoloji ve Gen Teknolojileri zel, Sonbahar 2002, Cilt: 8, Say: 3, s. 104-119.

AVRASYA DOSYASI

105

da genlerini maniple ederek daha fazla rn vermelerini salamak,

rn yap ve aktivitelerini deitirmek, hatta yeni rnler sentezlemelerini salamak mmkndr.
Mikroorganizmalar, binlerce yl ncesinden bu yana ekmek, arap,
bira, sirke yapmnda kullanlm, bu tr uygulamalar geleneksel mikrobiyal biyoteknolojinin ilk fazn oluturmutur. Geleneksel biyoteknolojinin ikinci faz I. Dnya Sava yllarnda aseton-btanol ve gliserol fermentasyonlarnn gelitirilmesi ile balam, 1960 ylna dek sitrik asit,
amino asitler, vitaminler ve antibiyotiklerin retilebildii mikrobiyal
prosesleri iermitir. Geleneksel biyoteknoloji ile molekler biyoloji ve
genetiin, bir dier deyile gen teknolojilerinin 1977 ylnda yaptklar
evlilik ise nc faz; yani modern biyoteknolojiyi oluturmutur.
1976 ylnda kurulan Genentech isimli irketin bir insan proteinini bir
mikroorganizmann retmesini saladklarn rapor etmesi bu faza
balang tekil etmitir. 1980li yllarn balangcnda, dzinelerce biyoteknoloji irketi kurularak rekombinant DNA teknolojisi ile tpta
tedavi amacyla kullanlan proteinlerin yapmna balanm, genetik
deiiklie uratlm Escherichia coli isimli barsak bakterisi
tarafndan retilen insan inslini FDA tarafndan onaylanarak pazara
sunulan ilk rn olmutur. Hzla gelien biyofarmastik endstri,
molekler modelleme, protein mhendislii ve antisens tekniklerinin
de kullanlmasyla, biyoaktivite ve biyogvenlik asndan ok daha
stn ikinci ve nc kuak farmastik rnlerin gelitirilmesini
salamtr. Bu rekombinant ila/a/aktif madde/tehis kiti
endstrisinin global pazar 1990da 1.5 milyar dolar iken, bu rakam
2000 ylnda 12 milyar dolar amaktadr. Rekombinant kan faktrleri,
rekombinant hormonlar, hematopoietik byme faktrleri, rekombinant interferonlar ve interlkinler, rekombinant alar, monoklonal antikorlar ve oligonkleotid yapda ilalar eklinde snflandrlabilecek
nleme/tehis/tedavi rnlerini ieren toplam 84 adet rekombinant
rn gnmzde kullanmdadr. Bunlarn yansra be yzn zerinde
yeni farmastik, halen klinik denemeler aamasndadr. Denemede
olan rnlerin hemen hemen yars kanser tedavisi iin gelitirilmi
rnlerdir. Biyofarmastik teknolojiden yakn gelecek iin en nemli
beklentilerden birisi de, farmakogenomikler ad verilen ve bireyler
arasndaki genetik deikenlikleri temel alarak tedavi ynnde daha etkili ya da yan etkileri grlmeyecek "kiiye zgn" ilalarn yaplmasdr.
Biyofarmastik endstrisindeki uygulamalarn yansra, rekombinant
DNA teknolojisi geleneksel mikrobiyal teknoloji ile retilebilen ve
endstriyel neme sahip pek ok rnn [kimyasallar, enzimler
(biyokimyasal reaksiyonlar katalizleyebilen protein moleklleri), gda
rnleri, alternatif enerji kaynaklar] yapmnda da, retici organiz-

106

GLAY ZCENGZ/ENDSTRYEL RETMDE GEN TEKNOLOJLER

mann ve/veya rnn kalitesinin deitirilmesi ve iyiletirilmesi, organizmann ucuz besin maddelerini kullanabilmesinin salanmas, istenmeyen yan rnlerin oluumunun engellenmesi, rn miktarnn
arttrlmas ve sonuta maliyetin azaltlmas bakmndan ok nemlidir.
Yine rekombinant DNA teknikleri kullanlarak, evreyi kirleten toksik
atklar paralayacak (biyoremediasyon ilemleri) endstriyel mikroorganizmalar gelitirilmektedir.
Mikroorganizmalar, enerjilerini gereksiz yere harcamamak iin,
hcrelerindeki metabolik aktiviteleri katalizleyen enzimlerin ve
dolaysyla metabolik yollarn ara bileiklerinin sentezini eitli metabolik ve genetik mekanizmalar kullanarak sk bir kontrol altnda tutarlar.
Dolaysyla, endstriyel retimde daha iyi verim elde etmek zere
mikroorganizma gelitirilmesinin balca yolu bu kontrollar yok etmektir. Bunun en etkin yolu ise organizmann genetik yapsnda deiiklikler yapmak, onu yeniden programlamaktr. Genetik deiiklikleri 3
ekilde elde etmek mmkndr:
1. Mutasyonlarn indklenmesi: Genetik materyaldeki kalc
deiikliklere mutasyon ad verilir. Mutasyonlarn ortaya kmas iin,
hcre populasyonu mutasyonlara neden olan fiziksel ya da kimyasal
ajanlara maruz braklr. Mutasyonlar pratik olarak organizmann sahip
olduu her gende eit olaslkla ortaya kabileceinden mutasyon
ileminden sonra hcreler taranarak istenilen zellikleri kazanm
mutant organizmalarn seimi gereklidir.
2. Genetik rekombinasyon: Bir mikrop hcresinden dierine genetik
maddenin aktarlmasdr. Mikroorganizmalarda istenilen karakterlerin
yeni kombinasyonlarnn oluturulmasnda kullanlr.
3. Rekombinant DNA teknikleri (genetik mhendislii, gen
maniplasyonu): Hcreden izole edilmi DNA molekllerini test tp
ierisinde eitli yntemlerle maniple etmek suretiyle istenilen zellikleri kazanm yeni DNA molekllerinin oluturulmasn ierir. Gen
klonlamas, maniple edilmi DNA molekllerinin vektr ad verilen
uygun bir tayc DNA molekl ierisine yerletirilip uygun bir konakya aktarlmasn, bu konakda oaltlmasn ve ona daha nceden
sahip olmad zelliklerin kazandrlmasn, ayrca klonlanan genin
rnnn o organizmada yksek seviyede ifade edilmesini (sentezlenmesini) ierir. Gen teknolojileri balca klonlama, DNA sentezi, DNA dizi
analizi, blge hedefli mutasyonlar, kombinatoryal protein mhendislii,
DNA karmas (shuffling), ynlendirilmi protein evrimi gibi yntem ve
stratejileri ierir.

AVRASYA DOSYASI

107

Canl hcrelerinde genetik materyalin deiiklie uramas ve istenilen karakterlerin kendiliinden ortaya kmas son derece yava bir
biimde gereklemektedir. Yukarda sz edilen yntemlerin tm bu
deimeyi hzlandrmay amalamakta olup ilerinde hedefe en yakn
ve etkin olan hcreler yerine dorudan DNAnn maniple edildii
genetik mhendisliidir. Bu teknoloji, gereksinim duyulan genetik
deiikliin olmas gerektii yerde meydana gelmesini salar, dier iki
teknik gibi istenilen deiikliin yansra istenmeyen ve/veya zararl
deiikliklerin/kombinasyonlarn ortaya kmas riskini tamaz.
Aada, gen teknolojisinin endstriyel retimdeki nemi rn ya
da ilem baznda rneklerle aklanmaktadr. Gen teknolojisinin tp ve
eczaclktaki etkileri derginin yine bu saysndaki bir dier makalenin
konusu olduundan, antibiyotikler ve benzeri metabolitler dndaki
rnler iin mevcut uygulamalara yukarda zetlendiinden fazla yer
verilmeyecektir.
Etil Alkol
Etil alkol, eitli mikroorganizmalarn ekerleri fermente ederek
oluturduklar nemli bir rndr. Etil alkoln gnmzde
petrokimyasal etilenden sentetik olarak retimi ylda sadece 1 milyon
ton iken, maya hcreleri kullanlarak fermentasyonla retimi ylda 4
milyon tonu bulmaktadr. Maya hcreleri 5 gnlk bir fermentasyonla
% 10-12 dzeyinde etil alkol retirler, daha sonra bu seviyede alkol
retici hcrelere toksik olduundan hcre oalmas durur ve fermentasyon sona erer. Bira, arap gibi alkoll ikilerde bulunan, kimya
endstrisinde kullanlan, farmastikler ve temizlik malzemelerine
katlan etil alkol, bu uygulamalarn yansra, hava kirliliine neden olan
benzine alternatif bir yakt olarak ok nemli bir endstriyel rndr.
Etil alkol endstrisi, gen teknolojilerinden ok byk yararlar beklenen
alanlardan birisidir. Tarmsal atklar ve bitki biyoktleleri gibi
yenilenebilir maddeler hammadde olarak kullanlp etil alkol retilmesi
ekonomik olarak ok caziptir. Ancak sellozik yapdaki bitki
biyoktleleri maya hcreleri sellozu paralayamadndan bu hcreler
tarafndan dorudan besin kayna olarak kullanlamamaktadr.
Biyoktlenin kimyasal ya da enzimatik yntemlerle n ilemden geirilmesi ve oluan ekerlerin besin kayna olarak kullanlmas ise maliyeti
ykseltmektedir. Sellozu paralayabilen, etanol reten, oksijensiz
ortamda ve yksek scaklkta reyen bir bakteri tr bu anlamda maya
hcrelerine alternatif bir reticidir. Ancak bu tip bakteriler etil alkoln
yansra eili organik asitler de rettiklerinden etanol verimi dk
olmaktadr. Gnmzde gen teknolojileri kullanlarak sz edilen bak-

108

GLAY ZCENGZ/ENDSTRYEL RETMDE GEN TEKNOLOJLER

terinin istenmeyen son rnlerine giden metabolik yollarnn

kapatlmasna (gene knock-out) allmaktadr. Alkol retebilen ve
yukarda sz edilen reticilerden farkl zellikler gsteren dier baka
bakteri trleri de yine DNA teknolojileri kullanlarak kullanmlarn
snrlayan mevcut dezavantajlarndan arndrlmaya allmaktadr.
Yenilenebilir ucuz besin maddeleri deiik ekerlerin bir karmn ierdiinden, hem alkol retebilen, hem de glikozdan farkl ekerleri,
rnein pentozlar da besin olarak kullanabilen organizmalar gen
teknolojileri kullanlarak elde edilmektedirler. Bir dier yaklamla,
alkol retimi iin gerekli genler normalde bu genleri tamayan, ancak
etil alkole olduka dayankl bir bakteride klonlanp ifade edilmi, % 43
dzeyinde alkol retebilen mkemmel bir retici organizma elde edilmitir.
Organik Asitler
Mikroorganizmalar, organik asitlerin ticar retiminde geni apta
kullanlmaktadr. rnein, asitlendirici, tat arttrc ve antioksidant zellii gsteren sitrik asit gda ve farmastik endstrilerinde kullanlmakta
olup yarm milyon ton civarndaki yllk retiminin pazar 1.4 milyar
dolar bulmaktadr. Mikrobiyal fermentasyonla retilen dier organik
asitler asetik, laktik, glukonik ve sksinik asitlerdir. Bunlardan asetik
asit fermentasyonu genetik mhendislii uygulamas bulmu, asetik
asit biyosentez yolunda kritik olan bir enzimin genleri retici organizmada klonlanarak gen dozu etkisi ile asetik asit veriminde % 100n
zerinde art elde edilmitir.
Amino asitler ve Vitaminler
Amino asitler ve vitaminler, insan ve hayvan beslenmesinde ve
ayrca farmastik ve teraptik amalarla kullanlan primer metabolitler
olup baka rnleri oluturmak zere balang malzemesi olarak da
kullanlrlar (en yaygn kullanlan suni tatlandrc aspartam, fenilalanin
ve aspartik asitten olumutur). Dnyada her yl en az 1 milyon ton
amino asit retilmekte olup sadece bu sektrn pazar 53 milyar dolar
bulmaktadr. Pek ok vitaminin retiminde kimyasal proseslerin yerini
mikrobiyal fermentasyonlar almtr. Gnmzde en ok retilen
amino asit, gdalarda lezzet arttrcs olarak ve ayrca teraptik amala
kullanlan glutamik asittir. nsanlar ve hayvanlar tarafndan tketilen
hububatlar lizin, metiyonin ve triptofan gibi temel amino asitleri iermemekte olup hububatlar ancak amino asit takviyesi sonucu dengeli
besin haline gemektedirler. Amino asitlerin en nemli ticari uygulama
alan hayvan yetitiricilii olup hayvan yemleri ham proteini minimum

AVRASYA DOSYASI

109

miktarlarda, ancak kristal formdaki lizin, methionin, triptofan ve treonini uygun oranlarda ierecek ekilde formle edilmektedir. Bu yolla
daha pahal olan ham protein kaynaklarnn kullanm azaltlabildii
gibi, hayvan performans arttrlmakta, bunlarn yansra evreye verilen
atk azot miktar daha az olmaktadr.
Son yllarda, rekombinant DNA teknolojisi amino asit ve vitamin retimi zerine nemli etkiler yapmaya balamtr. Bu metabolitler ok
basamakl metabolik yollarn rn olup, biriken metabolitlerin
metabolik yolun ilk basaman katalizleyen enzimin sentezini
basklamas ya da mevcut enzimi inhibe etmesi biyosentezlerini
snrlayan en nemli faktrdr. Bu nedenle, yaplan genetik manipulasyonlar ncelikle geleneksel mutajenez metodlaryla mevcut organizmalarda son rn basklamas ve inhibisyonunun engellenmesi,
daha sonra da rekombinant DNA, yani gen klonlama teknikleriyle
biyosentetik enzimleri kodlayan genlerin kopya saysnn arttrlmasn
iermektedir. Bu yntemlerle lizinin endstriyel retimi 170 g/L gibi
olduka yksek bir deere (0.54 mol/mol glikoz) karlmtr. Bu
amino asitin yllk retimi 350 bin ton olup pazar 600 milyon dolardr.
Yine ayn yntemlerle 100 g/L treonin, 40 g/L izolsin, 34 g/L lsin, 31
g/L valin, 28 g/L fenilalanin, 58 g/L triptofan, 26 g/L tirozin, 100 g/L
prolin, 65 g/L arjinin ve 40 g/L histidin retebilen mikroorganizmalar
gelitirilmitir. retim miktarlarna ve/veya market deerlerine
bakldnda ise, tablo yledir: fenilalanin, 13000 ton, 198 milyon
dolar; aspartik asit, 43 milyon dolar; izolsin, 400 ton. Vitaminlerden
riboflavin (Vitamin B2) retiminde gnmzde ana rota fermentasyondur. Yine genetik manipulasyonlarla 30 g/L ribofavin reten organizmalar gelitirilmitir. ngilterede rekombinant bir bakteri ile retilen
riboflavin 1997 ylnda onay almtr. Vitamin B12 ise 150 mg/L
seviyesinde retilmekte olup her yl 3 tonluk retime ve 71 milyon
dolarlk bir pazara sahiptir. Rekombinant bir mikroorganizma
tarafndan retilen Vitamin B12 nin gda olarak kullanlmas ksa sre
nce svirede onaylanmtr. Getiimiz yllarda molekler klonlama
ile bir dier vitamin olan biyotinin retimi 600 mg/L gibi bir seviyeye
ulatrlm olup bu verim biyoteknolojik prosesin geleneksel kimyasal
sentezle yarabilmesine izin vermitir. Gnmzde biyotin pazar 100
milyon dolardr. Vitamin C (askorbik ast) retimi ise uzun yllar
kimyasal yntemle yapldktan sonra gnmzde rekombinant bir organizma tarafndan glikozun (40 g/L) ketoglikonik asite (20 g/L)
dnmn ve ketoglikonik asitin daha sonra asit veya baz uygulamas ile askorbik asite dntrlmesini iermektedir.

110

GLAY ZCENGZ/ENDSTRYEL RETMDE GEN TEKNOLOJLER

Endstriyel Enzimler
Enzim teknolojisi, OECD tarafndan srdrlebilir endstriyel
kalknmann nemli bir paras olarak kabul edilmektedir.
Rekombinant DNA teknolojisinden en abuk ve en fazla yararlanm
olan rnler endstriyel enzimlerdir. 1980li yllarn banda, o
dnemde 300 milyon dolarlk bir markete sahip olan enzim endstrisi,
kendi rnlerinin sadece tek bir gen tarafndan ifrelendiinin, dolays
ile ksa srede yol almann kolay olacann bilinci iinde enzim retimini arttrabilmek ve yeni enzimler yapabilmek amacyla gen teknolojisini hemen kendisine uyarlamtr. Sonuta bugn endstriyel enzim
endstrisi ylda 1.6 milyar dolarlk bir sat yapmakta, bu enzimlerin %
45i gda ve niasta ilenmesinde, % 34 deterjanlarda, % 11i tekstilde % 3 dericilikte ve % 1.2si kat endstrisinde uygulama bulmaktadr. Leke giderimini kolaylatrmak iin deterjanlara katlan proteaz enzimi (subtilisin) toplam enzim marketinin 200 milyon dolarlk
blmn oluturmaktadr. Dier yandan, tpta tedavi amacyla kullanlan enzimlerin de 2.3 milyar dolarlk ayr bir pazar vardr.
Gnmzde, mevcut pazardaki enzimlerin % 60 gen teknolojisi ile
elde edilen rekombinant organizma rnlerdir. ou gda
endstrisinde kullanlmak zere en az 19 farkl enzim genetik olarak
deitirilmi mikroorganizmalar tarafndan retilmektedir (bunlarn bir
listesi ve ilave bilgiler iin: www.bats.ch/abstr/table13.htm).
Rekombinant DNA teknolojisi ile elde edilen ilk enzim, peynir
yapmnda kullanlan kimozin isimli enzimidir. 1984-1985 yllar
arasnda Danimarkada gda sektrnn nde gelen irketlerinden Chr.
Hansen A/S Bio Ingredientsin laboratuvarlarnda bu enzimin genleri
dana midesinden izole edilerek bir kf mantarna klonlanm, 1990
ylnda ise bu enzimin gda yapmnda kullanlmas onaylanmtr. Aksi
halde hayvan midesinden izolasyonu ve saflatrlmas ok pahal olan
kimozin, gen teknolojisi sayesinde mikrop hcreleri tarafndan ksa
srede ve yksek verimlilikle retilmektedir. 1993 ylna kadar, farkl
firmalar tarafndan farkl rekombinant mikroorganizmalar (maya, kf ve
bakteriler) tarafndan retilen kimozinin gda endstrisinde
kullanlmas toplam 17 lkede onaylanmtr. Avrupa Birlii lkelerinde
dzenleyici kurallar sadece genetik olarak deitilmi mikroorganizmalarn kullanmn iermekte olup, genetik mhendislii ile elde edilmi enzimlerin kulanm ile ilgili dzenlemeler standart hale getirilmemitir, her lkede farkl dzenlemeler vardr. rnein svire ve
ngilterede byle enzimlerden kullanmna izin verilenlerin bir listesi
oluturulmutur. Almanyada gda rnlerinde kullanlacak enzimler
iin (rnein rekombinant kimozin) onay alnmas zorunludur. Dier bir
ok Avrupa lkesinde ise hibir dzenleme mevcut deildir.

AVRASYA DOSYASI

111

Yeni aktiviteler ve/veya daha stn zelliklere sahip biyokatalizrlere

daima gereksinim vardr. Doadan elde edilen ok sayda mikroorganizma izolatnn yeni enzim aktiviteleri iin taranmas da her zaman amaca
uygun enzimler elde edilmesini salamaz. te protein mhendislii ile bu
snrlamann nne geebilebilmekte, (i) bilgisayar aracl ile molekler
modelleme ve blge hedefli mutasyonlar ya da (ii) ynlendirilmi molekler evrim teknikleriyle doal enzimlerden yeni biyokatalizrler oluturulabilmektedir. Protein mhendisliinin bu iki farkl yaklam ekil 1de
ematik olarak karlatrlmaktadr. Blge hedefli mutasyonlar temel
alan yaklam rasyonel protein tasarm adn alr ve adeta terzi yapm
enzimler elde edilmesini salar. Ancak, bu yaklamn kullanlabilmesi
iin enzimin yapsnn, yapsn oluturan amino asitlerin diziliminin ve yap-fonksiyon ilikilerinin ok iyi biliniyor olmas gerekir. Protein yapsnn
NMR spektroskopi ile zlmesindeki hzl gelime artk ok sayda sekansn herkesin ulaabildii databazlarna girmesini salam olup pek
ok protein iin yeni tasarmlar kolaylatrmaktadr. Mevcut bilgiler nda, molekler modelleme ile enzimin substrat (katalizledii kimyasal reaksiyonda rne dntrd bileik) seiciliinin, aktivitesinin ve stabilitesinin hangi tr amino asit deiiklikleri ile gerekleebilecei kestirilir, daha sonra bu deiiklikleri salayacak DNA manipulasyonlarna karar
verilir. Bir sonraki aamada blge hedefli mutasyon teknikleriyle DNA
zerinde gerekli mutasyonlar yaratlr. Deitirilen molekller konak
hcrelere aktarlr, orada ifade edilerek rne dnr, daha sonra konakdan izole edilerek saflatrlr ve substrat zgll, kinetik zellikleri, stabilitesi vb. analiz edilerek istenilen zellikleri tayp tamadklar belirlenir. Ynlendirilmi evrim yaklamnda ise enzim genini ieren
DNA fragmentleri nce rastgele mutasyona uratlr (polimeraz zincir reaksiyonu veya paralanm DNA fragmentlerinin rekombinasyonu ile).
Daha sonra mutasyona uram fragmentler klonlanarak bir mutant gen
ktphanesi oluturulur. Bu ktphane taranarak belirli seim parametrelerine gre istenilen deiikliklere sahip klonlar seilir. Bundan sonraki
aamalar, dier yaklamda olduu gibi enzimin ve rnnn karakterizasyonunu ve gelitirilmi mutant enzimlerin seilmesini ierir. Daha ileri bir iyiletirme iin, DNA karmas (shuffling) ad verilen yntem uygulanp ynlendirilmi evrim protokolu batan tekrarlanabilinir. DNA karmas yntemi rastgele mutajenez srasnda olagelen faydal mutasyonlar
biraraya toplamaya yarar. Her iki yaklam da, istenilen zellikleri tayan
biyokatalistler elde edilinceye kadar tekrarlanr. stenilen zelliin ya da
fonksiyonun mekanistik temelinin ne lde anlald ve seim iin etkin prosedrlerinin mevcut olup olmad iki yaklamdan hangisinin daha etkin biimde kullanlacan belirleyen faktrler arasndadr. Her ne
kadar her iki yntem de gayet etkin olsa da, her ikisinin bir arada kullanlmas en baarl yol olmaktadr.

112

GLAY ZCENGZ/ENDSTRYEL RETMDE GEN TEKNOLOJLER

ekil 1. Protein mhendisliinin iki ayr yaklam olan rasyonel protein tasarm
ve ynlendirilmi evrim.

Novo Nordisk firmas (Danimarka) aratrclar, iki yaklamn DNA

karmas yntemini entegre edecek ekilde kombinasyonunun ne denli
baarl olabileceine ilikin etkileyici bir rnek rapor etmilerdir.
Hedef, amar deterjanlarnn kuman rengini almamas iin deterjanlara katlan hem peroksidaz isimli enzimin stabilitesinin arttrlmas
olmutur. Sonuta, termal stabilitesi 174 kat, oksidatif stabilitesi ise
100 kat daha yksek hem perosidaz retebilen bir mutant organizma
elde edilmitir.

AVRASYA DOSYASI

113

Biyodnm
ok basamakl enzimatik reaksiyon dizilerini ieren fermentasyona
ilaveten, eitli kf ve bakteriler belli bir bileii stereospesifik biimde
yapsal olarak kendisine yakn, ancak farkl aktiviteye sahip bir dier
bileie dntrme kapasitesine sahiptirler. Pratik olarak hemen her
tip kimyasal reaksiyon iin biyodnm yapabilen mikroorganizmalar
mevcuttur. Byle dnmlerde verim % 90-100 gibi yksek seviyelerde olmaktadr. Yksek verim, stereospesifiklik, reaksiyon koullarnn
basit ve ekonomik olmas (yksek scaklk ve basn gerekmemektedir)
biyodnm kimyasal senteze gre ok ekici bir alternatif haline
getirmektedir. En nemli biyodnm, sterol-steroid transformasyonudur. Steroidler farmastik endstrinin nemli rnleri arasndadr.
Bu maddeleri hayvansal kaynaklardan elde etmek veya kimyasal olarak
sentezlemek ok zordur. rnein iltihaplamalarda kullanlan kortizonun kimyasal sentezi 31 ayr reaksiyon basama gerektirir. Bu reaksiyon basamaklarndan 9u steroln 11. karbonunun hidroksillenerek
11-a-hidroksi projesterona (steroid) dnmesini ierir. Bu 9 basamakl
kimyasal dnm, mikroorganizmalar tarafndan tek bir enzimatik
reaksiyonla gerekletirilmektedir. Rekombinant DNA teknolojisi, biyodnm srelerinin etkinliinin arttrlmasnda ok yararl olmaktadr. rnein, tek bir enzimin mayada klonlamasn ieren tek bir
maniplasyonla malik asitin fumarik asite dnm 2 g/Lden 125
g/Lye karlabilmitir.
Gda Endstrisinde Starter Kltrler
Fermente st ve et rnlerinin (peynir, tereya, yourt, salam, sosis
gibi) yapmnda kullanlan mikroorganizmalar (starter kltrler) fermente olacak ham besinde istenilen metabolik aktivitenin
gereklemesini salarlar. Halk arasnda mayalamak olarak bilinen
bu ilemde mayalar deil, daha ziyade bakteri kltrleri (laktik asit bakterileri ve dier baz bakterilerin kark kltrleri) kullanlr. Bu kltrler, rettikleri metabolitler aracl ile fermente besinin olgunlamasn
salarlar, ona zel bir tat ve koku verirler. Gnmzde gen teknolojileri, bu tip mikroorganizmalarn genetik yaplarnn deitirilmesi ve
teknolojik ve hijyenik uygunluklarnn arttrlmas ile tketiciye ve
topluma daha salkl, daha lezzetli, daha ucuz ve daha yksek kaliteli
gda rnlerinin sunulmas iin kullanlmaktadr. Burada, genetik olarak
deitirilmi organizmalarn gda sanayiinde kullanmnn dzenleyici
kurallar ve tketici tarafndan kabul gibi etin engellerden gemesi
gerektii zellikle not edilmelidir. Bu alanda mevcut uygulamalarla ilgili
olarak, Chr. Hansen A/S Bio Ingredients (Danimarka) isimli irketin

114

GLAY ZCENGZ/ENDSTRYEL RETMDE GEN TEKNOLOJLER

aratrma laboratuvarlarnda yrtlm, gen teknolojjsi ile starter

gelitirme almalarndan rnekler vermek yararl olacaktr. Peynir
yapmnda kullanlan mikroorganizmalarn sahip oldukar aminopeptidaz isimli enzim, st proteini kazeini daha kk yap talarna (kk
peptidler ve amino asitler) paralamakta, ortaya kan yap talar ise
peynire tat ve kokusunu veren bileiklerin yapm iin nclk etmektedirler. Ancak bu enzimin oluturduu baz peptidler ac bir lezzete
sahiptir ve peynirin kalitesini drmektedir. Aratrclar, kazeini farkl
blhelerden kran, dolaysyla farkl peptidler oluturan 4 farkl amino
peptidaz enzimine (genel aminopeptidaz, dipeptidaz, sistein aminopeptidaz ve endopeptidaz) karlk gelen genleri ayr ayr klonlamlar ve bu
genlerin rn olan enzimleri yksek seviyede ifade eden starter organizmalarla pilot seviyede peynir yapmna balamlardr. Farkl enzimleri tayan starterlarla hazrlanan peynirler, rekombinant olmayan orijinal kltr de kontrol tekil etmek zere belli aralklarla birok parametre iin karlatrlmtr. ki aylk bir olgunlatrmadan sonra peynirler arasnda nemli bir fark bulunulmam, ancak 4. aydan itibaren
genel aminopeptidaz ve sistein aminopeptidaz ifade eden kltrlerle
hazrlanan peynirlerin aclnda nemli bir d belirlenmitir.
Bylelikle, bu enzimlerin gen teknolojisi kullanlarak yksek seviyede
ifade edilmesinin peynirin organoleptik zelliklerini iyiletirdii gsterilmitir. Aminopeptidazlarla ilgili bir dier sorun da bu enzimlerin hcre
ii enzimler olmas, kazein de hcre iine alnamadndan ancak hcre
lm ve paralanmas (otoliziz) gerekletikten sonra bu enzimlerin
peynire geip kazeini paralamalardr. Aratrclar, bu sorunu gidermek iin bakteri viruslarnn (fajlarn) bakteri hcreleri ierisinde
oaldktan sonra konak hcrelerin duvarn ykarak onlar paralama
(lizize uratma) yeteneinden yararlanmlar, bunun iin bir nceki
aamada elde ettikleri rekombinant organizmalara ayrca fajdan izole
ettikleri lizin ad verilen protene ait geni klonlamlardr. Sonuta, elde
edilen rekombinantn daha abuk otolize olduu ve bu organizma ile
elde edilen peynirin lezzet asndan mkemmel olduu gsterilmitir.
Bir dier rnek ise, tereya yapm ile ilgilidir. Tereyana karakteristik
tat ve kokusunu veren, laktik asit bakterilerinin oalmas ve laktik asit
reterek asiditeyi arttrmas srecinde oluan diasetil isimli bileiktir.
Starter olarak 3 ayr tip laktik asit bakterisinin yansra Leuconostoc ad
verilen ve tereyanda istenmeyen bir bileik olan asetaldehidi
paralayan bir bakteri kullanlr. Ancak bu organizma diasetili indirgeyip
kokusuz bileikler olan asetoin ve btandiyole dntrmekte, bylece
de stoktaki tereya zaman ierisinde tm koku ve lezzetini kaybetmektedir. Bu sorunu zmek iin, klasik mutajenezden yararlanlarak
Leuconostocun diasetili indirgeme gc azalm mutant elde edilmi,

AVRASYA DOSYASI

115

dier yandan da laktik asit bakterileri genetik maniplasyona tab tutularak daha fazla diasetil retmeleri salanmtr.
Polisakkaritler ve Biyobozunabilir polyesterler
Mikrobiyal kkenli polisakkaridler (sellz, agar, aljinat, pektin,
ksantan, vb) de ticar nemi olan rnler arasndadr. Bunlarn en
nemlisi olan ve gida, boya ve tekstil endstrisinde kullanlan ksantan
ylda 30 bin ton retilmekte olup 408 milyon dolarlk bir markete
sahiptir. Mevcut gen teknolojisi uygulamalar, ksantann kimyasal
yapsn deitirmeye ynelik olmutur.
Bakteriler, karbon ve enerji rezervi olarak hcrelerinde polihidroksialkanoit (PHA) granlleri depolama kabiliyetindedirler, baz tip bakteriler bu maddeleri daha fazla retip depolarlar. PHAlar termoplastik zellik gsterirler, belirli bir scaklkta erir, soutulduunda ise katlarlar.
Molekler yaplar ve fiziksel zellikleriyle polipropilene benzerlik gsterirler, ancak younluklar farkldr. Polipropilen sudan daha az youn
olduu iin suda batmaz ve yzer, PHAlar ise suda batar ve dip sedimentlerde biyobozunmaya urar. Bu zellikleriyle evreyi kirleten plastiklere stnlk gsteren PHAlar nemli uygulamalar bulmakta, gnlk
hayatta kullanlan biyobozunur ie ve ambalaj malzemeleri yapmnda, tpta biyobozunur ivi ve teller, eitli destek malzemeleri gibi eitli cerrah malzemelerinin yapmnda kullanlmaktadrlar. PHAlarn
sentezlendii biyokimyasal yolu katalizleyen enzimlere ait genler hem
endstriyel PHA reticilerinde, hem de dier baka mikroorganizmalarda klonlanm ve ifade edilmilerdir. Bir almada rekombinant hcrelere T4 bakteriyofajnn lizozim (hctelerin paralanmasn salayan bir
enzimdir) genini tayan ve bu genin konak hcrelerde dk seviyede ifade edilmesini salayacak bir rekombinant plazmid transfer edilmitir. Lizozim geninin dk seviyede ifadesi hcre remesi ve PHA
sentezini olumsuz ynde etkilememitir. Hcrelerde yeterli miktarda
PHA birikmesi beklendikten sonra hcreler hcre zarnn btnln
bozacak bir kimyasalla muamele edilip lizozim enziminin hcre duvarna ulap onu paralamas salanmtr. Bu yolla hcrelerden byk
miktarda PHA salnmas salanmtr. Bir dier uygulamada, retici organizmaya yeni PHA biyosentetik yollar kazandrlarak organizmann
normalde rettiinden farkl yapda PHAleri retmesi salanmtr.
Antibiyotikler ve Dier Sekonder Metabolitler
Enfeksiyon hastalklar ile mcadelenin yansra ziraat ve veterinerlikte de kullanlan antibiyotikler, pazarn bykl asndan

116

GLAY ZCENGZ/ENDSTRYEL RETMDE GEN TEKNOLOJLER

gnmzde mikrobiyal biyoteknolojinin en nemli rnleridir. Amino

asit, etil alkol, vitamin gibi mikroorganizmalarn remek iin sentezlemek zorunda olduklar rnlerin (primer metabolitlerin) aksine, antibiyotiklerin sentezlenmesi retici mikroorganizmann oalmas iin art
deildir, bu nedenle de sekonder metabolitler olarak isimlendirilirler.
Antibiyotik aktiviteye sahip pek ok sekonder metabolit ayrca kolestrol
drc ajanlar, immnosupressantlar, antikanser ajanlar, biyoherbisitleri, biyoinsektisitleri, bitki ve hayvan bymesini tevik eden ajanlar ve ergot alkaloidleri iermekte olup tp, tarm ve veterinerlikte bu
aktiviteleri iin kullanlrlar. Yine antibiyotik aktivitesi olmayan, ancak
antihelmintik (r. ivermektin), biyoinsektisid (r. spinosad), bitki
byme stimulantlar (r. giberellinler) olarak kullanlan sekonder
metabolitler de mevcuttur. Bugne dek kefedilmi antibiyotik says 6
bin kadardr, buna karn kullanmda olan antibiyotiklere kar diren
gelitiren patojenlerin srekli ortaya kmasndan dolay yeni antibiyotiklerin aratrlmas almalar youn bir biimde srmektedir.
Gnmzde 160 farkl antibiyotiin ve trevlerinin (penisillinler,
sefalosporinler ve dier b-laktamlar, peptidler, eritromisin, tetrasiklinler, aminoglikozidler vd) retildii antibiyotik marketinin 1999 yl
toplam pazar 30 milyar dolarn zerindedir.
Rekombinant DNA teknolojisi, antibiyotik retiminde de geni apta
uygulama bulmutur. Yine de, sekonder metabolitlerin yapm hcrelerde karmak global dzenlemelerle kontrol edildiinden, primer
metabolitlerin retiminin arttrlmas iin baaryla kullanlan gen
teknolojilerinin sekonder metabolitler sz konusu olduunda daha
dk etkinlikle kullanlmakta olduu not edilmelidir. Antibiyotik
biyosentezini salayan ok basamakl metabolik yolda farkl basamaklar katalizleyen enzimlere ait genlerin retici organizmann kromozomunda ayn blgede grup halinde bulunmalar, bu genlerin tamamnn
izole edilip klonlanmasn kolaylatrmakta, daha sonra klonlanan gen
grubu ayn organizmaya ya da farkl bir organizmaya aktarlarak gen
dozu etkisi ile rn miktarnn arttrlmas yoluna gidilmektedir. Hastalk
yapc bakterilerin kullanmda olan antibiyotiklere giderek diren kazanmas, yeni ve daha etkili antibiyotiklerin bulunmasn zorunlu klmaktadir. Rekombinant DNA teknolojisi, yeni ya da modifiye sekonder rnlerin elde edilmesi iin de kullanlmaktadr ( kombinetoryal biyosentez); belirli bir sekonder rnn sentezi ile ilgili genler bir dier
sekonder rn yapmcs baka bir mikroorganizmada klonlandnda
her iki rnden de farkl, yeni ve hibrid bir rn elde edilebilmektedir.

AVRASYA DOSYASI

117

Biyopestisidler
Pek ok lkede, 20 yl akn bir sredir biyoinsektisit olarak da
bilinen biyolojik ajanlarn kimyasal ajanlara tercih edilmekte ve haere
kontrolnde yaygn olarak kullanlmaktadr. Bu tercihte rol oynayan en
byk etken; kimyasal ajanlarn hemen tmnn, biyolojik olanlarna
kyasla, evre ve insan sal iin tehdit oluturan zehirli maddelerden
kaynaklanmasdr. Bacillus thuringiensis (B t) isimli toprak bakterisi,
biyolojik ajanlar ierisinde en yaygn kullanm bulan biyoinsektisit reticisidir. Bakteri, yaam dngs iinde, bcek trne spesifik
(sivrisinek, karasinek, vb) ve o trn larvalar tarafndan besin yoluyla
alndnda ldrc etkisi olduu bilinen ve kristal protein ad verilen
baz toksin proteinleri sentezlemektedir. Bu proteinler iinde d-endotoksin olarak bilineni, deiik alt gruplara sahip olup, biyoinsektisit
olarak dnya apnda kullanm bulmaktadr. Bu toksinlerin, retim sonras, formlasyon ad verilen eitli n ilemlerden geirilmesi halinde,
dorudan haere mcadelesinde kullanlmalar mmkndr. Mcadele
edilecek haere cinsine gre deiik toksin cinsleri elde edilebilmekte
ve bunlardan gelitirilen preparatlar ok eitli uygulamalarda
(rnein sivrisineklere ve karasineklere, ayrca eitli sebze, meyve ve
orman zararllarna kar) kullanlabilmektedir. Gen teknolojileri daha
stn zellikler gsteren biyoinsektisit reticisi bakterilerin elde
edilebilmesi ve ayrca biyoinsektisilerin doal retici olan bakteriler
dnda baka canllar ve hatta haerelerden zarar gren bitkilerin bizzat kendileri tarafndan retilebilmesi iin ok etkin bir aratr. Deiik
bcek trlerine kar etkin biyoinsektisidleri kodlayan genlerin tamam
klonlanm ve karakterize edilmitir. Farkl bcek trlerine kar etkin
genlerin tek bir organizmada toplanmas yoluna gidilmi, ancak byle
bir rekombinant organizmada mevcut farkl biyoinsektisit genlerinin
birbirlerinin ifade edilmesini, yapmn engelledii ve bu yolla ideal bir
insektisid reticisi elde edilemeyecei belirlenmitir. Toksin genleri
modifiye edilerek yeni ve daha etkin toksinlerin elde edilmesi bir dier
yaklamdr. Tarm zararllarna kar etkili toksinler iin yaplan genetik
mhendislii almalarnda toksin genlerinin ilgili bitkiyle birarada
yaayan, rnein bitkinin yapraklarnda kolonize olan bakterilerde
klonlanmas, sivrisineklere kar etkili toksinler iin ise sulak alanlar
tercih eden fotosentetik bakterilerin klonlama konaks olmas gibi
stratejiler de gayet etkin biimde kullanlmtr. Yine toprak rneklerinden izole edilen bakteriler gen teknolojileri ile taranmakta, yeni ve
daha etkin toksin proteinlerin bulunmas ynnde aba gsterilmektedir. Biyoinsektisidlerle ilgili olarak gen teknolojisinin bir dier ilgi alan
da baculovirus ad verilen, pest trlerini enfekte edebilen, ancak bitkilere ve omurgal hayvanlara zarar vermeyen bcek viruslar zerine

118

GLAY ZCENGZ/ENDSTRYEL RETMDE GEN TEKNOLOJLER

younlamtr. Ancak, bu viruslarn bcekleri ok yava ldrmesi, her

birinin sadece tek bir bcek trne spesifik olmas ve gnein ultraviyole nlarna dayankszlklar bunlarn imdilik biyopestisid olarak
kullanmn snrlayan faktrler arasndadr. Rekombinant DNA teknolojisi kullanlarak bu dezavantajlarn giderilmesine (rnein, ultraviyole
nlarnn neden olduu DNA hasarlarn minimize etmek iin etkili
DNA tamir sistemlerini ifreleyen genlerin klonlanmas) allmaktadr.
Biyoremediasyon
Biyolojik ve jeokimyasal prosesler sonucu oluan organik maddelerin hemen tm doada yapsal paralanmaya urarken, doal
bozunmaya dayankl ve pek ou endstriyel ve zirai amala yapay
olarak sentezlenen organik kimyasallar (halojenli alifatik ve aromatik
hidrokarbonlar, polisiklik hidrokarbonlar, nitroaromatikler, vb) evre
kirliliine neden olmakta, besin zinciri ile konsantrasyonlar ykselmekte ve insanlar ve dier canllar iin ok ciddi bir tehdit oluturmaktadrlar. Ksenobiyotik ad verilen bu kimyasal kirleticiler ancak
belirli mikroorganizmalar tarafndan besin maddesi olarak kullanlp
etkin bir biimde paralanabilmektedir. Mikroorganizmalarn bu
yetenei gelimi lkelerde uygulama bularak biyoremediasyon
endstrisi oluturmutur. Ancak, mevcut mikroorganizmalarn paralama potansiyelleri baz inat kirleticiler iin yetersiz kalmaktadr. Byle
durumlarda, ilgili metabolik yollara ve organizmann fizyolojisine dair
bilgilerinin gen teknolojisi ile birletirilmesi yeni ya da iyiletirilmi
ksenobiyotik paralama aktivitelerinin deneysel evrimini salamaktadr. Genetik mhendislii uygulamalar, mevcut paralayc enzimlerin
zelliklerinin deitirilmesini, enzim yapmn kontrol eden mekanizmalarn yok edilmesini ve farkl paralayc organizmalara ait genetik
bilgilerin tek bir organizmada toplanmasyla belli bir organizmann
paralayabilecei ksenobiyotik eitlerinin arttrlmasn hedeflemektedir.
Son yllarda aratrmalarn younlat bir dier alan da rekombinant mikroorganizmalarn evresel toksisite biyosensrleri olarak,
yani evrede toksik kimyasal olup olmadnn belirlenmesinde kullanlmasn iermektedir. Byle rekombinant mikroplar, ar metaller ve
eitli organik kirleticilerin varln bir ekilde farkedip dardan
tehis edilebilir bir sinyal vermektedirler. Bu amala, promotor ad
verilen, kromozom zerinde mevcut genlerin hemen nlerinde yer alan
ve herbiri nnde yer ald genin aktivitesinin (ifade edilmesinin) kontrol edildii blge olan DNA dizilerinden yararlanlmaktadr. Bu diziler,
rnleri gzlenebilir bir sinyal (renk, k gibi) verdii iin raportr

AVRASYA DOSYASI

119

adn alan baka genlere balanarak fzyon oluturulmakta ve elde

edilen fzyon uygun bir konak organizmaya aktarlmaktadr. Promotor
olarak, belirli toksik kimyasallar tarafndan spesifik olarak uyarlan genlerin promotorlar (rnein naftalin paralayan enzime ait genin promotoru), ya da hcrede stres oluturan koullarda (s oku, oksidatif
stres, ar metaller ve dier ksenobiyotikler) devreye giren ve global
dzenlemenin birer paras olan genlerin promotorlar kullanlmaktadr. rnein s oku promotorlar pek ok kirletici kimyasalla
uyarlmaktadr. Byle rekombinant bakteriler, evreden alnan rnekler
zerinde onlarn kirletici kimyasal ierip iermediini belirlemektedir.
Kimyasal mevcutsa fzyondaki promotor uyarlmakta, bylelikle bu
promotorun kontrolundaki raportr gen ifade olmakta ve rn, yani
pozitif sinyal vermektedir.
Sonu
Gnmzde mikrobiyal biyoteknoloji, gen teknolojilerini de ieren
modern uygulamalar ile salk, gda ve kimya sektrleri bata olmak
zere global endstrinin ana paralarndan birisini oluturmaktadr.
Modern biyoteknolojinin gelecei iin herhangi bir snr tarif etmek
olanakszdr. Bu bildirimin en temel nedenleri, son derece gen bir
endstri olmasna karn getiimiz 25 yl ierisinde gsterdii mthi
gelime ve insan sal bata olmak zere hemen her sektrde yaam
kalitesini iyiletirmek zere sunduu ve sunabilecei olanaklardr. Gen
teknolojisinin sahip olduu byk yararlarnn yansra tad riskler
gznne alndnda ayn zamanda doaya ve insanla zarar verme
potansiyelini de tayan, dolays ile ciddi bir biimde izlenmesi
gereken modern biyoteknoloji, doru bir ynlendirme ile insanlk tarihinin en byk endstrilerinden birisini oluturacaktr.